Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Операции на желудке новые технологии (обзор литературы) 12
1.1. Осложнения после операций на органах брюшной полости 12
1.2. Фазы развития раневого процесса 13
1.3. Роль цитокинового статуса в снижении воспалительной реакции при патологии органов пищеварения 20
1.4. Биологическая терапия - новая стратегия в повышении качества заживления послеоперационных ран желудка 23
1.5. Обоснование клинического применения мезенхимальных стромальных клеток 24
Глава 2. Материал и методы исследования 33
2.1. Способ моделирования послеоперационной раны желудка у крыс 33
2.2. Методика введения стволовых клеток 36
2.3. Методы исследования материала от экспериментальных животных 37
2.4. Методы статистической обработки 40
Глава 3. Макроскопическая картина органов брюшной полости и слизистая оболочка желудка после операции с введением и без введения стволовых клеток (собственный материал) 41
3.1. Макроскопическая картина органов брюшной полости и слизистой оболочки желудка у крыс в норме, после операции, после операции с введением мезенхимальных стромальных клеток 41
3.2. Анатомические изменения отделов желудка у крыс после операции 47
Глава 4. Изменения функциональной активности слизистой оболочки желудка после резекции желудка 51
Глава 5. Содержание серотонина и цитокинов в динамике раневого процесса при операциях на желудке 56
Глава 6. Течение процесса заживления операционной раны при введении стволовых клеток 78
Заключение 90
Практические рекомендации 91
Перспективы дальнейшей разработки темы 91
Список литературы
- Роль цитокинового статуса в снижении воспалительной реакции при патологии органов пищеварения
- Методика введения стволовых клеток
- Анатомические изменения отделов желудка у крыс после операции
- Течение процесса заживления операционной раны при введении стволовых клеток
Роль цитокинового статуса в снижении воспалительной реакции при патологии органов пищеварения
В норме, с прогрессией формирования соединительно-тканного компонента и уменьшением отека тканей герметичность шва снижается (максимально к 4-6 суткам), что приводит к его скорейшему уплотнению за счет созревания соединительно-тканного компонента. Так как биологическая прочность шва зависит от коллагенеза, то максимально опасный период приходится на 4-7 сутки послеоперационного периода. Показано, что несостоятельность шва анастомоза чаще всего выявляется именно в этот ранний послеоперационный срок [61, 71].
По данным академика В.К. Гостищева шовный материал независимо от вида и характера материала вызывают асептическую воспалительную реакцию ткани [69]. В зоне сформированного анастомоза имеются положительные условия для роста микрофлоры ввиду наличия участка ишемии, сукровичного послеоперационного отделяемого, воспалительных изменений стенки органа. Ввиду вышесказанного, наличие дополнительного инородного компонента для тканей и органа - шовного материала - может снижать прочность послеоперационного шва. В связи с тем, что материал для создания анастомоза может иметь разную степень биологической инертности, достаточно остро стоит вопрос о его нахождении в зоне альтерации в первые несколько дней. Так как при создании желудочного шва шовный материал остается в тканях на длительный срок, этот фактор может, рассматривается как неблагоприятный для регенерации [107, 163, 191].
Наиболее изученными последствиями несостоятельности послеоперационных швов является развитие септических состояний и воспалительных реакций прилежащих тканей и органов. К этим же последствиям можно отнести: сепсис, развитие перитонита, формирование внутрибрюшных абсцессов и нагноение послеоперационной раны [104, 123, 126]. Наиболее частым источником инфекции при операциях на органах брюшной полости являются микроорганизмы, содержащиеся в просвете полых органов ЖКТ. Кроме того, существуют факторы иммунологического надзора – клеточные и гуморальные, которые могут, как обеспечит гомеостаз, так и наоборот – простимулировать воспаление в области хирургического повреждения [120 130, 132, 133, 134, 151, 161].
Иммунологическая защита является важным защитно приспособительным и эволюционно-обоснованным механизмом адаптации организма к неблагоприятным условиям среды. Эта защита представлена как клеточным, так и гуморальным компонентами. В совокупности они необходимы организму для скорейшей элиминации вредоносного агента.
В настоящее время наиболее изученной является система интрамуральных лимфатических капилляров, лимфоузлы брыжейки кишечника, пейеровы бляшки, клетки мезотелия сальника и брюшины. Совместно они образуют иммунологическую единицу, защищающую от инфекции путем выработки специфических белков - иммуноглобулинов. Показано, что в слизистой оболочке органов пищеварительного тракта расположено наибольшее количество иммуноглобулинов класса А и иммунологически активных клеток. Циркулирующие по периферии органов В-лимфоциты также вырабатывают иммуноглобулины и гуморальные антитела для предотвращения попадания в общий кровоток инфекционных компонентов [57, 72, 74, 75, 78, 80, 81, 88, 92, 94,113]. Против повреждающих агентов в нормальном организме большинства млекопитающих существует постоянно функционирующая система иммунокомпетентных клеток [126]. К этой системе относят системе Т-лимфоцитов, дендритные клетки, цитотоксические лимфоциты и макрофаги. Лейкоциты в совокупности с дендритными клетками обеспечивают связь клеточной и гуморальной иммунной системы, а макрофаги создают условия для распознавания инородных белков – презентацию антигенов. Кроме того, благодаря деятельности макрофагов происходит фагоцитоз патогенных агентов и транспорт крупных белковых молекул. Таким образом, осуществляется биологическая «самосанация» брюшной полости от инородного материала [84, 94, 128, 163]. Однако нет данных о механизмах прекращения и «самосанации» нормальной брюшины, до сих пор биологический механизм иммунореактивности брюшины остается малоизученным.
В результате этих данных, помимо общих принципов в решении вопроса несостоятельности шва начинают использовать высокотехнологичные подходы воздействия на воспалительный и регенеративный процессы [2, 56]. Одним из методов, обсуждаемых в последнее время, является воздействие на цитокиновую систему с помощью различных биологических технологий.
Методика введения стволовых клеток
Определение серотонина проводили флуориметрическим методом модифицированным Прошиной Л.Я. (1981). Экстракция серотонина осуществлялась путем гомогенизации ткани в 4,5 мл бутанола подкисленного слабым раствором соляной кислоты. Далее бутаноловый экстракт обрабатывали для определения в ней серотонина. Все реактивы были приготовлены на трижды перегнанной воде.Приготовление реактивов было проведено по описанию, данному в диссертационной работе Трубицыной И.Е. (2004).
Определение протеолитической активности ферментов в экстрактах слизистой оболочки желудка крыс. Протеолитическую активность определяли в день взятия проб. Активность экстрактов гомогената слизистой желудка определяли по методу AnsonM., MirskyA. (1932), в качестве субстрата использовали кристаллический гемоглобин бычий окисленный лиофилизированный, производитель Sigma.
Протеолитическую активность определяли при значении рН желудка от 2,0 и рН- 4,5, 6,5. Для этого слизистую желудка промывали в холодном физиологическом растворе, тщательно промокали фильтровальной бумагой, иссекали кусочек слизистой оболочки желудка, взвешивали 100 мг ткани и гомогенизировали. Определение ингибиторной способности экстрактов слизистой оболочки желудка. Приготовление реактивов было проведено по описанию, данному в диссертационной работе Трубицыной И.Е. (2004). Ингибиторную способность измеряли по остаточной протеолитической активности пепсина. В качестве субстрата был использован бычий гемоглобин. Метод биомикроскопии. Под эфирным наркозом прижизненно проводилась лапаротомия, у крыс извлекали желудок, стараясь не пересекать сосуды иссекали серозную оболочку, помещали под объектив в лупе NikonSWZ 800. Исследовали микроциркуляторное русло подслизистого слоя желудка. В другом случае, желудок разрезали по большой кривизне, выворачивали и проводили исследование капиллярной сети слизистой оболочки желудка. Изменения микроциркуляторного русла фиксировали на кинокамеру Nikon.
Морфологические исследования. Слизистую оболочку желудка оперированных и интактных животных фиксировали в 10% забуференном формалине. Кусочки с места оперативного вмешательства были залиты в целлоидин-парафин (в один блок). Серии срезов окрашены гематоксилином и эозином. Исследование цитокинового статуса в сыворотке крови. Проведение любого оперативного вмешательства в организме, в том числе операции на желудке, сопровождается нарушениями функциональной активности иммунной системы и ее медиаторов – цитокинов.
Для оценки цитокинового статуса изучали содержание про- (IL-1, TNF-, IFN-) и противовоспалительного (IL-4) цитокинов в сыворотке крови животных. Исходный уровень цитокинов определялся в первые сутки послеоперационного периода. Далее в динамике на фоне однократного применения аллогенных МСК на 3-и сутки после операции, на фоне двукратного введения на 3-и и 8-е сутки. На фоне применения физиологического раствора однократно на 3-и сутки, двукратно – на 3-и и 8-е сутки послеоперационного периода. Для получения сыворотки забирали кровь в пробирку, которую сохраняли 1ч. при комнатной температуре и 1ч. при 4С. Затем, после центрифугирования при 3000 об/мин в течение 10мин., отбирали супернатант в объеме 2,0мл. (сыворотку), который замораживали и хранили до тестирования цитокинов при -70С. Содержание в сыворотке крови животных цитокинов и а-АТ к Н+/К+ -АТФазе париетальных клеток определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием тест-систем «Протеиновый контур» (С-Петербург), «Вектор-Бест» (Новосибирск) на анализаторе ChemWell («AwarenessTechnology», США).
Статистическую обработку результатов производили на персональном компьютере с использованием специального статистического пакета Biostat; и с помощью непараметрического аналога дисперсионного анализа – теста Краскела-Уоллиса в программной среде для статистических вычислений R (пакет stats) [148]. Следует подчеркнуть, что подобно классическому дисперсионному анализу, тест Краскела-Уоллиса позволяет сделать заключение только следующего вида: либо "сравниваемые группы статистически значимо различаются" (при Р 0.05), либо "статистически значимых различий между группами нет" (при Р 0.05).
Анатомические изменения отделов желудка у крыс после операции
Биологически активные вещества (БАВ), комплекс веществ объединяющих гормоны, амины, нейромедиаторы, цитокины, ферменты. Они принимают участие в регуляции физиологических процессов, присутствуют во всех органах, имеют рецепторы на клетках–мишенях. Сами по себе они не являются ни агрессивными, ни защитными факторами. Только в случае их кратковременного или длительного повышения/снижения они могут указывать на развитие патологического процесса. Вернее они принимают участие в развитии и поддержании повреждений. Такие вещества, как ацетилхолин, адреналин, серотонин, цитокины и т.д., в норме участвуют в физиологической регуляции различных функций органов системы пищеварения, тем более, что слизистая оболочка ЖКТ это нервная, гормональная и иммунная система в комплексе. Повышение уровня серотонина в ткани слизистой оболочки имеет место при различных повреждениях желудка [3, 4]. Данный процесс сопровождается появлением в ткани протеолитической активности при рН 6,5-7,0. В этой связи вырисовывается патогенетическая цепочка: серотонин протеолитическая активность при рН 6,5-7,0 повреждение.
Имеет место, определенная последовательность событий в слизистой оболочке желудка при повреждении, дополнительное воздействие оказывают присутствующие провоспалительные факторы. Биогенные амины, гормоны и цитокины - активные соединения, которые в физиологических условиях участвуют в тканевом гомеостазе, а в случае локального достижения критической концентрации из физиологических регуляторов превращаются в свою противоположность – в медиаторы воспаления [2]. Происходит нарушение проницаемости лизосомных мембран с последующим высвобождением тканевых гидролаз, оказывающих цитотоксическое действие в толще ткани слизистой оболочки желудка. Воздействие лизосомальных ферментов, а также кислотно-пептического фактора самого желудка в глубине слизистой оболочки желудка является дополнительным фактором развития и поддержания деструкции ткани. Эти сдвиги сопровождаются определенными изменениями содержания ацетилхолина, серотонина и цитокинов в слизистой оболочке и сыворотке крови [5]. Указанные выше биологически активные вещества в физиологических условиях участвуют в регуляции микроциркуляции, обеспечивая устойчивость клеточных и межклеточных мембран. Анализируя представленные данные, можно утверждать, что формирование деструкции в эксперименте и в клинике связано с высвобождением лизосомальных ферментов, которые проявляют внутритканевый аутолитический эффект и обеспечивают формирование первоначальной деструкции в толще слизистые оболочки желудка. Именно благодаря этому местно происходит дестабилизация тканевого гомеостаза с локальным нарушением микроциркуляции, проницаемости экзо- и эндомембран, что ведет к выходу ферментов за «дозволенные» в условиях нормы пределы, т.е. в цитозоль и далее в межклеточный матрикс. Накапливается информации о том, что произошло повреждение [121]. Особенностью которого является его месторасположение – слизистая оболочка желудка синтезирующая и секретирующая протеолитические ферменты, и серотонин.
Учитывая вышеизложенное, нами было проведено экспериментальное исследование по определению биологически активных веществ в экстрактах слизистой оболочки в зоне операционного шва после резекции 2/3 желудка в железистой его части у белых крыс и сыворотке крови. Для проведения исследования животные были распределены на группы в зависимости от динамики развития и заживления операционной раны. Серотонин (5-НТ) определяли через 1 час, 72 часа, 5 и 10 суток. Динамическое наблюдение изменений содержания 5-НТ в экстрактах слизистой оболочки желудка при экспериментальной операционной ране выявило определенную закономерность в развитии патологического процесса (таблица 5).
Для выявления связи концентрации 5-НТ и развития реакции воспаления был проведен тест Краскела-Уоллиса [149] полученных данных. Первая строка в таблице 5 ("Kruskal-Wallischi-squared = 20.2117, df = 4, p-value = 0") говорит о том, что результаты достоверны (p=0), между имеющимися парами сравнений есть достоверные отличия.
Течение процесса заживления операционной раны при введении стволовых клеток
При морфологическом исследовании рубца (рис. 32) у животных без введения МСК формируется грубый рубец с очаговыми инфильтратами и толстостенными сосудами с сохранением шовного материала в просвете желудка (рис.33).
В случае введения МСК рубец имеет более нежную структуру, воспалительные изменения выражены значительно меньше (рис. 33).
В зоне ушитой стенки желудка в центре видны остатки шовного материала, вокруг которого отсутствует агрессивная воспалительная инфильтрация, видно лишь формирование новообразованных сосудов и молодой созревающей грануляционной ткани (рис. 34 А, Б). шовный материал в стенке желудка с введением МСК, молодая грануляционная ткань. Б - шовный материал в просвете сосуда после введения МСК, гигантские многоядерные клетки. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение Х 250.
После трансплантации МСК даже наличие инородного (шовного) материала не мешает процессу регенерации, как уже указывалось, отсутствует агрессивная воспалительная реакция.
На фото шовного материала (рис. 41Б) в просвете крупного артериального сосуда справа визуализируются гигантские многоядерные клетки типа «рассасывания инородных тел» – признак регенерации на месте убивания. В стенке желудка у животных после операции без введения МСК при сохранении слизистого слоя отмечался резко выраженный отек стенки. В мышечном слое стенки крупноочаговая полиморфноклеточная выраженная инфильтрация (рис. 35).
Желудок – слизистая оболочка сохранена. Выраженный отек мышечного слоя стенки желудка. Крупноочаговая полиморфноклеточная инфильтрация. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение Х 250. В тонкой кишке после введения МСК слизистая оболочка сохранена, отмечается выраженный отек стенки. Со стороны серозной оболочки -очаговые круглоклеточные инфильтраты в прилежащей клетчатке (рис.36). слизистая оболочка тонкой кишки
Слизистая оболочка тонкой кишки. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение Х 180. Чтобы подтвердить связь процессов репарации с восстановлением иммунного баланса в живом организме нами производилось определение содержания в сыворотке крови крыс ряда цитокинов, таких как TNF, IL1, IFN, IL-4 до операции и в динамике послеоперационного заживления. Для исследования цитокинового баланса использовали тест системы Diamed для иммуноферментного анализа (Швейцария, предназначенных для крыс).
В группе животных с трансплантацией МСК по сравнению с оперированной группой без МСК (Рис. 37) отмечалось более быстрая смена деструктивно-воспалительной фазы раневого процесса на пролиферативно-регенераторную фазу (Рис. 38). Это проявлялось в более быстром отторжении некротических масс, что мы можем расценивать как начало репаративного процесса.
В грануляционной ткани присутствует множество сосудов и умеренно выраженная диффузная воспалительная инфильтрация сегментоядерными нейтро филами, что свидетельствует появлению начальных признаков эпителизации. Упорядоченный рост коллагеновых волокон, менее выраженная воспалительная инфильтрация, увеличенное количество кровеносных сосудов являлось отличительным от предыдущего срока репарации. Положительную динамику регенераторных процессов в зоне операционной раны под влиянием МСК мы связываем с позитивным иммунорегуляторным действием этих клеток. B организме под влиянием МСК, которое создает благоприятные условия для восстановления баланса про- и противовоспалительных цитокинов.
Используя полученные данные и анализируя их, позволило свести их схему развития «шокового состояния слизистой оболочки в околораневой зоне и все последующие нарушения как локальные, так и системные (Рис. 37). Использование мезенхимальных стволовых клеток позволило убрать, вернее, снизить местную и системную воспалительную реакцию. Можно полагать, что уменьшение отека, инфильтрации, снижение концентрации медиаторов воспаления, улучшает качество заживления, что препятствует развитию послеоперационных осложнений (Рис.38)
Возникает вопрос, какой из механизмов является превалирующим в патогенетическом процессе повреждения стенки желудка в околораневой зоне. Полученные данные дают основание утверждать, что одномоментное повышение медиаторов воспаления (биогенных аминов, провоспалительных цитокинов), ацидоз межклеточной жидкости и появление активных ферментов являются ведущими на самых ранних этапах воспалительного процесса и острого повреждения слизистой оболочки железистой части желудка. Клеточная терапия способствует тому, что в сыворотке крови снижается уровень TNF, IL1 и IFN (контроль р 0,05), повышается IL-4 (контроль р 0,05).
Следовательно, в хирургических ситуациях, при которых большая вероятность развития послеоперационной несостоятельности швов, патогенетически оправдано применение МСК. Положительную динамику регенераторных процессов в зоне операционной раны под влиянием МСК мы связываем с позитивным иммунорегуляторным действием этих клеток. Полученные данные свидетельствуют о наступающем снижении системной воспалительной реакции в организме под влиянием МСК, которое создает благоприятные условия для восстановления баланса про- и противовоспалительных цитокинов. Отражением этих процессов является качественное заживление операционной раны. Качественное заживление операционной раны желудка отсутствует при цитокиновом дисбалансе, которое характеризуется длительным повышением провоспалительных (TNF, IFN, IL1) и снижением противовоспалительного цитокина (IL-4). Устранение цитокинового дисбаланса в организме крыс после трансплантации МСК способствует снижению системной воспалительной реакции, ингибирует иммунное воспаление на местном уровне и тем самым способствует качественному заживлению операционной раны.Q