Введение к работе
Актуальность проблемы.
Изучение физиологических и биохимических особенностей адаптации поикилотермных животных к разным температурам имеет важное значение для понимания регуляторних механизмов, обеспечивающих жизнедеятельность этих организмов в различных условиях среды. Важное место в приспособлении поикилотермных к разным температурным условиям занимают ферменты, обеспечивающие метаболические перестройки при изменении температуры. В то время, как механизмы эволюционных приспособлений к различным температурным условиям детально исследованы (Александров, 1975; Хочачка, Сомеро, 1977, 1988; Holland et al., 1997 и др.), онтогенетические температурные адаптации, формирующиеся на протяжении нескольких недель или месяцев, изучены фрагментарно (Клячко и др., 1993; Ozemyuk et al., 1994; Vetter, Buehholz, 1997). Изменение функциональных и структурных свойств белков при адаптациях к различным температурам обитания определяется, с одной стороны, аминокислотными заменами, а с другой -взаимодействием белков со стабилизирующими факторами (катионами, коферментами, мембранами, пептидами) (Argos et al., 1979; Jaenicke, 1991; Fields, Somero, 1997).
Изменения, претерпеваемые белками при кратковременных температурных адаптациях (акклимациях) и сезонных адаптациях, изучены недостаточно. Особенно важным представляется изучение структурных изменений в белках при температурных акклимациях поикилотермных животных, поскольку эти изменения лежат в основе функциональных особенностей белков.
Для изучения структурных и функциональных изменений в белках при температурной акклимации был выбран фермент углеводного обмена - лактатдегідрогеназа (ЛДГ). Известно, что этот детально изученный фермент проявляет высокую степень полиморфизма и чувствительность к различным воздействиям. В связи с этим можно ожидать, что изучение структурных и функциональных особенностей данного фермента н различных температурных условиях может служить адекватной моделью для исследования молекулярных механизмов адаптации ферментативных процессов.
Цель и задачи исследования.
Целью настоящей работы было изучение влияния температуры на функциональные и физико-химические свойства ЛДГ из мышц вьюнов. Конкретно было необходимо изучить следующие вопросы:
-
Анализ кинетических свойств ЛДГ при температурных акклимациях.
-
Сравнение устойчивости ЛДГ к температурным воздействиям при адаптации рыб к разным температурам.
-
Термодинамический анализ изменений в молекуле ЛДГ при температурных акклимациях.
Научная новизна.
Впервые показано, что активность ЛДГ из скелетных мышц рыб, адаптированных к низким температурам, обладает более высокой стабильностью, чем при адаптации к высоким температурам.
Впервые исследовано влияние температурной акклимации на структурную стабильность ЛДГ из скелетных мышц рыб. Методом дифференциальной сканирующей микрокалориметрии показано, что температурная акклимация вьюнов влияет на термодинамические свойства мышечной ЛДГ. Энтальпия денатурационного перехода и свободная энергия Гиббса выше для фермента из мышц рыб, адаптированных к высоким температурам, по сравнению с акклимацией к низким температурам. Впервые установлено, что ЛДГ из мышц рыб, адаптированных к низким температурам, обладает более высокой удельной теплоемкостью, чем при акклимации к высоким температурам.
Проведен компьютерный анализ трехмерной структуры М4-ЛДГ и доказано наличие в молекуле этого фермента специфических участков допускающих связывание ионов цинка.
Впервые методом рентгеноспектралыюй флуоресценции, показано различие в содержании ионов цинка в ЛДГ при акклимации рыб к низким и относительно высоким температурам. Содержание цинка в молекуле этого фермента из мышц вьюнов, адаптированных к низким температурам, в 3-4 раза выше. Полученные различия в содержании цинка в ЛДГ служат одной из причин функциональных и структурных различий этих форм фермента при температурной акклимации рыб.
Практическая значимость работы.
Полученные результаты являются важным звеном в понимании молекулярных механизмов регуляции метаболизма пойкилотермных животных при температурных акклимациях. Термодинамический анализ изменений в молекуле ЛДГ из мышц рыб позволяет объяснить структурные перестройки этого фермента в различных температурных условиях. Исследованная модель температуркой акклимации ферментов открывает возможность более глубокого анализа молекулярных механизмов адаптационных процессов.
Апробация результатов.
Основные материалы диссертации докладывались на конференциях ИБР им. Н.К.Кольцова РАН (1995, 1997 гг.), на всероссийском симпозиуме «Возрастная и экологическая физиология рыб», Борок, 1998 г., на международных симпозиумах: «Stability and Stabilization of Biocatalysts», Cordoba, Spain, April, 1998; «Protein Structure, Stability and Folding. Fundamental and Medical Aspects», Moscow, Russia, June, 1998; «Twelfth Symposium of the Protein Society», San Diego, California, USA, July, 1998.
Структура и объем работы.
Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Изложена на 121 странице машинописного текста, содержат 20 рисунков и 7 таблиц. Список литературы содержит 168 источников.