Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1 Общая характеристика тимуса 11
1.2 Основные формы взаимодействий эпителиальных клеток и тимоцитов 14
1.2.1 Роль эпителиальных клеток в процессе миграции тимоцитов внутри тимуса 14
1.2.2 Адгезия тимоцитов к эпителиальным клеткам тимуса 15
1.2.3 Роль эпителиальных клеток в пролиферации и апоптозе тимоцитов 17
1.3 Функционирование тимуса организме 19
1.3.1 Роль эпителия в механизмах инволюции тимуса 21
1.3.2 Терапия для восстановления вилочковой железы 24
1.4 Семафорин 3А 26
1.4.1 Общая характеристика и строение 26
1.4.2 Рецепторы 28
1.4.3 Функции семафорина 3А 30
1.4.4 Семафорин 3А в иммунной системе 31
Глава 2. Материалы и методы 34
2.1 Животные 34
2.2 Клеточные линии 34
2.3 Изучение адгезии тимоцитов к эпителиальным клеткам тимуса мыши 35
2.4 Исследование пролиферативной активности клеток 36
2.5 Изучение апоптоза тимоцитов методом проточной цитометрии 38
2.6 Определение фенотипа клеток с помощью метода проточной цитометрии 38
2.7 Исследование экспрессии мРНК семафорина 3А, ростовых факторов и их рецепторов с помощью метода ОТ-ПЦР 39
2.8 Изучение структуры актинового цитоскелета 43
2.9 Выделение белка 44
2.10 Иммуноферментный анализ (ИФА) 44
2.11 Статистический анализ 45
Глава 3. Результаты 46
3.1 Характеристика линий эпителиальных клеток тимуса мыши 46
3.2 Синтез рецепторов семафорина 3A клеточными линиями эпителия тимуса и тимоцитами интактных мышей 49
3.3 Изучение пролиферативной активности клеточных линий эпителия тимуса мыши 54
3.3.1 Влияние семафорина 3A на пролиферативную активность эпителиальных клеток тимуса 54
3.3.2 Изучение способности семафорина 3A в комбинации с другими факторами влиять на пролиферативную активность эпителиальных клеток тимуса 56
3.4 Влияние семафорина 3A на функции тимоцитов интактных мышей in vitro 58
3.4.1 Разработка модели адгезии тимоцитов к клеточным линиям эпителия тимуса мыши 58
3.4.2 Влияние семафорина 3A на адгезию тимоцитов интактных мышей к клеточным линиям эпителия тимуса мыши 67
3.4.3 Влияние семафорина 3A на пролиферативную активность тимоцитов интактных мышей 74
3.4.4 Влияние семафорина 3А на клеточную гибель тимоцитов (апоптоз, некроз) 75
3.5 Влияние семафорина 3A на функции тимоцитов, полученных от мышей с гепатомой 22а 78
3.5.1 Влияние опухолевого роста на пролиферативную активность тимоцитов 79
3.5.2 Влияние опухолевого роста на адгезию тимоцитов к клеточным линиям эпителия тимуса мыши 81
3.5.3 Влияние опухолевого роста на синтез семафорина 3А и его рецепторов в тимоцитах мыши 83
Заключение 89
Выводы 101
Список сокращений 102
Список используемой литературы 104
- Функционирование тимуса организме
- Синтез рецепторов семафорина 3A клеточными линиями эпителия тимуса и тимоцитами интактных мышей
- Влияние семафорина 3A на адгезию тимоцитов интактных мышей к клеточным линиям эпителия тимуса мыши
- Влияние опухолевого роста на синтез семафорина 3А и его рецепторов в тимоцитах мыши
Функционирование тимуса организме
Тимус имеет максимальный относительный вес в возрасте 1 года, а максимальный абсолютный – в подростковом возрасте. Процесс возрастной инволюции вилочковой железы начинается после периода полового созревания. Лимфоидный компонент тимуса человека уменьшается на 3% в год до 35-45 лет, а после этого возраста на 1% [153].
Тимус подвергается инволюционным изменениям не только с возрастом [13], но и в результате стресса [6,9,15], различных заболеваний, включающих инфекции [170,200], злокачественные образования [3,7,8,46,68, 179], при введении глюкокортикоидов [16,66,188,203], цитостатиков [2,126], а также при облучении [26]. Однако акцидентальная (острая) инволюция отличается от физиологического процесса старения вилочковой железы тем, что она обратима, т.е. структура и функционирование тимуса могут быть восстановлены.
Достаточно долго существовало мнение о том, что тимус представляет собой «одноразовый» орган и основную роль играет в детском возрасте, когда он способен вырабатывать большое количество Т-лимфоцитов [72]. Однако в конце 90-х годов роль тимуса была пересмотрена, поскольку оказалось, что вилочковая железа продолжает функционировать до глубокой старости и производить новые Т-клетки, пусть и в меньшем объеме [148]. Хотя количество зрелых Т-лимфоцитов, выходящих из тимуса, снижается, пул периферических Т-лимфоцитов не истощается за счёт экстратимических Т-лимфоцитов, в дифференцировке которых участвуют клетки периферических органов иммунной системы [23]. Таким образом, поддержание наивного Т-клеточного пула у взрослых людей практически полностью зависит от гомеостатической пролиферации наивных Т-клеток, в которой принимает участие IL-7 и аутопептид в комплексе с MHC. Наивные Т-клетки у людей чрезвычайно долговечны (6-9 лет), в отличие от мышей (6-11 недель) [60].
Для определения количества зрелых тимоцитов, которые недавно вышли из тимуса, используют метод измерения Т-рецепторных эксцизионных колец (TREC). Деление клетки приводит к снижению среднего количества TREC на одну Т-клетку, поскольку во время деления TREC не копируются и распределяются случайным образом среди дочерних клеток [5,20,214]. TREC имеют преимущество в выживании по сравнению с резидентными Т-клетками памяти [39]. Показано, что при снижении количества выходящих из тимуса TREC наблюдается снижение разнообразия TCR [95,107,143]. Согласно одной из точек зрения это может служить причиной того, что у пожилых людей развивается Т-клеточный иммунодефицит. Поэтому пожилые люди в большей степени восприимчивы к инфекциям [146,211], плохо отвечают на вакцинацию [51,89], обладают повышенной склонностью к развитию аутоиммунных [160] и злокачественных заболеваний [67].
Кроме того, ряд исследований показали, что у взрослых людей, перенесших тимэктомию в раннем детстве, наблюдается снижение абсолютного количества Т-клеток в крови [65]. Также наблюдается снижение абсолютного количества CD4+ клеток, что приводит к уменьшению разнообразия антиген-распознающих рецепторов TCR [161]. Пациенты, которые перенесли тимэктомию в раннем детстве, более подвержены некоторым аутоиммунным (гипотиреоз, целиакия), а также инфекционным и аллергическим заболеваниям [82,83].
Синтез рецепторов семафорина 3A клеточными линиями эпителия тимуса и тимоцитами интактных мышей
Прежде чем приступить к основной части работы – изучению влияния семафорина 3A на функции клеток тимуса мыши, необходимо было определить какие именно клетки являются мишенью для действия данного фактора в тимусе – тимоциты или эпителиальные клетки.
Для исследования экспрессии мРНК рецепторов семафорина 3А применяли два метода – ОТ-ПЦР и метод проточной цитометрии.
Кортикальные и медуллярные эпителиальные клетки тимуса экспрессировали мРНК PlexA1, PlexA3 и Nrp-1. Nrp-1 сильнее экспрессировался в клетках mTEC3-10, чем в сTEC1-2, а экспрессия мРНК PlexA1 и PlexA3 была одинаковой в обеих клеточных линиях. Экспрессию мРНК PlexA2, PlexA4 на клетках обеих клеточных линий выявить не удалось в пределах чувствительности данного метода (рисунок 3.5).
Кроме экспрессии мРНК, была изучена и мембранная экспрессия Nrp-1 и PlexA1 на клеточных линиях эпителия тимуса с помощью метода проточной цитометрии. На рисунке 3.6 продемонстрировано, что клетки cTEC1-2 и mTEC3-10 экспрессировали Nrp-1 и PlexA1 на своей поверхности.
Впервые было проведено исследование синтеза PlexA1 на эпителиальных клетках тимуса мыши и показана экспрессия мРНК PlexA1 и PlexA3 в них. Полученные данные о наличии синтеза Nrp-1 в эпителиальных клетках тимуса мыши не согласуются с литературными данными, где с помощью метода иммуногистохимии на срезах тимуса мыши синтез Nrp-1 в эпителиальных клетках выявлен не был [56].
Затем проводили изучение экспрессии мРНК рецепторов семафорина 3A в другой потенциальной мишени – тимоцитах мыши. Тимоциты мыши синтезировали мРНК PlexA1, PlexA2, PlexA3 и Nrp-1 и не экспрессировали мРНК PlexA4, в пределах чувствительности данного метода (рисунок 3.5). Кроме того, используя метод проточной цитометрии, было показано, что тимоциты экспрессируют на своей поверхности Nrp-1 и PlexA1 (рисунок 3.6).
Анализируя полученные результаты о синтезе рецепторов семафорина 3A, можно говорить о том, что и эпителиальные клетки и тимоциты могут являться мишенью действия данного фактора.
Для сравнительного анализа семафорина 3A и двух других факторов, необходимо было исследовать синтезируют ли эпителиальные клетки и тимоциты рецепторы HGF и KGF. Поэтому было проведено изучение экспрессии мРНК рецептора HGF – c-Met и рецептора KGF – FGFR2-IIIb в клеточных линиях эпителия тимуса мыши и тимоцитах интактных мышей.
С помощью метода ОТ-ПЦР, результаты которого представлены на рисунке 3.7, была обнаружена экспрессия мРНК c-Met и FGFR2-IIIb в клетках сTEC1-2 и mTEC3-10. Используя метод проточной цитометрии, показано, что клетки mTEC3-10 и cTEC1-2 экспрессируют на своей поверхности c-Met (рисунок 3.8). Полученные результаты подтверждают данные других исследователей, которые выявили c-Met и FGFR2-IIIb на кортикальных и медуллярных эпителиальных клетках тимуса мыши с помощью иммуногистохимии [96,165].
При исследовании тимоцитов интактных мышей с помощью ОТ-ПЦР была выявлена экспрессия мРНК FGFR2-IIIb и не выявлена экспрессия мРНК c-Met в пределах чувствительности данного метода (рисунок 3.7), что соответствует данным литературы [64,96,164]. Также не удалось обнаружить мембранную экспрессию c-Met на поверхности тимоцитов с помощью метода проточной цитометрии (рисунок 3.8).
Таким образом, как видно из таблицы 3.1 тимоциты и клеточные линии cTEC1-2 и mTEC3-10 синтезировали рецепторы семафорина 3А и KGF, и, следовательно, потенциально способны отвечать на данные факторы. Отвечать на HGF способны только клеточные линии, так как они синтезировали c-Met, а тимоциты нет.
Влияние семафорина 3A на адгезию тимоцитов интактных мышей к клеточным линиям эпителия тимуса мыши
Процесс адгезии тимоцитов к клеткам cTEC1-2 и mTEC3-10 исследовали при добавлении экзогенного семафорина 3A (10-200 нг/мл) на двух выбранных сроках – 30 мин, когда ИА максимальный, и 120 мин, когда начинается процесс деадгезии. В качестве негативного контроля использовали азид натрия (NaN3) в концентрации 10 мМ [131].
На рисунке 3.18 продемонстрировано, что при 30 мин сроке культивирования семафорин 3A оказывал дозазависимое ингибирующее влияние на адгезию тимоцитов к эпителиальным клеткам тимуса мыши, с максимальным эффектом в концентрации 200 нг/мл, как на клетках cTEC1-2, так клетках mTEC3-10. При 120 мин сроке культивирования ингибирующий эффект семафорина 3А на адгезию тимоцитов к клеткам эпителия обеих линий сохранялся.
При сравнении адгезии при двух сроках – 30 и 120 мин оказалось, что семафорин 3A оказывает ингибирующее влияние на начальный этап прикрепления тимоцитов к эпителиальным клеткам обеих линий и не усиливает процесс деадгезии.
Ранее было показано, что тимоциты и эпителиальные клетки имеют рецепторы для взаимодействия с семафорином 3A (см. раздел 3.2), поэтому необходимо было выяснить, на какие именно клетки он действует. Для этого тимоциты и клетки эпителия инкубировали с семафорином 3A (200 нг/мл) раздельно в течение 120 мин, после чего отмывали и проводили реакцию адгезии в течение 30 мин. При предварительной обработке тимоцитов подавляющий эффект семафорина 3A сохранялся и был одинаковым на обеих клеточных линиях (рисунок 3.19). При этом предварительная обработка клеток эпителия обеих линий с семафорином 3A никакого эффекта на процесс адгезии не оказывала. Аналогичные данные были получены и при адгезии в течение 120 мин на обеих клеточных линиях (рисунок 3.19).
Таким образом, можно сделать вывод о том, что ингибирующее действие семафорина 3A на процесс адгезии связано с его действием на тимоциты, а не на клетки эпителия.
Покольку Nrp-1 является клеточным рецептором, связывающим семафорин 3А, необходимо было подтвердить, что действие данного фактора опосредовано через Nrp-1. Для этого тимоциты прединкубировали с блокирующими антителами к Nrp-1 в течение 20 мин до постановки адгезии. После чего проводили отмывку и прединкубацию тимоцитов с семафорином 3A (200 нг/мл) в течение 120 мин, отмывали и только потом добавляли тимоциты к клеткам эпителия. Последовательная прединкубация тимоцитов с блокирующими антителами, а потом с семафорином 3A отменяла ингибирующий эффект фактора на адгезию тимоцитов к клеткам эпителия обеих линий (рисунок 3.20). Таким образом, можно сделать вывод, что ингибирующее влияние семафорина 3A на адгезию тимоцитов к клеткам cTEC1-2 и mTEC3-10 опосредовано через Nrp-1.
С помощью проточной цитометрии исследовано влияние семафорина 3A на изменение популяционного состава адгезированных и неадгезированных тимоцитов в процессе адгезии тимоцитов к клеткам cTEC1-2 и mTEC3-10. Основной популяцией адгезированных клеток являлись незрелые лимфоциты CD4+CD8+; при этом относительное содержание зрелых CD4+ и CD8+–тимоцитов уменьшалось на клетках эпителия обеих линий. При этом добавление экзогенного семафорина 3A не оказывало влияние на популяционный состав адгезированных и неадгезированных тимоцитов в процессе адгезии к клеткам cTEC1-2 и mTEC3-10 по сравнению со спонтанной адгезией (таблица 3.3, рисунок 3.21).
Кроме того, с помощью метода проточной цитометрии, было проведено изучение влияния экзогенного семафорина 3A на относительное содержание клеток, несущих Nrp-1 и PlexA1 среди адгезированных и неадгезированных тимоцитов при 120минутном совместном культивировании с эпителиальными клетками тимуса мыши. При добавлении семафорина 3A увеличивалось относительное содержание PlexA1+клеток среди адгезированных тимоцитов, что было показано на клетках обеих линий (рисунок 3.22, 3.23). При этом относительное содержание PlexA1+клеток среди неадгезированных тимоцитов не отличалось от контроля. Кроме того, внесение семафорина 3A в совместное культивирование тимоцитов с клетками cTEC1-2 и mTEC3-10 не оказывало влияния на относительное содержание Nrp-1+клеток, как среди адгезированных тимоцитов, так и неадгезированных.
Действие семафорина 3A на адгезию тимоцитов к эпителиальным клеткам тимуса сравнивали с влиянием других факторов KGF и HGF. Влияние этих двух факторов оценивали в диапазоне концентраций 10-200 нг/мл при 30 и 120 мин совместной инкубации клеток эпителия и тимоцитов.
Впервые показано, что добавление KGF не оказывало влияние на адгезию тимоцитов как к клеткам cTEC1-2, так к клеткам mTEC3-10 на двух сроках совместной инкубации (рисунок 3.24). Влияние KGF на адгезию клеток иммунной системы практически не изучено. Известно только, что KGF не оказывает влияния на адгезию нейтрофилов к клеткам бронхиального эпителия человека и снижает адгезию к клеткам бронхиального эпителия, стимулированного TNF [102].
Впервые показано, что добавление HGF усиливало адгезию тимоцитов к клеткам cTEC1-2 и mTEC3-10 на обоих сроках совместной инкубации (рисунок 3.25), хотя механизм данного эффекта не вполне ясен и требует дальнейших исследований. Возможно, что стимулирующее действие HGF на адгезию тимоцитов к клеткам обеих линий эпителия тимуса зависит от одновременного присутствия тимоцитов, клеток эпителия и самого фактора. Можно предположить, что HGF играет роль связующего мостика, взаимодействуя с Nrp-1 на тимоцитах и с c-Met на клетках эпителия. В литературе существуют работы о стимулирующем эффекте HGF на адгезию В-лимфоцитов и опухолевых клеток к компонентам внеклеточного матрикса [197,201].
Влияние опухолевого роста на синтез семафорина 3А и его рецепторов в тимоцитах мыши
В связи с тем, что при росте гепатомы 22а было обнаружено изменение ответа тимоцитов на семафорин 3А в тесте адгезии, необходимо было проверить не связан ли этот эффект с изменением экспрессии рецепторов семафорина 3А в тимоцитах мышей с опухолью.
Для этого с помощью ОТ-ПЦР и метода проточной цитометрии была исследована экспрессия Nrp-1 и PlexA1 в тимоцитах при росте гепатомы 22а. По данным ОТ-ПЦР наблюдалось усиление экспрессии мРНК Nrp-1 в тимоцитах на 7 и 21 сут опухолевого роста (рисунок 3.34).
Однако с помощью метода проточной цитометрии не была выявлена разница в мембранной экспрессии Nrp-1 в тимоцитах мышей-опухоленосителей (7 и 21 сут) по сравнению с контрольными животными (таблица 3.4 и рисунок 3.35).
При исследовании экспрессии мРНК PlexA1 с помощью ОТ-ПЦР, также как и относительного содержания PlexA1+-тимоцитов с помощью проточной цитометрии, между опытными и контрольными группами животных разницы не обнаружено на 7 и 21 сут роста опухоли (рисунок 3.35, 3.36, таблица 3.4).
Известно, что для проведения сигнала от семафорина 3А необходимы не изолированно расположенные рецепторы, а рецепторный комплекс, состоящий из Nrp-1 и плексина класса А [187]. Поэтому с помощью метода проточной цитометрии, мы провели оценку относительного содержания клеток, несущих оба маркера одновременно, т. е. Nrp-1+PlexA1+. Однако, на 7 и на 21 сут роста гепатомы 22а не было выявлено разницы в относительном содержании Nrp-1+PlexA1+тимоцитов, полученных от мышей с опухолью и контрольных животных (таблица 3.4).
Таким образом, изменение ответа тимоцитов на семафорин 3А в адгезии не связано с изменением экспрессии рецепторов Nrp-1 и PlexA1.
Для того чтобы ответить на вопрос участвует ли семафорин 3А в индукции инволюции тимуса при опухолевом росте необходимо было исследовать изменение его синтеза у мышей с гепатомой.
Известно, что некоторые опухолевые клетки сами способны продуцировать семафорин 3А [34,47,106], поэтому необходимо было проверить может ли гепатома 22а синтезировать исследуемый нами фактор. Методом ОТ-ПЦР показано, что клеточная линия гепатомы 22а не экспрессировала мРНК семафорина 3А в пределах чувствительности данного метода (рисунок 3.37).
Также исследовали содержание семафорина 3A в сыворотке крови мышей-опухоленосителей с помощью ИФА. У контрольных животных в сыворотке содержалось 1,05±0,1 нг/мл семафорина 3А (n=5), а на 21 сутки роста гепатомы 22а – 0,95±0,12 (n=5). Таким образом, рост гепатомы 22а не сопровождался изменением содержания семафорина 3A в сыворотке крови мышей.
Поскольку не было обнаружено системного повышения семафорина 3А в сыворотке крови мышей, было проведено исследование локального синтеза данного фактора в тимусе, а именно в строме и тимоцитах.
По данным ОТ-ПЦР, в строме на 7 сут роста опухоли различий в экспресии мРНК семафорина 3А выявлено не было, а на 21 сут наблюдалось усиление экспресии мРНК семафорина 3А, по сравнению с контрольными животными (рисунок 3.38).
Однако содержание белка семафорина 3А в экстрактах стромы тимуса не изменялось при опухолевом росте (таблица 3.5).
При этом разницы в экспрессии мРНК семафорина 3А в тимоцитах, полученных от мышей с опухолью и контрольных животных не обнаружено (рисунок 3.39).
Таким образом, в данном исследовании впервые была сформулирована гипотеза о том, что семафорин 3А может являться индуктором инволюции тимуса при росте экспериментальной опухоли. Было проведено исследование пролиферации тимоцитов и их адгезии к клеточным линиям эпителия тимуса, а также содержание и синтез семафорина 3А и его рецепторов при росте гепатомы 22а.
В настоящей работе не было обнаружено изменение мембранной экспрессии рецепторов семафорина 3А Nrp-1 и PlexA1, также не было изменения содержания белка семафорина 3А в тимусе. Адгезия тимоцитов, полученных от мышей с опухолью, к клеточным линиям эпителия тимуса не снижалась. При росте гепатомы 22а наблюдалось снижение только спонтанной пролиферативной активности тимоцитов.
По совокупности всех проведенных экспериментов нам не удалось получить данных, подтверждающих участие семафорина 3А в инволюции тимуса при опухолевом росте. Однако, были получены новые данные об изменении характера ответа тимоцитов, полученных от мышей с опухолью, на семафорин 3А в тесте адгезии in vitro.