Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 16
1.1. Убиквитин-протеасомная система клеток многоклеточных животных 16
1.2. Основные этапы развития головного мозга, печени и селезёнки крысы 33
1.3. Функционирование протеасом в ЦНС млекопитающих 44
1.4. Функционирование протеасом в иммунной системе млекопитающих 52
1.5. Протеасомы в развитии злокачественных опухолей. 55
1.6. Заключение 57
2. Материалы и методы 60
2.1. Экспериментальные модели беспозвоночных и млекопитающих 60
2.2. Эксперименты по исследованию пулов протеасом в раннем развитии 63
2.3. Эксперименты по исследованию пулов протеасом в развитии донорспецифической иммунологической портальной толерантности 64
2.4. Эксперименты по исследованию пулов протеасом в тканях человека 65
2.5. Получение осветленных гомогенатов 65
2.6. Определение активностей протеасом 66
2.7. Вестерн-блоттинг 67
2.8. Приготовление криостатных срезов органов и последующее иммунофлуоресцентное окрашивание 68
2.9. Выделение мононуклеарных клеток печени 70
2.10. Электрофорез в нативных условиях 70
2.11. Двумерный форез и массспекрометрия 72
2.12. Определение активности ферментов триптофан- и тирозин-гидроксилаз у крыс линии Август 73
2.13. Высокоэффективная жидкостная хроматография с электрохимической детекцией 73
2.14. Статистический анализ 74
3. Результаты 76
3.1. Функционирование протеасом и шаперонов в клетках эволюционно удаленных классов беспозвоночных 76
3.1.1. Особенности функционирования протеасом и шаперонов в целомоцитах полихет при индукции воспаления 76
3.1.2. Функционирование протеасом и шаперонов в клетках Sp насекомых при бакуловирусной инфекции 79
3.1.2.1. Реакция шаперонов семейства HSP/HSC70 на инфекцию вирусом AcMNPV в клетках Sf9 79
3.1.2.2. Особенности функционирования убиквитин-протеасомной системы в клетках Sf9 в ходе инфекции вирусом AcMNPV 86
3.1.2.3. Зависимость репродуктивного цикла вируса AcMNPV от протеолитической активности протеасом и шапероновой активности белков семейства HSP/HSC70 92
3.2. Особенности протеасомных механизмов регуляции гомеостаза протеома клеток ЦНС, печени и селезенке у грызунов 100
3.2.1. Иммунные протеасомы во фронтальной коре, мозжечке и стволе головного мозга крыс линии Вистар в раннем развитии 100
3.2.2. Особенности функционирования иммунных протеасом в селезенке и печени в раннем развитии крыс линии Вистар 110
3.2.3. Содержание иммунных протеасом в отделах мозга и печени плода при индукции воспаления у матери инъекцией липолисахарида (LPS) 135
3.2.4. Протеасомы в головном мозге, печени и селезенке мышей, нокаутных по 02-микроглобулину, составной части молекул ГКГ1 137
3.2.5. Особенности пулов протеасом в головном мозге крыс с метаболическими нарушениями моноаминов 145
3.3. Особенности пулов иммунных протеасом в опухолевых клетках человека 154
4. Обсуждение результатов 164
4.1. Особенности функционирования УПС в клетках эволюционно удалённых классов беспозвоночных 164
4.2. Особенности протеасомных механизмов регуляции гомеостаза протеома клеток ЦНС, печени и селезенке у грызунов 166
4.3. Особенности пулов протеасом в процессе развития опухоли молочной железы человека 180
Заключение 183
Выводы 184
Список публикаций по материалам диссертации 187
Список литературы 193
Приложение 219
- Убиквитин-протеасомная система клеток многоклеточных животных
- Экспериментальные модели беспозвоночных и млекопитающих
- Особенности функционирования убиквитин-протеасомной системы в клетках Sf9 в ходе инфекции вирусом AcMNPV
- Особенности протеасомных механизмов регуляции гомеостаза протеома клеток ЦНС, печени и селезенке у грызунов
Убиквитин-протеасомная система клеток многоклеточных животных
Протеом клеток формируется благодаря согласованным процессам синтеза и деградации белковых молекул. Многочисленные факторы обеспечивают регуляцию процесса трансляции и упаковку вновь синтезированных белков в функциональные структуры. Деградация белков также является строго регулируемым процессом, и в клетке сосуществуют долгоживущие, стабильные белки и быстрораспадающиеся белки, короткоживущие, по сравнению с временем жизни клетки. В клетках эукариот УПС играет ключевую роль в регуляции гомеостаза клеточного протеома.
Представление о гомеостазе протеома, как о строго регулируемом балансе процессов синтеза и распада белковых клеточных компонентов, является центральным понятием в биологии клетки. Пионерские работы 50- и начала 60 х годов прошлого века показали, что синтез белков в клетке (трансляция) осуществляется рибосомами – сложными мультисубъединичными белковыми комплексами с использованием рибонуклиновой кислоты в качестве матрицы.
Многочисленные факторы обеспечивают регуляцию процесса трансляции и упаковку вновь синтезированных белков в функциональные структуры. В то же время представления о механизме распада белков в клетке долгое время оставались на примитивном уровне. Предполагалось, что основные функции в деградации белков играют растворимые протеазы лизосом, которые рассматривались как единственные клеточные структуры, ответственные за протеолиз. Однако постепенно стали накапливаться наблюдения, которые противоречили такой упрощенной картине. Выяснилось, что распад белков является строго регулируемым процессом, и в клетке сосуществуют долгоживущие стабильные белки и быстрораспадающиеся белки, короткоживущие по сравнению со временем жизни клетки. Каким образом осуществляется выбор белков для протеолиза, долгое время оставалось неизвестным. Были обнаружены протеазы-кальпаины и их ингибитор кальпастатин, составляющие регуляторную кальпаиновую систему и зависящие от гомеостаза Ca2+ в клетках [Dayton et al.,1976; Бондарева, Немова, 2008; Лысенко и др., 2011]. Настоящий прорыв в исследованиях распада белков произошел в начале 80-х годов и связан с открытием протеасом – специализированных мультисубъединичных белковых комплексов с многофункциональной протеолитической активностью [трипсинподобной, химотрипсинподобной и каспазаподобной]. Значение этого открытия было отмечено в 2004 г. присуждением Нобелевской премии первооткрывателям протеасом – А. Чехановеру [A. Ciechanover], А. Гершко [A. Hershko] и И. Роузу [I. Rose].
Выяснилось, что именно протеасомы играют основную роль в гидролизе индивидуальных белков в клетке, в то время как лизосомы выполняют вспомогательную роль, специализируясь преимущественно на деградации крупных белковых агрегатов, эндосом и поврежденных митохондрий (Рис. 1). Протеасома – эволюционно древний ферментативный комплекс, который эволюционировал в сторону более сложной пространственной организации при увеличении разнообразия субъединиц и регуляторов, сохранив неизменной базовую цилиндрическую архитектуру из четырех сложенных колец (Рис. 2).
У архей Thermoplasma acidophilum, 20S- протеасома (Рис. 2А) состоит двух наружных колец с семью идентичными субъединицами альфа- типа и двумя внутренними кольцами с семью субъединицами бета- типа [Lowe et al., 1995].
У эубактерий актиномицета Rhodococcus sр. 20S -протеасома (Рис. 2Б) построена из колец с двумя разными субъединицами альфа- типа А и двумя разными субъединицами бета-типа [Tamura et al., 1996], тогда как у дрожжей Saccharomyces сerevisiae 20S- протеасома (Рис.2В) состоит из семи различных субъединиц альфа-типа и семи различных субъединиц бета- типа [Groll et al., 1997]. Протеолиз происходит во внутренней камере протеасомы, формирующейся с помощью двух бета-колец. Хотя каждая из субъединиц протеасомы архебактерий и эубактерий имеют гидролитически активные центры, только три из семи субъединиц бета-типа у дрожжей каталитически активны. Усложнение набора субъединиц в эволюции сопровождается, по видимому, снижением количества активных субъединиц. Эта тенденция идет наряду со специализацией субстратной специфичности трех каталитических субъединиц, активность которых может быть измерена с помощью гидролиза небольших флуорогенных пептидов с определенными аминокислотами в положении P1. Эти пептиды выявляют химотрипсинподобную активность (расщепление после гидрофобных остатков), трипсиноподобнуюх активность (расщепление после основных остатков), и каспазоподобную активность протеасом (расщепление после кислотных остатков). Хотя для протеасом архей и бактерий отдельных родов показана только химотрипсинподобная активность, эукариотические протеасомы демонстрируют все три вида активности, которые связаны с бета1- (каспазоподобная активность), бета2 (трипсиноподобная активность) и бета5- (химотрипсинподобная активность) субъединицами. Номера субъединицам бета-типа у эукариот присвоены в соответствии с их положением в бета-кольцах [Groll et al., 1997]. Пептидные продукты гидролиза в протеасоме при предпочтительном расщеплении бета1-, бета2- или бета5- субъединицами существенно различаются. Функциональная специализация бета1-, бета2- или бета5- субъединиц позволяет модификацировать расщепление в протеасоме, заменив эти субъединицы индуцибельными или тканеспецифическими гомологами. У млекопитающих помимо бета1-бета2 -и бета5- субъединиц, составляющих "конститутивные" протеасомы имеются еще три подтипа индуцибельных, иммунных, субъединиц (Рис. 3Б): субтип, содержащий все иммунные каталитические субъединицы; субтип, содержащий субъединицы LMP2 и MECL1; и субтип, обладающий только LMP7 (Dahlmann et al., 2000; 2001; Sharova, Zakharova, 2008). Иммунные протеасомы содержат каталитические субъединицы LMP7 (5i), LMP2 (1i) и MECL1 (2i) вместо каталитических субъединиц X (5), Y (1) и Z (2) конститутивных протеасом. Замена конститутивных субъединиц на иммунные происходит в процессе сборки новых протеасом. Причем субъединицы LMP2 и MECL1 встраиваются совместно и независимо от субъединицы LMP7. Включение субъединицы LMP7 во вновь образующуюся протеасому, хотя и облегчается наличием LMP2 и MECL1, но может осуществляться и в их отсутствие (Groettrup et al., 1997).
Основные сведения о стуктурной организации и функционировании протеасом, а также о регуляции УПС в клетках получены на дрожжах и млекопитающих. Белки, предназначенные для деградации в протеасомах, как правило, маркируются специальной меткой – ковалентным присоединением убиквитина, полипептида из 76 аминокислотных остатков, или некоторых ему подобных небольших полипептидов, таких как SUMO (Small Ubiquitin-like Modifier) и др. Убиквитин присоединяется к остаткам лизина в белке-мишени многочисленной системой ферментов убиквитинлигаз Е3 (Enzyme 3), каждая из которых специфична в отношении определенной группы белков-мишеней. Вспомогательную роль в убиквитинировании белков играют менее многочисленные факторы Е2 (Enzyme 2), которые связывают убиквитин, и уникальный фактор Е1 (Enzyme 1), который активирует убиквитин.
Дальнейшая судьба убиквитинированного белка зависит от структуры метки – размера убиквитиновой цепочки и от того, какие остатки лизина в молекуле убиквитина были использованы для формирования цепочки. Образование цепочки из четырех, по крайней мере, молекул убиквитина является сигналом для связывания с протеасомами. УПС высокоспецифична и избирательна за счет того, что построена по принципу иерархического усложнения. Фермент Е1 (в клетке он только один) запускает работу УПС, активируя молекулу убиквитина, и передает ее одному из ферментов семейства Е2 (их называют конъюгирующими). Затем в каскад реакций вступает третий участник — представитель семейства Е3-лигаз, «сшивающих» ферментов. Он принимает убиквитин от Е2, соединяется с белком-субстратом и ковалентно пришивает к нему цепочку убиквитина (Рис. 4).
Экспериментальные модели беспозвоночных и млекопитающих
Аннелиды (кл. Polychaeta) - одна из ключевых групп беспозвоночных животных в морских донных сообществах. У кольчатых червей имеется хорошо развитая защитная система, способная противостоять инвазии паразитов. Метамерное строение тела, наличие целомической полости и хорошо развитой кровеносной системы в совокупности дают высокую адаптивную пластичность и, как следствие, возможность развития более совершенной иммунной защиты. Для изучения роли УПС в защитной реакции при инфицировании липополисахаридом у аннелид мы использовали модельную систему целомоцитов холодноводных кольчатых червей Arenicola marina (кл. Polychaeta).
Arenicola marina (Linnaeus, 1758) – вид седентарных полихет из семейства Arenicolidae. Распространен в бореальных районах северной Атлантики, в прилегающих районах Северного Ледовитого океана (Жирков, 2001). В Белом море это массовый, легко доступный вид. Укольчатых червей A. marina большая целомическая полость, заполненная жидкостью. В торакальном отделе полость не разделена диссипиментами, что обеспечивает свободную циркуляцию жидкости по телу. В качестве объекта исследования его делает удобным относительно крупный размер (10-12 см в длину) и, соответственно, большое количество целомической жидкости и целомоцитов. Основным компонентом иммунной системы полихет являются свободные клетки целомической жидкости – целомоциты [Галактионов, 2005; Dhainaut, Scops, 2001; Sima, 1994].
Эксперименты по индукции воспаления и сбор материала проводилось на базе Беломорской биостанции им. Н.А. Перцова. Для индукции воспаления взрослым особям червей A. marina вводили в целомическую полость липополисахарид клеточной стенки бактерий, LPS (Sigma, США), растворенный в стерильной морской воде (FSW), в расчетной дозе 50 мкг/мл.
Для контрольных экспериментов использовали FSW. Через 1 час после инъекции у червей отбирали целомическую жидкость и центрифугированием осаждали целомоциты (106 клеток на пробу). Целомоциты гомогенизировали и в осветлённых гомогенатах определяли ХПА протеасом по гидролизу флуорогенного олигопептида Suc-LLVY-AMC (Sigma, США) в концентрации 30 мкМ. Специфичность реакции определяли в опытах с ингибитором протеасом MG-132 и ботезомибом (Sigma, США). Содержание субъединиц 1,2,3,5,6,7 и протеолитической субъединицы 5 протеасом, а также регуляторов протеасом и белков теплового шока оценивали с помощью Вестерн-блоттинга. Структуру протеасомных комплексов исследовали методом нативного электрофореза, модифицированного для неочищенных фракций протеасом.
Чешуекрылые (кл. Insecta) нами использовались в модельной системе клеток Sf9 кукурузной листовой совки для изучения роли УПС в процессе инфицирования бакуловирусом AcMNPV. В природных условиях бакуловирусы инфицируют преимущественно клетки насекомых отрядов Lepidoptera, Hymenoptera и Diptera. Однако эти вирусы обладают тропизмом в отношении широкого спектра клеток позвоночных и млекопитающих, способны проникать в эти клетки, но не реплицируются в них. Из 27 вирусов, испытанных в доклинических и клинических исследованиях, конструкции на основе бакуловируса AcMNPV признаны наиболее безопасными [Koppers-Lalic and Hoeben., 2011]. Использование бакуловирусных векторов типа «sleeping beauty» [Luo et al., 2012] обеспечивает долговременную экспрессию генов в инфицированных клетках и высокую терапевтическую эффективность этих векторов. Линию клеток насекомых Sf9 Spodoptera frugiperda культивировали в среде Sf–900 II, содержащей 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, при 27оС, используя основные технические приемы, разработанные ранее и описанные в инструкции [Bac–to–Bac Baculovirus Expression System./ Instruction Manual.–1993. St. Louis, Life Technologies, Inc., Monsanto Corp. Res.]. Для определения титра вируса, амплификации рекомбинантного вируса, заражения клеток Sf9 бакуловирусом, а также для анализа вирусной экспрессии использовали ту же инструкцию.
Млекопитающие были использованы для изучения особенностей функционирования протеасом в процессе раннего развития органов иммунной и нервной систем. У млекопитающих функционирование иммунной системы в эмбриональный период и во взрослом организме принципиально отличаются. В эмбриональном и раннем постнатальном развитии иммунная система организма знакомится со «своими» антигенами, чтобы в дальнейшем эффективно различать чужеродные. Формирование отдельных структурно функциональных элементов иммунной и нервной систем и становление их специфических функций характеризуются высокой лабильностью и чувствительностью ко многим регуляторным факторам. Особенности функционирования протеасом клеток нервной и иммунной систем в раннем развитии млекопитающих изучены не были. Мы исследовали экспрессию иммунных субъединиц и регуляторов протеасом в клетках печени, являющейся первичным лимфоидным органом в эмбриональном развитии, и вторичном лимфоидном органе селезенке и структурах головного мозга у грызунов в раннем развитии в нормальных условиях и при патологии. Изучение особенностей функционирования пулов протеасом в эмбриональном и раннем постнатальном периодах развития ЦНС селезенке и печени проводили на крысах линии Вистар. Исследование функционирования пулов протеасом в отделах головного мозга у мышей с нарушениями ГКГ класса I проводили на половозрелых мышах-самцах линии C57BL/6J-B2mtm1Unc и C57BL/6 контрольной группы, которых получали из отдела разведения лабораторных животных ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН. Изучение особенностей содержания иммунных протеасом в различных отделах головного мозга с нарушением метаболизма моноаминов проводили у инбредной линии крыс Август с нарушениями обмена 5-HT и DA и контрольной линии Вистар, полученных из отдела разведения лабораторных животных ФГУП «НИИ общей патологии и патофизиологии» РАН. Все эксперименты были выполнены в соответствии с Перечнем требований по этике работы с лабораторными животными.
Кроме того, мы охарактеризовали взаимосвязь экспрессии иммунных протеасом и экспрессии рецепторов половых гормонов в опухоли молочной железы у человека. Для изучения пулов протеасом в злокачественных опухолях у пациентов были исследованы пулы протеасом послеоперационного материала 123 пациентов с опухолями молочной железы. Использовали экспериментальный материал, полученный в Томском Государственном научно-исследовательском Институте онкологии Сибирского отделения РАН. Работа проводилась с информированного согласия пациентов в соответствии с этическими нормами, изложенными в 3м издании Руководства по Практике этических комитетов в области медицинских исследований, выпущенных Королевским институтом врачей и одобренными местным комитетом
Особенности функционирования убиквитин-протеасомной системы в клетках Sf9 в ходе инфекции вирусом AcMNPV
Чтобы охарактеризовать протеасомную систему в клетках Sf9 инфицированных AcMNPV, клеточные экстракты были получены в разные периоды после заражения бакуловирусом. Вестерн-блоттинг с моноклональными антителами к субъединице а 1,2,3,5,6,7 протеасом выявил 6 иммунореактивных полос в осветлённых гомогенатах проб. Они определяются в гомогенатах проб до 120 часов после инфекции и означают, что протеасомы стабильны в течение всего цикла инфекцирования (Рис. 16А). Ферментативная активность протеасом в ходе инфекции определялась после инкубации осветленных гомогенатов проб с флуоресцентным субстратом Suc-LLVY -AMC, предназначенного для анализа ХПА. Нормализованные данные показывают плавное снижение ХПА в течение инфекции (Рис. 16Б). Снижение удельной активности протеасом в течение 2-3 дней после заражения может быть обусловлено накоплением вирусных белков в инфицированных клетках. Данные, приведенные на Рис. 16, предполагают целостность и функциональную активность протеасом клеток в течение всего цикла бакуловирусной инфекции. Этот вывод подтвержден анализом структуры протеасом и их активности после фракционирования в нативном полиакриламидном геле (Рис. 16В). Очевидно, что протеасомы в клетках Sf9, как и у других эукариот, представлены комплексами 20 S (коровая частица CP) и 26S (коровая частица и одна или две 19S регуляторные частицы), протеолитическая активность которых в ходе бакуловирусной инфекции существенно не изменяется (Рис. 16Б). При электрофорезе экстрактов клеток Sf9 в полиакриламидном геле в нативных условиях протеолитическая активность возрастает во фракциях 20S протеасом инфицированных клеток (Рис. 16В, дорожки 3-4). Особенностью пула 20S протеасом в клетках Sf9 является структурная гетерогенность, которая проявляется в наличии субфракций с большей массой, чем индивидуальные коровые частицы CP. Мягкая обработка детергентом 0,1 % SDS приводит к конверсии всех субфракций 26S протеасом во фракцию индивидуальных коровых частиц (Рис. 16В, дорожка 5). Последующий Вестерн-блоттинг с моноклональными антителами к субъединице а 1,2,3,5,6,7 протеасом выявил 6 иммунореактивные полосы во фракциях 20S- и 26S- протеасом.
Методами протеомного анализа, включающего двумерный электрофорез, MALDIOF масс-спектрометрию и поиск гомологов в биоинформационных базах с помощью пакета MASCOT мы идентифицировали 34 гомолога субъединиц 26S протеасом эукариот, включая 14 белков, составляющих «коровую» 20S протеасому (7 субъединиц альфа-типа и 7 субъединиц бета-типа) и 20 белков регуляторной 19S частицы RP (11 субъединиц RPN-типа, 6 субъединиц RPT-типа, деубиквитиназы UCH-14/UBP6, UCH-L5/UCH37 и тиоредоксин). Мы провели сравнительный анализ субъединичного состава 26S протеасом из контрольных и инфицированных бакуловирусом AcMNPV клеток Sf9, который показал, что субъединичный состав 26S протеасом в ходе инфекции бакуловирусами остается неизменным (Табл. 3, Приложение). 20S субъединицы протеасомы обозначались с использованием номенклатуры, UniProKB, предоставленной в GenBank.
Однако в результате бакуловирусной инфекции появляются дополнительные минорные формы нескольких субъединиц в коровых 20S протеасомах (бета1a, бета3a, альфа1a, бета7a). Наиболее выраженным результатом инфекции является частичный протеолиз субъединицы альфа5(zeta). По-видимому, в ходе инфекции бакуловирусом происходит протеолиз свободной формы этого белка (Рис. 17).
На поздних стадиях инфекционного цикла (24-48 час после инфицирования) в цитоплазме клеток определяются агресомы, содержащие убиквитинированные белки и шапероны семейства HSP/HSC70. Агресомы постепенно сливаются со структурами типа вакуолей, которые идентифицированы как лизосомы на основе иммунной реакции с антителами к катепсину D (Рис. 18).
По-видимому, формирование агресом и их слияние с лизосомами отражают специфичную защитную реакцию клеток насекомых на вирусную инфекцию. В опытах с ингибированием протеасом лактацистином нами были обнаружены существенное увеличение количества убиквитинированных белков и их агрегатов и задержка инициации репликации вирусного генома (Рис. 19), что свидетельствует о роли протеасом в детоксикациии, а также об их важной функции в ранних этапах развития инфекции.
Активность протеасом необходима для ранних стадий продуктивного инфекционного цикла бакуловирусов (Рис. 19). Ингибирование протеасом лактацистином значительно увеличивает пул убиквитинированных белков (Рис. 20А) и снижает синтез вирусной ДНК в Sf9 клетках, инфицированных AcMNPV (Рис. 28).
Добавление ингибитора (Lactacystin) протеасом в инкубационную среду увеличивает содержание в цитоплазме клеток убиквитинированных белков (агресом) (Рис. 21).
Особенности протеасомных механизмов регуляции гомеостаза протеома клеток ЦНС, печени и селезенке у грызунов
Известно, что высокий уровень мРНК иммунных субъединиц протеасом не коррелируют с высоким содержанием белка и предполагает специфический механизм трансляции, который контролирует синтез иммунных субъединиц протеасом [Frentzel et al., 1993]. Наше внимание было уделено именно белковой экспрессии субъединиц протеасом. Экспрессия иммунных протеасом, содержащих субъединицы LMP2 и / или LMP7 было проанализировано на основании экспрессии этих субъединиц в клетках. Поскольку третья иммунная субъединица MECL1, как известно, интегрируется в сборку протеасом совместно с субъединицей LMP2, но независимо от субъединицы LMP7 [Griffin et al., 1998; Cruz et al., 2005], в наших экспериментах была исследована экспрессия только субъединиц LMP2 и LMP7.
Исследуя пластичность протеасом у млекопитающих, мы выявили особенности пулов протеасом клеток головного мозга, селезенки (вторичного лимфоидного органа) и печени (являющейся первичным лимфоидным органом в эмбриогенезе) в процессе функционального созревания клеток в раннем онтогенезе крысы и в модельных системах нарушения развития.
Клетки мозга и печени и селезенки крысы в период раннего развития демонстрируют динамику изменений иммунных субъединиц протеасом, связанную с их функциональным созреванием. Пулы протеасом мозга и органов иммунной системы отличны и в разной степени могут быть задействованы в реализации КПА и КПА протеасом в клетках, что было продемонстрировано при использовании метода нативного фореза для грубых фракций протеасом. По данным, полученным нами в нативных условиях, в печени существует «свободная» форма 20S протеасом, тогда как в мозге превалируют 20S формы протеасом связанные с регулятором РА28 (Рис. 75).
Очевидно изменения, наблюдаемые в экспрессии регуляторов протеасом в развитии органов ЦНС и иммунных органов, а также изменения при нарушениях в развитии, могут быть связаны с перестройками в определённых пулах протеасом. На клеточных линиях HeLa ранее показано, что в клетках присутствуют подтипы конститутивных и иммунных протеасом, а воздействие IFN- приводтит к сборке иммунных протеасом 1i-2i-5i или 1i-2c-5i, симметричных относительно их 1- и 5-субъединичной композиции [de Bruin et al., 2016]. Другими авторами продемонстрирована сборка ассиметричных форм иммунных протеасом 1i-2c-5 и 1-2c-5i [Park et al., 2014; Dahlmann et al. 2016]. Клетки Пуркинье в мозжечке, экспрессирующие LMP7 иммунную субъединицу протеасом выявлены нами методом флуоресценции. Изменение в их численности и распределении соответствует периодам формирования структурных зон мозжечка [Zang et al., 2014]. В нейронах мозжечка показана необходимость локальной регуляции субъединиц РА700 протеасом, находящихся возле центросомы, для убиквитин-зависимого распада белков в раннем морфогенезе [Schmidt et al., 2005]. Полученные нами результаты указывают согласованную экспрессию регулятора РА700 и иммунной субъединицы LMP7 протеасом в периоды функционального созревания клеток мозжечка. По-видимому, у млекопитающих скоординированная тканеспецифическая экспрессия иммунной субъединицы LMP7 и регулятора РА700 необходимое условие для обеспечения иммунных функций клеток. Ранее было установлено, что экспрессия генов LMP7 иммунных субъединиц протеасом связана с экспрессией генов ГКГ класса 1 в развитии Xenopus [Sal-Cid et al., 1998]. Интересно, что мозжечок и селезенка в раннем развитии демонстрируют сходную динамику ХПА протеасом. Возможно, согласованные изменения в пулах протеасом необходимы для обеспечения гомеостаза клеточного протеома в раннем развитии и обусловливают взаимодействие органов у взрослых животных. Показано, что селезенка является ключевым компонентом в иммунной реакции ишемического повреждения головного мозга увзрослых млекопитающих [Okuaki et al., 1996; Savas et al., 2003; Pennypacker, 2014].
Нами обнаружена положительная связь динамики содержания регулятора РА28, иммунной субъединицы LMP2 и конститутивной субъединицы 5 в раннем онтогенезе фронтальной коры головного мозга крысы. В период раннего онтогенеза в мозжечке уровень иммунной субъединицы LMP2 не меняется, но увеличивается содержание иммунной субъединицы LMP7 и регулятора РА700. В стволе головного мозга наблюдалось увеличение общего пула протеасом, которое сопровождалось увеличением содержания иммунных LMP2 и LMP7 и каталитических 1 и 5 субъединиц, а также регулятора РА28 протеасом. ХПА и КПА протеасом значимо менялись в периоды функционального созревания отделов мозга.
Известно, что специфичность протеолиза регулируется посредством РА28, что позволяет протеасомам эффективнее продуцировать олигопептиды для ГКГ класса I [Gavilan et al., 2009]. Фронтальная кора и мозжечок мозга В2m-нокаутных мышей (с нарушениями в ГКГ класса I) характеризуются повышением экспрессии иммунных протеасом и увеличением соотношения регуляторов РА28 и РА700, по крайней мере, за счет повышения экспрессии регулятора РА28. Изменение экспрессии иммунной субъединицы LMP2 было однонаправлено с изменением экспрессии иммунной субъединицы LMP7 во всех отделах мозга В2m-нокаутных животных по сравнению с контрольной группой. Однако изменение экспрессии субъединицы LMP2 было либо менее выраженным (в мозжечке), либо проявлялась только тенденция к этому изменению (в коре, стриатуме, стволе). Полученный результат свидетельствует о том, что иммунные субъединицы LMP7 и LMP2 входят в состав разных форм иммунных протеасом в головном мозге В2m-нокаутных мышей. Иными словами, во всех отделах головного мозга В2m-нокаутных мышей имеется форма, содержащая субъединицу LMP7, а также форма, содержащая субъединицу LMP2, и, возможно, форма, содержащая обе эти субъединицы. В стриатуме и стволе головного мозга В2m-нокаутных мышей при неизмененном уровне общего пула протеасом и сниженном содержании в нем иммунных субъединиц белковый обмен поддерживается преимущественно за счет конститутивных протеолитических субъединиц. Очевидно, такое разделение ролей протеасом в различных отделах головного мозга В2m-нокаутных мышей обеспечивает целостность функционирования центральной нервной системы в отсутствие молекул ГКГ I. Обнаруженный нами факт корреляции экспрессии иммунных протеасом, активатора РА28 и сигнальных белков nNOS и HSP70 во фронтальной коре и стволе мозга В2m-нокаутных мышей дает основание полагать, что данные сигнальные белки включены в регуляцию экспрессии иммунных протеасом и активатора РА28 и в ситуации, связанной с отсутствием молекул ГКГ I. По нашим данным, головной мозг В2m-нокаутных мышей отличается от контрольных мышей C57BL/6 клеточным составом: в большинстве изученных отделов нокаутных мышей уменьшено содержание нейронов и астроцитов. Этот результат отражает последствия нарушения миграции нейрональных предшественников из выстилки желудочков головного мозга в отсутствие молекул ГКГ I. Изменения клеточного состава в нервной ткани конечного мозга свидетельствуют о комплексных, специфических нарушениях процессов формирования фронтальной коры и стриатума в онтогенезе В2m-нокаутных животных. Снижение способности к запоминанию у взрослых В2m-нокаутных животных может быть обусловлено изменением структуры нейронных сетей в кортикальных отделах конечного мозга, и, как следствие, снижением пластичности неокортекса. Структуры конечного мозга демонстрируют самую высокую способность к компенсации нарушений в метаболизме моноаминов путем активации клеточных (увеличение популяции нейронов и глии) и молекулярных механизмов нейрональной пластичности, а именно, индукцией транскрипционного фактора Zif268, иммунных протеасом, регуляторов протеасом, и белка теплового шока HSP70. Стриатум занимает промежуточное положение между стволом и фронтальной корой, являясь ближайшей мишенью для дофаминергических нейронов и средне-удаленной для серотонинергических нейронов. Проведенное нами исследование показало, что содержание Zif268 и иммунных протеасом повышено во фронтальной коре и стриатуме крыс линии Август одновременно с увеличенным содержанием 5 HT и DA на фоне сниженной активности триптофан- и тирозин-гидроксилаз.
Иммуногистохимический анализ выявил значительно большее количество белка Zif268 в цитоплазме клеток фронтальной коры головного мозга у крыс линии Август, колокализованного с иммунными субъединицами протеасом.