Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 9
2.1. Поддержание и регуляция нейрогенеза: данные физиологии и сравнительной морфологии 9
2.1.1. Этапы нейрогенеза и свойства новых нейронов 10
2.1.2. Регуляция нейрогенеза 12
2.1.3. Данные сравнительной морфологии 15
2.2. Характеристика нейральных стволовых клеток гиппокампа 17
2.2.1. Морфология, происхождение и маркеры 17
2.2.2. Деление, обновление и поддержание 20
2.2.3. Разнообразие маркеров и свойств 26
2.3. Влияние ионизирующей радиации на стволовые клетки 34
3. Материалы и методы 36
3.1. Животные 36
3.1. Облучение 36
3.2. Введение нуклеотидных аналогов 36
3.3. Обработка ткани 38
3.4. Микроскопия и подсчёт клеток 39
3.6. Статистический анализ 40
4. Результаты и обсуждение 43
4.1. Деление стволовых клеток 43
4.1.1. Кратковременное поддержание меченых НСК 44
4.1.1.1. Результаты инъекционного мечения 45
4.1.1.2. Результаты длительного мечения 47
4.1.2. Долговременное поддержание меченых НСК 50
4.1.2.1. Результаты инъекционного мечения 51
4.1.2.2. Результаты длительного мечения 52
4.1.3. Обсуждение 53
4.2. Пространственное распределение НСК в гиппокампе 54
4.2.1. Распределение делящихся стволовых клеток 55
4.2.2. Истощение пула стволовых клеток с возрастом 62
4.2.3. Обсуждение 64
4.3. Деление и поддержание нейральных стволовых клеток после облучения 67
4.2.1. Острые эффекты: 24 часа после облучения 69
4.2.2. Долговременные эффекты: 2 месяца после облучения 76
4.2.3. Долговременные эффекты: 6 месяцев после облучения 81
4.3.1. Обсуждение 86
5. Заключение 91
6. Выводы 93
7. Список сокращений 94
8. Список литературы 95
9. Приложения 106
- Деление, обновление и поддержание
- Результаты длительного мечения
- Острые эффекты: 24 часа после облучения
- Обсуждение
Деление, обновление и поддержание
Деление НСК определяет обновление и поддержание стволового резерва, рост, регенерацию и функции ткани. Делящиеся НСК дают начало новым нейронам, которые, вероятно, важны для реализации специфического поведения [Aimone и др., 2014; Aimone, Deng, Gage, 2010; Christian, Song, Ming, 2014; Danielson и др., 2016; Miller и др., 2014; Miller, Hen, 2015]. В то же время инициирующие его НСК могут обладать терапевтическим потенциалом для регенерации мозга в паталогических условиях [Викторов, 2001; Корочкин, 2004; Александрова, Марей, 2015]. Поэтому определение параметров деления НСК важно определения значимости нейрогенеза для зрелого мозга.
К параметрам деления можно отнести его динамику, тип деления (симметричный или асимметричный), способность к самообновлению, число повторных делений и способность чередовать покой и деление. Небольшое число НСК делится в каждый момент времени [Encinas и др., 2011; Knobloch и др., 2013; Semerci и др., 2017], и подробная динамика этого процесса была определена с помощью введения нуклеотидных аналогов [Encinas и др., 2011] и прижизненной микроскопии [Pilz и др., 2011]. Однако, о типах деления НСК, способности НСК к самообновлению и длительности поддержания НСК в нейрогенной нише после деления пока нет единого мнения.
Большинству методов доступен лишь результат, а не процесс деления. В результате деления НСК могут образовываться новые НСК и клетки-потомки, количество которых в начальный момент зависит от типа деления НСК (Рисунок 3). При этом возможны два типа деления, образующих новые НСК: симметричные, когда материнская стволовая клетка дает две такие же дочерние НСК, и асимметричными, когда материнская НСК даёт начало одной НСК, идентичной материнской, и одной непохожей клетке-потомку. При этом обновление стволового резерва зависит не только от типа деления НСК, но и от дальнейшей судьбы НСК, т.е. длительности её поддержания в нише и способности чередовать деление и покой. Определение двух связанных между собой параметров деления – соотношения типов деления НСК и способности НСК чередовать покой и деление – описывает способность НСК к самообновлению, регуляцию числа клеток-потомков и механизмы длительного поддержания нейрогенеза.
Преимущественно асимметричные деления НСК выявлены при исследовании накопления и исчезновения делящихся НСК, меченных нуклеотидными аналогами [Encinas и др., 2011]. Признаками асимметричных делений были не увеличивающееся со временем число меченых НСК и отсутствие пар меченых НСК, расположенных близко друг к другу. Признаки симметричных делений не были обнаружены. Совокупность результатов этой работы описывает процесс постепенного расходования резерва «одноразовых» НСК: активация деления прежде покоящихся НСК приводит к их последующему превращению в астроциты и исчезновению из стволового пула.
Только асимметричные деления были также выявлены методом in vivo микроскопии [Pilz и др., 2011]. НСК были выявлены по экспрессии флуоресцентного белка под промотором гена Ascl1, активность которого повышена в части делящихся НСК. Критика результатов этой работы связана с вопросом о возможной гетерогенности пула НСК.
Преимущественные асимметричные деления с долей симметричных показаны при слежении за потомками стволовых клеток, экспрессирующих Nestin [Bonaguidi и др., 2011]. Суть этого метода состоит в индукции экспрессии флуоресцентного белка в малом числе радиальных НСК гиппокампа. В результате все потомки меченых НСК сохраняют экспрессию маркёрного белка, что позволяет без введения нуклеотидных аналогов проследить за разреженными в пространстве НСК и оценить типы их делений по окружающим кластерам вероятных клеток-потомков. Некоторые из кластеров (или вероятностных клонов, клеток-потомков одной материнской стволовой клетки), обнаруженные через месяц после индукции рекомбинации, содержали одну или две НСК. Сходные результаты были выявлены при использовании двух вариантов генетических линий: через 2 месяца после индукции экспрессии GFP около 5% клонов содержали две НСК. Обнаруженные пары близких НСК могут быть интерпретированы как следы симметричных делений.
Вывод о возможности симметричных делений НСК был сделан при исследовании влияния опыта животных на деление клеток и нейрогенез [Dranovsky и др., 2011]. В стандартных условиях содержания мышей число нестин-экспрессирующих НСК (индуцируемый трансген Nestin-GFP) увеличивалось со временем в нижнем лезвии гранулярного слоя гиппокампа. Количество НСК также увеличилось после месяца содержания мышей в условиях изоляции. Увеличение числа делящихся НСК было интерпретировано как увеличение частоты симметричных делений НСК или продукция новых НСК в результате деления нерадиального ещё более примитивного предшественника.
Признаки симметричных делений были подтверждены при использовании этого же типа анализа, напоминающего клональный [Song и др., 2012]. Индуцированное удаление субъединицы ГАМК-рецептора в НСК и фотоактивируемое торможение парвальбуминовых нейронов привели к увеличению числа делящихся НСК, а также к дополнительному увеличению доли клонов с двумя и более НСК (в случае нокаута по рецептору). К таким же эффектам привела продолжительная социальная изоляция мышей. Напротив, повышенная концентрация ГАМК и фотоактивация интернейронов привели к снижению пролиферации НСК. На этом основании авторы заключили, что НСК могут претерпевать симметричные и асимметричные деления, и соотношение типов деления может меняться в результате изменения концентрации ГАМК, в ходе приобретения животным опыта.
Возможность симметричного деления НСК была снова показана при маркировании популяции стволовых клеток, практически полностью перекрывающейся с популяцией нестиновых [Semerci и др., 2017]. Флуоресцентноый белок у трансгенных мышей данной линии конститутивно экспрессировался под промотором гена Lfng1. Вывод о симметричном делении был сделан по критерию неразделённой цитоплазмы клеток, меченных нуклеотидным аналогом.
Выводы о длительности поддержания НСК после деления тоже расходятся. НСК исчезали вскоре после деления, при наблюдении за НСК, экспрессирующих флуоресцентный белок под промотором гена Nestin и меченных аналогами нуклеотидов [Encinas и др., 2011]. То же обнаружено и методом прижизненного наблюдения за НСК, экспрессирующими флуоресцентный белок под промотором гена Ascl1 [Pilz и др., 2011], что вместе с предыдущим результатом говорит о скором расходовании НСК после активации серий делений. Тем не менее, небольшое число меченых НСК обнаруживается через 1-2 месяца после введения нуклеотидных аналогов (НСК Ascl-GFP, индуцируемый трансген, [Urban и др., 2016], НСК Lfng1-GFP и НСК Nestin-GFP, конститутивные трансгены, [Semerci и др., 2017]). Кроме того, значительное число клонов с НСК и клетками-потомками обнаружено через месяц после индукции экспрессии GFP под промотором гена Nestin [Bonaguidi и др., 2011; Song и др., 2012], что в совокупности с предыдущими результатами [Urban и др., 2016; Semerci и др., 2017] говорит о способности НСК чередовать покой и деление. Прояснение вопроса о длительности поддержания НСК после активации деления требует согласования этих данных. На возникновение противоречий о типах деления НСК и дальнейшей судьбе делящихся клеток могло повлиять использование разных методов, каждый из которых пока имеет существенные недостатки.
В работе [Encinas и др., 2011] изучены НСК, экспрессирующие флуоресцентный белок под промотором гена Nestin, и их деление детектировалось с помощью мечения делящихся клеток аналогами нуклеотидов. В то время как этот метод позволяет напрямую детектировать событие деления, короткое время мечения может снизить вероятность детекции симметричных делений (из-за мечения только части делящихся клеток, малая доля из которых может делиться симметрично, и разбавления метки со временем). Модифицированные протоколы мечения с увеличением и вариацией времени введения нуклеотидных аналогов могли бы уточнить эти данные.
Результаты длительного мечения
Постепенное исчезновение меченых клеток может происходить из-за разбавления однократно введённой инъекционной метки. Проверка этих данных возможна при увеличении длительности введении метки. Поэтому во втором эксперименте (Рисунок 4Б) для исследования тех же параметров, что и в прошлом (накопление, повторное деление и расходование делящихся клеток) первый нуклеотидный аналог вводили длительно с низкой концентрацией, а второй – кратковременно, с той же концентрацией, что и в прошлом эксперименте. Мышам того же возраста, что и в прошлом эксперименте, сначала длительно вводился BrdU инфузией (в течение 5 дней, 6 мг со скоростью 50 мкг/ч [Farah, 2004]) и далее за 2 часа до прекращения инфузии, через 1, 2 или 5 дней кратковременно вводился EdU инъекцией (123 мг/кг) (Рисунок 4Б). Затем анализировалось включения этих меток в ДНК НСК (GFP+GFAP+) и дочерних ПП (GFP+GFAP+). Результаты представлены на Рисунке 6 и в Приложении 2.
Для исследования накопления длительно меченых клеток за период пятидневной инфузии BrdU сразу же после её прекращения было проанализировано число BrdU-позитивных клеток (Рисунок 4Б группа 1, Рисунок 6А синяя линия – точка «0 дней»). Детектировано 142 (ст. откл. 32) меченых НСК на всех анализированных срезах (16 срезов), что при оценке на гиппокамп составило 777 (ст. откл. 146). Учитывая, что НСК не исчезают после деления в течение 5 дней [Encinas и др., 2011], в результате одного дня мечения накопилось бы 777/5=155 меченых НСК. Это количество соответствует числу НСК, которые у мышей данного возраста активируют первичные асимметричные деления после длительного периода покоя, не увеличивающие количество меченых клеток (Encinas и др., 2011). Повторные деления, которые могут быть помечены после первичных, также не увеличивают число меченых клеток, если они асимметричные (в отличие от симметричных). Таким образом, накопление меченых клеток сразу после длительного введения нуклеотидного аналога подтверждает, что преимущественный тип деления НСК – асимметричный.
Для исследования длительности присутствия длительно меченных клеток в нейрогенной ниши были проанализированы BrdU-позитивные клетки на остальных временных точках (1, 2 или 5 дней после прекращения инфузии, Рисунок 6А, Б). Число меченых НСК не возрастало со временем и только снижалось, что подтверждает преимущественно асимметричный тип деления НСК (Рисунок 6А). Существенное снижение числа BrdU-позитивных НСК наблюдается после окончания длительного мечения, как и после кратковременного. Это снижение оно было менее сильным, чем через 5 дней после однократного инъекционного мечения. Последнее согласуется с тем, что длительное введение метки пометило удельно больше НСК, первично делящихся после длительного периода покоя, и значит за счёт последующих повторных делений длительно помеченные НСК будут дольше присутствовать в нише и медленнее исчезать. Меченные ПП также не увеличивались в количестве после окончания введения метки (Рисунок 6Б), не смотря на их симметричный тип деления [Encinas и др., 2011]. Это согласуется с тем, что значительная часть ПП подвергается гибели в течение нескольких дней после деления [Encincas и др., 2011; Sierra и др., 2010]. Эти результаты говорят о том, что даже при значительном увеличении времени введения нуклеотидного аналога изменение числа меченых клеток со временем согласуется с 1) преимущественно асимметричным типом деления НСК (так как число меченых не увеличивается), 2) с непродолжительным поддержанием части делящихся клеток в нейрогенной нише (так как число меченых уменьшается не смотря на более эффективное мечение), 3) с возможно длительным поддержанием части НСК в нише (так как меченые НСК не исчезали полностью). Для анализа повторных делений длительно меченных клеток все НСК и ПП, включившие вторую метку (EdU) были разделяются на 3 популяции, отражающие 1) текущий уровень пролиферации (число всех EdU-позитивных клеток), 2) повторные деления (клетки EdU+BrdU+ или двоемеченые клетки) и 3) накопление клеток, не делившихся в период инфузионного мечения (клетки EdU+BrdU-, с первой нуклеотидной меткой, но без второй) (Рисунок 6 Б, Г). Число всех EdU-позитивных клеток показало одинаковый уровень пролиферации только в трёх группах из четырёх (что может быть связано с потерей части инъекционного объёма), поэтому для анализа двух остальных популяций клеток с меткой EdU учитывались результаты только в этих трёх группах – «0ч», «1д» и «5д». Число клеток EdU+BrdU+ убывало со временем, а число клеток только с первой меткой возрастало. Эти результаты говорят о небольшом числе повторных асимметричных делений НСК без длительного периода покоя и о накоплении делящихся клеток, которые покоились в течение 5 дней инфузии.
Обобщая результаты двух экспериментов, можно заключить, что исследование меченых НСК и их ПП, с помощью длительного мечения подтверждают результаты, полученные после кратковременного мечения и указывают на то, что большая часть меченых НСК делится асимметрично, подвергается серии из нескольких асимметричных делений, не прерывающихся длительным периодом покоя, и вскоре после этого перестают детектироваться в нейрогенной нише.
Острые эффекты: 24 часа после облучения
В остром эксперименте мы исследовали две дозы гамма-излучения, 1 и 5 Гр, и оценивали сохранность пула стволовых клеток, промежуточных предшественников, чувствительность клеток, делившихся до и после облучения. Ненаркотизированные гетерозиготные мыши линии Nestin-GFP [Mignone и др., 2004] возрастом 1,5 месяца были подвергнуты облучению всего тела мощностью 1 Гр/мин и затем возвращены в виварий на сутки до момента перфузии. Репрезентативные микрофотографии срезов субгранулярной зоны представлены на Рисунке 11.
Чтобы исследовать сохранность резерва стволовых и промежуточных клеток-предшественников (без дифференцировки на делящиеся и покоящиеся), мы подсчитали их количество на гиппокамп через 24 часа после облучения гамма-излучением в дозах 1 и 5 Гр (Рисунок 12 Б, В, Приложение 4). Среднее число НСК снизилось на 10% в среднем после облучения в дозе 1 Гр и на 17% в среднем после 5 Гр, но это снижение не было достоверным (1 Гр: p=0,33; 5 Гр: p=0,09; доверительные интервалы и параметры анализа приведены в Приложении 4). При этом общее число промежуточных предшественников уменьшилось на 40% после облучения в дозе 1 Гр, и на 64% – после 5 Гр (1 Гр: p=0,024; 5 Гр: p=0,002). Однофакторный тест ANOVA выявил эффект облучения на выживание ПП, но не НСК. Эти результаты говорят об устойчивости неделящиеся НСК к облучению, что согласуется с тем, что только небольшая часть НСК находится в S-фазе в каждый момент времени, и потеря всех делящихся НСК не отразилась бы существенно на численности всей популяции НСК.
Чтобы исследовать чувствительность делящихся клеток к гамма-излучению, мы применили протокол двойного нуклеотидного мечения (схема эксперимента – Рисунок 12 А, иллюстрация клеток – Рисунок 13). Сочетания нуклеотидных меток BrdU и EdU, встроившихся ДНК делящихся клеток в разное время, позволяют исследовать несколько параметров:
1) выживание клеток, находившихся в S-фазе непосредственно перед облучением и во время него, по числу BrdU-положительных клеток;
2) уровень пролиферации после облучения, по числу EdU-положительных клеток;
3) эффективность деления после облучения и прогрессии по клеточному циклу, по числу клеток, которые были в S-фазе непосредственно перед облучением и затем повторно вошли в S-фазу через 22 часа после облучения, т.е. число клеток меченных BrdU и EdU;
4) деление клеток после облучения, которые были облучены не в S-фазе (другой фазе клеточного цикла или в G0) до облучения, по количеству клеток, меченных EdU, но не BrdU.
Количественный результат анализа меченых клеток у контрольных животных представлен на Рисунке 14 и в Приложении 4. В то время как для НСК число BrdU-позитивных клеток равно числу EdU-позитивных (201±63 и 197±55), количество ПП, меченых первой меткой больше, чем меченых первой (2998±394 и 1672±131). В соответствии с тем, что промежуток между инъекциями близок к длине клеточного цикла, полученные результаты согласуются с ранее опубликованными [Encinas и др., 2011], говорящими в пользу преимущественно асимметричных делений НСК и симметричных делений ПП.
Для того, чтобы оценить чувствительность делящихся клеток к облучению, проанализировано число BrdU-положительных клеток (параметр 1), большинство которых находилось в S-фазе (длящейся примерно 8-10 часов, [Encinas и др., 2011; Podgorny и др., 2018]) во время облучения (Рисунок 14 А, Б, Приложение 4). Облучение в дозе 1 Гр уменьшило число BrdU-положительных НСК на 48% по сравнению с контролем (p=0.03, но доверительные интервалы имели широкий диапазон, захватывающий и незначительное снижение (Приложение 4)). Облучение в дозе 1 Гр уменьшило и число BrdU-положительных промежуточных предшественников (ПП) на 42% (p=0,0004). Облучение в дозе 5 Гр уменьшило число BrdU-положительных НСК на 73% (p=0,003) и уменьшило число BrdU-положительных ПП на 94% (p=0,0001). Однофакторный тест ANOVA выявил эффект облучения, а двухфакторный – взаимодействие факторов “тип клеток” и “доза”, указывая на различие дозозависимой чувствительности НСК и ПП, находящихся в S-фазе во время облучения.
Для того, чтобы оценить влияние облучения на уровень пролиферации через сутки, были проанализированы клетки второго параметра – EdU-положительные клетки, находящиеся в S-фазе через 24 часа после облучения (Рисунок 14 В, Г, Приложение 4). Облучение в дозе 1 Гр привело к снижению меченых НСК на 71% по сравнению с контролем (p=0.0003) и снижению меченых ПП – на 63% (p 0.0001). Доза 5 Гр уменьшила число меченых НСК на 97% (p 0.0001), а число меченых ПП – на 96% (p 0.0001). Однофакторный тест ANOVA выявил главный эффект облучения для обоих типов клеток, а двухфакторный – взаимодействие факторов “тип клеток” и “доза”, указывая на различие в дозозависимой чувствительности НСК и ПП, находящихся в S-фазе через сутки после облучения.
Для того, чтобы исследовать успешность продвижения клеток по клеточному циклу, мы оценили присутствие клеток третьего параметра (Рисунок 14 Д, Е, Приложение 4). А именно, чтобы определить, входят ли помеченные перед облучением клетки в S-фазу через 22-24 ч после облучения, мы проанализировали число клеток, меченных одновременно BrdU и EdU. Облучение в дозе 1 Гр привело к снижению числа BrdU+EdU+ НСК на 81% (p=0,01) по сравнению с контролем, а ПП – на 70% (p=0,0002). Доля НСК, которые находились в S-фазе во время облучения и снова вошли в S-фазу через 22-24 часа после облучения (т.е. доля BrdU+EdU+ клеток от BrdU+) уменьшилась на 61% от контрольной, а фракция ПП – на 48%. Если же рассматривать двоемеченные клетки как долю от тех, что через 24 часа вступили в S-фазу (т.е. доля BrdU+EdU+ клеток от EdU+), облучение в дозе 1 Гр сократило долю ранее делившихся НСК на 35% по сравнении с контрольной, а долю ранее делившихся ПП – на 20%. Облучение в дозе 5 Гр привело к полному исчезновению двоемеченных клеток, не смотря на то что часть BrdU+ НСК и ПП всё ещё присутствовали в нише. Эти результаты говорят о том, что стволовые и дочерние клетки, синтезирующие ДНК во время облучения и выжившие к 24 часам после облучения, имели сниженную способность входить в следующую S-фазу через 22 часа после облучения в дозе 1 Гр и теряли эту способность после облучения в дозе 5 Гр.
Наконец, мы исследовали клетки четвёртого типа – облученные не в S-фазе, то есть в другой фазе клеточного цикла или в покое (Рисунок 14 Ж, З и в Приложении 4). Эти клетки не были помечены BrdU перед облучением, но были помечены EdU через 22-24 часа после облучения. После облучения в дозе 1 Гр число НСК, меченых только EdU, уменьшилось на 64% (p=0,0002) по сравнению с контролем, а число ПП – на 56% (p 0,0001). После облучения в дозе 5 Гр число НСК, меченых только EdU, уменьшилось на 95% (p 0,0001) по сравнению с контролем, а число ПП – на 92% (p 0,0001). Однофакторный тест ANOVA выявил главный эффект облучения для обоих типов клеток (Приложение 4), а двухфакторный – взаимодействие факторов «тип клеток» и «доза», указывая на различие в дозозависимой реакции НСК и ПП, облучённых не в S-фазе. Эти результаты показывают, что даже те клетки, которые не находились в S-фазе во время облучения, были чувствительны к облучению обеими дозами и либо подверглись гибели, либо приостановили продвижение по клеточному циклу.
Вместе эти результаты показывают, что делящиеся НСК и ПП чувствительны к облучению в дозах 1 и 5 Гр. НСК и ПП, находящиеся в S-фазе во время облучения и выжившие через 24 часа, значительно хуже вступают в следующий клеточный цикл в период 6-22 часа после облучения. В дополнение, гамма-облучение негативно действует на уровень пролиферации НСК и ПП через 24 часа, и даже те клетки, которые не были в S-фазе во время облучения были чувствительны к дозе 1 Гр и практически не обнаруживались после дозы 5 Гр в результате гибели или приостановки клеточного цикла.
Обсуждение
Не смотря на то, что влияние гамма-излучения на нейрогенез было исследовано неоднократно, чувствительность НСК, делящихся и дифференцирующихся предшественников к облучению не известны детально. Это связано с тем, что комплексные методы исследования НСК интактного мозга только в малой степени применялись к исследованию НСК облучённого мозга в динамике.
Мы обнаружили, что к облучению чувствительны и НСК, и ПП, но большая часть клеток обоих типов выживает. Часть НСК и ПП, которые были помечены непосредственно перед облучением – около половины после облучения в дозе 1 Гр и большинство после облучения в дозе 5 Гр – исчезли после облучения. В то же время резерв НСК, который большей частью состоит из покоящихся клеток, не был затронут в той же степени или был вовсе нечувствителен к облучению. Как и ожидалось, в случае ПП, большая часть которых является делящимися, их общее количество было уменьшено сильнее, чем количество НСК. Большая устойчивость пула НСК, вероятно, позволяет частично восстанавливать нейрогенную нишу через 2 месяца после облучения, заполняя её делящимися НСК и дочерними ПП за счёт расходования резерва покоящихся НСК. Неодинаковая чувствительность НСК и ПП облучению проявилась и при сравнении их делящихся популяций. А именно, делящиеся НСК могут быть более устойчивы к облучению. Разная чувствительность стволовых, дочерних и дифференцирующихся предшественников, и большая устойчивость стволовых клеток были обнаружены и в других тканях [Insinga и др., 2013; Li и др., 2016; Mohrin и др., 2016; Sotiropoulou и др., 2010; Walter и др., 2015].
Мы также обнаружили, что облучение влияет на разные классы делящихся ранних предшественников. Облучение угнетает повторное вхождение стволовых и прогениторных клеток в клеточный цикл через 16-22ч после облучения. Облучение также привело к почти полному исчезновению НСК, меченных только EdU, но не BrdU, а значит – к недостатку активации деления НСК из состояния покоя. Таким образом, могут быть нарушены как первичное, так и повторные деления НСК. Эти эффекты могут быть вызваны изменением собственных свойств НСК или их микроокружения.
Ограничения, наложенные на деление НСК и ПП, были сняты через 2 месяца после облучения в дозах 1 и 5 Гр. Наблюдалось восстановление пролиферации обоих типов предшественников, и обнаруженный её уровень может означать сохранение их основного типа их делений (асимметричных делений у НСК и симметричных у дочерних клеток), нормальную количественную и пространственную активацию НСК из состояния покоя, нормальное вхождение в последовательные клеточные циклы и нормальный уровень выживания и гибели клеток (использованный протокол мечения аккумулировал делящиеся клетки за 4 дня до конца эксперимента). Восстановление пролиферации может быть следствием ненарушенных свойств НСК и снятия ограничений, накладываемых микроокружением на покоящиеся и делящиеся предшественники к 2 месяцам после облучения.
Восстановленного уровня пролиферации было тем не менее недостаточно для восстановления нейрогенеза. Это следует из сниженного количества DCX-положительных клеток. Так как выявляемые новые нейроны родились раньше оценки пролиферации (максимум, за 3 недели), недостаток этих нейронов может быть связан с тем, что микроокружение ещё не было восстановлено в момент рождения и созревания этих клеток [Belarbi и др., 2013]. Результаты о недостатке новых нейронов через 2 месяца после облучения дозой 5 Гр также означают, что в этот период или в скором времени после него могут проявляться негативные эффекты облучения на поведение, зависящее от новых нейронов.
Несмотря на частичное восстановление нейрогенеза через 2 месяца после облучения, нейрогенная ниша оказалась менее продуктивна через 6 месяцев. В то время как резерв НСК в целом сохранён, наблюдается существенная нехватка делящихся ПП и сравнимая с ней потеря созревающих новых нейронов. Сниженное число делящихся ПП могло быть вызвано снижением уровня деления НСК, деления или выживания самих ПП.
Резерв НСК длительно сохранён после облучения. Даже если большинство НСК выживает сразу после облучения, их продолжительное поддержание в нише может быть потенциально затруднено из-за воспаления или повреждения ДНК. Тем не менее, мы обнаружили, что общий резерв облучённых НСК не был истощён сильнее контрольного через 2 и 6 месяцев после радиационной экспозиции. Значит, резервы НСК у контрольных и облучённых мышей истощались с похожей скоростью. Расходование резерва НСК в интактном мозге может следовать за активацией их деления из покоя [Encinas и др., 2011; Pilz и др., 2018], а постоянное расходование ускоряется вызванными судорогами или повышением активности входов в гиппокамп [Bao и др., 2017; Sierra и др., 2015]. Сохранение облучённого резерва, однако, не гарантирует, что активация первичного и повторных делений облучённых НСК успешны. Наши результаты не противоречат тому, что уменьшенная продукция новых нейронов через 6 месяцев после облучения может развиваться из-за уменьшенной способности НСК продуцировать клетки-потомки.
Мы не нашли признаков симметричных делений НСК, которые могли бы быть способом быстрого восстановления резерва покоящихся НСК или делящихся НСК и ПП после радиационного повреждения. Тем не менее, мы не можем исключить, что временная индукция симметричных делений всё же происходила после облучения и не была детектирована.
Вместе эти результаты показывают, что экспозиция гамма-излучению не влияет на покоящиеся НСК, элиминирует делящиеся ПП в большей степени, чем делящиеся НСК, и временно угнетает клеточное деление в нейрогенной нише. Восстановление деления клеток и частичное восстановление нейрогенеза возможно через 2 месяца после облучения, однако через 6 месяцев снова наблюдается его угнетение. Необходимо отметить, что большинство этих последствий радиации не могли бы быть обнаружены, используя обычные протоколы однократного мечения.
Наши результаты поднимают ряд вопросов, касающихся обновления предшественников нейронов в гиппокампе. Один из них – природа различий между двумя нейрогенными зонами в зрелом мозге, субвентрикулярной зоне боковых желудочков и субгранулярной зоны гиппокампа. Не смотря на то, что нейрогенез в обеих зонах подвержен радиационному воздействию, нейрогенез в субвентрикулярной зоне восстанавливается лучше [Daynac и др., 2016; Hellstrm и др., 2009]. Это может означать меньшее различие между покоящимися и пролиферирующими НСК субвентрикулярной зоны и зависимость чувствительности радиации от типа НСК (гиппокампальных или желудочковых) [Barazzuol, Ju, Jeggo, 2017]. Различия между субвентрикулярной и субгранулярной зонами могут быть обусловлены различием в свойствах микроокружения нейрогенных предшественников. Также эти различия могут быть следствием разных свойств самих предшественников, в т.ч. в способах поддержания стволовых клеток. Так, например, НСК субгранулярной зоны обладают ограниченным самообновлением с делятся преимущественно асимметрично (Encinas и др., 2011), а НСК субвентрикулярной зоны самообновляются путём симметричных делений [Obernier и др., 2018]. Наконец, различия в восстановлении нейрогенеза в этих двух зонах может быть следствием разного ответа НСК на радиацию [Hellstrm и др., 2011].
Полученные нами результаты также относятся к проблеме разной чувствительности развивающегося и зрелого мозга к облучению. После облучения неонатального мозга рентгеновским излучением пролиферация в субвентрикулярной зоне боковых желудочков мозга восстанавливается быстрее, чем в субгранулярной зоне гиппокампа [Barazzuol и др., 2017]. Необходимо отметить, что частота делений НСК и нейрогенез больше в неонатальном мозге, чем во взрослом. Остаётся выяснить, связан ли эти различия с эффективностью чекпоинтов клеточного цикла, с ответом репарационных механизмов или способностью микроокружения нейрогенных предшественников к восстановлению.
Также существенно, наблюдаются ли также подобные изменения после воздействия других типов излучения. К экспозиции рентгеновскому излучению, гамма-излучению и тяжёлым ионам чувствительны ранние и поздние предшественники нейронов [Barazzuol, Ju, Jeggo, 2017; DeCarolis и др., 2013; Encinas, Enikolopov, 2008; Hellstrm и др., 2009; Li, Cheng, Wong, 2016; Monje и др., 2002; Rivera и др., 2013; Rola и др., 2004a; Rola и др., 2005; Rola и др., 2008], при этом экспозиция к высокоэнергичной радиации может иметь непропорционально более сильный эффект на покоящиеся НСК [DeCarolis и др., 2014; Encinas и др., 2008].
Дополнительным вопросом является отношение полученных нами результатов о радиационной чувствительности НСК к радиационной чувствительности и свойствам других типов стволовых клеток. Как и в зрелом мозге, во множестве тканей стволовые клетки более устойчивы к радиации чем клетки-потомки [Insinga и др., 2013; Li и др., 2016; Mohrin и др., 2010; Sotiropoulou и др., 2010; Walter и др., 2015]. Устойчивость покоящихся НСК гиппокампа может быть обусловлена преимущественной активностью быстрого репарационного механизма (напр., негомологичного соединения концов ДНК как преимущественного). Устойчивость делящихся НСК была меньше покоящихся, но больше, чем делящихся ПП, поэтому в делящихся НСК может происходить переключение с быстрого механизма репарации ДНК на более точный, но медленный (напр., гомологичной репарации) при вхождении НСК в клеточный цикл. Более низкая чувствительность НСК в сравнении с ПП может быть обусловлена тем, что быстрый механизм репарации ДНК может не до конца выключиться в делящихся НСК, но уже не работать в ПП. Такое характерно для гематопоэтических НСК [Mohrin и др., 2010] и может использоваться и другими типами НСК.
Наконец, наши результаты могут говорить о возможной связи длительных когнитивных нарушений после облучения с ослаблением нейрогенеза. Незрелые DCX-экспрессирующие нейроны, которые критически необходимы для обучения в пространственных задачах и переобучения [Vukovic и др., 2013], почти не образовывались через 6 месяцев после облучения. Примечательно, что к этому времени размер пула НСК не изменился значительно. Этот контраст между сохранением НСК и нарушением продукции из них новых нейронов может означать повреждение клеточного и межклеточного микроокружения и указывает на потенциал противовоспалительных препаратов, снимающих блок деления клеток-предшественников, ослабить когнитивные нарушения, вызванные облучением.
Подводя итог, наши результаты показывают, что гамма-излучение влияет на несколько стадий генерации нейронов из НСК. Угнетение претерпевают стадии делящихся НСК, пролиферирующих дочерних клеток и молодых нейронов.