Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1 Катехоламинергическая система мозга 10
1.1.1 Топография катехоламинергических нейронов 10
1.1.2 Метаболизм катехоламинов: синтез и деградация 12
1.1.3 Выделение и обратный захват катехоламинов 15
1.1.4 Рецепторы катехоламинов 16
1.2 Тубероинфундибулярная катехоламинергическая система 17
1.2.1 Морфология тубероинфундибулярной катехоламинергической системы 17
1.2.2 Моноферментные нейроны в тубероинфундибулярной катехоламинергической системе 19
1.2.3 Моноферментные нейроны в других отделах мозга 20
1.2.4 Роль моноферментных нейронов в механизмах пластичности мозга 21
1.3 Секреция пролактина лактотрофами гипофиза 22
1.3.1 Морфология лактотрофов 23
1.3.2 Ген, структура и функции пролактина 23
1.3.3 Регуляция секреции пролактина лактотрофами гипофиза 25
1.4 Синдром гиперпролактинемии 30
1.4.1 Экспериментальные модели гиперпролактинемии 31
1.4.2 Гиперплазия лактотрофов 33
1.4.3 Современные методы лечения гиперпролактинемии и пролактином 35
ГЛАВА 2. Материалы и методы 37
2.1 Животные 37
2.2 Эксперименты и подготовка материала 38
2.2.1. Инъекции 6-гидроксидофамина и десметилимипрамина 38
2.2.2 Инъекции бромдезоксиуридина 40
2.3 Проточная инкубация слайсов медиобазального гипоталамуса и черной субстанции 40
2.3.1 Инкубация слайсов медиобазального гипоталамуса и черной субстанции с L-лейцином 41
2.3.2 Инкубация слайсов медиобазального гипоталамуса и черной субстанции с L-лейцином и толкапоном 42
2.3.3 Инкубация слайсов медиобазального гипоталамуса на 14-й и 45-й день после стереотаксических инъекций 43
2.4 Высокоэффективная жидкостная хроматография с электрохимической детекцией 44
2.5 Иммуногистохимия
2.5.1 Пероксидазное моноиммумечение пролактина в гипофизе крыс 45
2.5.2 Флуоресцентное двойное иммуномечение пролактина и бромдезоксиуридина
в гипофизе крыс 46
2.6 Микроскопия и анализ изображений 47
2.7 Статистическая обработка результатов 47
ГЛАВА 3. Результаты 49
3.1 Содержание дофамина и L-диоксифенилаланина в слайсах медиобазального гипоталамуса и черной субстанции и в среде после проточной инкубации с L-лейцином и толкапоном у крыс в норме 49
3.1.1 Медиобазальный гипоталамус 49
3.1.2 Черная субстанция 50
3.2 Содержание дофамина, L-диоксифенилаланина и норадреналина в слайсах медиобазального гипоталамуса и в инкубационной среде у крыс на 14-й и 45-й день после введения 6-гидроксидофамина и введения 6-гидроксидофамина после предварительного внутрибрюшинного введения десметилимипрамина 52
3.2.1 Содержание дофамина, L-диоксифенилаланина и норадреналина в неинкубированных слайсах медиобазального гипоталамуса 52
3.2.2 Содержание дофамина, L-диоксифенилаланина и норадреналина в слайсах медиобазального гипоталамуса и в среде после проточной инкубации с L-лейцином 54
3.2.3 Индекс синтеза дофамина в инкубированных слайсах медиобазального гипоталамуса
3.3 Зональность и пролиферация лактотрофов в гипофизе крыс 66
3.3.1 Зональность распределения лактотрофов в передней доле гипофиза интактных крыс66 3.3.2 Пролиферация лактотрофов передней доли гипофиза 69
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 75
4.1 Кооперативный синтез дофамина моноферментными нейронами у крыс в норме 75
4.2 Кооперативный синтез дофамина моноферментными нейронами у крыс при нейродегенерации
4.2.1 Использованные модели дефицита катехоламинов 78
4.2.2 Кооперативный синтез дофамина в тубероинфундибулярной системе у крыс как компенсаторный механизм при нейродегенерации 80
4.2.3 Влияние норадреналина на кооперативный синтез дофамина 82
4.3 Влияние катехоламинов на пролиферацию лактотрофов гипофиза при нейродегенерации Заключение 87
Выводы 88
Cписок сокращений 89
Список литературы 90
- Метаболизм катехоламинов: синтез и деградация
- Инъекции бромдезоксиуридина
- Содержание дофамина, L-диоксифенилаланина и норадреналина в слайсах медиобазального гипоталамуса и в инкубационной среде у крыс на 14-й и 45-й день после введения 6-гидроксидофамина и введения 6-гидроксидофамина после предварительного внутрибрюшинного введения десметилимипрамина
- Кооперативный синтез дофамина в тубероинфундибулярной системе у крыс как компенсаторный механизм при нейродегенерации
Метаболизм катехоламинов: синтез и деградация
Рецепторы ДА являются членами семейства рецепторов, связанных с G-белками. Различают пять основных подтипов рецепторов ДА: Д1, Д2, Д3, Д4 и Д5. Все пять подтипов рецепторов гомологичны и имеют 7 трансмембранных доменов. По молекулярному строению рецепторы ДА подразделяются на два основных типа. К первому типу (Д1-подобные рецепторы) относятся Д1- и Д5-рецепторы, ко второму (Д2-подобные рецепторы) относятся Д2-, Д3- и Д4-рецепторы [Ben-Jonathan and Hnasko, 2001]. Связываясь с Д1 и Д5 рецепторами, ДА оказывает стимулирующие действие на аденилатциклазу, а с Д2, Д3 и Д4 рецепторами – ингибирующие.
Высокий уровень экспрессии генов Д2-рецепторов обнаружен в черной субстанции, вентральной области покрышки и гиппокампе. В миндалине обнаружены в основном Д1- рецепторы. Оба типа рецепторов высоко экспрессируются в хвостатом ядре, прилежащем ядре и обонятельных луковицах [Mansour et al., 1992]. В гипоталамусе обнаружена умеренная экспрессия генов Д1- и Д2-рецепторов и низкая экспрессия генов Д4- и Д5-рецепторов. В передней и промежуточной доле гипофиза обнаружена высокая экспрессия гена Д2-рецепторов. Более низкая экспрессия гена Д2-рецепторов обнаружена в надпочечниках и сетчатки глаза [OConnell, 1996]. Таким образом, Д1- и Д2-рецепторы широко распространены по всему организму [Missale et al., 1998]. Адренорецепторы
Рецепторы НА и адреналина также являются членами семейства рецепторов, связанных с G-белками. У млекопитающих различают следующие типы адренорецепторов: -1-, -2-и -адренорецепторы, имеющие 7 трансмембранных доменов. На основе их аминокислотных последовательностей, биологических и фармакологических свойств, каждый из этих типов был разделен еще на три подтипа [Bylund et al., 1992]. Все девять подтипов адренорецепторов кодируются различными генами, но имеют относительно высокую степень идентичности аминокислот [Xhaard et al., 2006].
Все подтипы адренорецепторов были обнаружены в мозге млекопитающих и на периферии. С помощью методов радиоавтографии и гибридизации in situ было показано распределение подтипов адренорецепторов в мозге. Высокий уровень экспрессии генов -1-адренорецепторов обнаружен в обонятельных луковицах, зоне инсенрта, вентральной зубчатой извилине, вентромедиальном гипоталамусе, таламусе, гипокампе, миндалине и стволе [McCune et al., 1993]. Высокая экспрессия генов -1-адренорецепторов обнаружена в областях гипоталамуса, оказывающих влияние на функцию гипофиза – паравентрикулярном и супраоптическом ядрах, а также в СВ [McCune et al., 1993; Sands and Morilak, 1999]. Также -2-адренорецепторы экспрессируются в стриатуме, таламусе, гипоталамусе, миндалине, прилежащем ядре, черной субстанции [Boyajian et al., 1987]. Высокая экспрессия гена -адренорецепторов наблюдается в обонятельном ядре, церебральной коре, обонятельных луковицах, таламусе, коре мозжечка, бледном шаре, черной субстанции [Nicholas et al., 1993].
Тубероинфундибулярная система гипоталамуса включает ДА-синтезирующие нейроны АЯ, проецирующие аксоны в СВ [Bjrklund and Nobin, 1973] (рисунок 5). СВ – срединное возвышение.
В АЯ содержится множество нейронов, синтезирующих ряд физиологически активных веществ, таких как ДА, соматолиберин, меланоцитстимулирующий гормон, -эндорфин, нейропептид Y, адренокортикотропный гормон, энкефалины, динорфин, субстанция Р, галанин, нейротензин и ГАМК [Everitt et al., 1986; Everitt et al., 1992].
Аксоны ДА-ергических нейронов тубероинфундибулярной системы гипоталамуса оканчиваются в наружной зоне СВ, где ДА выделяется в капилляры первичного сплетения и по портальным венам переносится к передней доле гипофиза, оказывая ингибирующие влияние на секрецию пролактина (ПРЛ) [McCann et al., 1984; Daikoku et al., 1986]. Из этих аксонов происходит выделение ДА в ответ на деполяризацию мембраны, но в отличие от классических ДА-ергических нейронов, отсутствует высокоаффинный обратный захват ДА [Demarest and Moore, 1979]. Поскольку ДА в тубероинфундибулярной системе не высвобождается непосредственно в синапсах, а выводится в портальный кровоток, было высказано мнение, что обратный захват не является физиологически важным в нейронах данной области [Demarest and Moore, 1979].
В АЯ обнаружены достаточно высокие уровни НА. НА-ергические аксоны проецируются в АЯ из голубого пятна моста и в меньшей степени из продолговатого мозга. Пронизывая АЯ, аксоны НА-ергических нейронов оканчиваются на СВ [Jonsson et al., 1972; Bjrklund et al., 1973; Lindval and Bjrklund, 1974; Palkovits et al., 1980, 1986; Hoffman et al., 1986; Leshin et al., 1996]. 1.2.2 Моноферментные нейроны в тубероинфундибулярной катехоламинергической системе ДА - ергические нейроны характеризуются наличием двух ферментов синтеза ДА - ТГ, превращающий L-тирозин в L-ДОФА, и ДАА, превращающий L-ДОФА в ДА [Dahlstrm,1964; Bjrklund and Lindvall 1984; Hkfelt et al., 1984]. В 80-е годы впервые удалось выявить нейроны, содержащие только по одному из ферментов - ТГ или ДАА, и, следовательно, не являющиеся ДА-ергическими [Meister et al., 1988; Okamura et al., 1988; Kitahama et al., 1990; Zoli et al. 1993].
АЯ у крыс подразделяют на вентролатеральную и дорсомедиальную области (рисунок 6). В дорсомедиальной области АЯ иммуноцитохимически выявлены нейроны, содержащие ТГ [Okamura et al., 1988; Zoli et al. 1993], и нейроны, содержащие ДАА [Okamura et al., 1988а]. Почти все нейроны дорсомедиальной области, содержащие ТГ, содержат одновременно и ДА [Zoli et al. 1993]. Нейроны, содержащие второй фермент синтеза ДА – ДАА локализованы исключительно в дорсомедиальной области АЯ [Okamura et al., 1988b; Ershov et al., 2002a,b]. Таким образом, нейроны дорсомедиальной области АЯ можно считать ДА-ергическими, поскольку они содержат оба фермента, необходимых для синтеза ДА – ТГ и ДАА, и синтезируют ДА.
В вентролатеральной области АЯ выявлены нейроны, содержащие ТГ [Okamura et al., 1988], однако содержание ТГ в них ниже, чем в нейронах дорсомедиальной области АЯ [Daikoku et al.,1986]. Анализ ростро-каудального распределения нейронов, содержащих ТГ, в этой области показал, что их количество увеличивается в каудальном направлении [Zoli et al., 1993]. Только единичные нейроны, содержащие ДАА, были выявлены в вентролатеральной области АЯ [Okamura et al., 1988; Ershov et al., 2002a,b]. ДА также практически не обнаруживается в данной области [Borisova et al., 1991; Zoli et al., 1993], однако, иммуноцитохимически там были выявлены нейроны, содержащие промежуточный продукт синтеза ДА - L-ДОФА [Okamura et al., 1988]. Таким образом, в вентролатеральной области АЯ нейроны, содержащие ТГ, не являются ДА-ергическими. У взрослых крыс такие моноферментные нейроны составляют порядка 50% от всех нейронов, экспрессирующих ферменты синтеза ДА [Ershov et al., 2002а], а в пренатальном периоде моноферментные нейроны составляют 99% [Balan et al., 2000].
По литературным данным нейроны вентролатеральной области, содержащие ТГ, способны синтезировать ряд физиологически активных веществ, таких как ГАМК [Meister and Hokfelt, 1988] и пептидов – соматолиберина [Okamura et al., 1985; Meister et al., 1986; Zoli et al., 1993], галанина, нейротензина [Melander, 1986].
Инъекции бромдезоксиуридина
На пролиферацию лактотрофов влияют 3 основных фактора: 1) гормоны, выделяемые периферическими эндокринными железами, 2) вещества, вырабатываемые гипоталамическими нейронами, поступающие в гипофиз через портальную систему циркуляции, 3) внутригипофизарные ростовые факторы, влияющие аутокрино или паракрино [Ezzat, 2001]. ДА играет значительную роль не только в регуляции секреции ПРЛ, но и в пролиферации лактотрофов. Эта роль доказана в экспериментах как in vitro на культуре клеток гипофиза [Ishida et al. 2007], так и в экспериментах in vivo при подавлении эстрадиол-индуцированной пролиферации лактотрофов [Borgundvaag et al. 1992]. При увеличении уровня ДА у мышей, нокаутных по мембранному транспортеру ДА, наблюдается острое снижение пролиферации лактотрофов в постнатальном периоде, что ведет к резкому сокращению числа лактотрофов к возрасту 8-ми недель [Bosse et al. 1997]. В отличие от этого, у мышей с нокаутом гена Д2- рецепторов проявляется существенная гиперплазия лактотрофов [Kelly et al. 1997, Saiardi et al. 1997], что приводит к образованию пролактином. Этот эффект усугубляется с возрастом и чаще встречается у самок, чем у самцов [Saiardi et al. 1997, Asa et al. 1999]. Более выраженная гиперплазия лактотрофов и более быстрое развитие опухоли гипофиза у самок может происходить за счет прямого действия эстрадиола, являющегося сильным стимулятором секреции ПРЛ и пролиферации лактотрофов. Так, после гонадоэктомии показано уменьшение гиперплазии лакотрофов и формирования опухоли у мышей, с нокаутом гена Д2-рецепторов [Hentges and Low, 2002].
Помимо антипролиферативного действия, ДА может индуцировать апоптоз лактотрофов в передней доле гипофиза. ДА индуцирует апоптоз путем активации митоген-активируемой протеинкиназы [Junn and Mouradian,2001; Radl et al., 2008; Radl et al., 2011], причем в основном через короткую изоформу Д2-рецепторов [Radl et al., 2011]. Интересно, что ДА-индуцированный апоптоз происходит только в присутствии эстрогенов и скорость апоптоза коррелирует с циркулирующим уровнем эстрогенов [Radl et al., 2008]. Также установлено, что ДА запускает апоптоз у постлактирующих крыс [Jaubert et al., 2007]. Образование пролактином
Пролактиномы – наиболее часто встречаемые опухоли гипофиза [Ezzat et al., 2004]. Гипотезы в отношении патогенетического происхождения опухолей гипофиза меняются в течение последних десятилетий от гормональных нарушений до внутригипофизарных генетических дефектов [Ezzat, 2001]. Однако генетические исследования с использованием метода клонального анализа доказали, что аденомы гипофиза представляют собой моноклональные новообразования [Alexander et al., 1990]. На сегодняшний день признана роль дизрегуляции гормонов или ростовых факторов в качестве посредников пролиферации уже трансформированных клеток. В некоторых опухолях, генетические изменения в результате мутации являются первичными; в других триггером может быть гормональных среда [Ezzat, 2001]. В развитии опухолей гипофиза также могут играть роль протеомные изменения [Asa and Ezzat, 2005].
Есть целый ряд различных ростовых факторов, которые могут играть роль в образовании аденом. Ростовые факторы - полипептиды нескольких семейств, которые регулируют репликацию и функциональную дифференцировку клеток путем непосредственного изменения экспрессии конкретного гена. Связываясь с определенными мембранными рецепторами, они регулируют клеточный рост и экспрессию генов ауто- или паракрино [Asa and Ezzat, 1998]. Ряд ростовых факторов был идентифицирован в гипофизе. Это инсулиноподобный фактор роста (IGF-I, IGF-II), эпидермальный фактор роста (EGF) [Long at al, 1990], фактор роста нервов (NGF) [Patterson and Childs., 1994], трансформирующий фактор роста (TGF) [Long at al, 1990] и основной фактор роста фибробластов (bFGF) [Gospodarowicz at al., 1989].
В контроль клеточного цикла вовлечено многочисленное количество белков, способствующих прогрессии клеточного цикла (онкогены) и блокирующих его (опухоль-супрессорные гены). В большом числе опухолей гипофиза обнаружены мутации G-белка, приводящие к активации аденилатциклазы, накоплению в клетках большого количества цАМФ и повышенной гормональной секреции [Wang and Melmed, 2000]. Повышение экспрессии гена, трансформирующего опухоль гипофиза (PTTG), приводит к нарушению сепарации, ведущей к потере или появлению избыточной хромосомы. Низкая экспрессия PTTG наблюдается в большинстве нормальных тканей, избыточная экспрессия PTTG обнаружена во всех раковых клетках, а также в различных опухолях человека, включая гипофиз [Wang and Melmed, 2000; Heaney et al., 2002; Cristina et al.,2007]. Экспериментальные модели пролактином
Существует целый ряд моделей пролактином, большинство их которых являются генетическими. К фармакологическим моделям относят эстроген-индуцированных крыс. У обоих полов длительное введение эстрогенов вызывает увеличение синтеза и секреции ПРЛ, гиперплазию и/или пролактиному [Sarkar, 2006]. Самая чувствительная к действию эстрогенов линяя крыс – Fischer 344. У этих крыс эстрогены индуцируют быстрый рост гипофиза. Уже в течение нескольких дней гипофиз начинает расти, и его масса увеличивается до 10 раз после 8-12 недель введения [Chun et al., 1998]. Хроническое введение этанола также усиливает уровень ПРЛ и пролиферацию лактотрофов у овариэктомированных крыс [Sarkar et al., 2001].
Самыми распространенными моделями пролактином являюся трансгенные мыши с нокаутом гена Д2-рецепторов. Такие мыши характеризуются повышенным уровнем ПРЛ с 3-го месяца жизни, далее имеют хроническую гиперпролактинемию в течение всей жизни. Гиперплазия лактотрофов наблюдается к 8-и месяцем, причем только у самок. После 16-и месяцев развивается сосудистая аденома, преимущественно у самок [Kelly et al., 1997; Saiardi et al., 1997]. У мышей с нокаутом гена Д2-рецепторов показано усиление экспрессии сосудисто эндотелиального фактора роста (VEGF) в гипофизе, участвующего в формировании сосудистой сети в опухоли [Luque et al., 2011]. У людей повышенная экспрессия VEGF обнаружена в опухолях, резистентных к агонистам ДА [Melmed et al., 2011]. ДА селективно ингибирует VEGF-индуцированный ангиогенез и подавляет рост злокачественных опухолей. Другие ангиогенные белки - PTTG и FGF2 не увеличиваются у мышей, с нокаутом гена Д2-рецепторов. Именно их низкие уровни могут быть связаны с медленными темпами роста опухоли, ее доброкачественной природой и редкими метастазами [Yamada and Takada 2003, Cristina et al.,2007].
Существуют другие генетические модели пролактином, среди которых трансгенные мыши с гиперэкспрессией усеченной изоформы фактора роста фибробластов (FGFR4) [Ezzat at al, 2002], мыши с гиперэкспрессией NGF (наблюдается гиперплазия лактотрофов без образования пролактином) [Borrelli at al, 1992], мыши с гиперэкспрессией галанина [Perumal and Vrontakis ,2003], мыши с нокаутом гена рецепторов ПРЛ [Schuff at al, 2002].
Содержание дофамина, L-диоксифенилаланина и норадреналина в слайсах медиобазального гипоталамуса и в инкубационной среде у крыс на 14-й и 45-й день после введения 6-гидроксидофамина и введения 6-гидроксидофамина после предварительного внутрибрюшинного введения десметилимипрамина
Через 2 часа после последней инъекции БрдУ животных наркотизировали и проводили перфузию для подготовки гипофизов к иммуногистохимии.
Для выявления пролиферирующих лактотрофов проводили двойное иммуномечение ПРЛ и БрдУ в гипофизе крыс на 14-й и 45-й день после инъекций 6-ГДА или ДМИ и 6-ГДА с соответствующими контролями. ПРЛ и БрдУ выявляли на срезах гипофиза толщиной 10 мкм, приготовленных на криостате (Leica, Германия) и монтированных на стекла. Ядра клеток выявляли с помощью DAPI (4,6-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлорида). Срезы последовательно инкубировали с: (а) 0,1% Triton Х-100 (Sigma, США) на 0.02 М ФСБ в течении 10 мин при +20С; (б) ДНКазным буффером (10мМ CaCl2, 40мМ TRIS-HCl, 6мМ MgCl2, 10мМ NaCl, pH 7,9) в течении 5 мин при +20С; (в) ДНКазы I (100 ЕА/мл) (Sigma, США) в течении 10 мин при +37С; (г) 5% нормальной козьей сывороткой (Abcam, США), 5% нормальной сывороткой осла (Abcam, США) и 0.3% Triton Х-100 (Sigma, США) на 0.02 М ФСБ в течение 30 минут при +20С; (д) поликлональными антителами кролика к ПРЛ (1:1000) (AbD Serotec, США) и моноклональными антителами мыши к БрдУ (1:250) (Santa Cruz, США) в 2,5% нормальной козьей сыворотки (Abcam, США), 2,5% нормальной сыворотки осла (Abcam, США) и 0.1% Triton Х-100 в течение 20 часов при +20С; (е) Alexa Fluor 546-конъюгированными антителами осла против иммуноглобулинов кролика (Alexa Fluor antirabbit, 1:1500) (Life Technologies, США) в течение 2 часов при +20С; (ж) Alexa Fluor 488-конъюгированными антителами козы против иммуноглобулинов мыши (Alexa Fluor antimouse, 1:1500) (Life Technologies, США) в течение 2 часов при +20С; (з) DAPI (1:10000) (Sigma, США) в течение 5 минут при +20С. После каждой инкубации, за исключением второй и четвертой, срезы промывали в фосфатно-солевом буфере 3 раза по 15 минут, после последней инкубации - в течение часа. Срезы заключали в гидрофильную среду Mowiol (Calbiochem, Германия). Срезы гипофиза после пероксидазного моноиммуномечения ПРЛ были исследованы с помощью микроскопа Zeiss Observer Z1 (Zeiss, Германия) при увеличении объектива 40. Анализировали каждый 10 срез гипофиза с использованием модуля MosaiX AxioVision, который фотографирует каждое оптическое поле среза по отдельности, затем воспроизводит единое мозаичное изображение целого среза. На каждом оптическом поле проводили подсчет клеток, иммуно-позитивных по ПРЛ, с помощью программы Image J, затем количество клеток с каждого поля суммировали и получали общее количество клеток на срез. Общее количество клеток делили на площадь среза и получали коэффициент распределения лактотрофов гипофиза в ростро-каудальном направлении.
Срезы гипофиза после двойного мечения по ПРЛ и БрдУ были исследованы с помощью флуоресцентного микроскопа Zeiss Observer Z1, который был оснащен фильтрами для DAPI (для визуализации клеточных ядер), Alexa 488 (для БрдУ) и Alexa 546 (для ПРЛ) с использованием программного обеспечения AxioVision 4.8. Анализировали по 3 среза гипофиза. На каждом срезе было случайно выбрано 10 областей при увеличении объектива 40, на которых в дальнейшем проводили подсчет клеток, иммуно-позитивных по ПРЛ, и клеток, иммуно-позитивных по БрдУ с помощью программы Image J. Считали клетки только с видимыми ядрами. Митотический индекс лактотрофов (процент делящихся лактотрофов от общего числа лактотрофов) высчитывали по отношению количества клеток, меченных одновременно по ПРЛ и БрдУ к количеству клеток, меченных только по ПРЛ:
Статистическую обработку данных выполняли в среде интегрированных программ GraphPad Prism Version 6.0 для Windows (GraphPad Software, США). Данные представлены в виде: среднее арифметическое ± средняя ошибка среднего арифметического (M±m). Для определения статистической значимости полученных результатов были использованы параметрический t-критерий Стьюдента (t-тест) и непараметрический U-критерий Манна-Уитни (U- тест).
Суммарное содержание ДА рассчитывали как сумму его содержания в слайсах после инкубации и в трех 20-ти минутных фракциях среды. Для оценки скорости синтеза ДА определяли индексы синтеза ДА, рассчитываемые как отношение общего содержания ДА после инкубации слайсов медиобазального гипоталамуса к содержанию ДА в неинкубированных слайсах:
ИСД – индекс синтеза ДА n-ной пробы; ССД – суммарное содержание ДА в слайсах после инкубации и в инкубационной среде в n-ной пробе; СДНС – содержание ДА в неинкубированных слайсах, относящихся к n-ной пробе.
Относительные изменения индекса синтеза ДА после инкубации с L-лейцином были рассчитаны как отношение среднего значения индекса синтеза после инкубации с L-лейцином к среднему значению индекса синтеза после инкубации без L-лейцина в каждой контрольной и экспериментальной группах.
Кооперативный синтез дофамина в тубероинфундибулярной системе у крыс как компенсаторный механизм при нейродегенерации
Изучение механизмов пластичности мозга, направленных на компенсацию функциональной недостаточности тубероинфундибулярной ДА-ергической системы, может оказаться ключом к разработке фармакотерапии при гиперпролактинемии. Для этого необходимо оценить вклад кооперативного синтеза ДА моноферментными нейронами в секрецию ДА при нейродегенерации. Как было показано в наших предыдущих исследованиях, после дегенерации примерно половины ДА-ергических нейронов аркуатного ядра у крыс под воздействием 6-ГДА в первые две недели развивается дефицит ДА, а через полтора месяца синтез ДА возвращаются к норме. В этой связи было высказано предположение, что при дегенерации ДА-ергических нейронов усиливается кооперативный синтез ДА моноферментными нейронами [Зиязетдинова и др., 2008]. Для проверки выдвинутой гипотезы, данное исследование проводили на модели дефицита ДА и НА сначала на 14-й день после введения 6-ГДА - на стадии декомпенсации, когда должна была закончиться дегенерация нейронов в ответ на введение токсина, а затем на 45-й день - на стадии компенсации, когда реализуются компенсаторные процессы – механизмы пластичности мозга [Jonsson, 1983]. При дегенерации ДА-ергических нейронов и возникающем при этом дефиците ДА может включаться ряд компенсаторных процессов, таких как: (а) увеличение синтеза ДА сохранившимися ДА-ергическими нейронами; (б) прорастание аксонов ДА-ергических нейронов из неповрежденных токсином экстрагипоталамических структур мозга; (в) включение экспрессии генов ферментов синтеза ДА в недофаминергических нейронах; (г) усиление кооперативного синтеза ДА моноферментными нейронами [Ugrumov, 2004; Ugrumov, 2014; Ugrumov, 2008; Vos et al., 1999].
В эксперименте была использована методология, описанная выше – инкубация слайсов медиобазального гипоталамуса в чистом растворе Кребса-Рингера и в растворе Кребса-Рингера с добавлением L-лейцина. На 14-й день после стереотаксических введений добавление в инкубационную среду L-лейцина вызвало одинаковое снижение содержания ДА в контрольной (0,9% NaCl) и опытной (6-ГДА) группах, что говорит об одинаковом вкладе кооперативного синтеза ДА моноферментными нейронами в секрецию ДА в период декомпенсации (рисунок 22, 24, таблица 3). На стадии компенсации на 45-й день после введения 6-ГДА в аналогичном эксперименте уровень синтеза ДА в присутствии L-лейцина существенно снизился по сравнению с контрольной группой (рисунок 22, таблица 3), что говорит об усилении кооперативного синтеза ДА моноферментными нейронами. Усиление кооперативного синтеза ДА на 45-й день после введения 6-ГДА согласуется с нашими предыдущими результатами о восстановлении уровня ДА [Зиязетдинова и др., 2008].
Для более корректной оценки скорости синтеза ДА нами был введен еще один показатель -индекс синтеза ДА, рассчитываемый как отношение общего содержания ДА после инкубации слайсов к содержанию ДА в неинкубированных слайсах. Фактически, индекс синтеза ДА характеризует количество ДА, которое синтезируется в слайсах за время проточной инкубации. После инкубации с L-лейцином снижение индексов синтеза ДА вследствие ингибирования кооперативного синтеза наблюдалось на 14-й и 45-й дни на модели дефицита ДА и НА и в соответствующих контролях (рисунок 32А). Для возможности количественного сравнения интенсивности кооперативного синтеза ДА в 4-х исследуемых группах между собой, оценивали относительные изменения индекса синтеза ДА после инкубации с L-лейцином, рассчитываемые как отношение среднего значения индекса синтеза после инкубации с L-лейцином к среднему значению индекса синтеза после инкубации без L-лейцина в каждой контрольной и опытной группах. Провести такое количественное сравнение нам позволяют особенности схемы проведенного эксперимента: с L-лейцином и без него инкубируются идентичные половинки слайсов медиобазального гипоталамуса от каждого животного, что дает возможность использовать их как парные выборки. Результаты анализа свидетельствуют о том, что интенсивность кооперативного синтеза ДА моноферментными нейронами медиобазального гипоталамуса статистически значимо выше на 45-й день после введения 6-ГДА по сравнению с контролем и группами опыта и контроля на 14-й день после введений (рисунок 32Б).
В данном эксперименте измеряли также содержание L-ДОФА и НА в среде и слайсах медиобазального гипоталамуса после инкубации. Содержание L-ДОФА в среде после инкубации с L-лейцином значительно увеличилось по сравнению с инкубацией без L-лейцина только на 45-й день после введения 6-ГДА – в период компенсации, в то время как в других исследуемых группах добавление в среду L-лейцина не привело к изменениям содержания L-ДОФА (рисунок 25А). Ранее было показано, что в норме при ингибировании кооперативного синтеза с помощью добавления в инкубационную среду L-лейцина, накопление L-ДОФА в среде происходит только при дополнительном блокировании его метаболизирования с помощью толкапона – ингибитора КОМТ. Однако в данном эксперименте содержание L-ДОФА увеличилось при добавлении в инкубационную среду только L-лейцина, а это означает, что на стадии компенсации скорость синтеза L-ДОФА в нейронах, содержащих только ТГ, сильно возрастает, по сравнению с нормой и стадией декомпенсации. Усиление кооперативного синтеза может быть связано с увеличением числа моноферментных нейронов, содержащих ТГ, происходящим при дегенерации примерно половины ДА-ергических нейронов, что было показано ранее в морфологических исследованиях в нашей лаборатории [Ershov et al., 2005].
Как и ожидалось, содержание НА в среде и слайсах медиобазального гипоталамуса после инкубации с L-лейцином не изменилось по сравнению с содержанием НА после инкубации без L-лейцина ни в одной из контрольных и опытных групп (рисунок 23Б, 25Б, 28Б, 30Б). В наших экспериментах L-лейцин, как конкурентный ингибитор поступления L-ДОФА из межклеточной среды в нейроны, содержащие ДАА, влияет именно на кооперативный синтез ДА моноферментными нейронами, а поскольку синтез в ДА-ергических биферментных и НА-ергических нейронах происходит внутриклеточно и не связан с переносом промежуточных продуктов через межклеточную среду, такое ингибирование не должно вызывать никаких изменений в уровне НА. В этой связи неизменное содержание НА в среде и слайсах медиобазального гипоталамуса после инкубации с L-лейцином можно расценивать как дополнительный контроль специфичности используемого подхода.
Таким образом, компенсаторное увеличение содержания ДА в тубероинфундибулярной системе, наблюдаемое у крыс на 45-й день после введения 6-ГДА, обусловлено усилением кооперативного синтеза ДА недофаминергическими моноферментными нейронами.