Введение к работе
... "І.- .L''i-Х] 1.
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Проблема адаптации человека и живот; ных к изменяющимся условиям внешней среды является одной из актуальных проблем биологической науки. Освоение человеком обширных территорий аридного - региона и других территорий с жарким климатом ставит задачу изучения влияния на организм различных факторов этих климато-герграфических зон, основным из которых является высокая внешняя температура,
В последнее время внимание специалистов широкого профиля привлекает так называемая система теплового шока, активируемая высокой температурой (тепловым шоком (ТШ )) и другими стрессовыми агентами. Основными компонентами этой системы являются гены теплового шока и кодируемые ими белки - белки теплового шока (БТШ) tLindquist, Craige, 1988]. Их такте называют стрессовыми белками. Накопленные к настоящему времени экспериментальные данные свидетельствуют, что ответ метки на ТШ является примером более общей клеточной реакции на стресс, а БТШ в клетках самых различных организмов - ет Е. 'сої і до человека - выполняют ватаые универсальные защитные функции, позволяющие им пережить стрессо-генное действие тепла и других агентов CSchlesineer et al., 1982; Lindquist, 19863. Эксперименты проведенные в различных лабораториях продемонстрировали важную роль БТШ в формирования термотолерантности клеток [Tanguay,'1983; Laszlo, Li, 1985]. Однозначные эксперименты в пользу адаптивной роли БТШ70 были получены, во-первых, благодаря исследованию ts-мутаций с нарушенной системой генов ТШ и, во-вторых, когда удавалось "ломать" те или иные гены этой системы и анализировать последствия таких нарушений [Jacobsen.Craige, 19843. Нарушения метаболизма, вызванные дефектами в функционировании системы генов ТШ и приводите к гибели клеток или снижению их термоустойчивости, и другие метаболические сдвиги блокируются увеличением внутриклеточной концентрации этих стрессовых белков [Lindquist, Craige, 1988; Welch, ;1990; Bukan et al., 1989; Van Dyk et al., 19893. В последние 2-3 года выяснилось, что БТШ и родственные им полипептиды интимно связаны с многими Еизненновагашми для клетки процессами и являются неотъемлемыми компонентами клеточного метаболизма в нормальных и стрессовых условиях. Генерализованйыэ функции БТШ из семейства БТПІ70 на основе выраганных белок-белковых взаиш-
-2.-
действий реализуются на уровне блокирования агрегации денатурированных и абберантних белков, стабилизации компетентных форм вновь синтезированных полипептидов, их транспорта в различные компартменты клетки, сборки в мультимерные комплексы. Совокупность свойств БТШ70 позволяет сегодня рассматривать их как белки широкого спектра действия, принимающих участие в контроле за состоянием, организацией и распределением пула внутриклеточных белков [Ellis, 19901. В этой связи естественным представляется всё увеличивающееся число работ, доказывамщих участие БТШ в разнообразных метаболических процессах [Hartle, Neupert, 1990; GoloubinofT et al. , 1989; Suhail et al. , 1990; Rynn et al. , 1989; Van Dyk et al. , 1989; Gaitanaris et al. , 19901.
Однако, несмотря на очевидные успехи в изучении защитных свойств БТШ70 на различных культурах клеток, практически отсутствуют работы, посвященные изучению роли БТШ, в частности основного стрессового белка (70 кДа), в естественной адаптации организма к высокой температуре. 'Актуальность таких исследований определяется способностью БТШ, пронизывающих весь клеточный объем и взаимодействующих потенциально с каждым или многими внутриклеточными полипептидами, поддерживать нормальное протекание белок-зависимых метаболических процессов при действии повышенных температур, что может быть одним из отобранных в процессе эволюции механизмов, обеспечивающих существование вида в регионах с жарким климатом. Особый интерес в этом плане представляют различные холоднокровные, обитающие в экологических нишах с различными температурами внешней среды. К сожалению, исследований, где бы сравнивалось .состояние компонентов системы теплового шока (БТШ, мРНК-ВТШ) у нескольких достаточно близких видов, резко отличающихся по температурам естественных сред обитания, пока . крайне мало. В этой связи представляется интересным выяснить состояние некоторых компонентов системы ТШ у организмов, приспособленных в процессе эволюции к различным температурным режимам. Вопрос о.наличии закономерностей и положительных корреляций . ыевду способностью организма к высокотемпературной экспрессии генов ТШ, уровнем содержания и синтеза БТШ, терш-устойчивостыо и температурными условиями обитания вида в природе приобретает сегодня особую актуальность. Его оешение позволит не только приблизиться к пониманию роли БТШ (70 кДа) в естественной адаптации организма к высокой температуре, но и способствовать
разработке особых режимов адаптации к различным стрессам и созданию новых форм с повышенной термоустойчивостью. Наши предварительные наблюдения и единичные работы других авторов [Bosch et al. , 1988; Kimpel, Key, 1985] косвенно указывали на существование определенной закономерности между БТШ и температурными условиями существования вида. Критерием общебиологической значимости такой заг^'^мерности, на наш взгляд, может быть комплесный сравнительный анализ некоторых компонентов системы ТШ, проведенный на достаточно большой выборке животных различных климате-географических зон, существенно отличающихся по температурным параметрам своих сред обитания.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ. Основной целью работы является установление закономерностей и коррелятивных связей между экспрессией, содержанием БТШ и кодирующих их мРНК, термоустойчивостью организма и температурными факторами среды его обитания. Исследования проводились на относительно близких группах видов, отобранных в пределах классов млекопитающих, рептилий, насекомых и простейших, отличающихся1 по температурам сред обитания, в условиях in vivo или на культивируемых клетках in vitro.
ИСПОЛЬЗУЯ ЭТИ ГРУППЫ уНИКаЛЬНЫХ ПРИРОДНЫХ Моделей П ЮТІССТРі!
объектов для исследований, мы поставили перед собой следующие
задачи:
1. У видов, обитающих в различных климато-географических зо
нах, изучить:
спектры БТШ, их индукцию при ТШ in vivo и in vitro и комбинированных стрессовых воздействиях (ТШ и вирусная инфекция), температурные диапазоны синтеза.БТШ;
уровень содержания и конститутивного синтеза БТШ, их тканевую специфичность, внутриклеточную локализацию;
устойчивость общего белкового синтеза к действию высокой температуры.
-
Выявить наличие коррелятивных связей между внутриклеточным содержанием основного БТШ (70 кДа), температурными условиями естественных сред обитания организмов и их термоустойчивостью.
-
Оценить содержание МРНК-БТШ70 в норме и их экспрессию при повышенных температурах у видов, отличающихся по температурным параметрам своих экологических ниш; провести качественный анализ содержания генов БТШ70 у некоторых видов животных аридной зоны.
-
Провести структурно-иммунологический анализ белков из се-
._ 4 -
мейства БТШ70. .. '
5. Изучить температурно-временную динамику синтеза БТШ70 у некоторых организмов в естественных условиях обитания, в модельных экспериментах на природных площадках и в условиях лаборатории.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые на большом числе природных моделей проведен комплексный сравнительный анализ некоторых компонентов клеточной системы ТШ, формирующий новые представления о важной роли БТШ (70 кДа) в естественной адаптации организма к высокой температуре среды:
выявлена позитивная корреляция между уровнем экспрессии генов ТШ, содержанием и синтезом БТШ70-подобных белков, термоустойчивостью организма.и температурными условиями его обитания. Показано, что терморезиетентные организмы отличаются более высоким уровнем содержания и конститутивного синтеза ВТШ70, они обладают более широким температурным диапазоном индукции и продол-хающзгося синтеза БТШ. В клетках этих видов синтез нормального набора клеточных белков сохраняется при более высоких температурах;
обнаружено, что синтез БТШ70 и кодирующих их мРНК в" клетках южных видов шелкопряда и ящериц, в отличие от видов, обитающих в средних и северных широтах, наблюдается при значительно более высоких температурах, вплоть до 45+50С, Высокоэффективная транскрипция мРНК-ШШО у тутового шелкопряда сохраняется и при комбинированном действии ТШ и вируса ядерного' полиздроза (ВЯЛ);
впервые описаны БТШ ящериц, представляющих различные климате- географические эоны, и их эндогенных паразитов - лейшманий. Показано, что сравнительная устойчивость общего белкового, синтеза в клетках паразитов сходна с таковой у соответствующих им хо-8яев. Продемонстрированы высокий консерватизм БТШ ящериц, асинхронная температурозависимая экспрессия различных членов семейства ВТШ70, их структурно-иммуннологические характеристики. Проведен качественный анализ дозы генов БТШ70 у ночных и дневных видов ящериц аридной зоны;
выявлена реальная значимость системы ТШ для ящериц, обитающих в условиях шркой песчаной пустыни. В летнее время года высокой амплитуда колебаний температури тела термофила песчаной круглоголовки сопряжена с синхронными иамененими синтеза основных БТШ (6U кДа). . В отличие от многих друїих организмов, как
- б -
шстиутивные, так и индуцибельные члены семейства ВТІМ) у этого їда зарегистрированы и при 25С;
- обнаружен новый тип зрелых ядерных клеток - эритроциты
Фблюда, - не способных синтезировать БТШ при Till Шесте с тем,
и клетки все же содержат некоторое количество конститутивного
'Ш73, хотя и в существенно меньших количествах, чем лимфоциты.
і основе особенностей синтеза и содержания БТШ в различных тя-IX клеток верблюда выдвинута ітащепция о доминирующей роли шетитутнвной формы БТІІГГО в реализации защитных свойств 'НТО-подобных белков в клетках этого вида;
продемонстрировано,, что в лимфоцитах человека конститутив-ш и индуцибельная формы БТІ1Г70 контактируют с большим числом іеточньгх белков; в очищенных ядрах, куда эти белки проникают ісле ТШ, число таких контактов ограничено;
предложи простой и безболезненный метод анализа индукции інтеза БТШ в свежевыделенных лимфоцитах при гипертермии целого іганизма;
- показано, что тканеспецифическая экспрессия основных БТШ различных типах клеток верблюда и гусениц тутового шелкопряда, іализуется на уровне отдельных членов семейств БТІІІ70 и BTUJJO.
НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ. Результати работы существенно ісширяют и углубляют представления о клеточных белковых факто-іх адаптации организма к высокой температуре. Совокупность поденных данных позволяет рассматривать систему теплэЕого шока lk универсальную отобранную в процессе эволюшш клеточную істему, являющуюся неотъемлемым компонентом стратегии биохими-ской адаптации клетки и целого "организма к температурки усло-[ям внешней среды. Высокая температура среды, как эволюционный іктор, способствует закреплению некоторых клеточных механизмов, [ним из которых является дозированная, в зависимости от значе-[й внешней температуры, активность системы генов белков теплого пока (70 кДа), реализующаяся в конечном счёте в повыиенной :утриклэточной концентрации БТІ1Г70 и кодирующих их мРНК. Очевид-|, что высокая концентрация этих стрессовых белков у "южных" Иов, обитающих при высоких внешних температурах, в сравнении с еверными" видами, необходима для обеспечения возросших, в ответствии с высокими абсолютными значениями температуры внеи-й среды и тела животных, нормальными клеточными и защитными акциями БТШ Это обстоятельство также отражает готовность ор-
ганнзма к резкому изменению температурных условий среды, что возможно при кратковременных перемещениях в пространстве, добывании пищи, В08НШШ0БЄНИИ опасности и т. д.
Значимость представленных данных, впервые полученных на широком спектре видов, с чрезвычайно разнообразными температурами естественных сред обнташш позволяют говорить о наличии реальной вакономернооти, связывающей температурные условия обитания вида с экспрессией генов ТШ, содержанием мРНК-ШГО и ВТШГО-подобных беддоЕ. Проведенні;; зксперні:енти свидетельствуют, что беліиі из сецойства БГІІГ70, 'особенно конститутивно синтезируемые стрессовые беліїИ, 'игрьот рщдіу» роль б естественной адаптации организма к теплу, их повышенная зкспрессия"является одним из неотъемлемых клеточных механизмов, обеспечивающих существование вида в условиях действия высоких внешних температур.
Прсзздешше исследования составляют основу нового перспективного направления'в изучении адаптивных'свойств'системы теплового шока Они позволяет не голыш расширить тєоретичесіме представления о клеточных' факторах адаптация її высокой температуре,- но и создать предпосылки для прогнозирования устойчивости организма к гипертермии, внедрению соотсетствукжвіх критериев профотбора при деятельности в экстремальных условиях, создания нових форм с повышенной термоустойчиЕостыэ.
Результаты исследований могут быть использованы при чтении курсов лекций по экологической Физиологии, общей биологии, молекулярной биологии.
ПУБЛИКАЦИИ. Основное содержание диссертационной работы ішло1 яено в 24 опубликованных.научных работах.
. АППРОЕАЦЩ РАБОТЫ. Материалы диссертации были доложены обсуждении одобрены на различных семинарах, симпозиумах и съездах: I всесоюзное совещание по белкам теплового шока (Гатчина, 1986), IY и Y конференции биохимиков республик Средней Азии и 'Казахстана (Ашхабад, 198S; Ташкент, 1991), научные конференции институтов физиологии (1987) и зоологии (1991) All Туркменистана, васедание бюро биологического отделения Президиума All Туркменистана^ 19.Є8), кевдуиародный конгресс по СПИДу (Стокгольм, 1988), XI Европейское рабочее совещание по клеточному ядру (Суздаль, 1989), YU1 всесоюзная конференция по экологической физио-еогии (1989), 1 всесоюзная токсинологическая конференция (Ашхабад, 1991), Н съезд физиологов республик Средней Азии и Ка
-7-.
захстана (Душанбе, iggi), заседание межлабораторного координаци
онного совета института физиологии АН Туркменистана (1991), меж
лабораторный семинар Института биологии развития им. Н. К. Кольцо
ва АН СССР (1991). '
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация изложена на 280 страницах ма^лиописного текста Она состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов собственных ис-исследований и их обсуждения. Экспериментальные данные документированы 46 рисунками и 4 таблицами. Список цитированной литературы содержит 384 наименований, из них 32 работы отечественных и 352 зарубежных авторов.
Работа выполнялась в рамках научных программ института физиологии АН Туркменистана (номера госрегистрации 01860023443 и 01900005377), программы "Геном человека" (номер госрегистрации 01900050785) и договора о научном сотрудничестве с Институтом молекулярной биологии им. R А. Энгельгардта АН СССР.
Автор выражает глубокую благодарность д. б. н. U. Б. Бвгеньеву,
инициировавшему дачные исследования и "оказавшему неоценимую
консультативную и экспериментальную помощь. '
В экспериментах также принимали участие Б. А. Титаренісо (Ш> АН СССР), а К. Дашкевич, И. JU Абрамова, М. Д. Худайбердыев' (ИФ АН Туркменистана),. С. Б. Акопов (ИБР АН СССР), К. К. Караев, А. Овезму-хамедов (ин-т зоологии АН Туркменистана), ЕНЛяшко, В.К. Викуло-ва (ВИМГЦ ММ СССР). Большую'помощь в сборе биологического материала и соответствующие консультации оказали С. Езммаков, ЧАтаев (ин-т зоологии АН Туркменистана), Б.Туниев (Сочинский заповедник), НЛ. Орлов, ЕБ.Ананьева (Зоологический ия-т АН СССР), В. А, Чзрлин (ИЭБМ8 АН СССР). Важную поддержку в продвижении экспериментальных исследований оказали Б. А. Мдргулис. (ин-т цитологии АН СССР), Т.Я. Брауде-Золотарева (ЙОГ АН СССР), Э. В, Караков (ин-т вирусологии АМН СССР), Е. В. Лесникова (НИИЭиГ МЗ Туркменистана), ЕII Ляпко, предоставившие для исследований соответствуете культуры клеток, антитела и другие препарата Всем перечисленным коллегам автор выражает искреннюю признательность и благодарность.