Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Взаимодействие наноматериалов с клетками .. 10
1.1. Взаимодействие клеток с квантовыми точками 16
1.2. Взаимодействие наночастиц, легированных ионами редкоземельных металлов, с клетками .28
1.3. Взаимодействие магнитных наночастиц с клетками 33
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования... 44
2.1. Материалы исследования 44
2.2 Методы исследования .50
2.2.1. Измерение размера и -потенциала наночастиц 50
2.2.2. Выделение нейтрофильных гранулоцитов .50
2.2.3. Исследование жизнеспособности нейтрофильных гранулоцитов в системе с наноматериалами .51
2.2.4. Определение скорости оседания эритроцитов (СОЭ) 53
2.2.5. Исследование осмотической резистентности эритроцитов унифицированным методом в модификации Л. И. Идельсона .53
2.2.6. Определение степени гемолиза эритроцитов методом кислотных эритрограмм (Терсков, Гительзон, 1957)
2.2.7 Кинетическое исследование спонтанного гемолиза эритроцитов 55
2.2.8 Определение спонтанного гемолиза эритроцитов по методу Ягера .56
2.2.9. Исследование морфологии эритроцитов методом атомно-силовой
микроскопии 57
2.2.10. Статистический анализ результатов 58
ГЛАВА 3. Результаты и их обсуждение 59
3.1 Измерение размера и -потенциала наночастиц 59
3.2. Сравнение влияния наночастиц разных типов на жизнеспособность нейтрофильных гранулоцитов 61
3.3. Исследование влияния наноматериалов на СОЭ и рН крови 71
3.4. Оценка резистентности мембран эритроцитов в системе с наноматериалами различного состава
3.4.1. Исследование влияния наноматериалов на индуцированный гемолиз эритроцитов 78
3.4.2. Влияние наночастиц магнетита на спонтанный гемолиз эритроцитов 89
3.5. Исследование архитектоники эритроцитов после взаимодействия с наночастицами .92
Заключение .105
Выводы .109
Список сокращений .110
Список литературы .
- Взаимодействие наночастиц, легированных ионами редкоземельных металлов, с клетками
- Выделение нейтрофильных гранулоцитов
- Определение степени гемолиза эритроцитов методом кислотных эритрограмм (Терсков, Гительзон, 1957)
- Исследование влияния наноматериалов на СОЭ и рН крови
Взаимодействие наночастиц, легированных ионами редкоземельных металлов, с клетками
Влияние поверхностного покрытия КТ на их взаимодействие с клетками описывалось многими авторами. A. Hoshino и соавт. (2004) исследовали воздействие КТ CdSe/ZnS–ТОФО, покрытых пятью различными оболочками (меркаптоундекановой кислотой (КТ-COOH), цистеамином (КТ-NH2), тиоглицеролом (КТ-OH), покрытиями с двумя функциональными группами КТ-OH/COOH и КТ-NH2/OH) на клетки WTK-1 (клеточная линия человеческих лимфобластов) и клетки Vero. В результате КТ с одинаковым основным составом и различными по химической природе поверхностными молекулами, продемонстрировали различное влияние на клетки. Проникновение КТ в клетки происходило по механизму эндоцитоза. Авторы предположили, что в эндосомах происходит расщепление покрытия КТ, в результате чего высвобождаются поверхностные молекулы (такие как меркаптоундекановая кислота) и проникают в цитоплазму. Таким образом, по мнению авторов, реализуется повреждающий эффект НЧ.
В работе G. Guo и соавт. (2007) также отмечалась зависимость влияния квантовых точек на клетки от их покрытия. В качестве модельной культуры была взята линия HepG2 (клеточная линия карциномы печени человека). В целом большинство используемых покрытий показывают существенное снижение жизнеспособности клеток (оценка шла с помощью МТТ-теста). Жизнеспособность клеток снижалась при увеличении концентрации КТ и времени инкубации.
Важной характеристикой в оценке безопасности применения наноматериалов является поверхностный заряд. G. Guo и соавт. (2007) обнаружили зависимость негативного влияния КТ от заряда поверхностного покрытия. Положительно заряженные (+59,3 мВ) КТ CdSe-ЦТАБ при инкубации с клетками HepG2 проявляли негативные эффекты при любой концентрации. Отрицательно заряженные (-57,6 мВ) КТ с покрытием не вызвали повреждение клеток при низких концентрациях (10 ppm, 20 ppm, 50 ppm) в течение 12, 24, 48 и 72 часов инкубации. Те же КТ, взятые при более высоких концентрациях (100 ppm, 200 ppm, 400 ppm) и тех же периодах инкубации, вызывали снижение жизнеспособности клеток. В случае неионогенных КТ (-13,4 мВ), покрытых Fluronic 68 (F-68), не наблюдалось изменения клеточной жизнеспособности при любых концентрациях.
Результаты, полученные H. Zheng и соавт. (2013) подтверждают эту зависимость. Показано, что КТ CdSe/ZnS, покрытые глутатионом, не только обладают слабым негативным эффектом, но и имеют наилучшие физико-химические характеристики (квантовый выход флуоресценции, стабильность и др.) по сравнению с другими покрытиями, имеющими отрицательный заряд (глутатион, N-ацетил-L-цистеин, дигидролипоевая кислота, тиопронин, меркапто-янтарная кислота). Положительно заряженные CdSe/ZnS, покрытые полиэтиленимином, несмотря на хорошие оптические характеристики гораздо больше снижают жизнедеятельность клеток.
H.D. Summers и соавт. (2010) исследовали стабильность флуоресценции с помощью проточной цитометрии при поглощении КТ мононуклеарами крови человека. Были использованы нанокристаллы состава CdTe/ZnS и CdSe/ZnS с максимумами флуоресценции 705 нм и 585 нм, соответственно. Через 20 минут с начала инкубации было зафиксировано максимальное поглощение КТ моноцитами. Флуоресценция НЧ после поглощения характеризуется двумя периодами: быстрое снижение интенсивности в первые 24 часа инкубации и последующая стабилизация сигнала. Сравнение с контрольными образцами позволило предположить, что основным фактором, способствующим спаду сигнала в начальный период, является взаимодействие КТ с внутриклеточной средой. С помощью конфокальной микроскопии визуализируется взаимодействие НЧ с клеточной мембраной, их интернализация и инкапсуляция в эндосомах. С другой стороны, снижение сигнала флуоресценции может быть связано с агрегацией КТ, что препятствует их проникновению через мембрану клеток. В исследовании S. Ranjbarvaziri и соавт. (2011) КТ разного размера с максимумами флуоресценции 525, 585 и 800 нм были использованы для мечения клеток CD133+, CD34+, CD14+ и мезенхимальных стволовых клеток (MSCs). Квантовые точки КТ525 и КТ585 в качестве кора содержали CdSe/Zns, КТ800 – CdTe/ZnS. Результаты показали, наличие высоко эффективной интернализации в течение 1-2 часов с возможным участием макропиноцитоза. Показано, что НЧ большего размера требуется больше времени для проникновения в клетку. В клетках CD133+ и CD34+ поглощенные НЧ локализовались на периферии ядер в центре формирования микротрубочек веретена деления. В случае клеток CD14+ и MSCs было обнаружено равномерное распределение в цитоплазме независимо от размера КТ. Кроме того, не было отмечено ощутимого воздействия КТ в концентрации 10 нМ на жизнеспособность клеток. Результаты проточной цитометрии показали значительное снижение интенсивности флуоресценции всех типов КТ после 24 часов инкубации (27С) с клетками CD133+ и CD34+. Вместе с тем понижение температуры повышало устойчивость НЧ. В связи с этим авторы предположили, что потеря сигнала флуоресценции связана с вовлечением КТ в энергозависимые процессы клетки. В частности, в случае CD14+ и MSCs выявлена зависимость между интенсивностью сигнала КТ800 и клеточным делением.
КТ влияют на функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов. В частности, они способны подавлять кислородзависимый метаболизм нейтрофилов. Причем, в состоянии активации клеток альтерационное воздействие КТ было более выраженным. Наибольшим повреждающим влиянием обладают НЧ состава CdSe/CdS-МУК. Авторами выявлено также подавление функционирования гранулярной системы нейтрофильных гранулоцитов под воздействием КТ (Плескова, Михеева, 2011).
Выделение нейтрофильных гранулоцитов
Нейтрофилы выделялись из гепаринизированной венозной крови здоровых доноров на двойном градиенте фиколла-урографина. Венозная кровь, взятая из локтевой вены здорового донора, смешивалась с физиологическим раствором (ОАО НПК ЭСКОМ", Ставрополь), куда предварительно вносился гепарин 20 мкл (50 ед/мл), в соотношении 1:1. Для выделения нейтрофильных гранулоцитов смесь центрифугировали в течение 45 мин (200g). Выделенную фракцию нейтрофилов дважды отмывали физиологическим раствором (200g, 3 мин и 2 мин) (Подосинников и соавт., 1981). После подсчитывалось количество нейтрофилов в камере Горяева, затем клетки ресуспендировались в физиологическом растворе в концентрации 2106 клеток/мл.
Исследование жизнеспособности нейтрофильных гранулоцитов в системе с наноматериалами Исследования проводились в научно-образовательном центре «Физика твердотельных наноструктур» ННГУ им. Н.И. Лобачевского на флуоресцентном микроскопе Olympus IX71 (Япония). Тест основан на способности красителя пропидиума йодида (PI) проникать в погибшие клетки через поврежденную мембрану и связываться с ДНК. Пропидиум иодид связывается с ДНК посредством интеркаляции в участки ДНК, стехиометрически взаимодействуя с 4-5 парами оснований. Флуоресценция комплекса PI с ДНК регистрируется в красной области спектра с использованием светофильтра U-MNG2.
Для приготовления рабочего раствора красителя (конечная концентрация 1,510-8 М) ex tempore смешивались 10 мл физиологического раствора с 20 мкл раствора PI (3,7410-5 М) («Sigma», США). Туда же добавлялись 100 мкл нативной сыворотки, выделенной из венозной крови здоровых доноров путем естественного свёртывания.
Нейтрофильные гранулоциты (2106 клеток/мл) инкубировались в чашке Петри («Corning», США) для спонтанной адгезии клеток к подложке (30 мин, 37С). Затем клетки инкубировались с НЧ, взятыми в различных концентрациях (30 мин с наноразмерными флуорофорами и 60 мин с наночастицами магнетита, 37 С). Начальная концентрация квантовых точек КТ-МПК и КТ-polyT составила 10-4; 10-3; 0,01; 0,1; 1 мг/мл, КТ-SiO2-NH2 – 0,01; 0,1; 1; 10; 18 мг/мл. Начальная концентрация АК-НЧ со структурой витлокита составила 0,12; 0,24; 0,6; 1,2; 2,4 мг/мл. Начальная концентрация наночастиц F3:Er/Yb – 1,5310-7; 1,5310-6; 1,5310-5; 1,5310-4; 1,5310-3; 3,0510-3 мг/мл. Начальная концентрация наночастиц магнетита составила – 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3 мг/мл. Далее клетки фиксировались 96% этанолом (15 мин), промывались дистиллированной водой, окрашивались рабочим раствором PI (30 сек) и снова пятикратно отмывались дистиллированной водой. Аналогично проводилось окрашивание контрольных образцов. Препараты микроскопировались на флуоресцентном микроскопе Olympus IX71, для возбуждения красителя использовалась галогеновая лампа. В каждой чашке подсчитывались 100 клеток, среди которых определялся процент погибших.
На основании полученных данных были построены кривые «концентрация наночастиц/процент живых клеток». Показатель DL50 определялся с помощью методов экстраполяции кривой гибели клеток и пробит-анализа. Пробит-анализ выполнялся в программе Probit Analysis 4, в основу которой положен алгоритм метода максимального правдоподобия, изложенный D.J. Finney (Finney, 1971).
В методе пробит-анализа предполагается, что зависимая переменная Y принимает два значения - 0 и 1. Считается, что вероятность того, что Y=1, определяется нормальным распределением. При использовании пробит-регрессии в биологии принимается x=lg(d), где d - доза ксенобиотика (Справочник по прикладной статистике, 1989, т. 1, с. 284-300). В результате логарифмического преобразования модель приобретает вид:
Исследование проводилось по методу Т. П. Панченкова (1972 г.). Венозная кровь здоровых доноров смешивалась с 5% раствором цитрата натрия в соотношении 3:1. В кровь вносились НЧ, и далее кровь переносилась в капилляры Панченкова. Для каждого капилляра время засекали отдельно. СОЭ определялась по высоте столба прозрачной плазмы через 1 час (Меньшиков и соавт., 1987, с. 122). КТ вносились в конечной концентрации 0,1 мг/мл; НЧ состава F3:Er/Yb – 0,076 мг/мл, -Ca3(PO4)2:Er3+,Yb3+ (Er/Yb=0,17) и -Ca3(PO4)2:Er3+,Yb3+ (Er/Yb=0,1) – 0,12 мг/мл; конечная концентрация МНЧ составила – 0,0018 мг/мл и 0,18 мг/мл.
Для каждого образца также проводились измерение рН («MettlerToledo» AG, China) до внесения наноматериалов (контрольное измерение), сразу после внесения и через 30 мин после внесения (для КТ и НЧ с Er/Yb) либо через 60 мин для МНЧ.
В клинической практике наибольшее распространение получило исследование осмотической резистентности эритроцитов унифицированным методом в модификации Л. И. Идельсона (Меньшиков и соавт., 1987, с. 119-120).
Принцип метода заключается в количественном определении степени гемолиза эритроцитов в гипотонических растворах хлорида натрия. Оптическая плотность измерялась с помощью спектрофотометра («СПЕКС ССП-705», Россия).
Для проведения эксперимента предварительно готовился раствор NaCl в диапазоне от 0,9% до 0,2 % (0,1548 М, 0,1376 М, 0,1204 М, 0,1032 М, 0,0860 М, 0,0688 М, 0,0516 М, 0,0344 М). Для исследования гепаринизированная венозная кровь инкубировалась с наноматериалами при комнатной температуре. КТ брали в конечной концентрации 0,1 мг/мл, время инкубации - 30 мин. Конечная концентрация НЧ состава F3:Er/Yb - 0,076 мг/мл, -Ca3(P04)2:Er3+,Yb3+ (Er/Yb=0,17) и Ca3(P04)2:Er3+,Yb3+ (Er/Yb=0,l) - 0,12 мг/мл, время инкубации - 30 мин. Конечная концентрация МНЧ составила 0,0018 мг/мл и 0,18 мг/мл, время инкубации - 1 час.
Рабочие растворы NaCl (от 0,9% до 0,2%) инкубировались с 20 мкл крови с наноматериалами (30 мин, 24С). В качестве контрольной пробы использовались 20 мкл крови без НЧ. Затем смесь центрифугировалась 5 мин (356g). После чего из каждой пробирки отбиралась надосадочная жидкость и измерялась оптическую плотность на длине волны 540 нм (зеленый светофильтр) в кювете против холостой пробы (физиологический раствор).
Определение степени гемолиза эритроцитов методом кислотных эритрограмм (Терсков, Гительзон, 1957)
Спонтанный гемолиз эритроцитов исследовался методом Ягера. Метод основан на фотометрическом определении внеэритроцитарного гемоглобина (при 540 нм), поступающего в среду вследствие спонтанного лизиса мембран эритроцитов, вызванного ПОЛ кислородом воздуха. Контрольное значение степени гемолиза эритроцитов составило 26,5±6,8%. Статистически значимых различий после инкубации с наночастицами магнетита по сравнению с контролем не зафиксировано (31,7±6,6% и 34,7±9,6% для конечной концентрации 0,0018 мг/мл и 0,18 мг/мл соответственно). Однако наблюдается тенденция к снижению резистентности эритроцитов под воздействием наноматериалов. Таким образом, МНЧ по-видимому, может вызвать лишь незначительное усиление ПОЛ в мембранах эритроцитов.
Внесение НЧ в систему также как в случае кислотного гемолиза повлияло на кинетику спонтанного гемолиза эритроцитов. На рисунке 18 представлены типовые эритрограммы спонтанного гемолиза эритроцитов при внесении в кровь МНЧ. Показано изменение эритрограммы после инкубации с наночастицами, однако статистически значимых различий с контролем не зафиксировано. Среднее значение максимума гемолиза в контроле составило 42,3% на 137-й секунде измерения. После воздействия ксенобиотика пик гемолиза наступает в среднем на 145-й секунде и достигает 41,1% для концентрации 0,0018 мг/мл и на 225-й секунде 67,5% для 0,18 мг/мл. Причем при более высокой концентрации МНЧ наблюдается усиление гемолиза эритроцитов, но время наступления максимального гемолиза увеличивается.
О стимуляции спонтанного гемолиза под воздействием наночастиц магнетита также говорит увеличение площади под кривыми на графиках «время-степень гемолиза» (таблица 6).
В работе А.Г. Гущина и соавт. (2011) упоминалось, что, несмотря на общий позитивный реологический эффект (снижение вязкости плазмы и агрегации эритроцитов), увеличение концентрации МНЧ вызывает гемолиз эритроцитов. Эти данные согласуются с результатами наших исследований.
Полученные данные демонстрируют неоднозначное влияние наночастиц магнетита на физико-химические параметры эритроцитов и крови в целом. С одной стороны, по сравнению с КТ и АК-НЧ они практически не изменяют рН крови и СОЭ, а также осмотическую резистентность эритроцитов. Однако более глубокое исследование индуцированного и спонтанного гемолиза с помощью кинетических методов показало, что взаимодействие МНЧ с эритроцитами имеет более сложный характер. Под действием данного типа наноматериалов спонтанный гемолиз эритроцитов усиливался, что говорит о наличии альтерирующего влияния МНЧ на мембраны. Однако подавление кислотного гемолиза эритроцитов свидетельствует о том, что взаимодействие
Разнонаправленность реакции на внесение наночастиц магнетита в присутствии и в отсутствии гемолитика может объясняться следующим. Транспорт H+ через мембрану с помощью анионтранспортного белка (белка полосы 3) является лимитирующей стадией кислотного гемолиза (Доценко, Мищенко, 2011). К снижению скорости проникновения H+ в цитозоль и замедлению начала гемолиза приводит ингибирование белка полосы 3 и увеличение ассоциации белка полосы 3 с компонентами клетки. Подавление кислотного гемолиза под воздействием МНЧ можно связать с их влиянием на транспортный белок и его ингибирование. Однако можно предположить, что такое же воздействие на анионтранспортный белок происходит и в отсутствие гемолитика. Следует отметить, что наночастицы магнетита могут вступать в реакцию с соляной кислотой согласно уравнению (5): FeOFe2O3 + 8HCl FeCl2 + 2FeCl3 + 4H2O (5) Тем самым концентрация кислоты в системе уменьшается, что приводит к снижению степени кислотного гемолиза по сравнению с контролем. Спонтанный гемолиз, напротив, стимулируется НЧ, что можно объяснить их повреждающим влиянием на различные клеточные структуры.
Таким образом, в данном разделе показано, что наноматериалы разных типов проявляют разную гемолитическую активность. КТ и АК-НЧ способствуют замедлению индуцированного гемолиза эритроцитов, то есть проявляют протекторные свойства по отношению к мембранам эритроцитов. Данный эффект отмечается как при исследовании гипоосмотического, так и кислотного гемолиза. Объяснением продемонстрированного феномена могло являться взаимодействие, как с компонентами мембран, так и проникновение ксенобиотиков в клетку. Воздействие на клеточную мембрану ведет к изменению ее ригидности и изменению архитектоники эритроцитов под влиянием наноматериалов. Поэтому в дальнейшем будет рассмотрено влияние ксенобиотиков на морфологические параметры эритроцитов.
Увеличение жизнеспособности эритроцитов и изменение основных физико-химических свойств крови под воздействием альтерирующих факторов могло объясняться изменением формы эритроцитов под воздействием наноматериалов. Для исследования архитектоники клеток была использована атомно-силовая микроскопия, позволяющая изучать поверхность клеток с высоким разрешением (Плескова, 2011, с. 5-9).
На рисунке 19 представлена морфология эритроцитов в контроле. На скане и на боковом сечении профиля клетки видна нормальная форма эритроцитов в виде двояковогнутого диска – нормоцит. На боковом сечении профиля клетки (рис. 19б) представлено расположение измеряющих плоскостей. Измеряющие плоскости располагались на полувысоте клетки, чтобы нивелировать эффект конволюции. Из рисунков 20-27 можно видеть, что после воздействия наноматериалов на эритроциты архитектоника клеток существенно изменялась. Все виды НЧ вызывают выраженный пойкилоцитоз, причем для разных типов наноматериалов наблюдались преимущественно различные изменения формы эритроцитов.
Наиболее распространенными формами эритроцитов после инкубации с КТ-МПК являются стоматоциты (рисунок 20а) и планоциты (рисунок 20в). Взаимодействие с КТ-ро1уТ в основном вызывало появление кодоцитов (рисунок 21а), хотя наблюдались и другие формы клеток. Кодоциты также преимущественно появлялись под воздействием КТ-Si02-NH2, но встречались также стоматоциты и планоциты (рисунок 22). АК-НЧ наночастицы состава F3:Er/Yb вызывали появление эхиноцитов (рисунок 23), НЧ на основе витлокита - кодоцитов (рисунки 24-25). Изменение архитектоники эритроцитов наблюдалось также после взаимодействия с наночастицами магнетита независимо от концентрации. Наиболее часто встречающимися формами эритроцитов в этом случае стали сфероциты и эхиноциты (рисунки 26-27).
Исследование влияния наноматериалов на СОЭ и рН крови
Негативные эффекты влияния НЧ на разных уровнях организации живой материи в последние годы отмечают все больше исследователей. В связи с этим для обеспечения безопасности применения новых ксенобиотиков возникает необходимость тщательного исследования механизмов их взаимодействия с различными клетками. Кроме того, разнообразие создаваемых НЧ, отличающихся физико-химическими свойствами, структурой и целевым назначением, а также разнообразие концентраций и методов исследования затрудняет сравнение биобезопасности различных наноматериалов. Несмотря на большое число исследований в этой области, по-прежнему наблюдается недостаток информации в первую очередь о механизмах воздействия НЧ на клетки крови.
Нейтрофильные гранулоциты являются важнейшим фактором неспецифической резистентности организма, в связи с чем привлекают внимание в качестве модели для оценки безопасности применения наноразмерных ксенобиотиков (Bartneck и соавт., 2010; Goncalves, de Liz, Girard, 2011). Анализ отечественных и зарубежных источников литературы показал рост числа исследований, посвященных взаимодействию различных НЧ с данным типом клеток. Неоднократно отмечался негативный эффект влияния наноматериалов на функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов (Babin и соавт., 2013; Kumazawa и соавт., 2002; Mainardes и соавт., 2009; Jovanovic и соавт., 2011; Плескова, Михеева, 2011; Горшкова, 2014). Учитывая все вышесказанное, на первом этапе данного исследования было целесообразно сравнение медиальных летальных доз наноматериалов именно в отношении нейтрофилов. Результаты исследования показали, что под влиянием всех исследуемых наноматериалов зафиксировано дозозависимое снижение жизнеспособности нейтрофильных гранулоцитов. Наименьший негативный эффект характерен для наночастиц FeOFe2O3, так как они вызывали гибель клеток при больших концентрациях и времени воздействия по сравнению с КТ и АК-НЧ.
На следующем этапе исследовалось влияние ксенобиотиков на кровь в целом. Для этого были оценены изменения таких характеристик крови как скорость оседания эритроцитов и рН крови. Выявлено, что КТ и АК-НЧ состава F3:Er/Yb существенно замедляют СОЭ, тогда как НЧ -Ca3(PO4)2:Er3+,Yb3+ и МНЧ практически не оказывают влияния на этот показатель. Кроме того, показано, что наноматериалы по-разному влияют на рН крови – КТ вызывают незначительный ацидоз крови, инкубация с АК-НЧ наоборот приводит к существенному сдвигу в щелочную сторону, в то время как инкубация крови с наночастицами магнетита не вызвала изменений рН. СОЭ – параметр, который зависит от многих факторов: количества, объема, формы и величины заряда эритроцитов, их способности к агрегации, белкового состава плазмы. Причем, в большей степени СОЭ зависит от свойств плазмы, чем эритроцитов. Таким образом, по изменению данных параметров можно косвенно судить не только о влиянии НЧ на эритроциты, но и на изменения в плазме крови. Эритроциты – самая многочисленная фракция форменных элементов крови, выполняющая множество функций. Кроме того, эритроциты часто выступают в качестве модельных клеток в исследованиях клеточных мембран (Горюнов и соавт., 2009; Mocan, 2013). Поэтому на следующих этапах рассматривалось влияние всех типов НЧ на эритроциты.
Выявлено, что КТ и АК-НЧ оказывают протективное воздействие на мембраны эритроцитов, что выражается в подавлении индуцированного гемолиза – снижается степень гипоосмотического гемолиза, смещается его пик и изменяется эритрограмма кислотного гемолиза. В наибольшей степени резистентность мембран изменяется под действием АК-НЧ на основе фторидной матрицы, а НЧ на основе биогенного минерала витлокита вызвали незначительное подавление гемолиза эритроцитов. Однако в работе T. Mocan (2013) было показано, что под действием НЧ серебра, наоборот, гемолиз эритроцитов усиливается.
Влияние наночастиц магнетита на индуцированный осмотический и спонтанный гемолиз незначительно. Однако кинетические исследования дают более глубокое представление о влиянии НЧ на клеточные мембраны. Несмотря на незначительное влияние МНЧ на индуцированный осмотический гемолиз эритроцитов, эритрограмма кислотного гемолиза говорит о его подавлении НЧ. И напротив, эритрограмма спонтанного гемолиза демонстрирует усиление лизиса мембран под влиянием МНЧ. Разнонаправленность реакции на присутствие гемолитика свидетельствует о его участии в процессах взаимодействия НЧ с мембранами клеток. Изменение важнейших характеристик крови и резистентности мембран эритроцитов под воздействием альтерирующих факторов может быть связано с изменением архитектоники эритроцитов под воздействием наноматериалов. С помощью АСМ было показано, что все исследуемые наноматериалы вызывают явления пойкило- и анизоцитоза. Стоит также отметить, что для разных типов наноматериалов наблюдались преимущественно различные изменения архитектоники эритроцитов, что соответствует данным, полученным другими исследователями (Горюнов и соавт., 2009). Поскольку причины и механизмы образования разных форм эритроцитов отличаются друг от друга, можно сделать вывод о том, что разнообразие измененных форм эритроцитов, наблюдаемых после инкубации с ксенобиотиками, обусловлено различиями в составе и свойствах разных типов наноматериалов.