Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 22
1.1 Структура и функции Na/K-ATФазы 22
1.2 Na/K-АТФаза как специфический рецептор для кардиотонических стероидов 30
1.3 Подтипы эндогенных кардиотонических стероидов 33
1.4 Различная чувствительность Na/K-ATФазных изоформ к кардиотоническим стероидам 40
1.5 Стресс и кардиотонические стероиды 41
1.6 Расстройства настроения и активность Na/K-ATФазы 42
1.7 Этанол и нейротрансмиттерные системы 45
1.8 Абстиненция и зависимость 54
1.9 Алкогольная зависимость и Na/K-АТФаза 56
1.10 Новые терапевтические возможности 57
1.11 Модулирование оуабаин-зависимого рецепторного сайта Na/K-ATФазы 62
1.12 Современная лекарственная терапия алкогольной зависимости 63
Глава 2. Материалы и методы 71
2.1 Экспериментальные животные 71
2.2 Препараты 72
2.3 Измерение активности Na/K-АТФазы и концентраций биологически активных веществ 73
2.3.1 Методы определения активности Na/K-АТФазы в эритроцитах 73
2.3.2 Подготовка и определение активности Na/K-АТФазы в клетках почек 74
2.3.3 Методы определения концентраций маринобуфагенина и оуабаина в моче и плазме крови 75
2.3.4 Получение и очистка маринобуфагенина 76
2.3.5 Методы определения концентраций вазопрессина в плазме крови 76
2.3.6 Метод определения концентрации натрия в моче 77
2.4 Подготовка и проведение количественное определение экспрессии белка 78
2.4.1 Метод получения изолированных фибробластов сердца крыс 78
2.4.2 Вестерн-блот анализ (Western Blot Analysis, иммуноблоттинг) 79
2.4.3 Вестерн-блот анализ коллагена-1 80
2.4.4 Оценка синтеза коллагена по включениям (3Н)пролина 81
2.4.5 Определение активности протеинкиназы С дельта (ПКС) в ядре и цитозоле клеток 82
2.5 Методы поведенческой фармакологии 82
2.5.1 Методика свободного потребления алкоголя в двухбутылочном тесте 82
2.5.2 Методика рецидива, основанная на эффекте депривации от этанола 83
2.5.3 Метод оценки дискриминативных стимульных свойств «классических» опиатов 84
2.5.4 Оценка двигательной активности в экспериментальных боксах для автоматической регистрации локомоторной активности (актометр), как модель неподкрепляемого поведения 87
2.5.5 Оценка двигательной активности в беговом колесе (running wheel) как модель подкрепляемого поведения 88
2.5.6 Метод выработки и поддержания реакции свободного потребления этанола в оперантных камерах 88
2.5.7 Внутримозговая имплантация электродов у крыс 90
2.5.8 Процедура внутримозговой самостимуляции системы «награды» 91
2.5.9 Процедура неинвазивного измерения систолического артериального давления у крыс 93
2.6 Методы статистического анализа результатов 94
Глава 3. Результаты и их обсуждение 95
3.1 Спиронолактон и канренон являются конкурентами маринобуфагенина за связь с Na/K-АТФазой 95
3.1.1 Эффект маринобуфагенина на экспрессию коллагена в фибробластах сердца крыс 96
3.1.2 Эффект блокады Na/K-АТФазного «сигналинга» на МБГ-индуцированную экспрессию коллагена 97
3.1.3 Влияние канренона на способность МБГ ингибировать активность Na/K-АТФазы 99
3.1.4 Спиронолактон и канренон препятствуют развитию МБГ индуцированного фиброза 101
3.1.5 Влияние канренона на функциональное состояние МБГ-зависимой активности Na/K-АТФазы 106
3.1.6 Влияние канренона на активность эритроцитарной Na/K-АТФазы у больных ХПН 108
3.1.7 Обсуждение результатов 110
3.2. Стадия инициации и поддержания потребления алкоголя 116
3.2.1 Выработка и поддержание свободного потребления этанола в двухбутылочном тесте 117
3.2.1.1 Влияние спиронолактона на потребление этанола у крыс 118
3.2.1.2 Влияние канренона на потребление этанола у крыс 119
3.2.1.3 Влияние оуабаина на потребление этанола у крыс 121
3.2.2 Выявление индивидуальной чувствительности крыс к этанолу на фоне введения спиронолактона 122
3.2.3. Маринобуфагенин и индивидуальная чувствительность крыс к алкоголю 126
3.2.3.1. Корреляция между свободным употреблением алкоголя и исходной концентрацией МБГ в моче у крыс 126
3.2.3.2. Влияние спиронолактона на корреляцию между свободным употреблением алкоголя и экскрецией МБГ у крыс 128
3.2.4 Влияние модуляторов натриевого насоса на выработку и поддержание реакции свободного потребления этанола в оперантных камерах 130
3.2.5 Влияние спиронолактона на систолическое артериальное давление у алкоголизированных крыс 134
3.2.6 Влияние спиронолактона на активность Na/K-АТФазы у алкоголизированных крыс 136
3.2.7 Влияние введения СПН на экскрецию маринобуфагенина у крыс 138
3.2.8 Экскреция натрия на фоне потребления алкоголя и введения спиронолактона у крыс 142
3.2.9 Оценка влияния спиронолактона на локомоторную активность у крыс 147
3.2.9.1 Оценка локомоторной активности крыс в установке «актометр» на фоне введения спиронолактона 147
3.2.9.2 Оценка локомоторной активности на фоне введения спиронолактона в тесте «вращения колеса» (running wheel) у крыс 149
3.2.10 Исследование влияния канренона на дифференцировочные стимульные свойства морфина и буторфанола 151
3.2.11 Исследование влияние канренона на пороги реакции электрической самостимуляции головного мозга крыс 156
3.2.11.1 Влияние различных доз этанола на пороги электрической самостимуляции у крыс 156
3.2.11.2 Изучение влияния канренона на пороги самостимуляции 156
3.2.11.3 Изучение влияния канренона на вызванное этанолом снижение порогов самостимуляции 157
3.2.12 Выработка и поддержание свободного потребления 0,1% раствора сахарина в двухбутылочном тесте 159
3.2.13 Обсуждение результатов 161
3.3. Стадия повторной инициации потребления алкоголя (рецедив, “relapse”) 166
3.3.1 Оценка влияния спиронолактона на депривационный эффект алкоголя у крыс 166
3.3.2 Восстановление угашенной оперантной реакции, вызванной стимулами, ранее ассоциированными с предъявлением этанола 176
3.3.3 Обсуждение результатов 178
3.4. Стадия алкогольного абстинентного синдрома 182
3.4.1 Иммунобиохимические изменения при алкогольном абстинентном синдроме у крыс, методика форсированного введения 20% раствора этанола 182
3.4.2 Физиологические и биохимические показатели на фоне алкогольного абстинентного синдрома при свободном потреблении этанола у крыс 188
3.4.3 Влияние спиронолактона на физиологические и биохимические показатели на фоне алкогольного абстинентного синдрома у крыс 194
3.4.4 Выявление возможного взаимодействия МБГ и вазопрессина у крыс при алкогольном абстинентном синдроме 196
3.4.5 Биохимические и физиологические события при алкогольном абстинентном синдроме у пациетов с диагнозом хронический алкоголизм (пилотное исследование) 199
3.4.6 Обсуждение результатов 202
Заключение 207
Выводы 247
Список литературы 249
- Структура и функции Na/K-ATФазы
- Влияние канренона на способность МБГ ингибировать активность Na/K-АТФазы
- Оценка влияния спиронолактона на депривационный эффект алкоголя у крыс
- Обсуждение результатов
Структура и функции Na/K-ATФазы
Открытие натриевого насоса около 60 лет назад стало важным этапом в изучении клетки как основной единицы животного организма. Ещё более важным было то, что изучение натриевого насоса дало основу для понимания концепции клеточной мембраны, которая изолирует внутреннее содержимое клетки от внешнего окружения и/или от других клеток, расположенных рядом. Базируясь на основе асимметричного распределение ионов натрия и калия, научное сообщество было готово принять существование «субмикроскопических насосов, проходящих через клеточную мембрану», которые могли бы активно участвовать в «тонкой настройке» трансмембранных ионных градиентов в соответствии с физиологическими потребностями клетки [55]. Открытие натриевого насоса, как правило, приписывают Skou J. [56] с его экспериментами на гомогенате нерва краба. Эти эксперименты наглядно продемонстрировали существование белковой структуры, встроенной в клеточную мембрану, которая перекачивает ионы натрия за пределы клетки, а ионы калия внутрь клетки, и, таким образом, превращает химическую энергию в работу. Стоит отметить, что это открытие стало возможным благодаря существованию оуабаина, специфического ингибитора натриевого насоса стероидной природы, растительного происхождения, который впоследствии оказался идентичен одному из эндогенных ингибиторов деятельности натриевого насоса у млекопитающих [37, 57].
Натриевый насос или Na/K-АТФаза [(Na/K)-стимулированная аденозинтрифосфатаза; EC 3.6.3.9], является активной транспортной системой ионов натрия и калия, которая представлена в эукариотических клетках. Данный фермент относится к классу Р-типа АТФаз, встроенных в мембрану белков, и отвечает за поддержание низкого соотношения между ионами натрия и калия при помощи активного транспорта этих ионов через плазматическую мембрану посредством гидролиза АТФ, который даёт необходимую энергию [58]. Na/K-АТФаза контролирует множество важных клеточных функций. Например, поддержание мембранного электрического потенциала, необходимого для проведения нервного импульса и сокращения мышечного волокна, возбудимости и многих других клеточных функций, которые зависят от наличия натрий-калиевого градиента [59]. Существование данного фермента является критическим для выживания организма. Это продемонстрировал эксперимент, в котором нокаутные мыши (по -1 или по -2 изоформы) оказались нежизнеспособны (Lingrel, 1997, цитата по неопубликованным данным) [60]. Натриевый насос также принимает участие в активации и работе вторичных ко- и противотранспортёров, которые связаны с градиентом экстрацеллюлярного и интрацеллюлярного натрия, таких как Na/Са-обменник [61]. И поэтому можно логически предположить, что Na/K-ATФаза, активирующаяся через гидролиз АТФ, определяется в различных процессах, протекающих в клетке [62].
Na/K-ATФаза существует в двух полипептидных равномолярных соотношениях: альфа каталитическая субъединица с молекулярной массой (Mr) около 110 kDa и гликозилированной бета гликопротеиновой субъединицы с Mr 31,5 kDa. Альфа-субъединица имеет 10 трансмембранных сегментов. Они содержат сайт связывания для ионов натрия и кардиостероидов на экстрацеллюлярном сегменте и сайт связывания для ионов калия и АТФ на интрацеллюлярных петлях. Asp369, в частности, имеет решающее значение для связывания фосфатной группы, что является важным сайтом связывания для гидролиза АТФ [59]. Ещё два остатка, Lys501 and Asp586, могут также участвовать в связывании АТФ [63] (рисунок 1). Регулирующая бета-субъединица является трансмембранным белком с гликолизирующим сайтом, который контролирует активность Na/K-ATФазы [62].
В настоящее время считается, что альфа-бета комплекс формирует функциональную димерическую единицу натриевого насоса. Эти димеры могут также организовывать тетрамеры или, возможно, стеки в лентах [64]. В соответствии с моделью Альбертса-Поста Na/K-ATФаза «выкачивает» ионы натрия из клетки наружу, в то время как движение ионов калия имеет противоположное направление, вместе они двигаются против градиента концентраций в энергетическизависимом процессе. -субъединица в присутствии ионов натрия и магния фосфорилируется АТФ, что приводит к окклюзии трёх цитозольных ионов натрия. Эта высокоэнергетическая Е1Р форма фермента загружает ионы натрия с последующей конформацией в низкоэнергетическую форму Е2Р. Когда сайт связывания для катионов натрия соприкасается с экстрацеллюлярной средой, ионы натрия высвобождаются, и в присутствии ионов калия Е2Р форма дефосфорилируется. Дефосфорилирование приводит к окклюзии двух ионов калия на специфическом сайте связывания. Захват ионов калия приводит к переходу Е2 формы к Е1, который ускоряется АТФ. Этот переход приводит к выходу ионов калия во внутрицеллюлярное пространство. Затем Е1 форма энзима со связанным АТФ повторяет цикл [65-67].
Семь дополнительных трансмембранных белков, которые локализованы совместно с - комплексом, были идентифицированы, их последовательность (FXYD) расшифрована [68]. Один из этих белков (FXYD2) также известен как гамма субъединица, имеет Mr 7,3 kDa и обладает высокой степенью межвидовой гомологичности [62]. Эти белки, которые ассоциированы с Na/K-АТФазой, включая и гамма-субъединицу, сами по себе не интегрированы в натриевый насос. Однако они ассоциированы со специфическим доменом альфа-бета комплекса и модулируют каталитические свойства Na/K-ATФазы [69-71].
На сегодняшний день известны четыре -(1,2,3,4) и три -(1,2,3) изоформы Na/K-ATФазы. Такое количество изоформ приводит к многочисленным комбинациям - комплексов в различных тканях, с различными характеристиками, включая специфическую дифференциацию к различным кардиостероидам [72].
Факт существования Na/K-АТФазных изоферментов был выявлен в результате экспериментов, в которых анализировалась чувствительность натриевого насоса грызунов к препаратам дигиталиса. Было показано, что кривые угнетения Na/K-ATФазы в мозге мыши оуабаином имеют гетерогенный характер в диапазоне Ki от низкого значения (0,1 мкмоль) в ткани мозга до высокого (100 мкмоль) в почечной ткани аффинного связывания. Это указывало на угнетение, которое происходило на уровне нескольких мест связывания [73]. Структурное доказательство гетерогенности натриевого насоса было найдено у морской креветки, у которой -субъединица могла быть разделена на две отличные друг от друга формы в додецил-сульфат-SDS-полиакриламидном геле [74], а позже и у млекопитающих [75].
Первая демонстрация изоформ Na/K-ATФазы у млекопитающих была выполнена Sweadner K. в 1979 году [75], которая нашла две формы -субъединицы, почечной альфа формы и мозговой формы, которая была названа альфой+. Эта новая каталитическая субъединица фермента показала более высокую чувствительность к оуабаину [75]. Впоследствии мозговую альфа+ изоформу, которая высокочувствительна к оуабаину, переименовали к –3 изоформу. Было предположено, что структурные различия в NH2 концевой терминали альфы и альфы+ имеют генетическую основу [62, 76]. На сегодняшний день четыре гена у человека осуществляют контроль над четырьмя -изоформами, три гена контроль над тремя -изоформами, и семь генов за FXYD пептидами [77-80].
Влияние канренона на способность МБГ ингибировать активность Na/K-АТФазы
Учитывая то, что калийсберегающий диуретик спиронолактон (СПН) и его активный метаболит канренон способны купировать интоксикацию препаратом сердечного гликозида, дигоксина [48, 50], а также способность канренона ингибировать активность Na/K-АТФазы на участках связывания оуабаина [52], была высказана гипотеза о том, что существует взаимосвязь между Na/K-АТФазой, ее эндогенными лигандами и СПН/канреноном, которая может заключаться в конкуренции СПН или канренона за связь с Na/K-АТФазой к МБГ.
Для оценки конкурирующего действия канренона к МБГ за связь с Na/K-АТФазой были проведены опыты in vitro на мембранах клеток наружного мозгового слоя почек крыс. На рисунке 14 (А, Б) приведены данные, иллюстрирующие действие канренона на ингибирование Na/K-АТФазы МБГ. В культуре клеток наружной зоны мозгового слоя почек крыс МБГ доза зависимо ингибировал Na/K-АТФазу, а добавление канренона в концентрации 10 мкМ в инкубационную среду заметно восстанавливало пониженную чувствительность Na/K-АТФазы к ингибиторному действию МБГ (IC50 = 1,9 ± 0,5 мкМ и 113,0 ± 11,0 мкМ, соответственно, р 0,01, критерий Бонферрони, ANOVA с повторными измерениями, рисунок 14, А). Поскольку активность эритроцитарной Na/K-АТФазы может быть маркером активности свободно циркулирующего МБГ [128, 416], в следующей серии экспериментов in vitro в эритроцитах крыс был оценен блокирующий эффект МБГ на активность Na/K-АТФазы в отсутствие и в присутствии канренона в концентрации 10 мкМ. Как показано на рисунке 14, Б, добавление одного канренона не изменяло активность Na/K-АТФазы (р 0,05, критерий Бонферрони, ANOVA), тогда как при сочетанном добавлении с МБГ препятствовало ингибиторному действию МБГ (р 0,01, критерий Бонферрони, ANOVA).
Таким образом, было показано, что канренон в концентрации 10 мкМ восстанавливает активность Na/K-АТФазы, которая в эритроцитах и клетках наружного мозгового слоя почек крыс была предварительно снижена добавлением МБГ в концентрации 1 нМ.
Оценка влияния спиронолактона на депривационный эффект алкоголя у крыс
Алкогольная зависимость является хроническим заболеванием с повторяющимися эпизодами неконтролируемого потребления алкоголя, ярко выраженным компульсивным поведением, нацеленным на поиск и потребление алкоголя, характеризуется неспособностью остаться в фазе ремиссии [475, 476]. И, как следствие, воздержание от употребления алкоголя является важной задачей терапии алкоголизма. Но, к сожалению, еще недостаточное понимание всего комплекса факторов, влияющих на риск рецидива, не всегда делает это лечение успешным [477].
Согласно исследованиям Le A. и Shaham Y. в 2002 году [478], основными моделями изучения алкогольного рецидивирования у крыс являются модель, основанная на депривационном эффекте алкоголя при свободном потреблении, и модель восстановления ранее угашенной реакции на фоне предоставления стимулов, ассоциированных с потреблением этанола (reinstatement) при оперантном поведении.
Выработку парадигмы свободного потребления этанола проводили в течение 4 х недель при помощи двухбутылочного теста (рисунок 51), подробно изложенного в разделе 2.5.1. Крыс, которые употребляли меньше 1,5 г/кг в день, были исключены из исследования. Каждая экспериментальная группа подвергалась двум депривационным процедурам. Депривационный эпизод состоит из 4-х фаз:
1) исходный уровень (продолжительностью 7 дней свободного потребления этанола);
2) собственно депривационный период (продолжительностью 2 недели с изъятием бутылок с алкоголем);
3) пост-депривационная фаза (продолжительностью 7 дней со свободным доступом к алкоголю);
4) фаза отдыха (продолжительностью не менее 4-х недель).
Перед оценкой каких-либо веществ, способных влиять на депривационный эффект этанола, необходимо было стандартизировать данный метод с учётом критериев предиктивной валидности. В течение 7 дней свободного потребления алкоголя (1 фаза) производился подсчет исходного уровня употребления этанола. Затем этанол в бутылках был заменен на питьевую воду. Через 2 недели одна из бутылок была наполнена 9% этанолом. Подсчет выпитого алкоголя производился ежедневно. Было показано, что возвращение этанола ранее алкоголизированным крысам после 2-недельного перерыва достоверно увеличивал объем выпитого этанола F2,578;30,93=12,8; р 0,001 (однофакторный дисперсионный анализ в повторными измерениями и поправкой Гринхауза-Гессера (one-way ANOAVA with repeated measures with the Greenhouse-Geisser correction). Последующее межгрупповое сравнение (post hoc analysis) подтвердило увеличение употребления этанола в первый день возвращения алкоголя (р=0,0001, критерий Даннетта, рисунок 51) по сравнению с исходным уровнем. Данное наблюдение доказывает, что этанол обладает депривационным эффектом, который был воспроизведен в условиях эксперимента.
Далее были проведены опыты по оценке влияния СПН на депривационный эффект этанола у крыс линии Wistar. Каждое экспериментальное животное за 2 дня до возвращения бутылок с алкоголем начинало получать одну дозу СПН (50 мг/кг или 100 мг/кг) или растворитель по методу стандартного латинского квадрата 3-го порядка с циклической схемой сдвига. Продолжительность введения СПН составляла 5 дней.
На рисунке 52 показано, что на фоне введения СПН выраженность депривационного эффекта достоверно изменялась (F2,47=7,0; р=0,002, двухфакторный дисперсионный анализ с повторными измерениями). Последующие межгрупповые сравнения подтвердили снижение выраженности депривационного эффекта этанола после введения дозы 100 мг/кг как в первый, так и во второй день рецидива (р=0,002 и р=0,004, соответственно, критерий Бонферрони, рисунок 52). Введение меньшей дозы (50 мг/кг) имело менее выраженное действие, достоверный эффект наблюдался только на второй день после возврата алкоголя крысам (р=0,03, критерий Бонферрони, рисунок 52).
Для доказательства селективного действия СПН на выраженность депривационного эффекта этанола были проведены опыты с внутрибрюшинным введением оуабаина в дозах 0,33 мг/кг и 0,56 мг/кг. Было показано, что блокада -3 изоформы натриевого насоса не влияет на выраженность депривационного эффекта алкоголя (F2,22=1,86; р=0,18, двухфакторный дисперсионный анализ с повторными измерениями, рисунок 53).
Данные представлены в виде средних значений и ошибки среднего (М±S.E.M.). n=9. Примечания:
1) «Исх. ур.» - исходный, средний уровень потребления 9% этанола на 1 неделю до отмены этанола;
2) «ОУ» - оуабаин;
3) «1-2» – дни после возвращения бутылок с 9% раствором этанола.
Для оценки алкогольного депривационного эффекта у крыс с различной степенью предпочтения к алкоголю проведены эксперименты, где перед фазой депривации все животные были разделены на группы в зависимости от количества ежедневного потребления этанола: многопьющие, с ежедневным потребление этанола 4 г/кг, n=25, и малопьющие, с ежедневным потребление этанола 1,5 – 4 г/кг, n=25. Крыс, которые потребляли меньше 1,5 г/кг в день, были исключены из эксперимента (n=15).
На рисунке 54 представлен результат депривационного эффекта алкоголя у многопьющих алкоголь животных (F2,78;33,36=3,7; р=0,02, однофакторный дисперсионный анализ с повторными измерениями и поправкой Гринхауза-Гессера). Последующий межгрупповой анализ показал достоверное увеличение потребления алкоголя в первый день по сравнению с исходным уровнем (р=0,03, критерий Даннетта, рисунок 54). У малопьющих животных депривационный эффект был более выражен (F2,529;27,82=13,9; р 0,0001, ANOVA с повторными измерениями и поправкой Гринхауза-Гессера). Последующий межгрупповой анализ показал достоверное увеличение потребления алкоголя в первый день по сравнению с исходным уровнем (р=0,0001, критерий Даннетта, рисунок 54). Проведенные эксперименты доказывают наличие депривационного эффекта этанола, как у много-, так и у малопьющих экспериментальных животных. Обращает на себя внимание то, что у малопьющих животных выраженность депривационного эффекта в первый день была существенно выше по сравнению с эффектом у многопьющих.
Обсуждение результатов
ААС является важным доказательством развития физической зависимости от этанола [482]. Несмотря на то, что симптомы ААС хорошо описаны у человека [506] и грызунов [507], вовлеченность различных систем в патологические процессы, лежащие в основе развития синдрома отмены, остаются недостаточно изучены.
Наиболее значимые исследования нейроадаптационных механизмов, лежащих в основе алкогольного абстинентного синдрома, стали возможны только в начале 70-х годов, когда были разработаны модели физической зависимости и синдрома отмены алкоголя у лабораторных животных [508]. До этого доклинические исследования были сосредоточены на оценке предпочтения алкоголя у лабораторных животных, потреблявших алкоголь добровольно.
Из-за ограниченного потребления алкоголя и быстрой элиминации алкоголя из кровотока, такие модели редко воспроизводили абстинентный синдром.
Следовательно, любые полученные нейрохимические находки не могли быть связаны с тяжестью или продолжительностью синдрома отмены. Ключом к успеху в развитии адекватных моделей оказалось использование «принудительного» или форсированного введения алкоголя.
Например, некоторые модели характеризуются тем, что животные получают доступ только к жидкой диете, содержащей алкоголь, другие модели характеризуются постоянным пребыванием экспериментального животного в изолированной камере, куда непрерывно подаются пары спирта, обеспечивая тем самым непрерывную интоксикацию, или многоразовые внутрижелудочные инъекции раствора этанола. Однако очевидным недостатком этих моделей является то, что нейрохимические эффекты при самовведении алкоголя, например, изменения в передний части мозга выхода дофамина, игнорируются [509]. Тем не менее, модели форсированного питья или введения этанола предоставляют ценные данные о нейрохимических изменениях, которые сопровождают развитие физиологической зависимости от алкоголя. В свою очередь, многие из изменений биохимических реакций в мозге дают достаточно убедительные объяснения физических изменений, которые происходят во время синдрома отмены [510].
Известно, что у алкоголиков абстинентный синдром сопровождается повышением систолического артериального давления и задержка натрия в почках [511]. Учитывая то, что МБГ является натрийуретическим гормоном и вазоконстриктором [128, 512], а также тот факт, что этот гормон обладает антиалкогольным эффектом [43-45], можно предположить, что МБГ вовлечен в повышение САД на фоне отмены этанола.
Чтобы подтвердить экспериментально эту гипотезу, была проведена серия экспериментов. На фоне форсированного введения 20% раствора этанола у крыс линии Sprague-Dawley не наблюдалось увеличения САД, экскреции натрия и маринобуфагенина, изменения гематокрита и активности Na/К-АТФазы.
Абстинентный синдром у этих крыс сопровождался увеличением САД на 20 мм рт. ст, задержкой выведения натрия и увеличением объема циркулирующей жидкости (снижением гематокрита), экскрецией МБГ, которая возрастала в 3,5 раза на 2-й день абстиненции, без существенных изменений экскреции эндогенного ОУ, что подтверждается другими исследованиями, где было показано, что ОУ не чувствителен к увеличению объема крови [494]. Однако предварительное внутривенное введение моноклональных антител (3Е9) против МБГ препятствовало подъёму САД после отмены этанола.
Тот факт, что у экспериментальных животных предварительное введение моноклональных антител против МБГ (3Е9) снижало прессорный эффект, вызванный синдромом отмены, говорит о том, что МБГ является не только маркером, но и выступает как медиатор гипертензии, вызванной алкогольной абстиненцией.
Известно, что ААС характеризуется поведенческим стрессом, который ассоциирован с депрессией и страхом [495]. Также довольно широко известно, что активность и экспрессия Na/K-АТФазы в головном мозгу и уровень её эндогенных лигандов (кардиотонических стероидов), вовлечены в механизмы поведенческого стресса, расстройства настроения и депрессию [204, 205, 208, 513].
Учитывая также то, что методика форсированного питья 20% этанола может не отражать поведенческих механизмов возникновения и развития алкоголизма, была проведена серия экспериментов, где алкогольная зависимость формировалась путем свободного выбора между 9% раствором этанола и водой. Затем, вызванный ААС характеризовался также значительным поднятием САД, достоверным повышением активности Na/K-АТФазы в эритроцитах крыс по сравнению с показателями во время свободного употребления алкоголя, увеличением экскреции МБГ при максимуме на 2-й день абстиненции и задержкой натрия во второй день синдрома. Аналогичные данные были получены при форсированном питье. Также на фоне синдрома отмены в 13 раз увеличивалось потребление воды, а иммунизация моноклональными антителами против МБГ достоверно снижала данное увеличение.
Интересны данные, полученные при введении СПН на фоне острого ААС. Так, введение СПН в дозе 100 мг/кг сопровождалось трехкратным увеличением экскреции МБГ и натрия с двухкратным снижением активности Na/K-АТФазы.
Таким образом, в поведенческих опытах было доказано, что СПН помимо его антагонизма к альдостерону является конкурентом к МБГ за связь с Na/K-АТФазой. Также интересным остается тот факт, что на фоне ААС происходит снижение активности Na/K-АТФазы после введения СПН, которое ассоциируется с повышением экскреции натрийуретического гормона – МБГ и натрия и отсутствием изменений САД.
Для выявления одного из возможных механизмов, лежащего в основе патогенеза ААС, у крыс линии Sprague-Dawley был проанализирован вклад вазопрессина как гормона, регулирующего ионно-водный баланс. Было показано, что синдром отмены у алкоголизированных крыс сопровождался трехкратным увеличением уровня вазопрессина в плазме крови по сравнению с показателями при регулярном употреблении этанола и более пятикратным увеличением по сравнению с показателями у интактных крыс. На фоне предварительного введения животным моноклональных антител против МБГ, происходило снижение вазопрессина в плазме крови на 30%. Для проверки данного факта и с целью показать специфическое взаимодействие между МБГ и вазопрессином при других условиях, исключающих воздействие этанола на концентрацию вазопрессина, проведен эксперимент, где было показано, что у крыс соль-чувствительной линии Dahl-S на фоне нагрузки 20% раствором натрия хлорида (0,8 г/кг, в/б) уровень вазопрессина в крови возрастал в 4 раза, однако, предварительное введение антитела к МБГ блокировали данное повышение уровня вазопрессина.