Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1 Изменения метаболизма миокарда при ишемии и реперфузии 12
1.2 Нарушение ионного баланса кардиомиоцитов при ишемии и реперфузии 13
1.3 Влияние ишемии-реперфузии на дыхание митохондрий и трансмембранный потенциал 17
1.4 Повреждение комплексов дыхательной цепи митохондрий и генерация активных форм кислорода при ишемии и реперфузии 19
1.5 Гибель клеток при ишемии и реперфузии миокарда 21
1.6 Защитные эффекты хронической гипоксии 23
1.7 Внутриклеточный механизм адаптации к хронической гипоксии: роль кардиальных митохондрий 25
1.8 Участие опиоидных рецепторов в реализации защитного эффекта хронической гипоксии 29
Глава 2. Материал и методы исследования
2.1 Дизайн исследования 33
2.2 Адаптация крыс к хронической непрерывной нормобарической гипоксии 35
2.3 Моделирование глобальной ишемии и реперфузии изолированного сердца 35
2.4 Измерение параметров сократительной активности изолированного сердца 37
2.5 Оценка степени некротического повреждения миокарда 38
2.6 Выделение митохондрий из миокарда 39
2.7 Оценка дыхания митохондрий 40
2.8 Измерение трансмембранного потенциала митохондрий (Ду) 40 2.9 Оценка кальций-связывающей способности митохондрий (КСС) 41
2.10 Определение содержания АТФ в миокарде 42
2.11 Неселективные и селективные антагонисты опиоидных рецепторов.. 42
2.12 Статистическая обработка данных 44
Глава 3. Результаты и их обсуждение 45
3.1 Кардиопротекторное действие хронической непрерывной нормобарической гипоксии 45
3.1.1 Антинекротический эффект адаптации к хронической гипоксии 45
3.1.2 Реперфузионное восстановление сократительной функции изолированного сердца при адаптации к хронической гипоксии 46
3.1.3 Функциональное состояние миокардиальных митохондрий после ишемии и реперфузии изолированного сердца у крыс при адаптации к хронической гипоксии 51
3.2 Исследование участия кардиальных опиоидных рецепторов в изменении устойчивости сердца и митохондрий к ишемии-реперфузии при адаптации к хронической непрерывной нормобарической гипоксии.. 58
3.2.1 Влияние блокады кардиальных опиоидных рецепторов на реализацию антинекротического эффекта хронической гипоксии 59
3.2.2 Участие кардиальных опиоидных рецепторов в реперфузионном восстановлении сократительной активности изолированного сердца у адаптированных к хронической гипоксии крыс 60
3.2.3 Участие кардиальных опиоидных рецепторов в повышении устойчивости митохондрий к ишемии-реперфузии при адаптации к хронической гипоксии 69 Обсуждение к Главе 3 81 Заключение 90
Выводы 91
Список сокращений 92
Список литературы
- Влияние ишемии-реперфузии на дыхание митохондрий и трансмембранный потенциал
- Адаптация крыс к хронической непрерывной нормобарической гипоксии
- Определение содержания АТФ в миокарде
- Влияние блокады кардиальных опиоидных рецепторов на реализацию антинекротического эффекта хронической гипоксии
Введение к работе
Актуальность исследования. Защита миокарда от ишемических и
реперфузионных повреждений – важная задача современной физиологии,
патологической физиологии и кардиологии. Данный тип повреждения
является ключевым звеном патогенеза ишемической болезни сердца и,
прежде всего, острого инфаркта миокарда (ОИМ) – социально значимого
заболевания, являющегося одной из основных причин потери
трудоспособности и смертности среди взрослого населения в Российской Федерации [Марков В.А. и др., 2011; Шальнова С.А. и др., 2012].
Гибель кардиомиоцитов во время ишемии развивается крайне быстро.
По данным нашей лаборатории, экспериментальное моделирование
коронароокклюзии (20 мин) и последующей реперфузии (3 ч) вызывает
формирование обширного очага некроза миокарда [Цибульников С.Ю. и др.,
2011]. У пациентов с инфарктом миокарда увеличение содержания
кардиоспецифических маркеров некроза кардиомиоцитов (тропонины Т, I,
миоглобин) в плазме крови регистрируется уже через 2 ч после острого
приступа стенокардии [Островский, О.В. и др., 2013]. Несмотря на
существование системы оказания скорой и неотложной помощи больным с
инфарктом миокарда, в России такие пациенты поступают в стационар в
среднем в течение 2,5 – 2,8 ч [Марков В.А. и др., 2011], то есть уже после
наступления необратимых повреждений кардиомиоцитов. Реканализация
инфаркт-связанной коронарной артерии может сопровождаться
реперфузионным повреждением сердца [Jennings R.B. et al., 1960; Braunwald E. et al., 1985; Hausenloy D.J. et al., 2005], которое проявляется возникновением реперфузионных аритмий, эндотелиальной дисфункцией (феномен no-reflow), нарушением сократимости миокарда (феномен «оглушенного миокарда»), а также некрозом кардиомиоцитов [Yellon D.M. et al., 2007].
Несмотря на существование широкого спектра клинических методов,
направленных на предупреждение ишемических-реперфузионных
повреждений миокарда [Гарганеева А.А. и др., 2014; Марков В.А. и др., 2011], эффективность традиционных подходов остается недостаточной [Braunwald E., 2015]. В связи с этим возникает необходимость повышения устойчивости сердца к ишемии и реперфузии. В качестве одного из таких способов рассматривается адаптация к хронической непрерывной нормобарической гипоксии (ХННГ), результатом которой является формирование выраженной толерантности сердца к ишемии-реперфузии. Кроме того, знания о механизмах формирования адаптационной устойчивости миокарда дают новые возможности в создании лекарственных препаратов, действие которых направлено на защиту сердца от ишемических-реперфузионных повреждений.
Степень разработанности. Явление повышенной толерантности сердца, формирующейся в условиях длительного воздействия гипоксии, было обнаружено еще в 50-х гг. прошлого столетия [цит. по Kolar F. et. al., 2004] и остается актуальным в настоящее время [Borchert G.H. et. al., 2011; Chytilova A. et al., 2015]. Это связано с возникновением длительной устойчивости сердца к ишемии-реперфузии, формирующейся в условиях гипоксии [Neckar J. et. al., 2004; Нарыжная Н.В. и др., 2013]. На основании эпидемиологических наблюдений конца 1950-х годов, показывающих низкую частоту инфарктов миокарда у людей, живущих в условиях высокогорья, чешскими исследователями был открыт кардиопротекторный эффект адаптации к гипоксии [Kopecky M. et al., 1958]. В 1958 году M. Kopecky и соавт. [Kopecky M. et al., 1958] показали, что сократительная активность изолированного сердца крыс, пребывавших в условиях моделирования высокогорной гипоксии, лучше восстанавливается после воздействия аноксии, чем у интактных животных. Кроме того, этой же группой физиологов было обнаружено повышение устойчивости миокарда адаптированных крыс к ишемическому повреждению [Poupa O. et al., 1966]. Большой вклад в изучение антиаритмического эффекта прерывистой высокогорной гипоксии внесли работы отечественных физиологов под руководством профессора Ф.З. Меерсона [Meerson F.Z. et al., 1973; Meerson F.Z. et al., 1987]. Позднее в 1994 году M. Tajima и коллегами на модели глобальной ишемии изолированного сердца крысы был обнаружен кардиопротекторный эффект адаптации к нормобарической гипоксии [Tajima M. et al., 1994].
Несмотря на то, что феномен кардиопротекции при адаптации к хронической гипоксии известен уже давно, механизмы его формирования еще мало изучены. Опираясь на результаты исследований, в которых было показано, что моделирование ишемического прекондиционирования у адаптированных к хронической нормобарической гипоксии животных не усиливает кардиопротекторный эффект адаптации [Baker J.E. et al., 1999; Neckar J. et al., 2002], можно предположить, что молекулярные механизмы этих адаптивных феноменов могут быть схожими.
Реализация механизма кардиопротекции в условиях пре- или посткондиционирования возможна за счет активации опиоидных рецепторов [Garlid K.D. et al., 2009]. К настоящему времени накоплен большой массив данных о способности агонистов опиоидных рецепторов повышать толерантность сердца к ишемии и реперфузии [Aitchison K.A. et al., 2000; Gross G.J., 2003; Peart N.J. et al., 2005; Takasaki Y. et al., 1999; Wang G.Y. et al., 2001; Лишманов Ю.Б. и др., 2005]. В частности, отмечается способность морфина ингибировать открытие МРТ-пор митохондрий [Kim J. H. et al., 2011], а также увеличивать скорость АДФ-стимулированного дыхания
митохондрий в ответ на гипоксию-реоксигенацию кардиомиоцитов [Obame F.N. et al., 2008].
Показано, что при продолжительном гипоксическом воздействии на
организм увеличивается содержание эндогенных лигандов опиоидных
рецепторов как в плазме крови, так и в миокарде [Maslov L.N. et al., 2013].
Кроме того, сами кардиомиоциты способны синтезировать эндогенные
опиоидные пептиды из пре-проэнкефалина, продинорфина и
проопиомеланокортина [Caffrey J.L. et al., 1994; Barron B.A., 2000]. Все эти данные подтверждают участие эндогенной опиоидной системы в повышении адаптационной устойчивости сердца к ишемии и реперфузии.
Известно, что развитие устойчивости миокарда к ишемии-реперфузии, вызванное пре- или посткондиционированием, осуществляется через запуск внутриклеточного каскада киназных реакций [Penna C. et al., 2013]. Конечным эффектором данного процесса служат митохондрии, в результате чего происходит повышение устойчивости МРТ-пор к избытку ионов кальция, активации митохондриальных АТФ-зависимых К+-каналов, стабилизация энергетической функции, а также уменьшение продукции активных форм кислорода [Halestrap A.P. et al., 2007; Hausenloy D.J. et al., 2009; O’Rourke B., 2004; Penna C. et al., 2013].
Учитывая имеющиеся сведения о возможном участии эндогенных
опиоидов в повышении устойчивости сердца к ишемии-реперфузии после
адаптивного феномена пре- и посткондиционирования [Maslov L.N. et al.,
2016], а также данные о роли митохондрий в защите миокарда от
ишемического-реперфузионного повреждения [Halestrap A.P. et al., 2015;
Ong S.B. et al., 2015], можно заключить, что исследования, направленные на
выяснение роли опиоидных рецепторов и кардиальных митохондрий в
механизмах кардиопротекции при адаптации к хронической гипоксии,
представляются важными и перспективными. Стоит отметить, что в
настоящее время участие кардиальных опиоидных рецепторов в механизмах
кардиопротекции при адаптации к хронической непрерывной
нормобарической гипоксии мало изучено.
Цель исследования. Изучить роль кардиальных 1-, 2-, - и -опиоидных рецепторов в повышении устойчивости изолированного сердца к действию глобальной ишемии и реперфузии в зависимости от функционального состояния миокардиальных митохондрий при адаптации к хронической непрерывной нормобарической гипоксии.
Задачи исследования:
1) Исследовать участие опиоидных рецепторов в реализации
антинекротического эффекта хронической непрерывной
нормобарической гипоксии при ишемии и реперфузии изолированного сердца.
-
Оценить вклад опиоидных рецепторов в улучшение постишемического восстановления сократительной активности изолированного сердца, а также в уменьшение реперфузионной контрактуры миокарда у крыс после хронической непрерывной нормобарической гипоксии.
-
Выявить роль опиоидных рецепторов в адаптационной регуляции митохондриального дыхания, трансмембранного потенциала, а также синтеза АТФ митохондриями миокарда при действии глобальной ишемии и реперфузии на изолированное сердце.
-
Определить значение опиоидных рецепторов в сохранении высокой устойчивости МРТ-пор митохондрий к открытию в условиях ишемии-реперфузии изолированного сердца после адаптации к хронической непрерывной нормобарической гипоксии
-
Сопоставить параметры восстановления сократительной функции изолированного сердца и функционального состояния миокардиальных митохондрий после адаптации к хронической непрерывной нормобарической гипоксии.
Научная новизна. В настоящем исследовании впервые установлено, что антинекротический эффект хронической непрерывной нормобарической гипоксии, а также ее способность улучшать постишемическое восстановление сократительной активности изолированного сердца крысы реализуются через активацию кардиальных 2- и -опиоидных рецепторов. Кроме того, выявлено, что 2- и -опиоидные рецепторы принимают участие в поддержании энергетической функции митохондрий и в повышении устойчивости МРТ-пор митохондрий к перегрузке их ионами кальция после ишемического-реперфузионного повреждения изолированного сердца у адаптированных к ХННГ крыс.
Впервые проведено сопоставление параметров постишемического
восстановления сократительной активности миокарда с показателями
функционального состояния митохондрий. При этом выявлена
корреляционная зависимость между реперфузионными значениями давления,
развиваемого левым желудочком (ДРЛЖ) сердца, и скоростью АДФ-
стимулированного дыхания митохондрий миокарда. Аналогичная взаимосвязь
обнаружена между ДРЛЖ и кальций-связывающей способностью
кардиальных митохондрий, которая сохранялась при блокировании
опиоидных рецепторов.
Теоретическая и практическая значимость. Полученные данные
фундаментального характера расширяют существующие представления о
механизмах реализации кардиопротективного действия хронической
непрерывной нормобарической гипоксии, что необходимо учитывать для разработки эффективных и патогенетически обоснованных методов
профилактики ишемических и реперфузионных повреждений, а также для создания новых кардиопротекторных препаратов.
Результаты настоящего исследования с 2016 года внедрены в учебный
процесс кафедры физиологии человека и животных Томского
государственного университета, в курс лекций для ординаторов по
специальностям кардиология, сердечно-сосудистая хирургия,
анестезиология-реаниматология, функциональная диагностика, детская кардиология, для аспирантов по специальностям сердечно-сосудистая хирургия, анестезиология-реаниматология, патологическая физиология НИИ кардиологии Томского НИМЦ, а также в учебный процесс кафедры нормальной физиологии ФГБОУ ВО СибГМУ.
В ходе выполнения настоящего диссертационного исследования был получен патент РФ № 2587783 от 27 мая 2016 г «Средство, увеличивающее устойчивость сердца к аритмогенному действию ишемии и реперфузии».
Методология и методы исследования. Для достижения
поставленной цели применялись системный и комплексный подходы.
Использовались следующие методы: спектрофотометрия,
спектрофлуориметрия, полярографическая оксиметрия и
хемилюминесцентный метод анализа. Объектом исследования были выбраны белые аутбредные крысы линии Вистар (источник – виварий НИИ кардиологии Томского НИМЦ). В качестве основных естественнонаучных методов исследования применялись эксперимент, измерение, сравнение.
Положения, выносимые на защиту:
-
Кардиопротекторное действие адаптации к хронической непрерывной нормобарической гипоксии, которое проявляется снижением степени некроза кардиомиоцитов, улучшением восстановления сократительной активности, а также уменьшением реперфузионной контрактуры изолированного сердца, связано с активацией кардиальных 2- и -опиоидных рецепторов.
-
В условиях адаптации к хронической непрерывной нормобарической гипоксии устойчивость показателей митохондриального дыхания, трансмембранного потенциала и синтеза АТФ, а также снижение чувствительности МРТ-пор митохондрий к избытку ионов кальция в ответ на ишемию-реперфузию изолированного сердца зависит от активации кардиальных 2- и -опиоидных рецепторов.
-
Постишемическое восстановление силы сокращения изолированного сердца зависит от скорости митохондриального дыхания и функционального состояния МРТ-поры. Эта зависимость сохраняется при адаптации к хронической непрерывной нормобарической гипоксии.
Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность
полученных результатов обеспечена достаточным объемом материала
исследования, использованием высокоинформативных научных методик,
современного оборудования, а также адекватных методов статистической
обработки данных. Материалы диссертации были доложены и обсуждены на
научно-практической конференции с международным участием
«Нейрогуморальные механизмы регуляции висцеральных функций в норме
и при патологии» (Томск, 2013); научной конференции с международным
участием «Нейрогуморальные механизмы регуляции висцеральных функций
в норме и патологии» (Томск, 2014); Всероссийской научно-практической
конференции с международным участием «Трансляционные исследования в
инновационном развитии здравоохранения» (Санкт-Петербург, 2014); VII
съезде кардиологов республики Узбекистан «Стратегические задачи
снижения сердечно-сосудистой заболеваемости и смертности» (Ташкент,
2015); VI Всероссийской с международным участием школе-конференции
«Физиология кровообращения» (Москва, 2016); XVI ежегодном научно-
практическом семинаре молодых ученых «Актуальные вопросы
экспериментальной и клинической кардиологии» (Томск, 2016);
международной научно-практической конференции «Новые технологии
восстановления деятельности сердца и других органов в эксперименте и
клинике» (Томск, 2016).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 работ, из которых 8 полнотекстовых статей в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК РФ для публикации диссертационных исследований на соискание ученой степени кандидата наук, 2 статьи в международных журналах, получен патент РФ на изобретение.
Личный вклад автора. Автором самостоятельно были выполнены экспериментальные исследования, проведены статистическая обработка, анализ и обобщение полученных данных, сформулированы научная новизна, положения и выводы, а также написан текст диссертации.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста. В структуре диссертации выделены введение, обзор литературы, описание материала и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключение, выводы, список литературы, который включает 202 источника (из них 19 отечественных и 183 зарубежных). Работа содержит 14 таблиц, 12 рисунков.
Влияние ишемии-реперфузии на дыхание митохондрий и трансмембранный потенциал
снижением активности Na+/K+-АТФазы из-за уменьшения Во время ишемии миокарда недостаток поступления кислорода нарушает работу электронной транспортной цепи митохондрий, в результате наблюдается падение содержания АТФ в миокарде. АТФ-синтаза митохондрий, в норме перекачивающая протоны из межмембранного пространства в матрикс органелл и синтезирующая молекулы АТФ, при ишемии начинает работать в обратном направлении [157]. Таким образом, она расходует 50-80% АТФ для перекачивания протонов из матрикса в межмембранное пространство, обеспечивая поддержание трансмембранного потенциала митохондрий () [75]. Активация анаэробного гликолиза, лактатацидоз, а также гидролиз АТФ приводят к значительному снижению внутриклеточного рН [157, 161]. Накопление [H+] активирует Na+/H+-антипортер, это приводит к увеличению содержания внутриклеточных ионов натрия ([Na+]i) [64]. Накопление [Na+]i также обусловлено содержания АТФ внутри клетки [139]. Увеличение содержания [Na+]i вызывает инверсию работы Na+/Ca2+-антипортера и способствует подъему концентрации [Са2+]i внутри клетки [46]. В перегрузку кардиомиоцитов кальцием вносит вклад ингибирование его обратного захвата саркоплазматическим ретикулумом за счёт снижения активности Cа2+-АТФазы (SERCA2a) [67]. Нарушение работы сарколеммальной Са2+-АТФазы – еще один механизм перегрузки кардиомиоцитов ионами Са2+ во время ишемии [183].
Во время реперфузии миокарда, несмотря на восстановление рН до физиологической нормы, накопление ионов [Ca2+]i в клетке продолжается. Интенсивное увеличение концентрации внутриклеточного кальция провоцирует возникновение реперфузионных аритмий. Например, было показано, что при избытке ионов Ca2+ в кардиомиоцитах наблюдаются спонтанные осцилляции мембранного потенциала клеток, триггерная активность и, в результате, угрожающие жизни тахиаритмии [102].
Образующийся при ишемии-реперфузии избыток кальция в саркоплазме захватывается митохондриями. Транспорт ионов Ca2+ внутрь митохондрий осуществляется Ca2+-унипортером за счет энергии трансмембранного потенциала митохондрий (), то есть без участия АТФ [140]. Помимо этого механизма, накопление кальция митохондриями во время ишемии происходит за счет инверсии работы митохондриального Na+/Са2+-обменника [71]. Поглощение избытка Са2+ митохондриями позволяет компенсировать перегрузку данными ионами цитоплазмы во время ишемии. Вместе с тем, обнаружено, что концентрация [Са2+]m во время реперфузии достигает максимум 0,3-0,4 мкМ [71], выше которого его избыток усугубляет ишемическое-реперфузионное повреждение. Существование этого порога объясняется присутствием в митохондриях специфических пор переменной проницаемости (МРТ-пор, mitochondrial permeability transition pore), чувствительных к концентрации ионов кальция [78].
МРТ-пора является компонентом внутренней и внешней мембран митохондрий. Она проницаема для ионов и белков массой до 1,5 кДа и в физиологических условиях находится в закрытом состоянии [76, 157]. По данным проф. A.P.Halestrap мембрано-связанными составляющими МРТ-поры являются фосфатный канал (phosphate inorganic carrier, PiC) и адениннуклеотидтранслоказа (ANT) [78]. Раньше в качестве одного из обязательных компонентов МРТ-пор считались потенциал-зависимые анионные каналы (VDAC1). Однако A. Krauskopf и соавт. сообщили, что нормальное формирование МРТ-поры возможно и у VDAC1-нокаутированных мышей [105]. В качестве регуляторных компонентов предлагаются циклофилин D (CyPD), белок матрикса митохондрий, являющийся мишенью для циклоспорина А, ингибитора МРТ-поры; гексокиназа 2 типа; креатинфосфокиназа; антиапоптотический белок Bcl-2; проапоптотический белок Bax [76, 106]. В недавних исследованиях было показано, что митохондриальная АТФ-синтаза также принимает участие в формировании МРТ-поры [29, 42, 68].
Исследователями принято считать, что во время ишемии МРТ-поры находятся в закрытом состоянии [78]. Предполагается, что этому способствует низкий рН [77]. Таким образом, при реперфузии, когда происходит восстановление рН до нормальных значений, ингибирующее влияние протонов устраняется, что способствует открытию МРТ-поры [70]. Помимо этого, необходимым для открытия МРТ-пор является повышенное содержание ионов кальция в митохондриях и чрезмерная продукция активных форм кислорода (АФК), что наблюдается во время реперфузии и приводит в дальнейшем к гибели кардиомиоцитов [76]. Кроме того, предполагается, что открытию МРТ-пор способствуют увеличение концентрации неорганического фосфата и снижение трансмембранного потенциала митохондрий [76].
Адаптация крыс к хронической непрерывной нормобарической гипоксии
Для регистрации параметров сократительной активности изолированного сердца в полость левого желудочка вводили катетер, на конце которого был закреплен латексный баллончик, заполненный дистиллированной водой. С помощью изменения объема баллончика, конечное диастолическое давление устанавливали на уровне 10-13 мм рт. ст. Показатели сократительной функции сердца измеряли в изоволюмическом режиме с использованием датчика давления SS13L (Biopac System Inc., США). Изменения давления в левом желудочке записывали с использованием аппарата MP35 (Biopac System Inc., США). Количественную обработку данных проводили с помощью программного обеспечения INSTBSL-W (Biopac System Inc., США). Значения параметров сокращения изолированного сердца записывались в период нормоксической перфузии, в начале ишемии, а также на 5-й, 15-й и 30-й мин реперфузии.
Измеряли параметры сократительной активности изолированного сердца: – Частота сердечных сокращений (ЧСС, уд/мин) – количество сердечных сокращений на протяжении одной минуты. – Давление, развиваемое левым желудочком изолированного сердца (ДРЛЖ, мм рт. ст.) – характеризует силу сокращений сердца и представляет собой разницу между систолическим и диастолическим давлением. Уменьшение данного параметра в период постишемического восстановления перфузии является одним из показателей тяжести повреждения миокарда. – Конечное диастолическое давление (КДД, % от исходного значения) – используется для оценки степени расслабления сердца, характеризует контрактуру миокарда. В связи с тем, что контрактура миокарда зависит от содержания ионов кальция в миоплазме, то КДД можно рассматривать как косвенный показатель содержания ионов кальция в миоплазме кардиомиоцита [2]. - Максимальная скорость сокращения (МСС, мм рт.ст./с) - рассчитывается как максимум производной первого порядка от кривой развития давления в левом желудочке. - Максимальная скорость расслабления (МСР, мм рт.ст./с) - характеризует состояние процесса расслабления сердечной мышцы.
Степень некроза миокарда в ответ на ишемию и реперфузию оценивали по измерению активности фермента креатинфосфокиназы (КФК) в перфузионном растворе, который оттекал от изолированного сердца во время его реперфузии. Активность КФК в перфузате измеряли с использованием коммерческих энзиматических наборов CK-NAc фирмы «Analyticon Biotechnologies» (Lichtenfels, Германия) на спектрофотометре SmartSpec Plus (Bio-Rad, Калифорния, США), длина волны 340 нм. Суть метода заключалась в увеличении поглощения света (длина волны 340 нм), которое зависит от активности креатинфосфокиназы в образце перфузата, который вносили в кювету с инкубационной смесью. Реакция протекает в три этапа:
Инкубационная среда содержит глюкозу, гексокиназу (ГК), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу (ГФДГ) и никотинамиддинуклеотидфосфат (НАДФ+). Образующийся на первой стадии АТФ используется в реакции фосфорилирования глюкозы с получением глюкозо-6-фосфата. На третьем этапе глюкозо-6-фосфат участвует в восстановлении НАДФ+ до НАДФН. В результате, скорость образования НАДФН, измеряемая на спектрофотометре (длина волны 340 нм), пропорциональна активности КФК. В кювету к 1 мл инкубационной среды добавляли 100 мкл перфузионного раствора и инкубировали при 30 С; оптическую плотность измеряли на 3-й и 5-й минутах от начала инкубации. Активность креатинфосфокиназы вычисляли по следующей формуле: мкмолъЫАПН ( нач- он хVхЮОО КФК{ ) = , мынхл 6,22хPх2 где Анач - начальная оптическая плотность раствора на 3 мин инкубации образца, Аконеч - конечная оптическая плотность раствора на 5 мин инкубации образца, V -общий объем (мл), Р - объем пробы (мл), 6,22 - коэффициент молярной экстинкции НАДН при длине волны 340 нм, 1000 - коэффициент пересчета на литр. Для более удобного представления данных активность КФК выражается в условных единицах (Ед) и пересчитывается на единицу массы сердца (г).
Изоляцию митохондрий проводили методом дифференциального центрифугирования [22, 47]. Для достижения высокого качества выделяемых органелл, все процедуры проводили при температуре 4С. Миокард измельчали ножницами и гомогенизировали с помощью диспергатора Ultraurrax Т10 (IKA-Werke, Staufen, Германия) в 20 мл раствора, содержащего (ммоль/л): сахароза -70, маннитол - 210, EGTA - 6, HEPES - 10 и БСА - 5 мг/мл (рН 7,4). Гомогенат центрифугировали 10 мин при 900 g. Супернатант собирали, пропускали через нейлоновый фильтр, и повторно центрифугировали 10 мин при 12000 g. Осадок ресуспендировали в 20 мл изоляционного буфера с добавлением 0,1 ммоль/л EGTA, а затем центрифугировали 10 мин при 12000 g. Полученный в итоге осадок, содержащий митохондрии, ресуспендировали в 200 мкл изоляционного буфера без EGTA и БСА. Концентрацию белка в конечной суспензии митохондрий определяли по методу Бредфорд [31].
Определение содержания АТФ в миокарде
В главе 3.1.1 было показано, что адаптация к ХННГ обладает выраженным антинекротическим эффектом, проявляющимся уменьшением выброса КФК в 2,6 раза из некротизированных кардиомиоцитов после ишемии-реперфузии изолированного сердца у адаптированных крыс по сравнению с группой неадаптированных особей (Таблицы 2, 9). Перфузия изолированных сердец антагонистами ОР у неадаптированных крыс не влияла на степень некроза миокарда после моделирования глобальной ишемии и реперфузии (Таблица 9).
Активность КФК (Ед/г) в перфузате, оттекающем от изолированного сердца у крыс после перфузии антагонистами ОР (M±SEM) Группа животных Неадаптированные Адаптированные Контроль 10,76 ± 2,18 8,96 ± 0,91 ИР 49,45 ± 3,96 pi = 0,0002 19,02 ± 1,08 рі = 0,0002 р2 = 0,0003 Налоксон + ИР 43,78 ± 3,17 рі = 0,0004 39,78 ± 5,29 р3 = 0,001 TIPP () + ИР 49,7 ± 3,67 рі = 0,0001 51,43 ± 3,06 р3 = 0,0002 BNTX + ИР 47,19 ± 5,58 рі = 0,0002 18,81 ± 1,99 р3 = 0,591 Налтрибен + ИР 43,12 ± 4,84 рі = 0,0004 46,53 ± 3,7 рз = 0,0003 CTAP + ИР 43,89 ± 4,24 рі = 0,006 45,16 ± 3,22 рз = 0,0003 Норбиналторфимин + ИР 49,94 ± 4,46 рі = 0,006 16,25 ± 1,81 Рз = 0,25 Примечание – Контроль – группа крыс с нормоксической перфузией изолированного сердца. ИР – ишемия-реперфузия. p1 - различия по сравнению с группой «Контроль»; p2 - различия по сравнению с группой «Неадаптированные, ИР»; p3 - различия по сравнению с группой «Адаптированные, ИР». Количество особей в каждой группе составило 12. Это свидетельствует об отсутствии самостоятельного кардиопротекторного действия у использованных в эксперименте антагонистов ОР. Перфузия изолированных сердец адаптированных крыс неселективным антагонистом всем типов ОР налоксоном вызывала увеличение активности КФК в перфузате после ишемии-реперфузии в 2,1 раза по сравнению с группой «Адаптированные, ИР» (р 0,05, Таблица 9). В условиях блокады -опиоидных рецепторов TIPP(), а также при селективной блокаде 2-ОР налтрибеном или ингибировании -ОР пептидом CTAP активность КФК в перфузионном растворе оставалась высокой и не отличалась от таковой в группе неадаптированных крыс с ишемией-реперфузией изолированного сердца (Таблица 9). Блокада кардиальных rОР BNTX или -ОР норбиналторфимином у адаптированных особей не влияла на проявление антинекротического эффекта адаптации к гипоксии - активность КФК в перфузате, оттекающем от сердца, у таких крыс не отличалась от группы «Адаптированные, ИР» (Таблица 9).
Анализ полученных данных свидетельствует об участии г и д-субтипов кардиальных опиоидных рецепторов в реализации антинекротического эффекта адаптации к ХННГ. Эти результаты согласуются со сведениями о роли данных субтипов ОР в реализации инфаркт-лимитирующего [129] и цитопротекторного эффектов адаптации к хронической непрерывной нормобарической гипоксии [14].
В главе 3.1.2 была показана способность адаптации к ХННГ улучшать восстановление сократительной функции миокарда у крыс после моделирования глобальной ишемии и реперфузии изолированного сердца. Об участии кардиальных опиоидных рецепторов в реализации защитного эффекта ХННГ судили после неселективной и селективной блокады ОР перед моделированием ишемии-реперфузии изолированного сердца у крыс. Исследование реперфузионного восстановления частоты сердечных сокращений (ЧСС, уд/мин) показало более высокие значения у адаптированных к гипоксии крыс по сравнению с неадаптированными особями (Таблицы 4, 10). Перфузия изолированных сердец неадаптированных крыс неселективными и селективными антагонистами ОР не влияла на показатель ЧСС, т.е. использованные в экспериментах блокаторы ОР в данных концентрациях не обладают самостоятельным хронотропным эффектом (Таблица 10). Блокада всех типов кардиальных ОР налоксоном устраняла защитный эффект адаптации к ХННГ – ЧСС у таких крыс на 15 мин реперфузии была в 1,8 раз меньше (p 0,05), а на 30 мин – в 2,75 раз меньше (p 0,05) по сравнению с группой «Адаптированные, ИР» (Таблица 10). Положительный хронотропный эффект адаптации к хронической гипоксии устранялся после перфузии изолированного сердца селективным -ОР-антагонистом TIPP(), а также 2-ОР-антагонистом налтрибеном – значения ЧСС в этих группах исследования на 15 и 30 мин реперфузии не отличались от таковых у неадаптированных крыс с ишемией-реперфузией сердца (Таблица 10). Аналогичная ситуация наблюдалась и при блокаде -субтипа кардиальных ОР пептидом CTAP – на 5 мин реперфузии изолированного сердца адаптированных особей ЧСС снижалась в 1,4 раза (p=0,048) по сравнению с таковой в группе «Адаптированные, ИР»; на 15 мин реперфузии различие в ЧСС достигало 2,1 раза (p=0,001), к концу данного периода составило 1,8 раз (p=0,0023) по сравнению с группой адаптированных крыс (Таблица 10). Перфузия изолированных сердец адаптированных крыс перед моделированием глобальной ишемии блокатором 1-ОР BNTX или -ОР норбиналторфимином не влияла на восстановление ЧСС – значения данного показателя на всем протяжении реперфузии не отличались от таковых в группе «Адаптированные, ИР» (Таблица 10). На основании полученных результатов можно заключить, что кардиальные 2- и -ОР участвуют в реализации положительного хронотропного эффекта адаптации к ХННГ в ответ на ишемию-реперфузию изолированного сердца у крыс.
Влияние блокады кардиальных опиоидных рецепторов на реализацию антинекротического эффекта хронической гипоксии
Таким образом, кардиальные 2- и -опиоидные рецепторы играют ключевую роль в реализации антинекротического эффекта в условиях адаптации к хронической непрерывной нормобарической гипоксии.
Существует немало доказательств того, что активация ОР эндогенными и экзогенными агонистами оказывает кардиопротекторный эффект в различных формах пре- и посткондиционирования миокарда [73, 109, 156]. В экспериментах с использованием агониста ОР морфина был продемонстрирован его кардиопротекторный эффект [82, 100, 149]. В недавно опубликованной работе H. He и соавт. [82] сообщается, что перфузия изолированного сердца крысы раствором, содержащим морфин (1 мкМ), перед началом моделирования 30-минутной ишемии и 2-часовой реперфузии уменьшала размер инфаркта и снижала высвобождение тропонина I в перфузат, оттекающий от сердца, а также улучшала постишемическое восстановление сократимости. Кроме того, морфин уменьшал реперфузионное падение трансмембранного потенциала кардиальных митохондрий и снижал выработку активных форм кислорода [82]. Установлено, что кардиопротекторный эффект морфина может реализоваться за счет увеличения скорости АДФ-стимулированного дыхания митохондрий и повышения устойчивости МРТ-пор митохондрий к открытию при перегрузке ионами кальция [99, 149].
В отношении защитного действия на сердце селективных агонистов опиоидных рецепторов данные экспериментов несколько расходятся. Например, селективные агонисты -ОР [20, 97], 2-ОР [127], а также -ОР [4] уменьшают степень постишемического некроза кардиомиоцитов в экспериментах с моделированием глобальной ишемии и реперфузии изолированного перфузируемого сердца у крыс. Перфузия изолированного сердца крыс селективными агонистами -ОР DPDPE и TAN-67 оказывает на него негативное инотропное и хронотропное влияние [126]. Однако если агонисты ОР вводили внутривенно до изоляции сердца, они улучшали его сократимость в реперфузионном периоде [110]. Возможно, что указанный инотропный эффект опиоидов связан с появлением в крови подопытных животных опиоид-индуцированного гуморального фактора, который повышает его устойчивость к негативному действию ишемии-реперфузии in vitro.
В исследовании, проведенном на свиньях, с использованием селективного агониста 2-ОР дельторфина D (1 мг/кг) была показана его способность ограничивать размер инфаркта в ответ на моделирование 45-минутной коронароокклюзии и 180-минутной реперфузии [172]. Позднее эти данные были подтверждены в нашей лаборатории в экспериментах на крысах [127]. Селективная активация периферических 2-ОР дельторфином II (0,12 мг/кг) уменьшала соотношение зона инфаркта/область риска после моделирования коронароокклюзии-реперфузии. Способность ограничивать размер инфаркта сохранялась у дельторфина II после селективной блокады 1-ОР BNTX и устранялся в результате селективной блокады 2-ОР налтрибеном. Кроме того, кардиопротекторный эффект дельторфина II устранялся после селективной блокады периферических ОР препаратом налоксона метийодид (5 мг/кг) [127]. Таким образом, активация периферических 2-ОР оказывает кардиопротекторный эффект. В исследовании, проведенном в нашей лаборатории на изолированном перфузируемом сердце крысы, было выявлено, что селективный агонист -ОР DAMGO уменьшает повреждение миокарда в ответ на моделирование глобальной ишемии-реперфузии [112]. Этот эффект был подтвержден и в последующих работах [111, 125]. Кроме того, в этих экспериментах было показано, что селективный агонист -ОР DALDA также способен предотвращать гибель кардиомиоцитов после глобальной ишемии-реперфузии сердца. В более позднем исследовании кардиопротекторного эффекта пептида DAMGO на модели глобальной ишемии-реперфузии изолированного сердца крысы было обнаружено, что интраперитонеальное введение данного -ОР-агониста (0,1 мг/кг) уменьшает реперфузионный некроз кардиомиоцитов и улучшает постишемическое восстановление сократительной функции левого желудочка (ДРЛЖ) [110]. Однако активация кардиальных -ОР с помощью перфузии раствора DAMGO (170 нмоль/л) через изолированное сердце крысы за 10 минут до моделирования глобальной ишемии не влияла на некротическую гибель кардиомиоцитов и ухудшала реперфузионное восстановление сократимости миокарда [110]. Известно, что Ki пептида DAMGO для -ОР составляет 1,23 нмоль [128]. Таким образом, авторы не исключают возможности, что инотропный эффект DAMGO ex vivo реализуется в более низких концентрациях пептида. И в связи с этим предполагают, что кардиопротекторный эффект исследуемого агониста -ОР может быть связан с активацией данного типа периферических рецепторов, локализованных вне самого сердца [138]. Такое расхождение с полученными нами данными, вероятно, объясняется адаптационными изменениями, происходящими в миокарде после длительного воздействия гипоксии. Вполне вероятно, что у адаптированных к хронической гипоксии крыс изменяются экспрессия и свойства ОР, их сродство к агонистам. Например, уже на 3-4 неделе адаптации к хронической прерывистой гипоксии в головном мозге у крыс увеличивается экспрессия мРНК как -, так и -ОР [191], несмотря на то, что до сих пор наличие у крыс кардиальных -ОР остается предметом дискуссии. Обобщая представленные выше данные, а также опираясь на результаты собственных исследований, можно сделать вывод, что улучшенное постишемическое восстановление сократительной активности изолированного сердца крысы при адаптации к хронической непрерывной нормобарической гипоксии также, как и уменьшение некроза кардиомиоцитов, происходит посредством активации кардиальных 2- и -опиоидных рецепторов.
Стоит отметить, что ингибирование открытия МРТ-пор митохондрий, вероятно, также вносит существенный вклад в реализацию опиоид индуцированной кардиопротекции [99]. Кроме того, активация ОР морфином способствует увеличению скорости АДФ-стимулированного и максимальной скорости дыхания митохондрий в кардиомиоцитах при их гипоксии реоксигенации [149]. В нашем исследовании было продемонстрировано, что защитный эффект ХННГ, связанный с повышенной устойчивостью митохондриального дыхания, трансмембранного потенциала и синтеза АТФ митохондриями миокарда, не проявлялся в условиях неселективной блокады ОР, либо селективной блокады 2- или -ОР. Схожая картина наблюдалась и при исследовании устойчивости МРТ-пор к открытию избытком ионов кальция после ишемии-реперфузии в условиях ХННГ – защитный эффект ХННГ устранялся неселективной блокадой ОР, либо селективной блокадой 2- или -ОР.
Таким образом, кардиальные 2- и -опиоидные рецепторы играют важную роль в сохранении энергетической функции митохондрий и в поддержании МРТ-пор в закрытом состоянии после ишемии-реперфузии изолированного сердца крысы в условиях адаптации к хронической непрерывной нормобарической гипоксии.