Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 14
1.1. Строение и функции кожи 14
1.2. Старение кожи
1.2.1. Клеточное старение 18
1.2.2. Окислительный стресс 21
1.2.3. Хроническое воспаление 23
1.2.4. Дезорганизация внеклеточного матрикса 28
1.3. Регенерация фетальной и взрослой кожи 33
1.4. Препараты для подавления процессов старения и восстановления нормальной физиологии кожи 40
1.5. Культура клеток как модель для исследования. Современное состояние проблемы получения и культивирования клеток человека и животных 45
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 55
2.1. Выделение и культивирование фибробластов из дермы кожи человека.. 55
2.1.1. Получение 2D культуры дермальных фибробластов человека 55
2.1.2. Контроль контаминации 57
2.1.3. Криоконсервация клеток 58
2.1.4. 3D культивирование дермальных фибробластов человека
2.2. Исследование влияние р199 на функциональную активность дермальных фибробластах в условиях патофизиологического процесса 59
2.2.1. Моделирование процесса «заживления» после повреждения монослоя дермальных фибробластов путем миграции клеток 59
2.2.2. Моделирование повреждения ткани на 3D культуре дермальных фибробластов человека 60
2.3. Методы гистологии, иммуноцитохимии и молекулярной биологии 61
2.3.1. Подсчет и анализ жизнеспособности монослойной культуры дермальных фибробластов человека 61
2.3.2. Фиксация 2D и 3D культуры дермальных фибробластов человека 62
2.3.3. Морфологический анализ 2D культуры дермальных фибробластов 63
2.3.4. Иммуноцитохимический анализ дермальных фибробластов человека. 63
2.3.5. Детекция провоспалительных белков методом иммуноблота 64
2.4. Статистический анализ 65
ГЛАВА 3. Результаты 69
3.1. Получение штаммов дермальных фибробластов человека 69
3.2. Характеристика 2D культуры дермальных фибробластов человека
3.2.1. Контроль контаминации 70
3.2.2. Морфологический анализ 2D культуры дермальных фибробластов 72
3.2.3. Иммуноцитохимический анализ 2D культуры дермальных
3.3. Подбор разведения олигопептида р199 для последующих экспериментов на 2D культуре дермальных фибробластов человека 78
3.4. Исследование биоактивного эффекта олигопептида р199 на 2D культуру дермальных фибробластов 85
3.5. Исследование влияния олигопептида р199 на миграционную активность фибробластов на модели повреждения монослоя в 2D культуре 94
3.6. Исследование биоактивного эффекта олигопептида р199 на 3D культуру дермальных фибробластов 96
3.6.1. Исследование формирования сфероидов из дермальных фибробластов 3.6.2. Исследование влияния р199 на экспрессию функциональных белков дермальных фибробластов человека в 3D культуре 98
3.7. Моделирование повреждения ткани в 3D культуре дермальных фибробластов человека 105
3.8. Исследование содержания провоспалительных факторов в 3D культуре дермальных фибробластов человека 108
ГЛАВА 4. Обсуждение
Заключение 124
Выводы 128
Список используемой литературы
- Дезорганизация внеклеточного матрикса
- 3D культивирование дермальных фибробластов человека
- Характеристика 2D культуры дермальных фибробластов человека
- Исследование биоактивного эффекта олигопептида р199 на 3D культуру дермальных фибробластов
Дезорганизация внеклеточного матрикса
Иммунная система кожи обеспечивает защиту от инфекций, развития раковых заболеваний, очищает ткань от поврежденных клеток, но под действием УФ-излучения иммунная система может активировать процесс старения кожи. В целом, при старении функция иммунной системы постепенно угнетается - за счет инволюции тимуса уменьшается количество наивных Т-клеток, причём в первую очередь это затрагивает популяцию CD8+ наивных клеток, и в меньшей степени - CD4+ клеток, снижается разнообразие Т-клеточных рецепторов, падает количество наивных В-клеток, и, как результат, снижается количество и афинность продуцируемых ими антител, что делает организм более уязвимым для различных инфекций (Castelo-Branco С, Soveral L, 2014; Ritti L., Fisher G.J., 2015; Sunderktter C. et al, 1997). В коже с возрастом уменьшается количество и миграционная активность дендритных клеток плазмацитоидного и миелоидного происхождения (клетки Лангерганса), которые выполняют функцию антиген-презентирующих клеток (Castelo-Branco С, Soveral L, 2014), а действие УФ-излучения дополнительно стимулирует эти процессы (Bennett M.F. et al, 2008).
В общем, влияние хронического воспаления на фотостарение кожи заключается в том, что УФ-излучение индуцирует высвобождение провоспалительных факторов из разных типов клеток кожи, инфильтрации и активации клеток иммунной системы (нейтрофилов, макрофагов, тучных клеток) и продукции провоспалительных цитокинов, что в итоге приводит к активации ММР и деградации ВКМ (Scharffetter-Kochanek K. et al, 2000).
Показано, что воздействие УФ-облучения и увеличение продукции АФК в коже приводит к развитию хронического воспаления. В упрощенном виде, это связано с повреждением ДНК и образованием тимидиновых димеров, что приводит к иммуносуспрессии (Matsumura Y., Ananthaswamy H.N., 2004) и выделению нейроэндокринных медиаторов, таких как пептиды проопиомеланокортина - адренокортикотропного гормона, бета-липотропного гормона и бета-эндорфина. В результате увеличивается синтез провоспалительных факторов в разных типах клеток кожи (Pillai S. et al, 2005).
АФК вступают в реакции перекисного окисления с фосфолипидами клеточных мембран. В результате реакций перекисного окисления липидов, а также активации фосфолипаз образуется избыточное количество арахидоновой кислоты, которая является предшественником провоспалительных эйкозаноидов - простагаландинов, тромбоксанов и лейкотриенов (Matsumura Y., Ananthaswamy H.N., 2004, Hruza L.L., Pentland A.P., 1993). Так, простагландин Е2 (ПГЕ2) является основным медиатором возникновения эритемы (сильного покраснения кожи вследствие расширения капилляров) при солнечном ожоге (Gilchrest B.A. et al, 1981). Ферментом, регулирующим синтез ПГЕ2, является индуцируемая форма циклооксигеназы - ЦОГ2, которая активируется под воздействием таких факторов как свет, факторы роста, цитокины (Smith W.L. et al, 1994). Показано, что в стареющей коже УФ-излучение в большей степени стимулирует экспрессию ЦОГ2 и ПГЕ2, чем в молодой коже, что делает ее более чувствительной к повреждающему воздействию и стимулирует процесс фотостарения (Seo J.Y. et al, 2003).
Известно, что одной из первых реакций, развивающихся в ответ на воздействие УФ-излучения, которая стимулирует дальнейший воспалительный процесс, является синтез и секреция кератиноцитами ФНО-а, ИЛ-1 и молекулы адгезии ICAM-1 (Svobodova A. et al, 2006, Barker J. et al., 1991, Kck A. et al, 1990). Кроме провоспалительных цитокинов, под воздействием УФ в кератиноцитах активируется секреция и других ростовых факторов, которые могут ингибировать воздействие УФ и защищать клетки кожи от его дальнейшего повреждения (рис.5): антагониста рецептора IL1, а-меланоцит стимулирующий гормона (a-MSH), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), оксид азота (NO), основного фактора роста фибробластов (b-FGF), фактора роста нервов (NGF) и эндотелина-1 (Pillai S. et аі, 2005).
Показано, что индукцию экспрессии ИЛ-1 и ФНО-а в кератиноцитах обеспечивает транскрипционный фактор NF-кВ, который активируется в клетках под воздействием УФ-излучения. В дальнейшем, активированные провоспалительные факторы дополнительно по принципу положительной обратной связи усиливают экспрессию NF-кВ (РИС. 6) (Tапака K. et аі, 2010, TапакаK. etal.,2005).
Далее в клетках кожи увеличивается продукция IL3, 6,7, 10 и, под влиянием УФ излучения типа Б, IL12. Также в исследовании Pillai S. и соавторов (2005) отмечено повышение секреции гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) (Pillai S. et al, 2005). Цитокины попадают в кровоток, в ответ на продукцию провоспалительных факторов увеличивается проницаемость кровеносных сосудов, в результате чего происходит инфильтрация области воспаления фагоцитирующими клетками -макрофагами и нейтрофилами (Pillai S. et al, 2005; Svobodova A. et al, 2006). Подобную картину воспалительной реакции, приводящую к хроническому воспалению кожи и ее старению, можно наблюдать и без воздействия УФ - при различных патологиях процесса заживления ран (Eming S.A. et al, 2014).
3D культивирование дермальных фибробластов человека
Подсчет клеток производили после сбора клеток с культуральной поверхности с использованием автоматического счетчика клеток Countess (Invitrogen, США). Для этого от суспензии клеток отбирали Юмкл и смешивали с 10 мкл 1% раствора красителя трипанового синего, окрашивающего мертвые клетки. Полученную смесь вносили в счетную камеру и помещали в прибор, после чего производился автоматический подсчет клеток с погрешностью 0,5%. Для снижения ошибки подсчет производили трижды. В результате получали общее количество клеток и количество погибших и живых клеток.
Чтобы подсчитать количество погибших клеток в монослое, культуру окрашивали растворами флуоресциирующих красителей, связывающихся с ДНК, Hoechst 33258 (0,002мг/мл) и йодида пропидия PI (0,001мг/мл), с помощью которых оценивали жизнеспособность клеток по проникновению в их ядро PI, который способен метить только погибшие клетки, под инвертированным флуоресцентным микроскопом Olympus СКХ41 («Olympus», Япония). Окрашивание проводили в течение 20 минут при 25С.
Кроме того, для анализа индекса пролиферации клеток, с помощью программы Cell-IQ Analyzer производили подсчет тотального числа клеток в течение 48 часов культивирования в монослое, далее выстраивали график, где по оси X откладывали время культивирования в часах, а по Y - общее число клеток в поле зрения прибора. Индекс пролиферации (IP) вычисляли по формуле: IP=N4s/No, где N48 - количество клеток через 48ч культивирования, а No - через 0ч культивирования.
Все 2D культуры клеток фиксировали по стандартной схеме. Монослой клеток, рассеянных на чашках (35мм) и покровных стеклах, по достижении конфлуентного состояния промывали холодным раствором PBS (рН=7,4) и 20 минут фиксировали при +4оС в 4% растворе параформальдегида. После фиксации клетки промывали PBS три раза по 5 мин и заливали незамерзающим раствором (эквимолярная смесь PBS, этиленгликоля и глицерина), в котором оставляли на хранение при -2o оС до окрашивания. Перед фиксацией 3D культуры, сфероиды собирали в общую пробирку типа эппендорф с помощью наконечника до ЮООмкл. Далее сфероиды осаждали с помощью центрифугирования (1мин, 600об/мин, 600g), сливали супернатант и добавляли к осажденным сфероидам раствор фосфатно-солевого буфера (рН=7,4). Данную операцию повторяли еще два раза. После третьего центрифугирования к сфероидам добавляли 4% раствор параформальдегида, в котором сфероиды фиксировали 20мин при комнатной температуре или оставляли на ночь при +4оС.
Для проведения морофологического анализа, зафиксированные предварительно на стеклах клетки окрашивали по протоколу гематоксилин-эозин. Для это стекла помещали в раствор гематоксилина (5мин) и далее дифференцировали под проточной водой в течение 10 мин. После стекла с клетками помещали в раствор эозина (1мин), с последующей проводкой по восходящему ряду спиртов и заключением на предметное стекло.
Для проведения иммуноцитохимического анализа клетки после фиксации инкубировали с первичными антителами к цитокератину 19, эластину, а-гладкомышечному актину (aSMA), PCNA (маркеру пролиферации), IL1, коллагенам I, III, IV типов и фибронектину. Результат визуализировали с помощью вторичных антител, конъюгированных с флуорохромами FITC (Е=525нм) и DyLight594 (Е=617нм). Ядра докрашивали флуоресцентным красителем бис-бензимид - Hoechst 33258 (0,002 мг/мл, 10 минут, 25С). Данный краситель (C27H28N6O 3HCl 3H2O) окрашивает все клетки, как нормально функционирующие, так и гибнущие и используется как проба на конденсацию хроматина. Mолекула красителя Hoechst связывается с малой бороздкой ДНК и занимает сайт из пяти последовательно расположенных пар оснований (5;-ATTTG). После окрашивания избыток красителя удаляли троекратной сменой фосфатно-солевого буфера. Полученные препараты заключали в монтирующую среду Витрогель и анализировали в видимом и ультрафиолетовом световых диапазонах с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа Olympus Fluoview FV10 («Olympus», Япония). Количественный анализ интенсивности флуоресценции проводили с помощью программного обеспечения ImageJ. Исследовали интенсивность свечения в отдельных каналах, выделяя с помощью инструментов выделения анализируемые области и фоновые области для дальнейшего вычитания для достоверности результата. Значения данных приведены в условных единицах, используемых программой для подсчета.
После облучения лазером и трехсуточной инкубации, сфероиды собирали в отдельные центрифужные пробирки типа эппендорф, экстракты клеток получали после обработки лизирующим буфером по инструкции производителя (Reporter Lysis Buffer, BDBioscience, США). Белки разделяли с помощью вертикального электрофореза в 18% полиакриламидном геле при 40мА, 29В 1,5 часа. После разделения белки из геля переносили на мембрану из поливинилденфторида методом полусухого переноса. Режим переноса: 2мА/см2 (стабилизация по току) 2 часа напряжение не более 20В. Далее мембрану обрабатывали раствором бычьего сывороточного альбумина для предотвращения неспецифичной реакции антител и инкубировали с первичными антителами (12 часов, +4С) к ЦОГ-1, ПГЕ2 и -актину (контрольному белку) и вторичными антителами (1 час, 250С), конъюгированными с пероксидазой хрена. Результат визуализировали с использованием ECL-набора по инструкции производителя (ThermoScientific). Данные регистрировали на станции регистрации изображений Kodak 440 CF (Kodak, США).
Исследования проводили с помощью пакета прикладных программ STATISTICА 6.0. С использованием критериев Шапиро-Вилка и %2 Пирсона были проверены гипотезы о нормальности распределений исследуемых показателей. При сравнении параметров, имевших нормальное распределение, использовали однофакторный дисперсионный анализ с последующим применением метода множественных сравнений. При сравнении параметров, имевших ненормальное распределение, использовали критерий Крускалла-Уоллиса. В каждой экспериментальной серии было проведено не менее трех повторностей, единовременно в каждой группе проанализировано не менее 200 клеток при анализе 2И культур и не менее 50 сфероидов при анализе 3D культур.
Характеристика 2D культуры дермальных фибробластов человека
При исследовании индекса пролиферации было установлено, что олигопептид р199 стимулировал скорость размножения фибробластов на пассаже 18: к 70 часам культивирования количество клеток в присутствии олигопептида значительно превышало количество клеток в культурах без добавления р199 (рис.22). Cell count
Динамики изменения общего числа клеток в течение 70 часов культивирования фибробластов 4 пассажа (А), 18 пассажа без добавления (Б) и 18 пассажа с добавлением пептида р199 в ростовую среду (В). Графики построены в программе Cell-IQ Analyzer
Чтобы не допустить ошибки подсчета, связанной с повышенной плотностью клеток в монослое и наложением их изображения, анализ индекса пролиферации производили за период 48 часов в трех повторениях (таблица 3). При этом было установлено, что эффект зависел от количества вещества, внесенного в культуральную среду: при разведениях пептида 1:10, среднее значение индекса пролиферации превышало значение для разведения 1:100 и было сопоставимо со значением для пассажа 4. Тогда, как среднее значение индекса пролиферации при разведении р199 1:100 оставалось на уровне пассажа
Индекс пролиферации клеток с добавлением в культуральную среду олигопептида в соотношении 1:50 превышал значение индекса для разведения 1:100, однако разница не была статистически значимой (рис.23).
Сравнительный анализ индекса пролиферации в контрольных и экспериментальных культурах фибробластов кожи человека. р 0,05 по сравнению с культурами «стареющих» фибробластов Р18 без р199 и с добавлением р199 (1:100). Результаты исследования дозозависимого эффекта олигопептида р 199 на 2D культуре показали, что предлагаемые разведения 1:10, 1:50, 1:100 и 1:1000 не оказывали цитотоксического действия на культуру дермальных фибробластов человека. Наибольший эффект на пролиферацию фибробластов оказало добавление олигопептида р199 в разведении 1:10.
По данным проведенного иммуноцитохимического исследования культуры дермальных фибробластов 18 пассажа были установлены определенные закономерности в окрашивании клеток антителами к характерным для фибробластов белкам при добавлении в культуральную среду олигопептида р199 и без него. На данном этапе работы также использовали различные разведения олигопептида р199 в среде (1:10, 1:50, 1:100), а анализ проводили через 3 суток инкубирования с пептидом. Однако при добавлении пептида в разведениях 1:50 и 1:100 статистически значимых изменений выявлено не было. Поэтому ниже приведены результаты только для разведения олигопептида 1:10. Было показано, что после добавления в ростовую среду олигопептида р199 интенсивность флуоресценции отвечающих за упругость и эластичность кожи белков - цитокератина 19 и эластина, превышала интенсивность флуоресценции тех же маркеров, окрашенных в контрольной культуре (рис. 24). Также было установлено, что под воздействием пептида в «стареющих» фибробластах 18 пассажа происходит индукция синтеза коллагена IV типа, который характерен для эмбриональных фибробластов и мультипотентных стромальных клеток. В группе «молодых» фибробластов только отдельные клетки окрашивались антителами к коллагену IV типа, тогда как в группе «стареющих» клеток с добавлением пептида р199 специфическое окрашивание наблюдали практически во всех клетках (рис.25). Также было показано, что интенсивность флуоресценции окрашенных клеток антителами к фибронектину выше у фибробластов в среде с добавлением р199, чем у клеток, культивированных в среде без р199 (рис.26). Повышение количества клеток, окрашиваемых антителами к PCNA - маркеру пролиферирующих клеток (рис.27), после культивирования в среде с олигопептидом р199 подтверждает рост пролиферации «стареющих» клеток под влиянием р199. Интенсивность синтеза коллагенов I и III типов в культуре «стареющих» фибробластов с добавлением пептида и в культуре без пептида имела одинаковый уровень (рис. 28, 29). Отсутствовала экспрессия aSMA, характерная для миофибробластов (рис.29).
Исследование биоактивного эффекта олигопептида р199 на 3D культуру дермальных фибробластов
Фибробласты широко применяют в изучении механизмов репарации и анализа механизмов онтогенеза и геронтологии. Они являются основным типом клеток дермы кожи, ответственны за синтез и секрецию основных компонентов дермальной матрицы, таких, как коллаген, эластин и гликозамингликаны (Woodley D.T., 2017). Коллаген обеспечивает прочность, эластин придает эластичность, а гликозамингликаны поддерживают влажность и упругость кожи. В процессе синтетической активности, фибробласты образуют волокна и основное вещество соединительной ткани, также они участвуют в восстановлении кожного покрова при закрытии раневых поверхностей, что и обуславливает анализ этих клеток в исследованиях процессов восстановления повреждений кожи и терапии ран различной этиологии (Tracy L.E. et al, 2016). При культивировании in vitro дермальные фибробласты на первых пассажах активно пролиферируют и сохраняют высокую синтетическую активность, при длительном культивировании претерпевают изменения, свойственные стареющим культурам, что отражает значимость применения таких культур для моделирования «старения кожи» (Tigges J. et al, 2014). Создание культуры фибробластов кожи человека и наращивания большого количества стандартных по биологическим свойствам клеток, создания на их основе аттестованных банков клеток, хранящихся при температуре жидкого азота (Колокольцова Т.Д., Сабурина И.Н., 2013; Колокольцова Т.Д. 2008) подчеркивает перспективность, научную и практическую значимость исследований этого типа клеток.
Важным аспектом в выборе экспериментальной культуры клеток является соответствие ее основным целям. В рамках данного исследования в качестве критериев для выбора объекта были определены пролиферативная и секреторная активность клеток. В начале работы предполагалось получение двух культур клеток от молодого и стареющего организма с разницей в возрасте не менее двадцати лет. Однако, как показал анализ литературы, активность клеток in vitro строго индивидуальна, не коррелирует с возрастом донора, а значит, сравнительный анализ культур клеток от различных доноров является недостоверным (Cristofalo V.J. et al, 2000). Даже в нашем исследовании на первом этапе отбора была выведена из экспериментов культура от более молодого донора - ФЧ-1 (45 лет) из-за низкого значения индекса пролиферации, тогда как культуры ФЧ-2 и ФЧ-3 от доноров 54 и 52 лет демонстрировали высокий пролиферативный и секреторный потенциал.
Известно, что наибольшую опасность при работе с культурами клеток представляют линии, загрязненные микроорганизмами. Если контаминация бактериями или грибами проявляет себя сразу, то много опаснее являются клетки, загрязненные микоплазмами. Микоплазмы значительно влияют на результаты исследований и особенно опасны при использовании контаминированных клеток в производстве биопрепаратов (Колокольцова Т.Д., Сабурина И.Н., 2013). Отсутствие микоплазменной, вирусной и других видов контаминации в полученной нами культуре фибробластов ФЧ-2 было подтверждено также методами ПЦР-анализа в специализированной лаборатории.
В свете изложенного впервые выделенная нами культура фибробластов кожи человека ФЧ-2, отличающаяся отсутствием контаминантов, стабильностью морфологических и культуральных характеристик, а также стабильной экспрессией специфических маркеров на ранних пассажах (4), может быть использована для научных и прикладных исследований. Применение стандартизированных клеток фибробластов кожи, заложенных на хранение на ранних пассажах, позволяет проводить дальнейшие научные исследования с использованием стандартного клеточного материала, свободного от контаминантов и отражающего модель «старения клеток» с ростом числа пассажей.
В данном исследовании было показано, что фибробласты в процессе культивирования претерпевают изменения как в морфологии, так и в функциональной активности. Размеры клеток увеличивались, а индекс пролиферации клеток пассажа 18 (Р18) не превышал значение 2, тогда как, индекс пролиферации клеток пассажа 4 (Р4) имел среднее значение 3,75. Кроме того фибробласты в культуре Р18 демонстрировали низкий уровень синтеза коллагенов I и III типов и фибронектина, что также подтверждает процесс «старения» клеток в культуре. Отсутствовала экспрессия коллагена IV типа, что является характерным для фибробластов, полученных от донора старше 35 лет (Vzquez F. et al, 1996). Отсутствие экспрессии гладкомышечного актина свидетельствует об отсутствии в полученной нами культуре миофибробластов. Дифференцировка фибробластов в миофибробласты, которые в составе рубцовой ткани вызывают дистрофические изменения кератиноцитов, наблюдается т vivo в случае больших повреждений ткани (Desmoulire A. et al., 2005). Согласно стандартам клинических исследований и данным других авторов, описанные нами изменения дермальных фибробластов культуры ФЧ-2 соответствуют этапам клеточного старения (Rattan S.I.S., 2010). Следовательно, полученная культура является оптимальной для дальнейших исследований процессов старения и влияния на них синтетического олигопептида.
В настоящем исследовании проведен анализ влияния на дермальные фибробласты кожи синтетического олигопептида р199 (sh-oligipeptide 72), состоящего из 72 аминокислот, молекулярная масса 8,4 кДа, аналога одного из компонентов основного вещества пупочного канатика - Вартонова студня. На модельных системах как в культуре in vitro, так и в опытах in vivo компоненты и клетки Вартонова студня пупочного канатика способствуют заживлению ран с минимальными воспалительными реакциями и практически без образования грануляционной ткани. Клетки и строма Вартонова студня влияют на миграционную активность фибробластов, способствуют неоваскуляризации и реэпителизации, регулируют миграцию, пролиферацию и жизнеспособность клеток (Aто A.I. et al, 2014). Ранее было изучено влияние ММСК пупочного канатика человека на безрубцовое заживление ран кожи на бестимусных мышах, где авторы показали, что темпы заживления ран не менялись. Но клетки основного вещества пупочного канатика влияли на ремоделирование внеклеточного матрикса, стимулировали синтез металлопротеиназ ММР2 и PLAU при снижении синтеза провоспалительных интерлейкинов ША, II IB (Doi H. etal.,2015).