Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
1.1. Клеточно-молекулярные основы и физиологические проявления адрено- и холинореактивности организма
1.1.1. Клеточно-молекулярные механизмы и физиологические проявления адренореактивности сердца и эритроцитов крови
1.1.2. Клеточно-молекулярные механизмы и физиологические проявления холинореактивности сердца и эритроцитов крови
1.1.3. Клеточно-молекулярные основы модуляции адрено-, холинореактивности, взаимодействия адрено- и холинорецепторов
1.1.4. Современные подходы к оценке адрено- и холинореактивности сердечного ритма и эритроцитов крови
1.2. Взаимосвязи процессов свободнорадикального окисления и механизмов вегетативной регуляции функций
1.3. Нейромедиаторные системы и их влияние на функции сердца и форменные элементы крови
1.4. Стресс-индуцированные изменения функций нейромедиаторных систем, сердца и свободнорадикальных процессов в крови
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 39
2.1. Общая характеристика экспериментов
2.2. Экспериментальные воздействия
2.2.1. Введение препаратов, влияющих на нейромедиаторные процессы
2.2.2. Моделирование острого стресса
2.3. Методика забора крови
2.4. Методика определения -адренореактивности эритроцитов и её модификация для оценки М-холинореактивности эритроцитов
2.5. Цитологическое определение способности эритроцитов связывать катехоламины
2.6. Методика регистрации ЭКГ и анализа вариабельности сердечного ритма у крыс
2.7. Методики исследования свободнорадикального баланса крови
2.8. Методика определения общего гемоглобина крови
2.9. Статистические методы анализа данных
ГЛАВА 3. Адрено- и холинореактивность эритроцитов крыс и анализ их взаимосвязей с показателями сердечного ритма и свободнорадикального баланса крови
3.1. Адрено- и холинореактивность эритроцитов крыс и их взаимосвязи с показателями вариабельности сердечного ритма
3.2. Адрено- и холинореактивность эритроцитов крыс и их взаимосвязи с показателями свободнорадикального баланса крови
ГЛАВА 4. Адрено- и холинореактивность эритроцитов, показатели сердечного ритма и свободнорадикального баланса крови крыс при введении -адрено-, м холиноблокаторов и в условиях острого стресса
4.1. Изменения -АРЭ, показателей сердечного ритма и свободно-радикального баланса крови при введении -адреноблокатора
4.2. Изменения реактивности эритроцитов, показателей сердечного ритма и свободнорадикального баланса крови при введении М-холиноблокатора
4.3. Стресс-индуцированные изменения -АРЭ и М-ХРЭ, показателей сердечного ритма и свободнорадикального баланса крови
4.4. Особенности стресс-индуцированных изменений исследуемых показателей на фоне введения -адрено- и М-холиноблокаторов
ГЛАВА 5. Адрено- и холинореактивность эритроцитов, показатели сердечного ритма, свободнорадикального баланса крови и их изменения в экспериментах на фоне стимуляции центральных нейромедиаторных систем
5.1. Влияние стимуляции центральных нейромедиаторных систем на адрено- и холинореактивность эритроцитов, показатели сердечного ритма и свободнорадикального баланса крови крыс
5.2. Изменения исследуемых показателей при введении -адрено- и М-холиноблокаторов на фоне стимуляции центральных нейромедиаторных систем
5.3. Особенности стресс-индуцированных изменений исследуемых показателей на фоне стимуляции центральных нейромедиаторных систем
5.4. Особенности стресс-индуцированных изменений исследуемых показателей при введении -адрено- и М-холиноблокаторов на фоне стимуляции центральных нейромедиаторных систем
Заключение 113
Выводы
Список литературы
- Клеточно-молекулярные основы модуляции адрено-, холинореактивности, взаимодействия адрено- и холинорецепторов
- Введение препаратов, влияющих на нейромедиаторные процессы
- Адрено- и холинореактивность эритроцитов крыс и их взаимосвязи с показателями свободнорадикального баланса крови
- Изменения реактивности эритроцитов, показателей сердечного ритма и свободнорадикального баланса крови при введении М-холиноблокатора
Введение к работе
Актуальность темы. Адрено- и холинореактивность как способность тканей и органов изменять свойства и функции в ответ на действие адренергических и холинер-гических регуляторных факторов (Авакян А.Э. и Ткачук В.А. 2003; Циркин В.И. и со-авт., 2015) является одной из проблем физиологии, которая сохраняет актуальность, несмотря на ее разработку в различных аспектах: возрастном, гендерном, на уровне различных органов и тканей (Манухин Б.Н., 1984, 1993; Глушковская-Семячкина О.В., 2002; Стрюк Р.И., Длусская И.Г., 2003; Ситдиков Ф.Г., Зефиров Т.Л., 2006; Ананьев В.Н., 2011; Стрельникова А.И. и соавт., 2012; Коротаева Ю.В. и соавт., 2010, 2013; Цир-кин В.И. и соавт., 2015).
Эти свойства обусловлены присутствием на мембранах клеток адрено- и холино-рецепторов. Известно, что адренорецепторы локализованы практически во всех органах и тканях (Wenzel D.G., Su J.L., 1966; Lands A.M. et al., 1967; Brown J.E. et al., 1983; Kawabe K. et al., 1998; Стрюк Р.И., Длусская И.Г., 2003; Циркин В.И., Громова М.А., 2008). Различные подтипы холинорецепторов обнаружены на мембранах кардиомиоци-тов, гладких мышечных клеток и других (Levey A.I., 1993; Eglen R.M. et al., 1996; Caulfield M.P., Birdsall N.J., 1998). Не составляют исключение и форменные элементы крови, на мембранах которых доказано присутствие адренорецепторов (Bilezikian J.P., Aurbach G.D., 1973; Levitzki A. et al., 1974; Rasmussen H. et al., 1975) и холинорецепто-ров (Tang L.C., 1984, 1986, 1991; Carvalho F.A. et al., 2004; Стрельникова А.И. и соавт., 2012).
Связывание блокаторов и агонистов с адренорецепторами эритроцитов влияет на их осмотическую стойкость, деформируемость, реологические свойства, скорость оседания и скорость агглютинации (Соминский В.Н. и соавт., 1981; Стрюк Р.И., Длусская И.Г., 2003; Муравьев А.В., Муравьев А.А., 2005; Тихомирова И.А. и соавт., 2006; Цир-кин В.И. и соавт., 2008, 2015; Коротаева К.Н. и соавт. 2010; Стрельникова А.И. и соавт., 2012; Шамратова В.Г. и соавт., 2012). Некоторые из этих свойств изменяются при воздействии на холинорецепторы эритроцитов (Стрельникова А.И. и соавт., 2012; Циркин В.Н. и соавт., 2015).
На основе этих фактов было разработано достаточно большое число методов определения реактивности эритроцитов, которые нашли применение в клинике (Стрюк Р.И., Длусская И.Г., 2003; Циркин В.И. и соавт., 2008; Крысова А.В., Циркин В.Н., 2011; Стрельникова А.И. и соавт., 2012; Шамратова В.Г. и соавт., 2012). По мнению авторов, -адренореактивность и М-холинореактивность эритроцитов (-АРЭ и М-ХРЭ) позволяют оценивать системные проявления активности симпатоадреналовой и холинергиче-ской систем. Не исключено, что это действительно так. Однако на основе преимущественно клинических данных сложно дать физиологическую оценку значимости -АРЭ и М-ХРЭ для организма. Осмысление физиологической роли этих свойств эритроцитов предполагает определение не только видовой и внутригрупповой изменчивости, механизмов проявления, но и закономерностей изменений при воздействии на регуляторные системы организма, что требует организации соответствующих экспериментальных исследований.
Известно, что физико-химические свойства и молекулярная организация мембран эритроцитов, рецепция ими регуляторных веществ, претерпевают изменения при сдвигах в нейромедиаторном обмене мозга, колебаниях активности моноаминергических систем (Рязанцева Н.В., Новицкий В.В., 2003; Дыгай А.М., Скурихин Е.Г., 2011). Одна-3
ко прямых указаний на изменения -АРЭ и М-ХРЭ при этих состояниях в доступной литературе не обнаружено.
Для оценки состояния как адренергической, так и холинергической систем часто используют методы анализа вариабельности сердечного ритма (ВСР) (Полунин И.Н., 1997; Баевский Р.М. и соавт., 2002; Дмитриева С.Л., 2012; Курьянова Е.В., 2012; Горст В.Р. и соавт., 2014). Однако сведения о взаимосвязях параметров ВСР с показателями адрено- и холинореактивности эритроцитов крови практически отсутствуют. Это определяет потребность в такой информации как для уточнения интерпретации показателей реактивности эритроцитов, так для более глубокого понимания динамики показателей ВСР с учетом данных о мембранной рецепции регуляторных факторов.
Известно, что катехоламины и холиноподобные вещества могут влиять на интенсивность свободнорадикального окисления (Меерсон Ф.З., 1981; Мещанинов В.Н. и со-авт., 2015). Процессы перекисного окисления липидов изменяют физико-химические свойства мембран (Малахова М.Я., 1995; Луценко М.Т., 2010; Аль-Рабии М.А.М., 2015) и способны модулировать аффинность рецепторов к регуляторным факторам. Тем не менее фактические данные, подтверждающие связь -АРЭ и М-ХРЭ с процессами сво-боднорадикального окисления, антиоксидантной защитой эритроцитов практически отсутствуют.
С учетом вышесказанного целью работы стало исследование -адрено- и М-холинореактивности эритроцитов, их сопряженности с показателями сердечного ритма и свободнорадикального баланса крови в норме и при изменении активности периферических и центральных нейромедиаторных процессов у нелинейных крыс. В связи с поставленной целью были определены следующие задачи:
-
Определить величины и диапазоны изменчивости -АРЭ и М-ХРЭ, проанализировать их возможные связи с параметрами ВСР и свободнорадикального баланса крови у интактных нелинейных крыс.
-
Выявить характерные изменения -АРЭ и М-ХРЭ, оценить их согласованность с динамикой связывания адреналина, параметрами ВСР и свободнорадикального баланса крови при введении блокаторов -адрено- и М-холинорецепторов.
-
Исследовать динамику -АРЭ и М-ХРЭ и ее сопряженность со сдвигами в связывании адреналина эритроцитами, параметров ВСР и свободнорадикального баланса крови в условиях острого стресса и его комбинации с введением -адрено- и М-холиноблокаторов.
-
Выявить общие и специфические изменения -АРЭ, М-ХРЭ и связывания адреналина эритроцитами, определить их согласованность с динамикой параметров ВСР и сво-боднорадикального баланса крови при активации центральных нейромедиаторных систем (норадренергической, серотонинергической и дофаминергической).
-
Выявить особенности действия блокаторов -адрено- и М-холинорецепторов на -АРЭ и М-ХРЭ, связывание адреналина эритроцитами, параметры ВСР и свободноради-кального баланса крови в условиях активации центральных нейромедиаторных систем.
-
Определить особенности эффектов стресс-индуцированного подъема уровня ка-техоламинов, его сочетания с введением -адрено- и М-холиноблокаторов на -АРЭ и М-ХРЭ, рецепцию адреналина эритроцитами, параметры ВСР и свободнорадикального баланса крови на фоне активации центральных нейромедиаторных систем.
Научная новизна результатов исследования. Новизна работы состоит в экспериментальном исследовании -АРЭ и М-ХРЭ, формировании представлений об их изменениях и сопряженности с показателями сердечного ритма и свободнорадикального баланса крови при моделировании блокады и активации нейромедиаторных процессов у
нелинейных крыс. Впервые определены значения, установлены диапазоны варьирования и проанализирована структура выборки нелинейных крыс по величинам -АРЭ и М-ХРЭ, дана оценка информационной значимости и корреляционным связям -АРЭ и М-ХРЭ в совокупности с показателями ВСР и свободнорадикального баланса крови.
Впервые экспериментально доказано, что введение блокаторов адрено- и холино-рецепторов, а также стрессогенный подъем уровня катехоламинов вызывают снижение -АРЭ, а также М-ХРЭ при уменьшении (на фоне блокаторов) и увеличении (при стрессе) количества гранул связанного эритроцитами адреналина. Эти данные свидетельствуют о взаимном влиянии систем адрено- и холинорецепции на уровне мембран эритроцитов. В условиях введения блокаторов адрено- и холинорецепторов, острого стресса и их комбинации впервые показано, что однонаправленные изменения -АРЭ и М-ХРЭ сопряжены как со снижением, так и с повышением ЧСР, параметров ВСР и свободнора-дикального баланса крови.
Получены новые данные о значительном и стабильном увеличении -АРЭ и умеренном снижении способности эритроцитов связывать адреналин в условиях моделирования повышенной активности центральных нейромедиаторных систем. Рост -АРЭ сопряжен с повышением ЧСР и ригидности сердечного ритма, со снижением интенсивности свободнорадикальных процессов в крови.
Впервые обнаружено, что особенности рецепции и реактивности эритроцитов к катехоламинам, вызванные стимуляцией центральных нейромедиаторных систем, модифицируют эффекты блокаторов адрено- и холинорецепторов, катехоламинов стресса в отношении показателей реактивности эритроцитов, ВСР и свободнорадикального баланса крови.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты существенно расширяют и дополняют представления о реакциях эритроцитов на вещества, комплементарные -адрено- и М-холинорецепторам, о внутригрупповом варьировании этих свойств эритроцитов у нелинейных крыс, их изменчивости при различных состояниях организма и воздействии на нейромедиаторные процессы. Сопряженность изменений -АРЭ и М-ХРЭ, ВСР и свободнорадикального баланса крови подтверждает значимость показателей реактивности эритроцитов для характеристики регуляторных влияний на уровне мембранной рецепции с учетом интенсивности свободнорадикаль-ных процессов в крови. На основе полученных данных сформулированы представления о значении адренореактивности для изменения свойств и функций эритроцитов и роли холинореактивности как фактора модуляции адренергических влияний на эритроциты.
Результаты работы, в том числе способ определения М-холинореактивности эритроцитов, расширяют базу экспериментального изучения механизмов регуляции функций, свойств эритроцитов при моделировании различных состояний организма. Результаты исследования могут иметь значение для уточнения интерпретаций динамики величин -АРЭ и М-ХРЭ, для прогнозирования и контроля эффектов препаратов, влияющих на нейромедиаторные процессы в клинической и экспериментальной практике. Результаты работы включены в учебный процесс в рамках дисциплин «Физиология человека и животных», «Клеточная биология», «Цитология» и учебно-производственных практик в Астраханском государственном университете.
Методология и методы исследования. Работа выполнена на кафедре физиологии, морфологии, генетики и биомедицины Астраханского государственного университета. Часть работы была осуществлена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований в рамках проекта «Роль центральных нейромедиаторных систем в формировании медленных волн вариабельности сердечного ритма» (№14-04-00912).
Эксперименты выполнены на нелинейных белых крысах (n=196) в соответствии с принципами биоэтики. На первом этапе исследования определяли и анализировали исходные величины -АРЭ, М-ХРЭ, параметров ВСР, свободнорадикального баланса крови и сопряженность этих показателей. На втором этапе изучили изменения -АРЭ, М-ХРЭ, числа гранул адреналина (ЧГАдр) на эритроцитах, параметров ВСР, свободнора-дикального баланса крови и их корреляции после введения -адреноблокатора и М-холиноблокатора, при остром стрессе и сочетании этих воздействий. На третьем - пятом этапах исследовали влияние стимуляции центральных нейромедиаторных систем (ЦНМС) - норадренергической, серотонинергической и дофаминергической - на изучаемые показатели и особенности их изменений при блокаде адрено- и холинорецепторов, стрессе и их комбинаций.
Основными показателями в работе были -АРЭ и М-ХРЭ. -АРЭ определяли по методу Стрюк Р.И. и Длусской И.Г. (2003), основанному на оценке степени снижения гипоосмотического гемолиза эритроцитов в присутствии -адреноблокатора в среде инкубации. Для определения М-ХРЭ использовали собственную модификацию метода определения -АРЭ, суть которой состояла в использовании вместо анаприлина блокатора М-ХР – атропина, способного вызывать снижение гипоосмотического гемолиза эритроцитов, но только в другом диапазоне величин (заявка на патент РФ № 2016137540). Уровень связывания КА на поверхности эритроцитов проводили цитологическим методом Астафьевой О.Г. и Вилковой Е.Е. (1982). Гранулы адреналина выявляли с помощью импрегнации мазков крови азотнокислым серебром. ЧГАдр подсчитывали на поверхности 40 свободнолежащих эритроцитов в каждом мазке (M±m).
Оценку активности механизмов регуляции на системном уровне осуществляли по параметрам ВСР: ЧСР, индекс напряжения (ИН), индекс централизации (IC) и мощности спектра волн сердечного ритма. Регистрацию ЭКГ и анализ ВСР проводили на аппарат-но-программном комплексе «Варикард» и в программе «ИСКИМ6» («Рамена», Россия). Спектральный анализ динамических рядов R-R интервалов выполняли в диапазонах волн: высокочастотных – HF (0,9 – 3,5 Гц), низкочастотных – LF (0,32 – 0,9 Гц), очень низкочастотных – VLF (0,17 - 0,32 Гц) (Курьянова Е.В., 2012).
Поскольку адрено- и холинорецепторы встроены в клеточную мембрану, свойства которой могут изменяться при усилении перекисного окисления липидов (ПОЛ), определяли показатели свободнорадикального баланса крови: 1) уровень конечных продуктов ПОЛ - ТБК-реактивных продуктов (ТБК-РП) в эритроцитах (Камышников В.С., 2002) и плазме крови (Стальная М.Д., Гаришвили Т.Т., 1977 в модификации Е.И. Кондратенко, 1996); 2) каталазную активность эритроцитов и плазмы по методу Королюка М.А. и соавт. (1988). На первом этапе исследования у крыс определяли содержание гемоглобина гемиглобинцианидным методом с помощью стандартных наборов «ГЕМОГЛОБИН АГАТ» («Агат-Мед», Россия), чтобы выяснить, зависят ли величины -АРЭ от уровня гемоглобина в крови.
Изменения всех исследуемых показателей наблюдали на фоне экспериментальных воздействий и их комбинаций. В качестве однократных воздействий применяли блокаду -адренорецепторов анаприлином (2 мг/кг м.т., ИФА, Россия) и М-холинорецепторов атропином (1 мг/кг м.т., ГНЦЛС, Украина), моделирование острого стресса (по Перцову С.С. и соавт., 1997) и комбинацию введения блокаторов АР и ХР и острого стресса. В качестве многократных воздействий использовали введение препаратов для моделирования повышенной активности ЦНМС. Стимуляцию норадренергиче-ской системы (НАС) вызывали введением мапротилина (10 мг/кг м.т.), серотонинерги-ческой системы (СРС) – сочетанием 5-гидрокситриптофана (50 мг/кг м.т.) и флуоксети-6
на (3 мг/кг м.т.), дофаминергической системы (ДФС) – комбинацией L-допа и амантади-на (по 20 мг/кг м.т.). Все препараты производства Sigma (Германия) вводили 4-кратно. Стимуляцию ЦНМС сочетали с введением блокаторов -адрено-, М-холинорецепторов, острым стрессом и их комбинацией. Контрольные животные получали инъекции физиологического раствора (1 мл/кг м.т.).
Положения, выносимые на защиту
-
Адрено- и холинореактивность эритроцитов нелинейных крыс имеют самостоятельные диапазоны варьирования, значения -АРЭ в несколько раз выше величин М-ХРЭ. Для большинства интактных крыс характерна высокая адрено- и низкая холиноре-активность эритроцитов. М-ХРЭ в большей мере сопряжена с показателями ВСР и сво-боднорадикального баланса эритроцитов, а -АРЭ сильнее коррелирует с показателями свободнорадикального баланса плазмы крови.
-
Характерным изменением -АРЭ и М-ХРЭ при введении в организм блокаторов как -адрено-, так и М-холинорецепторов, при стрессогенном повышении уровня кате-холаминов является их существенное снижение, сопряженное с характерными для этих воздействий изменениями числа гранул адреналина на эритроцитах, параметров ВСР и свободнорадикального баланса крови. Это подтверждает способность -АРЭ и М-ХРЭ адекватно отражать изменения рецепции эритроцитами адрено- и холиноподобных веществ, свидетельствует о взаимодействии адрено- и холинорецепторов на мембранах эритроцитов.
-
Моделирование повышенной активности центральных нейромедиаторных систем вызывает стойкое увеличение -АРЭ и умеренное снижение способности эритроцитов связывать адреналин, что сопряжено с ростом ЧСР и ригидности сердечного ритма, снижением интенсивности свободнорадикальных процессов. Изменения рецепции и реактивности к катехоламинам модулируют действие адрено-, холиноблокаторов и острого стресса на показатели реактивности эритроцитов, ВСР и свободнорадикального баланса крови.
Степень достоверности результатов. Достоверность результатов, представленных в работе, определяется большим объемом исследований (196 особей нелинейных крыс, 5 экспериментальных серий), использованием унифицированных физиологических, биохимических и цитологических методов исследований и современного оборудования; статистической обработкой результатов в программе Statistica.10 с применением критерия Стьюдента, кластерного, факторного и корреляционного анализа.
Апробация работы. Материалы диссертации апробированы на X Международной конференции «Микроциркуляция и гематореология (Клиника и эксперимент: из лаборатории к постели больного)» (Ярославль, 5-8 июля 2015); VIII Всероссийском с международным участием конгрессе молодых ученых-биологов «Симбиоз-Россия 2015» (Новосибирск, 5-9 октября 2015); XI Международной конференции «Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии» (Гагра, 14-24 сентября 2015); VI Всероссийской школе-конференции с международным участием «Физиология кровообращения» (Москва, 2-5 февраля 2016); VII Международном конгрессе «Кардиология на перекрестке наук» (Тюмень, 11-13 мая 2016); V Съезде физиологов СНГ (Сочи-Дагомыс, 4-9 октября 2016); Научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, почвоведения и естественнонаучного образования» (Астрахань, 15 мая 2016); XII и XIII Международных междисциплинарных конгрессах «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, 1-11 июня 2016, 30 мая - 10 июня 2017); III Всероссийской научной конференции с международным участием «Свободные радикалы, антиоксиданты и старение» (Астрахань, 2-3 ноября 2016).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 научных работ, в том числе 7 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации материалов диссертационных исследований, 10 тезисов докладов на конференциях и симпозиумах всероссийского и международного уровня. Принята заявка на изобретение (№ 2016137540).
Структура и объм работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, трех глав с результатами собственных исследований, заключения и выводов. Общий объм диссертации 161 страница. Диссертация иллюстрирована 28 таблицами и 12 рисунками. Список цитированной литературы включает 330 источников, в том числе 175 отечественных и 155 зарубежных.
Клеточно-молекулярные основы модуляции адрено-, холинореактивности, взаимодействия адрено- и холинорецепторов
Холинореактивность – свойство органов и тканей специфически реагировать на холинергические или холиноблокирующие регуляторные факторы. Это свойство, как и адренореактивность, обусловлено наличием на мембранах клеток холинорецепторов (ХР), связывающих ацетилхолин (АХ) или блокаторы ХР.
Холинорецепторы, как и АР, относятся к классу рецепторов, осуществляющих передачу сигнала через G-белки плазматических мембран. ХР принято делить на никотинчувствительные (Н-ХР) и мускаринчувствительные (М-ХР) (Аничков С.В., Гребенкина М.А., 1946). В свою очередь, среди Н-ХР различают рецепторы нейронального (Нн) и мышечного (Нм) типов (Katz B., Miledi R., 1973; Albuquerque E.X. et al., 1995), а М-ХР подразделяются на подтипы: М1, М2, М3, М4 и М5 (Kubo T. et al., 1986; Bonner T.I. et al., 1987). Подтипы ХР, выявляемые при помощи специфичных антител, были обнаружены в разных частях головного мозга, большинстве висцеральных органов (Levey A.I., 1993; Eglen R.M. et al., 1996; Caulfield M.P., Birdsall N.J., 1998).
Установлено, что М-ХР всех млекопитающих близки по молекулярной структуре и имеют высокий уровень гомологичности. Так, M1, М2, М3, М4 и M5-ХР крыс на 99, 95, 92, 95 и 89% соответствуют подтипам М-ХР человека (Lee H.K. et al., 1994; Абрамочкин Д.В., Сухова Г.С., 2009). Следовательно, холинореактивность тканей и органов может быть исследована не только у человека, но и в экспериментах на лабораторных животных.
Известна важная роль холинергических механизмов в регуляции функций сердца через М2-ХР (Hulme E.C. et al., 1990; Caulfield M.P., 1993; Ситди-ков Ф.Г., Зефиров Т.Л., 2006; Miaoa Y., 2013). М2-ХР кардиомиоцитов относятся к рецепторам ионотропного типа, при их стимуляции усиливается проводимость К+-каналов. Посредником между М2-ХР и К+-каналами выступает мембранный Go-белок, через который одновременно активируется выход К+ и тормозится вход Ca2+ в кардиомиоциты (Сергеев П.В. и соавт., 1999). Усиленный выход К+ приводит к гиперполяризации мембраны, снижению крутизны нарастания спонтанной диастолической деполяризации пейсмекеров и урежению ЧСР (Виноградова Т.М. и соавт., 1997; Ситдиков Ф.Г., Зефиров Т.Л., 2006). Торможение входа Ca2+ ускоряет завершение потенциала действия кардиомиоцитов и снижает силу сокращений миокарда (Thiebot H. et al., 1996; Ситдиков Ф.Г., Зефиров Т.Л., 2006).
При связывании АХ с М2-ХР (а также М4-ХР) кардиомиоцитов через Gi-белок запускаются следующие изменения: снижение активности аде-нилатциклазыснижение уровня цАМФ ослабление интенсивности всех метаболических процессов, зависимых от цАМФ. Кроме того, из-за снижения входа Ca2+ тормозится активность процессов, зависимых от Ca2+-сигнального каскада. Одновременно активируется гуанилатциклаза и повышается уровень циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ). цГМФ активирует протеинкиназу G, которая фосфорилирует K+-каналы, а также Na+-K+-насосы (Han X. еt al., 1998; Мушкамбаров H.H., Кузнецов С.Л., 2003).
Совокупность названных изменений внутриклеточных каскадов в пей-смекерных и рабочих кардиомиоцитах при взаимодействии АХ с М2-ХР приводит к реализации отрицательных хроно- и инотропные эффектов, по степени выраженности которых судят о холинореактивности сердца (Савин В.Ф., 1988; Зефиров Т.Л., 1999; Глушковская-Семячкина О.В., 2002; Миннахметов Р.Р. и соавт., 2002; Ситдиков Ф.Г., Зефиров Т.Л., 2006).
М-ХР локализуются также в мембране эритроцитов человека (Tang L.C. et al., 1984, 1986, 1991; Carvalho F.A. et al. 2004; Стрельникова А.И. и соавт., 2012), собак (Dalefield R.R., Oehme F.W., 1999), крыс (Dehaye J. P. et al., 1984; Klapproth H. et al.,1997). Считается, что в основном это подтипы М1-и М3-ХР (Tang L.C. et al., 1986; Lopes de Almeida J. P., Saldanha C., 2010; Циркин В.И. и соавт., 2013).
Связывание АХ с М-ХР эритроцитарной мембраны вызывает активацию входа Са2+, что стимулирует образование цГМФ (Tang C.L. et al., 1984). Также связывание АХ с М-ХР через Gq-белок запускает сигнальный каскад: активация фосфолипазы С образование диацилглицерола и инозитол-3-фосфата открытие инозитол-3-фосфат-зависимых Са2+-каналов усиление входа Са2+ и выхода К+ (Hoffman J.F. et al., 2004; Lopes de Almeida J.P., Saldanha C., 2010; Nathanson N.M. 2012). Са2+ совместно с диацилглицеролом и фосфатидилсерином эритроцитарной мембраны активируют протеинкиназу С, которая фосфорилирует белки полос 4.1 и 4.9, что приводит к увеличению микровязкости мембраны эритроцита (Faquin W.C. et al., 1986; Postnov Y.V. et al., 1988).
Другой путь увеличения микровязкости мембраны эритроцита посредством М-ХР - это активация фосфолипазы А2, а также Са2+-зависимых проте-инкиназ. Их активность приводит к деструкции некоторых компонентов ли-пидного бислоя мембраны, уменьшению числа и прочности белково-липидных контактов (Huestis W.H. et al., 1981; Boivin P., Galand C., 1984; Крутецкая З.И. и соавт., 2003).
Следует обратить особое внимание на тот факт, что эритроциты несут как рецепторы к АХ, так и высоко активный фермент его обмена – ацетилхо-линэстеразу (АХЭ). Ненейрональным эффектам АХ и роли АХЭ эритроцитов посвящен большой обзор литературы, сделанный J.P. Lopes de Almeida and C. Saldanha (2010). Авторы полагают, что АХ, взаимодействуя с АХЭ эритроцитов, также запускает сигнальные каскады через G-белок с образованием цАМФ, что приводит к фосфорилированию белка полосы 3. Белок полосы 3 является многофункциональным, регулирует форму эритроцита, мембранный транспорт и др. Авторы находят, что АХ способен потенцировать в эритроцитах повышение уровня и цАМФ, и цГМФ, что отражается на активности протеинкиназ, фосфатаз, ферментов гликолиза, уровне рН, проводимости ионных каналов и свойствах мембраны. По данным Mesquita R. et al. (2001), Santos T. et al. (2003), АХ повышает текучесть липидного слоя мембраны, что влияет на гемореологические характеристики эритроцитов, вязкость крови, отражаясь на транспорте газов и насыщении тканей кислородом.
Приведенные факты о способности АХ запускать сигнальные каскады в эритроцитах и влиять на свойства мембраны дают основание предполагать модулирующее влияние АХ на свойства эритроцитов: осмотическую резистентность, деформируемость, способность к агрегации и агглютинации (Lopes de Almeida J. P., Saldanha C., 2010; Стрельникова А.И. и соавт., 2012; Циркин В.И. и соавт., 2015). По степени изменения этих свойств в присутствии АХ или блокаторов М-ХР можно судить о такой характеристике как М-холинореактивность эритроцитов (М-ХРЭ).
М-ХРЭ может проявляться в изменении скорости агглютинации эритроцитов. По данным А.И. Стрельниковой и соавт. (2012), В.И. Циркина и со-авт. (2013), АХ снижает время начала агглютинации эритроцитов посредством М1- и М3-ХР из-за уменьшения поверхностного отрицательного заряда, которое обусловлено снижением концентрации K+ в эритроците вследствие открытия Са2+-зависимых К+-каналов.
Есть данные, что АХ тормозит агрегацию эритроцитов и повышает их деформируемость посредством изменения текучести липидной фазы мембраны. Агрегация и деформируемость тесно связаны между собой и влияют на вязкость крови (Lopes de Almeida J. P., Saldanha C., 2010). Влияние АХ на агрегацию эритроцитов предполагает также его эффект в отношении СОЭ. В работе Е.Н. Бушковой и соавт. (2015), В.И. Циркина и соавт. (2015) приводятся данные о влиянии АХ на СОЭ у женщин в разные сроки беременности. Нормой признан эффект снижения СОЭ в присутствии АХ, но в зависимости от срока беременности М-холинореактивность СОЭ может варьировать.
М-ХРЭ оценивается также по изменению осмотической стойкости эритроцитов (Крысова А.В. и соавт., 2011; Циркин В.И. и соавт., 2015). Показано, что АХ снижает осмотическую стойкость эритроцитов только у мужчин, а эффект реализуется через М3-ХР мембран.
Введение препаратов, влияющих на нейромедиаторные процессы
Для обоснованного суждения об адренореактивности эритроцитов важно наблюдать и оценивать рецепцию КА на их мембранах в норме и при изменении активности регуляторных систем организма. Поэтому наряду с -АРЭ определяли число гранул адреналина (ЧГАдр) на поверхности эритроцитов цитологическим методом (Астафьева О.Г., Вилкова Е.Е., 1982). Суть метода заключается в импрегнации азотнокислым серебром гранул адреналина на эритроцитах в мазках крови.
Мазки крови готовили традиционным способом (Ноздрачев А.Д. и со-авт., 2007; Ройтберг Г.Е., Струтынский А.В., 2007) и фиксировали в концентрированных парах формалина в течение 2 мин. Затем выдерживали 40 мин в темноте при комнатной температуре в смеси, состоящей из следующих компонентов (мас.%): формалин – 10, бихромат калия – 3, ацетат натрия - 0,2, хлорид натрия 1,5% р-р – 85,9. Сразу после извлечения из фиксирующей среды мазки промывали дистиллированной водой и импрегнировали в 5% растворе азотнокислого серебра в течение 3 мин. После импрегнации мазки докрашивали 1% р-ром эозина в течение 1 мин. Затем мазки крови высушивали при комнатной температуре. Микроскопию проводили в проходящем свете на микроскопе Leica DM 750 под масляной иммерсией при x1000 увеличении c апертурой 1,25. На фоне светло-розовой цитоплазмы эритроцитов наблюдали гранулы темно-бурого цвета разного размера – глыбки адреналина.
Подсчет количества гранул адреналина производили на фотографиях, сделанных с идентичных участков мазков крови контрольных и опытных животных. Каждый кадр разделяли на 4 равных сектора. В центре каждого сектора находили 10 свободно лежащих эритроцитов и подсчитывали гранулы адреналина, четко видимые на фоне их цитоплазмы. Гранулы, лежащие на границе эритроцитов, не учитывались. Поскольку гранулы имели разные размеры, была принята градация их на 3 класса: мелкие, средние и крупные (Автандилов Г.Г., 1990). При подсчете гранулы сразу же разносили по классам с учетом их величины. Всего на каждом мазке крови просматривали 40 эритроцитов. В контрольных и опытных группах на каждое состояние обрабатывали 3 мазка крови, соответственно, просматривали 120 эритроцитов. После просмотра мазков, подсчета и классификации гранул адреналина производили расчеты. Находили среднее количество мелких, средних, крупных гранул и общее число гранул на 40 эритроцитов в мазках крови (M±m).
Для изучения активности адренергических и холинергических механизмов регуляции на системном уровне применяли методы анализа ВСР (Ба-евский Р.М. и соавт., 2002; Курьянова Е.В., 2012). Определение параметров ВСР наряду с -АРЭ и М-ХРЭ у каждой особи дало возможность оценить сопряженность между реактивностью эритроцитов и активностью регулятор-ных влияний на сердце у крыс в исходном состоянии и в условиях экспериментальных воздействий. Определение ЧСР и анализ ВСР при блокаде и стимуляции нейромедиаторных процессов позволили, с учетом данных (Глушковская-Семячкина О.В., 2002; Нигматуллина Р.Р. и соавт., 2002; Али-пов Н.Н. и соавт., 2005; Сергеева О.В. и соавт., 2008, 2014 и др.), оценивать эффективность экспериментальных воздействий и обоснованно судить о том, что изменения -АРЭ, М-ХРЭ, ЧГАдр вызваны действием препаратов, влияющих на регуляторные процессы.
ЭКГ регистрировали у половозрелых крыс без применения наркотических средств и фиксации, за исключением экспериментов с моделированием острого стресса. Регистрация ЭКГ у животных осуществлялась в небольших коробках, которые не ограничивали позу и передвижение. После помещения в коробку крысам давалось некоторое время для адаптации. После того как животные успокаивались, начинали записывать ЭКГ. Записи проводили на аппаратно-программном комплексе «Варикард» («Рамена», Россия) с использованием миниатюрных электродов-зажимов во II стандартном отведении при местном обезболивании лидокаином (0,05 мл 0,5% раствора в/кожно) (Курьянова Е.В., 2012).
Обработка кардиоинтервалов и анализ кардиоинтервалограмм осуществляли в программе «ИСКИМ6» («Рамена», Россия). ВСР анализировали на отрезках из 350 R-R-интервалов с точностью измерения 1 мс. Стабильность варьирования кардиоинтервалов являлась главным критерием для выбора фрагмента для анализа.
Для математического анализа ВСР использовали статистические методы, а также временной и спектральный анализ (Баевский Р.М. и соавт., 1984, 2002). Определяли ЧСР (уд/мин), моду – Мо (мс), амплитуду моды – АМо (%), размах варьирования – Х (мс). На основе полученных данных рассчитывали индекс напряжения - ИН (отн.ед.) с учетом ширины класса гистограммы 7,8 мс по формуле: ИН = (АМо / 2 Х Мо) (50 / 7,8) 103.
Спектральный анализ динамических рядов R-R интервалов выполняли в диапазонах волн: высокочастотных – HF (0,9 – 3,5 Гц), низкочастотных – LF (0,32 – 0,9 Гц), очень низкочастотных – VLF (0,17 - 0,32 Гц) (Курьянова Е.В., 2012). Определяли абсолютные мощности волн (в мс2), рассчитывали индекс централизации – IC (отн. ед.) по формуле: IC = (LF + VLF) / HF.
Анализ ВСР у крыс экспериментальных групп проводили в исходном состоянии, через 5-7 мин после введения -адреноблокатора или М-холиноблокатора, на этапах острого стресса, на фоне стимуляции центральных нейромедиаторных систем, при комбинациях названных воздействий.
Поскольку адрено- и холинорецепторы встроены в клеточную мембрану, свойства которой могут изменяться при усилении перекисного окисления липидов (ПОЛ), мы определяли показатели свободнорадикального баланса крови: 1) уровень конечных продуктов ПОЛ, реагирующих с тиобарбитуро-вой кислотой - ТБК-реактивных продуктов (ТБК-РП) в эритроцитах и плазме крови, 2) каталазную активность эритроцитов и плазмы крови, так как активность каталазы является одним из ведущих компонентов антиоксидантной защиты крови (Меньшикова Е.Б. и соавт., 2005).
Для определения ТБК-РП в эритроцитах крови использовали методику по Камышникову В.С. (2002). Гемолизат готовили путем добавления 0,2 мл дистиллированной воды к 0,1 мл трехкратно отмытых эритроцитов. Для осаждения белков добавляли 1 мл 17% ТХУ. Конечные продукты ПОЛ выявляли в реакции с ТБК (1 мл 0,8% раствора). Интенсивность окраски определяли при длине волны 540 нм. Расчеты производили с учетом того, что экстинкция 1 нмоль малонового диальдегида (МДА) в 1 мл раствора составляет 0,156. Содержание ТБК-РП в эритроцитах выражали в нмоль/мл эритроцитарной массы.
Содержание ТБК-РП в плазме крови определяли по методике (Стальная М.Д., Гаришвили Т.Т., 1977 в модификации Е.И. Кондратенко, 1996). Плазму разбавляли физиологическим раствором в соотношении 1:1. Оптическую плотность проб определяли при длине волны 540 нм. С учетом коэффициента молярной экстинкции МДА рассчитывали содержание ТБК-РП (нмоль/мл) в плазме крови.
Определение каталазной активности эритроцитов и плазмы крови проводили по методу Королюка М.А. и соавт. (1988). В основе метода определения каталазной активности лежит способность фермента расщеплять перекись водорода, которая может образовывать окрашенный комплекс с молиб-датом аммония. Оптическую плотность опытной и холостой пробы против контроля определяли при длине волны 410 нм. Расчет активности каталазы в плазме крови (Кпл в мккат/л) проводили по формуле А, активности каталазы в эритроцитах (Кэр в мккат/мл эритроцитарной массы) - по формуле Б с учетом того, что в качестве биологического материала в пробу вносили гемолизат эритроцитов:
Адрено- и холинореактивность эритроцитов крыс и их взаимосвязи с показателями свободнорадикального баланса крови
С одной стороны, рост каталазной активности плазмы может указывать на повышение антиоксидантной защиты крови, а с другой стороны, свидетельствовать о лабилизации мембран эритроцитов и выходе каталазы в плазму крови (Эмирбеков Э.З. и соавт., 1998; Курьянова Е.В. и соавт., 2006).
Корреляционный анализ выявил, на фоне стресса усилилась сопряженность между -АРЭ и М-ХРЭ (r= -0,39, против r= 0,11 в покое). Более тесной стала связь -АРЭ с ЧСР (r= -0,20, против r= -0,08 в покое). -АРЭ, и М-ХРЭ в условиях стресса имели более сильные корреляции с показателями ВСР, нежели с ЧСР. При этом проявилась специфичность корреляционных отношений: -АРЭ особенно тесно коррелировала с мощностью LF- и VLF-волн (r= -0,65 и r= -0,58), а также имела положительную связь с ИН (r= 0,42); М-ХРЭ наиболее сильно коррелировала с мощностью НF-волн (r= 0,71) и имела отрицательную связь с ИН (r= -0,38). Это согласуется с физиологической интерпретацией ИН и волн ВСР по Р.М. Баевскому и соавт. (2002) и подтверждает, что -АРЭ может расцениваться как показатель, характеризующий ад-реналовые регуляторные влияния, а М-ХРЭ – как показатель холинергиче-ских регуляторных влияний на уровне мембран эритроцитов. При стрессе усилилась связь -АРЭ с каталазной активностью эритроцитов (r= -0,70) и уровнем ТБК-РП в эритроцитах, но связь с уровнем ТБК-РП плазмы стала слабее (r= -0,11). М-ХРЭ стала теснее коррелировать с концентрацией ТБК-РП (r= 0,57) и каталазной активностью плазмы (r= -0,46).
Иными словами, в условиях стресса в корреляционных отношениях -АРЭ стали преобладать связи с показателями симпатических влияний, М-ХРЭ - с показателем парасимпатических влияний. В корреляционных отношениях с параметрами свободнорадикального баланса при стрессе произошли изменения: -АРЭ стала теснее коррелировать с эритроцитарным, а М-ХРЭ – с плазменными показателями свободнорадикального баланса крови.
Итак, острый стресс вызывает снижение -АРЭ и М-ХРЭ при вполне ожидаемом подъеме уровня КА, что проявляется в росте ЧГАдр на эритроцитах. Изменения сопряжены с ростом ЧСР и каталазной активности плазмы крови. -АРЭ снижается на фоне общего падения осмотической стойкости эритроцитов, очевидно, являясь результатом связывания КА с АР и реализации адренергических сигнальных каскадов, что уменьшает число свободных АР, способных взаимодействовать с анаприлином в среде инкубации. Параллельное снижение -АРЭ и М-ХРЭ при стрессе указывает на сопряженность систем адрено- и холинорецепции на мембранах эритроцитов.
При стрессорной активации симпатоадреналовой системы возрастает сила и проявляется специфичность корреляций -АРЭ и М-ХРЭ с параметрами ВСР, подтверждая их способность отражать влияния адренергических и холинергических факторов на уровне эритроцитов. Усиление связей -АРЭ с М-ХРЭ, с эритроцитарными показателями свободнорадикального баланса свидетельствует, что в условиях стресса реакция эритроцитов на холинопо-добные факторы, активность ферментов антиоксидантной защиты эритроцитов и общее про- и антиоксидантное состояние крови зависят от рецепции КА на мембране эритроцитов.
Для уточнения роли адрено- и холинергических регуляторных влияний в стресс-индуцированных изменениях реактивности эритроцитов, с учетом динамики параметров ВСР и свободнорадикального баланса крови была проанализирована реакция на стресс животных, получавших однократную инъекцию анаприлина (2 мг/кг м.т. в/бр.) и атропина (1 мг/кг м.т. в/бр.). Контрольные животные получали физиологический раствор. Процедура стрессирования, регистрация ЭКГ, забор крови для определения показателей в контрольной и экспериментальных группах были идентичными.
Согласно данным табл. 16, крысы, получившие блокатор -АР, перед началом стрессирования имели сниженные значения -АРЭ (р 0,001). Тем не менее у них при стрессе также, как у контрольных животных, проявилась тенденция к снижению -АРЭ, но в меньшей мере (на 5,8 отн. ед. или на 27%). Показатель достиг наименьших для крыс величин (около 15 отн. ед.) и стал вдвое ниже, чем в соответствующем контроле (р 0,01). Общее ЧГАдр на эритроцитах крыс, получивших анаприлин, после острого стресса не выросло, а стало даже меньше, чем в покое – всего 48 шт., что было в 5 раз ниже, чем у контрольных крыс в тех же условиях стресса (р 0,001).
Достоверность различий рассчитана по критерию Стьюдента: р 0.05, р 0.01, р 0.001 - , , -по сравнению с состоянием спокойного бодрствования на фоне препаратов; А, АА, ААА - в сравне нии с соответствующим контролем.
Животные, получившие атропин, входили в стресс, имея низкие значения -АРЭ и М-ХРЭ (табл. 16). После острого стресса у этих крыс оба показателя оставались на стабильно низком уровне, -АРЭ достигла минимальных величин и была ниже, чем в контроле (р 0,05). Общее ЧГАдр на 40 эритроцитов составило 78 шт., то есть оказалось немного меньше, чем в покое (99 шт.) и в 3,3 раза ниже, чем у контрольных животных в тех же условиях стресса (р 0,01).
То есть, в условиях стрессогенного подъема уровня КА показатели рецепции и реактивности эритроцитов к КА оставались низкими и даже проявили тренды к еще большему снижению на фоне блокады как (3-АР, так М-ХР, при сочетании воздействий регистрировались наименьшие величины (3-АРЭ и ЧГАдр на эритроцитах.
По данным табл. 17, прирост ЧСР у животных, получивших анаприлин, в начале стресса был незначительным, развивался медленно и стал существенным только к 60-й мин, когда составил 29,5% (р 0,01). На всех этапах стресса ЧСР была ниже (р 0,01), чем у контрольных крыс.
Изменения реактивности эритроцитов, показателей сердечного ритма и свободнорадикального баланса крови при введении М-холиноблокатора
Для выявления того, насколько стойкими и значительными являются изменения, вызванные стимуляцией ЦНМС, проведены серии исследований с введением блокаторов -АР и М-ХР. Введение и -адреноблокатора, и М-холиноблокатора снижает ЧГАдр на эритроцитах практически во всех сериях с активацией ЦНМС, следовательно, на связывание КА с АР эритроцитов блокаторы оказывают влияние, сопоставимое с их действием в контроле. Исключение составляет серия с активацией СРС, на фоне которой атропин не изменяет ЧГАдр на эритроцитах, возможно, из-за того, что серотонин способен снижать чувствительность ХР (Манухин Б.Н. и соавт., 2015). Факт снижения ЧГАдр на эритроцитах после введения атропина подтвердил возможность аллостерического взаимодействия -АР и М-ХР в мембранах эритроцитов даже в условиях стимуляции ЦНМС.
В отношении -АРЭ, а также М-ХРЭ действие блокаторов на фоне стимуляции ЦНМС ослаблено или изменено. Так, анаприлин умеренно снижает -АРЭ у крыс со стимуляцией СРС и ДФС, и потенцирует ее рост на фоне стимуляции НАС. Во всех сериях с активацией ЦНМС -АРЭ остается в 2-2,5 раза выше, чем в контроле: Контроль ДФС = СРС НАС. Эффект атропина в виде снижения -АРЭ и М-ХРЭ на фоне стимуляции ЦНМС практически нивелирован. Оба показателя остаются значительно выше, чем у контрольных крыс: -АРЭ – Контроль СРС = НАС = ДФС и М-ХРЭ – Контроль ДФС НАС = СРС. По сути, эксперименты с введением блокаторов -АР и М-ХР показали, что связывание Адр на эритроцитах понижается, но при этом слабо или почти не изменяются величины -АРЭ. Следовательно, на фоне стимуляции ЦНМС происходят стойкие изменения в системах сигнальных каскадов к элементам цитоскелета. Это могут быть конформационные сдвиги на уровне мембран эритроцитов, вызывающие фиксацию активированного состояния АР в мембране, разобщение АР и сигнальных каскадов, компенсаторное усиление реактивности мессенджеров к сигналам от сохранивших аффинность АР (Chuang D.M., Costa E., 1979; Трошкина Н.А. и соавт., 2007; Артемова Е.В. и соавт., 2016).
Относительно слабое снижение М-ХРЭ после введения анаприлина, слабые эффекты атропина в отношении -АРЭ указывают на ослабление хо-линорецепции и аллостерического взаимодействия АР и ХР эритроцитов на фоне повышения активности ЦНМС, возможно, в связи с модулирующими влияниями серотонина и дофамина в отношении свойств АР и ХР (Манухин Б.Н. и соавт., 2015).
Анализ эффектов блокаторов в отношении ВСР показывает, что в условиях активации ЦНМС даже после введения анаприлина ЧСР и ИН хотя и снижаются, но остаются выше контрольных значений во всех опытных сериях и даже нарастают на фоне активации НАС и ДФС. Лишь у крыс с активацией СРС, имевших очень напряженный ритм сердца, анаприлин снижает ИН, потенцируя повышение мощности HF- и VLF-волн. В основе такой реакции ВСР может лежать антагонистическое отношение между НАС и СРС (Jones L.F., Tackett R.L., 1988; Лычкова А.Э., 2012).
Реакция ВСР на атропин в условиях стимуляции ЦНМС в целом является характерной, но величины ЧСР и ИН крайне высоки, что свидетельствует о резком преобладании адренергических влияний над холинергическими, особенно при стимуляции НАС. В серии с атропином прослеживается зависимость между приростом ЧСР и уменьшением ЧГАдр на эритроцитах: чем сильнее снижается ЧГАдр, тем больше прирастает ЧСР (в сериях с активацией НАС и ДФС). Исходя из этого, мы считаем, что способность АР эритроцитов связывать Адр может выступать одним из механизмов изменения ЧСР через колебания уровня свободных КА в плазме крови. Особенности эффектов анаприлина и атропина в отношении ВСР подтверждают, что при стимуляции ЦНМС высокая реактивность к адренергическим факторам становится характерной не только для эритроцитов, но и для клеток миокарда.
Введение блокаторов -АР и М-ХР приводит к колебаниям низкого уровня ТБК-РП в крови, сформировавшегося при стимуляции ЦНМС. Наименьшие изменения отмечаются при стимуляции НАС, разнонаправленные – при активации СРС и ДФС. Полагаем, что тренды в направлении роста интенсивности ПОЛ вызваны высокой концентрацией КА в крови из-за ограничения их связывания с АР эритроцитов. Умеренная выраженность этого процесса определяется адаптивной устойчивостью мембран к высокому уровню КА и высокой каталазной активностью эритроцитов у крыс с активацией ЦНМС. Кроме того, серотонин и дофамин способны проявлять антиок-сидантные свойства (Agil A. et al., 2006; Cornetta T. et al., 2009; Бахшалиева Р.Р. и соавт., 2010; Зилов В.Г. и соавт., 2014), что может выступать сдерживающим фактором в отношении ПОЛ. Факт снижения активности каталазы в эритроцитах и тренд к росту ее активности в плазме крови у крыс с активации СРС после введения анаприлина, вероятно, обусловлен наименьшим связыванием Адр эритроцитами, а также стабильно высоким напряжением адре-нергических механизмов на фоне СРС (Лычкова А.Э., 2012), что может привести к истощению антиоксидантной защиты.
В целом, эффекты блокаторов -АР и М-ХР, введенных в организм на фоне активации ЦНМС, в основном выражены слабее или противоположны тем, что наблюдаются у контрольных животных. -АРЭ после введения блокаторов остается стабильно высокой, особенно в опытах с атропином, М-ХРЭ после введения анаприлина находится в диапазоне менее 10 отн. ед., а после введения атропина – растет и становится выше 10 отн.ед., но ЧГАдр на поверхности эритроцитов снижается после введения и анаприлина, и атропина. Следовательно, изменения в рецепции КА и свойствах мембран эритроцитов, вызванные стимуляцией ЦНМС, в большей мере отражаются на эффектах блокаторов АР и ХР в отношении функционирования внутриклеточных сигнальных каскадов, и в меньшей мере – в отношении связывания лигандов на мембране. Эти изменения способствуют поддержанию высокой ЧСР и ригидности ритма сердца, низкого уровня ТБК-РП и высокой каталазной активности крови даже при введении блокаторов АР и ХР. Специфичность изменений реактивности эритроцитов и ВСР в условиях стимуляции каждой из ЦНМС отчетливо проявляется в сериях с блокадой -АР, но слабо выражена при блокаде М-ХР.
У крыс с активацией ЦНМС в состоянии стресса связывание Адр эритроцитами ослаблено в сравнении с контролем в 5-12 раз (!), а фактические величины ЧГАдр ниже в 2-2,8 раза, особенно на фоне активации СРС. Это ярко демонстрирует значительное снижение способности АР эритроцитов связывать КА, что вполне согласуется с данными (Spasojevic N. et al., 2009; Артемовой Е.В. и соавт., 2016) о падении аффинности АР к лигандам при усилении адренергических влияний на клетки.
При пониженном связывании Адр у животных со стимуляцией ЦНМС в стрессовых условиях величины -АРЭ остаются высокими: Контроль НАС ДФС СРС. При этом обнаружено 2 варианта изменений -АРЭ: 1) снижение на фоне активации НАС и ДФС, как и в контрольной серии, и 2) рост при активации СРС. Первый вариант был характерен для серий, в которых ЧГАдр превышало 100 шт./40 эр., а второй - для серии с ЧГАдр ниже 100 шт./40 эр. Вероятно, при стрессогенном подъеме концентрации КА в плазме до некоторого критического уровня, часть АР восстанавливает способность связывать КА и проводить сигнал к внутриклеточным мессенджерам, что проявляется в снижении -АРЭ. При низкой концентрации и связывании КА (из-за истощения резервов или слабой активации стресс-реализующих механизмов при стимуляции СРС) реактивность внутриклеточных мессенджеров к сигналам от АР остается повышенной.