Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1 Экспериментальные модели эпилепсии 12
1.2 Гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальная система и эпилепсия 16
1.2.1 Общая характеристика гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системы 16
1.2.1.1 Паравентрикулярное ядро гипоталамуса 17
1.2.1.2 Передняя доля гипофиза 24
1.2.1.3 Надпочечники 28
1.2.2 Взаимосвязь гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системы и эпилепсии 30
1.3 Вазопрессинергическая система и эпилепсия 34
1.3.1 Общая характеристика вазопрессинергической системы 34
1.3.1.1 Супраоптическое и паравентрикулярное ядра гипоталамуса 36
1.3.1.2 Задняя доля гипофиза 38
1.3.2 Взаимосвязь вазопрессинергической системы и эпилепсии 40
Глава 2. Материалы и методы 44
2.1 Экспериментальные модели 44
2.2 Обработка материала 46
2.2.1 Иммуноферментный анализ 46
2.2.2 Иммуногистохимический метод 47
2.2.3 Двойное иммуномечение 49
2.2.4 Метод гибридизации in situ 49
2.2.5 Вестерн-блот анализ 51
2.3 Морфофункциональный анализ материала 52
2.4 Статистический анализ результатов 52
Глава 3. Результаты исследования 54
3.1 Межлинейные различия в функциональной активности гипоталамо-гипофизарно адренокортикальной системы в базальном и стимулированном состоянии у крыс линий Вистар и КМ 54
3.1.1 Морфофункциональная характеристика паравентрикулярного ядра гипоталамуса у крыс линий Вистар и КМ 54
3.1.2 Функциональное состояние передней доли гипофиза у крыс линий Вистар и КМ 59
3.1.3 Анализ содержания кортикостерона в крови у крыс линий Вистар и КМ 62
3.1.4 Влияние иммобилизационного стресса на функциональное состояние передней доли гипофиза и концентрацию кортикостерона в крови у крыс линий Вистар и КМ 62
3.2 Межлинейные различия в функциональной активности вазопрессинергической системы в базальном состоянии у крыс линий Вистар и КМ 64
3.2.1 Морфофункциональная характеристика супраоптического и паравентрикулярного ядер гипоталамуса у крыс линий Вистар и КМ 64
3.2.2 Морфофункциональная характеристика задней доли гипофиза и анализ содержания вазопрессина в сыворотке крови у крыс линий Вистар и КМ 68
3.3 Влияние однократной звуковой стимуляции на функциональное состояние гипоталамо гипофизарно-адренокортикальной системы у крыс линии КМ 71
3.3.1 Влияние однократной звуковой стимуляции на функциональную активность паравентрикулярного ядра у крыс линии КМ 71
3.3.2 Влияние однократной звуковой стимуляции на функциональную активность передней доли гипофиза у крыс линии КМ 74
3.3.3 Влияние однократной звуковой стимуляции на концентрацию кортикостерона в крови у крыс линии КМ 76
3.3.4 Влияние однократной звуковой стимуляции на концентрацию АКТГ и кортикостерона в крови у крыс линии Вистар 76
3.4 Влияние однократной звуковой стимуляции на функциональное состояние вазопрессинергической системы у крыс линии КМ 78
3.4.1 Влияние однократной звуковой стимуляции на функциональную активность супраоптического ядра гипоталамуса у крыс линии КМ 78
3.4.2 Влияние однократной звуковой стимуляции на функциональную активность задней доли гипофиза у крыс линии КМ 82
3.5 Влияние многократных звуковых стимуляций на функциональное состояние гипоталамо гипофизарно-адренокортикальной системы у крыс линии КМ 84
3.5.1 Влияние многократных звуковых стимуляций на функциональную активность паравентрикулярного ядра у крыс линии КМ 84
3.5.2 Влияние многократных звуковых стимуляций на функциональную активность передней доли гипофиза у крыс линии КМ 88
3.5.3 Влияние многократных звуковых стимуляций на концентрацию кортикостерона в крови у крыс линии КМ 91
3.6 Влияние многократных звуковых стимуляций на функциональное состояние вазопрессинергической системы у крыс линии КМ 92
3.6.1 Влияние многократных звуковых стимуляций на функциональную активность супраоптического и паравентрикулярного ядер гипоталамуса у крыс линии КМ 92
3.6.2 Влияние многократных звуковых стимуляций на функциональную активность задней доли гипофиза у крыс линии КМ 96
Глава 4. Обсуждение результатов 97
4.1 Межлинейные различия в функциональном состоянии и в механизмах регуляции гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной и вазопрессинергической систем у крыс линий Вистар и КМ в базальном и стимулированном состоянии 97
4.2 Влияние однократной звуковой стимуляции на функциональное состояние и механизмы регуляции гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной и вазопрессинергической систем у крыс линии КМ 105
4.3 Влияние многократных звуковых стимуляций на функциональное состояние и механизмы регуляции гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной и вазопрессинергической систем у крыс линии КМ 111
Заключение 117
Выводы 120
Список литературы 121
- Паравентрикулярное ядро гипоталамуса
- Морфофункциональная характеристика паравентрикулярного ядра гипоталамуса у крыс линий Вистар и КМ
- Влияние многократных звуковых стимуляций на функциональную активность паравентрикулярного ядра у крыс линии КМ
- Влияние многократных звуковых стимуляций на функциональное состояние и механизмы регуляции гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной и вазопрессинергической систем у крыс линии КМ
Паравентрикулярное ядро гипоталамуса
Пространственно ПВЯ располагается в дорсо-латеральной области гипоталамуса у стенки III желудочка и представляет собой хорошо очерченную группу нейронов, в которой выделяют крупноклеточную и мелкоклеточную части. В нейронах мелкоклеточной части ПВЯ гипоталамуса происходит синтез ряда нейрогормонов, которые способны стимулировать (рилизинг факторы или либерины) или подавлять (ингибирующие факторы или статины) выработку тропных гормонов в клетках передней доли гипофиза. Тропные гормоны, в свою очередь, регулируют работу ряда периферических желез внутренней секреции, таких как надпочечники, щитовидная железа и т. д. Аксоны нейронов мелкоклеточной части ПВЯ гипоталамуса короче по сравнению с нейронами крупноклеточной части и оканчиваются в области срединного возвышения (нейрогемальной контактной зоне), где образуют терминали на первичной капиллярной сети, которая собирается в воротные вены, оплетающие переднюю долю гипофиза (Swanson, Sawchenko, 1983).
В настоящее время известно, что нейроэндокринные клетки мелкоклеточной дорсомедиальной части ПВЯ гипоталамуса в составе ГГАКС принимают участие в регулировании защитной реакции организма на изменения внешних и внутренних условий среды (Smith, Vale, 2006). Нейроны ПВЯ гипоталамуса, являясь центральным звеном ГГАКС, получают и интегрируют информацию от различных структур головного мозга. Вследствие активации этих нейронов за счет нервных импульсов происходит повышение секреции кортиколиберина и вазопрессина в портальный кровоток, что соответствует началу активации ГГАКС. Таким образом, на уровне нейронов ПВЯ происходит трансформация нервного сигнала в гуморальный, который в дальнейшем ответственен за регуляцию нижележащих эндокринных желез (Herman et al., 2002).
Кортиколиберин является одноцепочечным полипептидом, состоящим из 41 аминокислоты. Ген, отвечающий за синтез кортиколиберина, у человека расположен на большом плече 8-й хромосомы и состоит из двух экзонов и одного короткого интрона. Так, в 1987 году Thompson и соавторы показали, что ген, кодирующий кортиколиберин, и у человека, и у крысы имеет сходное строение и базовую организацию (Thompson et al., 1987). Первый экзон гена кортиколиберина кодирует большую часть 5 -нетранслируемой области мРНК, второй экзон содержит последовательность, кодирующую препрогормон, а также 3 нетранслируемую область мРНК (Owens, Nemeroff, 1991). Последовательность проксимальной 5 -фланкирующей нуклеотидной последовательности гена кортиколиберина является высококонсервативной, содержит два сайта связывания с TATA-связывающим-белком и ряд специфических аминокислотных последовательностей с помощью которых транскрипционные факторы способны модулировать транскрипцию. На промоторе гена кортиколиберина представлены следующие специфические участки: CRE, AP1, ERE, nGRE и другие. Кроме того, интрон гена кортиколиберина содержит специальный участок RE-1/NRSE, с которым связывается белок REST/NRSF и ограничивает транскрипцию кортиколиберина (Majzoub, 2006). Было показано, что стрессорные воздействия вызывают активацию кортиколиберинергических нейронов, которая сопровождается экспрессией генов раннего ответа таких как c-fos, Fra-2, zip-268/Egr-1 и NGFI-B, а также фосфорилированием транскрипционного фактора CREB и ERK1/2 киназы (Kovcs, Sawchenko, 1996; Khan et al., 2007; Weinberg et al., 2007), что предполагает участие этих транскрипционных факторов в регуляции транскрипции кортиколиберина.
Большое количество экспериментальных данных указывает на то, что цАМФ является основным регулятором экспрессии гена кортиколиберина и опосредует основной механизм изменения уровня транскрипции нейропептида. Так, за счет цАМФ-зависимой активации протеинкиназы А происходит фосфорилирование транскрипционного фактора CREB и связывание его димера со специфическим участком на промоторе гена кортиколиберина CRE в присутствии ряда коактиваторов, в том числе и цАМФ-зависимого TORC (Aguilera, Liu, 2012).
Ключевыми репрессорами транскрипции кортиколиберина являются глюкокортикоиды. Так показано, что после введения глюкокортикоидов или дексаметазона – синтетического глюкокортикостероида, следовало понижение уровня мРНК кортиколиберина в ПВЯ гипоталамуса (Kovcs et al., 1986; Sawchenko, 1987). При этом адреналэктомия у крыс приводила соответственно к повышению мРНК кортиколиберина в нейронах ПВЯ гипоталамуса (Ma et al., 2001). Заместительная терапия глюкокортикоидами при адреналэктомии приводила к возвращению уровня мРНК кортиколиберина к базальным значениям (Young III et al., 1986; Swanson, Simmons, 1989). Однако механизмы подавления транскрипции кортиколиберина глюкокортикоидами до сих остаются неясны. В одних работах на трансфецированных клеточных линиях было выявлено, что активированный рецептор глюкокортикоидов способен напрямую модулировать уровень транскрипции кортиколиберина (Nicholson et al., 2004). В других показано, что связывание активированного рецептора глюкокортикоидов со специфическим участком GRE на промотре гена кортиколиберина не является основным механизмом регуляции транскрипции (Evans et al., 2013). Показано, что активированные рецепторы глюкокортикоидов способны взаимодействовать с транскрипционным фактором CREB и влиять на интенсивность транскрипции (Van et al., 1990). Таким образом, существует мнение, что глюкокортикоиды могут негативно регулировать транскрипцию кортиколиберина путем белок-белковых взаимодействий и/или с помощью модуляции активности афферентных проекций, направленных к нейронам ПВЯ гипоталамуса (Nicholson et al., 2004). Кроме того, в экспериментах Ма и соавторов показана способность глюкокортикоидов оказывать влияние на стабильность мРНК кортиколиберина в нейронах ПВЯ гипоталамуса. Так, период полураспада мРНК кортиколиберина у крыс, перенесших адреналэктомию, был длиннее, чем у контрольных животных. При этом введение глюкокортикоидов приводило к сокращению периода полураспада мРНК кортиколиберина и у контрольных животных, и у крыс, подвергшихся адреналэктомии. Таким образом, авторы этого исследования предположили что глюкокортикоиды способствуют деградации мРНК кортиколиберина в ПВЯ гипоталамуса (Ma et al., 2001). Следовательно, глюкокортикоиды способны оказывать регуляторное воздействие на транскрипцию кортиколиберина двумя способами, одним из которых является угнетение транскрипции, а другим - повышение скорости деградации мРНК кортиколиберина, причем, последний механизм соответствует, по-видимому, долгосрочным эффектам глюкокортикоидов (Ma et al., 2001).
Синтезируется кортиколиберин в нейронах ПВЯ гипоталамуса в виде препрогормона, состоящего из 196 аминокислотных остатков. На карбоксильном конце препрогормона локализована 41 аминокислотная последовательность зрелого кортиколиберина, которая отделена от N-конца протеазочувствительным основным остатком. После посттрансляционных модификаций в эндоплазматическом ретикулуме препрогормон попадает в аппарат Гольджи, где подвергается эндопротеолитическому расщеплению и последующему амидированию карбоксильной группы, после чего сортируется в секреторные гранулы, отпочковывается и транспортируется к терминалям аксонов (Majzoub, 2006).
В ряде исследований показано, что как гипоталамические, так и экстрагипоталамические структуры ЦНС принимают участие в регуляции нейросекреторных клеток ПВЯ гипоталамуса (Рис. 2) (Herman et al., 2003; Smith, Vale, 2006).
В базальном состоянии все гормоны ГГАКС подвержены суточным ритмам секреции. Суточные колебания уровня гормонов ГГАКС обусловлены влиянием супрахиазматического ядра гипоталамуса на активность нейронов мелкоклеточной части ПВЯ гипоталамуса. В настоящее время известно, что аксоны нейронов супрахиазматического ядра гипоталамуса направляются напрямую к ПВЯ гипоталамуса, а также к ГАМК-ергическим нейронам дорсомедиального ядра гипоталамуса, которые, в свою очередь, обеспечивают тормозную
регуляцию кортиколиберинергических нейронов (Kalsbeek et al., 1996; Hermes et al., 2000). Показано, что у большинства млекопитающих наблюдается четко выраженный суточной ритм активации ГГАКС, пиковые уровни которого соответствуют фазе бодрствования (Kalsbeek et al., 2012). У человека наивысший пик концентрации гормонов ГГАКС приходится на утреннее время, а наименьший на вечернее (Spiga et al., 2011). В то же время у грызунов, напротив, пик секреции кортиколиберина, АКТГ и кортикостерона приходится на вечернее время, которое соответствует темному времени суток, а наименьшая концентрация гормонов наблюдается ранним утром, что соответствует началу светового дня (Moldow, Fischman, 1984; Herman et al., 2012). Таким образом, считается, что суточные колебания уровня глюкокортикоидов играют важную роль в регуляции энергетического баланса в зависимости от дневного или ночного типа активности животного (Leal, Moreira, 1997; Le Minh et al., 2001).
Морфофункциональная характеристика паравентрикулярного ядра гипоталамуса у крыс линий Вистар и КМ
Мы показали, что у крыс линии КМ оптическая плотность кортиколиберин-иммунореактивного вещества в нейронах ПВЯ гипоталамуса (Рис. 5) и в волокнах наружной зоны срединного возвышения (Рис. 6-А,Б,В) была достоверно ниже, чем у крыс линии Вистар. Количество кортиколиберин-иммунореактивных клеток в ПВЯ гипоталамуса у крыс линии КМ было также понижено по сравнению с крысами линии Вистар (Вистар 24±7; КМ 16±5, p 0,05). С помощью вестерн-блот анализа также было показано пониженное содержание кортиколиберина в пробах гипоталамуса, содержащих нейроны ПВЯ, у крыс линии КМ по сравнению с крысами линии Вистар (Рис. 7-А,Б).
Известно, что вазопрессин наряду с кортиколиберином может участвовать в регуляции секреции АКТГ кортикотропоцитами аденогипофиза (Smith, Vale, 2006), поэтому мы проанализировали его содержание в нейронах мелкоклеточной части ПВЯ и в волокнах наружной зоны срединного возвышения. Для оценки содержания и распределения вазопрессина были использованы моноклональные антитела против нейрофизина II, который совместно с вазопрессином синтезируется из общего препрогормона, транспортируется и секретируется в эквимолярных количествах (Burbach et al., 2001). Мы показали отсутствие различий как в оптической плотности вазопрессин-нейрофизин II-иммунореактивного вещества (Вистар 0,185±0,02; КМ 0,182±0,029, р 0,05), так и в количестве иммуномеченых клеток (Вистар 13±3; КМ 15±3, р 0,05) в мелкоклеточной части ПВЯ гипоталамуса у крыс обеих линий. Межлинейных различий в содержании вазопрессин-нейрофизина II в волокнах наружной зоны срединного возвышения также не было выявлено (Вистар 0,059±0,004; КМ 0,057±0,006, р 0,05).
Известно, что в регуляции мелкоклеточной части ПВЯ гипоталамуса участвуют множество нейромедиаторных систем мозга. Глутамат и ГАМК являются основными нейромедиаторами, оказывающими возбуждающее и тормозное влияние на активность нейронов ПВЯ гипоталамуса соответственно (Herman et al., 2003). Поэтому мы проанализировали межлинейные различия в глутаматергической и ГАМК-ергической иннервации гипоталамуса у крыс линии Вистар и линии КМ. Глутаматергическая иннервация гипоталамуса оценивалась на основании иммуногистохимического выявления VGlut2, который используется в качестве маркера глутаматергических нейронов (Vigneault et al., 2015). Мы показали отсутствие различий в плотности VGlut2-иммунопозитивных волокон, иннервирующих нейроны ПВЯ (Вистар 0,042±0,008; КМ 0,039±0,009, р 0,05) и волокна наружной зоны срединного возвышения (Вистар 0,072±0,01; КМ 0,071±0,009, р 0,05) у крыс линий Вистар и КМ.
ГАМК-ергическая иннервация гипоталамуса оценивалась на основании содержания GAD67 в волокнах, иннервирующих нейроны ПВЯ гипоталамуса, наружную зону срединного возвышения, а также на основании содержания GAD65 в пробах гипоталамуса, содержащих ПВЯ. GAD67 и GAD65 используются в качестве маркера содержания ГАМК в нейронах в связи с тем, что уровень фермента глутаматдекарбоксилазы отражает уровень синтеза нейромедиатора в нейронах (Fong et al., 2005). Денситометрический анализ показал, что у крыс линии КМ плотность GAD67-иммунопозитивных волокон, иннервирующих нейроны ПВЯ гипоталамуса (Рис. 8-А,Б,В), и волокна наружной зоны срединного возвышения (Рис. 9-А,Б,В) была выше по сравнению с крысами линии Вистар.
С помощью вестерн-блот анализа было показано, что уровень GAD65 в пробах гипоталамуса, содержащих ПВЯ у крыс линии КМ также был выше (Рис. 10-А,Б) по сравнению с крысами Вистар.
Различий в содержании рецепторов ГАМКА (Вистар 0,736±0,212; КМ 0,709±0,357, р 0,05) и ГАМКБ (Вистар 0,778±0,182; КМ 0,885±0,103, р 0,05) в пробах гипоталамуса, содержащих ПВЯ, у крыс линий Вистар и КМ выявлено не было.
Полученные данные свидетельствуют о повышенной тормозной ГАМК-ергической иннервации нейронов ПВЯ гипоталамуса у крыс линии КМ, это сопровождается пониженным содержанием кортиколиберина.
Влияние многократных звуковых стимуляций на функциональную активность паравентрикулярного ядра у крыс линии КМ
Анализ оптической плотности кортиколиберин-иммунореактивного вещества в нейронах ПВЯ показал отсутствие различий в содержании кортиколиберина у эпилептизированных крыс линии КМ и у крыс линии КМ с приобретенной устойчивостью к АСП по сравнению с контрольными животными (КМ контроль 0,092±0,01; КМ киндлинг 0,089±0,006; КМ с приобретенной устойчивостью к АСП 0,09±0,006, р 0,05). Однако многократные АСП приводили к понижению оптической плотности кортиколиберин-иммунореактивного вещества в волокнах наружной зоны срединного возвышения у эпилептизированных крыс линии КМ (Рис. 36-А,Б,Г). У крыс линии КМ с приобретенной устойчивостью к АСП подобных изменений выявлено не было (Рис. 36-А,В,Г).
Достоверных различий в оптической плотности вазопрессин-нейрофизин II– иммунореактивного вещества (КМ контроль 0,121±0,012; КМ киндлинг 0,143±0,017; КМ с приобретенной устойчивостью к АСП 0,133±0,023, р 0,05) и в количестве иммуномеченых клеток (КМ контроль 23±3; КМ киндлинг 25±6; КМ с приобретенной устойчивостью к АСП 28±4, р 0,05) в мелкоклеточной части ПВЯ гипоталамуса у эпилептизированных крыс и крыс с приобретенной устойчивостью к АСП по сравнению с контролем не было обнаружено. При этом многократные АСП приводили к повышению содержания вазопрессин-нейрофизина II в волокнах наружной зоны срединного возвышения у эпилептизированных крыс линии КМ (Рис. 37-А,Б,Г) по сравнению с контролем. Различий в содержании вазопрессин-нейрофизин II– иммунореактивного вещества в волокнах наружной зоны срединного возвышения у крыс линии КМ с приобретенной устойчивостью к АСП по сравнению с контролем отмечено не было (Рис. 37-А,В,Г).
Было показано отсутствие различий в плотности VGlut2-иммунопозитивных волокон, иннервирующих нейроны ПВЯ гипоталамуса (КМ контроль 0,084±0,01; КМ киндлинг 0,092±0,003; КМ с приобретенной устойчивостью к АСП 0,089±0,014, р 0,05) и волокна наружной зоны срединного возвышения (КМ контроль 0,088±0,009; КМ киндлинг 0,093±0,005; КМ с приобретенной устойчивостью к АСП 0,093±0,007, р 0,05) как у эпилептизированных крыс, так и у крыс линии КМ с приобретенной устойчивостью к АСП по сравнению с контролем. Денситометрический анализ также не выявил изменений в оптической плотности GAD67-иммунореактивного вещества в волокнах, иннервирующих мелкоклеточную часть ПВЯ гипоталамуса у эпилептизированных крыс и крыс с приобретенной устойчивостью к АСП по сравнению с контролем (КМ контроль 0,058±0,003; КМ киндлинг 0,054±0,008; КМ с приобретенной устойчивостью к АСП 0,05±0,011, р 0,05). Однако многократные АСП вызывали понижение уровня GAD67 в волокнах, иннервирующих наружную зону срединного возвышения у эпилептизированных крыс линии КМ (Рис. 38-А,Б,Г). Изменений в ГАМК-ергической иннервации наружной зоны срединного возвышения у крыс линии КМ с приобретенной устойчивостью к АСП обнаружено не было (Рис. 38-А,В,Г).
Таким образом, полученные данные указывают на то, что многократные АСП приводят к снижению ГАМК-ергической иннервации волокон наружной зоны срединного возвышения, что сопряжено с пониженным содержанием кортиколиберина и повышенным содержанием вазопрессина в наружной зоне срединного возвышения.
Влияние многократных звуковых стимуляций на функциональное состояние и механизмы регуляции гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной и вазопрессинергической систем у крыс линии КМ
Гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальная система
На следующем этапе исследования была поставлена задача оценить функциональное состояние ГГАКС у крыс линии КМ на модели лимбической эпилепсии, развивающейся в результате аудиогенного киндлинга. Для этой модели характерно распространение эпилептической активности в структуры лимбической системы, а также в новую кору. Известно, что судорожные припадки, а также сопутствующие им процессы (сосудистые нарушения и т.д.) сами по себе могут являться фактором, вызывающим состояние стресса и таким образом способствовать изменению функциональной активности ГГАКС (Семиохина и соавт., 2006). В связи с этим представлялось интересным сопоставить изменения в функциональной активности центральных и периферического звеньев ГГАКС и механизмы их регуляции, наблюдаемые после многократных аудиогенных судорожных припадков и изменения, вызванные хроническим стрессом.
Известно, что хронический стресс сопровождается повышенным уровнем кортикостерона в крови, что обусловлено повышением чувствительности к АКТГ, гиперплазией, а также гипертрофией клеток пучковой зоны надпочечников (Ulrich-Lai et al., 2006). На модели электрического киндлинга было показано, что многократные электрические стимуляции амигдалы или дорсального гиппокампа приводили к повышению уровня кортикостерона в плазме крови (Szafarczyk et al., 1986). Эпилептический статус, вызванный введением пилокарпина, у крыс также вызывал устойчивое повышение концентрации кортикостерона через два месяца после острой фазы (Mazarati et al., 2009). В нашем исследовании было отмечено, что многократные аудиогенные припадки у крыс линии КМ вызывали развитие гиперактивности периферического звена ГГАКС, о чем свидетельствует повышенная масса надпочечников и повышенный уровень кортикостерона в крови. Таким образом, из полученных данных следует, что и при многократных судорожных припадках, и при хроническом воздействии стресса наблюдаются схожие изменения в работе периферческого звена ГГАКС: продолжительная активация надпочечников.
Мы показали, что аудиогенный киндлинг у крыс линии КМ не приводил к изменениям в возбуждающей глутаматергической и тормозной ГАМК-ергической иннервации тел нейронов ПВЯ гипоталамуса. При этом уровень кортиколиберина и вазопрессина в телах нейронов мелкоклеточной части ПВЯ гипоталамуса также не менялся. Однако аудиогенный киндлинг способствовал повышению содержания вазопрессина в наружной зоне срединного возвышения. По данным литературы известно, что накопление вазопрессина в наружной зоне срединного возвышения коррелирует с повышением его концентрации в портальном кровотоке (Verbalis et al., 1986). Таким образом, полученные нами данные о накоплении вазопрессина в наружной зоне срединного возвышения у эпилептизированных крыс линии КМ свидетельствуют о повышенной секреции нейрогормона в портальный кровоток. Кроме того, мы показали, что у крыс линии КМ вследствие аудиогенного киндлинга происходило понижение возбуждающей ГАМК-ергической иннервации аксонов нейронов ПВЯ гипоталамуса, что сопровождалось снижением содержания кортиколиберина в наружной зоне срединного возвышения. Пониженное содержание кортиколиберина в отростках на фоне не отличающегося содержания в телах нейронов может указывать на изменение секреции кортиколиберина в портальную систему кровотока вследствие снижения возбуждающей регуляции отростков, входящих в состав наружной зоны срединного возвышения. Снижение содержания активной формы транскрипционного фактора CREB в кортикотропоцитах аденогипофиза и снижение содержания ПОМК и АКТГ в аденогипофизе свидетельствует о торможении выведения кортиколиберина в портальный кровоток у крыс линии КМ вследствие аудиогенного киндлинга. При этом также было отмечено понижение содержания уровня SNAP25 в гипофизе, что, по-видимому, может также указывать на угнетение синтетических и секреторных функций кортикотропоцитов аденогипофиза. Таким образом, из полученных данных следует, что многократные аудиогенные судорожные припадки у крыс линии КМ способствуют снижению возбуждающей ГАМК-ергической иннервации, что приводит к понижению секреции кортиколиберина, которое, в свою очередь, приводит к понижению уровня траскрипции и трансляции ПОМК. Еще одним подтверждением снижения секреторной активности кортиколиберинергических нейронов является показанный нами пониженный уровень АКТГ в крови у крыс линии КМ после многократных судорожных припадков по сравнению с контролем. Таким образом, у крыс линии КМ после многократных судорожных припадков наблюдается снижение возбуждающей ГАМК-ергической иннервации отростков нейронов ПВЯ гипоталамуса, что сопряжено со снижением активности центральных звеньев ГГАКС.
Однако в ряде исследований показано, что в результате хронического стресса, происходит увеличение размера кортиколиберинергических нейронов вследствие повышения уровня мРНК кортиколиберина и содержания самого гормона в них (Chappell et al., 1986; Herman et al., 1995; Flak et al., 2009). Также было отмечено повышение экспрессии вазопрессина в нейронах мелкоклеточной части ПВЯ гипоталамуса (Ma et al., 1999). Показанные изменения экспрессии и содержания нейрогормонов авторы исследований связывают с повышением возбуждающей глутаматергической регуляции нейронов ПВЯ гипоталамуса, а также с ослаблением отрицательной обратной связи, что способствует повышению экспрессии кортиколиберина и вазопрессина и снижению деградации мРНК кортиколиберина соответственно (Makino et al., 1995; Ma et al., 2001; Flak et al., 2009; Franco et al., 2016). Различий в ГАМК-ергической иннервации тел и отростков нейронов ПВЯ гипоталамуса при хроническом стрессе выявлено не было (Flak et al., 2009). Интересно, что при хроническом стрессе наблюдаются несколько иные изменения также и в функциональной активности передней доли гипофиза, по сравнению с результатами, полученными нами на модели аудиогенного киндлинга. Так, показано, что в результате хронического стресса происходит повышение уровня мРНК ПОМК в аденогипофизе (Aguilera, 1994). При этом уровень АКТГ в крови не изменяется (Kant et al., 1987).
В отличие от полученных нами данных на модели аудиогенного киндлинга на модели электрического киндлинга эпилепсии было показано, что многократные электрические стимуляции амигдалы способствовали повышению уровня мРНК кортиколиберина в нейронах ПВЯ гипоталамуса (Smith et al., 1991). В исследовании Greenwood и соавторов были получены схожие результаты о повышении уровня мРНК кортиколиберина в нейронах ПВЯ гипоталамуса через 1 месяц после последней элктрической стимуляции амигдалы (Greenwood et al., 1997). Однако показанное повышение экспрессии кортиколиберина в экспериментах на модели электрического киндлинга может являться следствием непосредственно стимуляции амигдалы, которая, как показано (Herman et al., 2005) напрямую способствует активации нейронов ПВЯ гипоталамуса.
Таким образом, в отличие от данных, полученных на модели хронического стресса, вследствие многократных аудиогенных судорожных припадков не происходит изменений в возбуждающей глутаматергической иннервации, но наблюдается снижение возбуждающей ГАМК-ергической иннервации отростков нейронов ПВЯ гипоталамуса, что приводит к снижению активности центральных звеньев ГГАКС. По-видимому, показанные нами различия связаны с распространением эпилептиформной активности в мозге. Мы предполагаем, что снижению активности гипоталамуса и гипофиза у крыс линии КМ, предшествовала длительная активация ГГАКС в ходе аудиогенного киндлинга, о чем косвенно свидетельствует повышение массы надпочечников и повышенный уровень кортикостерона в крови. По-видимому, одной из причин истощения гипоталамуса и гипофиза у крыс линии КМ после многократных аудиогенных припадков может также являться повышенная чувствительность структур лимбической системы у этих крыс к кортикостерону. Известно, что повышенный уровень глюкокортикоидов способен оказывать отрицательное влияние на нейроны гиппокампа и вызывать их потерю (Sapolsky et al., 1985), что может способствовать дисфункции в активности нейрональной сети гиппокампа и его гипервозбудимости (Moghaddam et al., 1994).
Интересно что у крыс линии КМ с приобретенной устойчивостью к АСП мы не выявили различий в функциональной активности ни центральных, ни периферического звеньев ГГАКС. Таким образом, показанные данные могут свидетельствовать о том, что у эпилептизированных крыс линии КМ выявленные нами нарушения являются следствием аудиогенной судорожной активности, а не хронического акустического стресса. При этом отсутствие каких-либо нарушений в состоянии ГГАКС у крыс линии КМ с приобретенной устойчивостью к АСП указывает на привыкание этих животных к процедуре предъявления звуковых стимуляций в течение месяца, что объясняет отсутствие стрессорного ответа ГГАКС.
Таким образом, совокупность полученных нами данных указывает на то, что аудиогенный киндлинг приводит к пролонгированной активации периферического звена ГГАКС, при этом наблюдается истощение центральных звеньев ГГАКС у крыс линии КМ, о чем свидетельствует снижение возбуждающей ГАМК-ергической иннервации отростков нейронов ПВЯ гипоталамуса, снижение секреторной активности кортиколиберинергических нейронов и кортикотропоцитов передней доли гипофиза.