Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 16
1.1 Современная этиология и патогенез психических расстройств 16
1.1.1 Особенности патогенеза эндогенных психических расстройств 16
1.1.2 Глутаматергическая система и её роль в патогенезе психических расстройств, изменения в метаболизме глутамата при патологических состояниях 29
1.1.3 Современные аспекты возникновения и развития расстройства адаптации 39
1.2 Протеомный анализ и его методы 42
1.2.1 Электрофорез 44
1.2.2 Масс-спектрометрия 46
1.3 Протеомные исследования у пациентов с психическими расстройствами 50
Глава 2. Материалы и методы исследования 56
2.1 Характеристика обследуемых лиц 56
2.2 Методы исследования 58
2.2.1 Методы психометрического обследования 58
2.2.2 Методы пробоподготовки образцов к масс-спектрометрическому анализу 59
2.2.2.1 Аффинная хроматография 59
2.2.2.2 Концентрирование белков с помощью центрифужных ультрафильтров Микрокон-ультра 60
2.2.2.3 Определение концентрации белка по методу Мэрион Бредфорда 60
2.2.2.4 Электрофорез 61
2.2.2.5 Предварительная оценка молекулярной массы белков, разделённых с помощью электрофореза 62
2.2.2.6 Расчет молекулярной массы белков с помощью системы гель-документации 63
2.2.2.7 Трипсинолиз белковых пятен в полиакриламидном геле. 64
2.2.3 Идентификация белков сыворотки крови с помощью масс спектрометрии 64
2.2.4 Обработка данных масс-спектрометрии с использованием программного обеспечения Mascot 66
2.2.5 Количественный масс-спектрометрический анализ с использованием синтетических пептидных стандартов 67
2.2.6 Определение количества z-1 субъединицы глутаматного NMDA рецептора в сыворотке крови .69
2.2.7 Определение количества глутамата в сыворотке крови .71
2.2.8 Определение количества кадгерина-5 в сыворотке крови .72
2.2.9 Определение количества кортизола в сыворотке крови .73
2.3 Статистическая обработка результатов 74
Глава 3. Результаты и их обсуждение 75
3.1 Основные клинические характеристики обследованных лиц .75
3.2 Изменения в электрофоретическом распределении белков сыворотки крови в исследуемых группах 82
3.3 Сравнительный протеомный анализ идетифицированных белков ыворотки крови больных психическими расстройствами и здоровых лиц .96
3.4 Количественное определение белка метаботропного глутаматного рецептора в сыворотке крови больных шизофренией масс спектрометрическим методом .129
3.5 Определение количества z-1 субъединицы NMDAR в сыворотке крови больных эндогенными психическими расстройствами .130
3.6 Исследование количества глутамата в сыворотке крови больных эндогенными психическими расстройствами .132
3.7 Определение количества кадгерина-5 в сыворотке крови больных эндогенными психическими расстройствами .140
3.8 Определение количества кортизола в сыворотке крови больных расстройством адаптации 142
Заключение 146
Выводы. 166
Список сокращений 168
Библиографический список 169
Список иллюстративного материала .221
Приложения 224
- Особенности патогенеза эндогенных психических расстройств
- Протеомные исследования у пациентов с психическими расстройствами
- Изменения в электрофоретическом распределении белков сыворотки крови в исследуемых группах
- Исследование количества глутамата в сыворотке крови больных эндогенными психическими расстройствами
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Психические расстройства (ПР) относят к социально значимым заболеваниям современности, которые характеризуются распространенностью, частыми рецидивами и, в случае эндогенных психических расстройств, короткими периодами ремиссий или их полным отсутствием. Существует этиологическое деление всех психических расстройств на эндогенные и психогенные (Тиганов А.С., 1999). На эндогенное заболевание указывает спонтанный характер возникновения болезни, т.е. отсутствие какого-либо внешнего фактора. К таким заболеваниям относят расстройства шизофренического спектра и биполярное аффективное расстройство (БАР).
Несмотря на большую социальную значимость, этиология и патогенез ПР
остаются не до конца изученным (Lakhan S.E., 2006). В основе шизофрении и, в
определённой мере, других расстройств шизофренического спектра и БАР
(биполярное аффективное расстройство) лежит нарушение процессов синаптической
передачи, приводящее к нарушению нейротрансмиссии (Hashimoto M. et al., 2003). До
сих пор параллельно существует несколько гипотез патогенеза этих заболеваний.
Последнее время возрос интерес к глутаматергической гипотезе; в её основе лежит
дисфункция глутаматной рецепторной системы (Ehrlich A. et al., 2015; Chitty K.M. et
al., 2015). Появились также сообщения, что активация синтеза глутамата имеет
патогенетическое значение при нейродегенеративных заболеваниях мозга, глутамат
осуществляет повреждающее действие на нейроны и может опосредовать гибель
клеток (, M., 2004; Martin H., 2010). Но, тем не менее,
не выявлено неопровержимых доказательств ведущей роли нарушения
глутаматергической нейротрансмиссии в патогенезе шизофрении и каких-либо биологических маркёров этих процессов.
Трудности в создании новых эффективных методов диагностики и лечения
психических расстройств связаны с недостаточным пониманием молекулярных
механизмов патогенеза болезней. На начальных этапах заболевания многие ПР имеют
сходную клиническую картину. Но развитие заболевания и его исход совершенно
разный: для шизофрении характерно разрушение эмоций и способностей, ведущее к
формированию дефекта личности и инвалидизации, для других видов эндогенных
психических расстройств в период ремиссий не наблюдается дефекта психических
функций и снижения интеллекта. Поэтому крайне актуальна ранняя
дифференциальная диагностика психических расстройств.
В настоящее время не существует параклинических лабораторных методов дифференциальной диагностики психических расстройств. Для постановки диагноза того или иного психического расстройства используют только анамнестические и клинико-психопатологические данные, основанные на клинических оценках преобладания тех или иных психогенных симптомов. Поэтому правильность диагноза того или иного психического расстройства зависит исключительно от квалификации лечащего врача. Особую сложность при постановке диагноза представляют пациенты, впервые поступившие в психиатрическую клинику. На сегодняшний день являются перспективными исследования, связанные с поиском белков, специфичных для расстройств шизофренического спектра, БАР и других ПР (English J. et al., 2010; Lakhan S., 2006; Domenici E., 2010) отражающих характерные изменения патогенеза этих расстройств.
Степень разработанности темы исследования. Несмотря на длительное изучение психических расстройств, до сих пор не удавалось обнаружить наличие
патогенетического дефекта, специфично характеризующего данные патологические
процессы (Pickard B., 2011). В последнее время активно развиваются новые подходы
к диагностике психических заболеваний и поиску их патогенетических маркеров, в
том числе и методом протеомного анализа (Ding Y.H. et al., 2015; Song Y.R. et al.,
2015; Sabherwal S. et al., 2016; Giusti L. et al., 2016; Davalieva K. et al., 2016; Guest P.C.,
H., 2017). По протеомному анализу больных с психическими
расстройствами имеются немногочисленные исследования, в основном
представленные работами по шизофрении (Martins-de- Souza D., 2010-2011; Horvth S. et al., 2011; Cafe-Mendes C.C., Torrao E.S. et al., 2014; Song Y.R. et al., 2015, Sabherwal S. et al., 2016). Протеомные исследования ПР представлены, в основном, работами, выполненными на постмортальном материале, а по исследованию белкового состава сыворотки крови представлены единичные работы (Wan C. et al., 2007, Lisitsa S. et al., 2014, Knochel C. et al., 2016; Sabherwal S. et al., 2016), данные которых противоречивы и в большей степени не подтверждены другими методами. Есть единичные работы по протеомике депрессии и БАР (Domenici E., 2012; Carboni L., 2014; Sussulini A. et al., 2014). Несмотря на повышенный интерес к протеомным исследованиям ПР и интенсивные исследования в этом направлении, в доступной литературе не встречается работ, посвященных анализу белкового спектра методом 1D электрофореза у больных ПР, также совсем отсутствуют протеомные исследования при шизотипическом расстройстве и расстройстве адаптации. Сравнительный протеомный анализ при разных ПР также не проводился. Кроме того, в представленной мировой литературе практически отсутствуют попытки связать выявленные белки с патогенезом расстройств.
Таким образом, является обоснованным выявление белка-маркера или
регуляторных белков, участвующих в патогенезе шизофрении, ШТР
(шизотипического расстройства), БАР и РА (расстройства адаптации) в доступном для использования в диагностических целях биоматериале – сыворотке крови, которые максимально приблизят нас к пониманию специфичных патогенетических моментов ПР и могут послужить дополнением к имеющимся клиническим критериям дифференциальной диагностики различных эндогенных психических расстройств и основой для разработки персонализированного подхода к терапевтической тактике. Анализ литературных данных в этой области исследований психических расстройств свидетельствует об актуальности проблемы, ее приоритетности и нерешенности заявляемых задач.
Цель исследования – выявить связь специфических белков, обнаруженных с помощью сравнительного протеомного анализа, с особенностями патогенеза ряда психических расстройств: шизофрении, шизотипического расстройства, биполярного аффективного расстройства и расстройства адаптации.
Задачи исследования:
1. Определить закономерности электрофоретического распределения белков
сыворотки крови больных эндогенными психическими расстройствами и
расстройством адаптации.
-
Выявить специфичные для шизофрении, шизотипического расстройства, биполярного аффективного расстройства и расстройства адаптации белки с помощью масс-спектрометрии из белковых областей, имеющих достоверные различия между исследуемыми группами.
-
Определить связь белков, специфичных для каждой из изучаемых патологий, с особенностями патогенеза эндогенных и психогенных расстройств.
-
Оценить вклад выявленных белков (mGlu6, z-NMDAR) в нарушение глутаматергической нейротрансмиссии при эндогенных психических расстройствах.
-
Выявить связь идентифицированных белков с изменениями в гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системе, участвующих в патогенезе расстройства адаптации.
Научная новизна работы. В результате комплексного исследования с
использованием современных методов впервые выявлены особенности изменений
белкового спектра сыворотки крови при расстройствах шизофренического спектра,
биполярного аффективного расстройства и расстройстве адаптации в сравнении со
здоровыми лицами. Впервые получены достоверные отличия в электрофоретических
картинах распределения сывороточных белков при различных видах психических
расстройств и выявлены специфичные белковые области, характеризующие каждое
заболевание, используемые в дальнейшем для масс-спектрометрии. В результате
масс-спектрометрического анализа впервые были идентифицированы специфичные
белки для каждой изучаемой патологии: шизофрении, шизотипического расстройства,
биполярного аффективного расстройства и расстройства адаптации. Впервые в крови
больных эндогенными расстройствами определено достоверное увеличение
концентрации белка метаботропного глутаматного рецептора 6 типа, z-1
субъединицы глутаматного NMDA-рецептора и глутамата и оценен их вклад в
нарушение глутаматергической нейротрансмиссии у этих больных. Впервые
выявлена патогенетическая роль в развитии эндотелиальной дисфункции у больных
эндогенными психическими расстройствами таких белков, как: тирозин-зависимая
протеинкиназа ABL 2, актин -2 и актин -3, кадгерин-5, мaк-2-связывающий
гликопротеин, гельзолин, белок внеклеточного матрикса 1, рецептор фактора роста
эндотелия сосудов 1. По итогам работы впервые представлена гипотетическая схема
участия всех выявленных белков в патогенезе эндогенных расстройств. У больных
расстройством адаптации патогенетические изменения в функционировании
гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы впервые подтверждены
определением в крови белка специфического фактора удлинения глюкокортикоидных рецепторов, а изменения в иммунном ответе – секреторным актин-связывающим белком. Выявление этих белков расширило и дополнило имеющиеся сведения о патогенезе расстройства адаптации в контексте ключевых механизмов его развития.
Теоретическая и практическая значимость работы. Данное исследование
позволило выявить изменения в белковом спектре сыворотки крови при психических
расстройствах, играющие роль в патогенезе изучаемых заболеваний. В работе
выявлен ряд специфичных белков, отражающих особенности патогенеза больных тем
или иным расстройством и не встречающихся при других нозологических формах. По
итогам работы впервые выявлены потенциальные белковые маркёры, являющиеся
значимыми патогенетическими факторами у больных эндогенными психическими
расстройствами – нарушение глутаматергической нейротрансмиссии и
эндотелиальная дисфункция; у больных расстройствами психогенного спектра – белки, характеризующие изменения в гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой и нейроиммунных системах.
Использование результатов оценки электрофоретического спектра
распределения сывороточных белков и выделения белковых областей сыворотки крови, характеризующих только одну конкретную нозологию, легло в основу двух патентов: патента РФ № 2522236 «Лабораторный способ дифференциальной диагностики эндогенных психозов» (2014 г.) и патента РФ № 2558056 «Лабораторный
способ диагностики биполярного аффективного расстройства» (2015г.). На основании
данных об уровне глутамата в сыворотке крови больных разными формами
расстройств шизофренического спектра в зависимости от клинических особенностей
заболевания получены два патента: патент РФ № 2569741 «Лабораторный способ
диагностики шизотипического расстройства» (2015г.) и патент РФ № 2578957
«Лабораторный способ диагностики ведущей негативной симптоматики у больных
шизофренией» (2016г.). На основе патентов РФ № 2569741 и № 2522236 разработаны
и внедрены в клиническую практику новые медицинские технологии: «Лабораторная
диагностика шизотипического расстройства на основе определения количества
глутамата в сыворотке крови» и «Лабораторный метод дифференциальной
диагностики шизофрении и острого полиморфного психотического расстройства на
основе электрофоретического анализа белков сыворотки крови». Результаты
исследования в дальнейшем могут служить теоретической базой для разработки
принципиально новых методов диагностики ПР, основанных на параклинических
критериях. Использование новых знаний об участии выявленных белков в патогенезе
ПР, позволит назначать лекарственные препараты с учётом патогенетических
особенностей течения заболевания и тем самым увеличить эффективность
проводимой терапии. Применение результатов исследования в практическом
здравоохранении будет способствовать улучшению качества оказания
индивидуальной специализированной психиатрической помощи.
Методология и методы исследования. В соответствии с поставленными
задачами были использованы современные высокоинформативные методы
исследования. Материалом для исследования являлась сыворотка крови
обследованных лиц.
Основные методы исследования: клинико-психопатологический (шкала оценки позитивных и негативных симптомов PANSS; оценка тяжести депрессивного симптома по шкале Гамильтона версия для сезонного аффективного расстройства (SIGH-SAD); биохимические: аффинная хроматография и концентрирование белков; электрофорез и расчет молекулярной массы белков, разделённых с помощью 1D; трипсинолиз белковых пятен из ПААГ; ESI масс-спектрометрический анализ белков; идентификация белков с использованием баз данных системы Mascot; целевой количественный масс-спектрометрический анализ белка сыворотки крови mGluR6 с использованием синтетических пептидных стандартов, меченных стабильными изотопами; определение концентрации глутамата в сыворотке крови; определение концентрации кадгерина-5 в сыворотке крови; определение концентрации кортизола в сыворотке крови; статистический анализ результатов.
Положения, выносимые на защиту:
-
У больных с психическими расстройствами в сыворотке крови впервые определены специфичные патогенетически значимые белки: для шизофрении – тирозинзависимая протеинкиназа ABL, актин-2 и -3, белок метаботропного глутаматного рецептора 6 типа; для шизотипического расстройства – компонент комплемента C9; для больных биполярным аффективным расстройством – z-1 субъединица глутаматного NMDA-рецептора; рецептор фактора роста эндотелия сосудов 1, для больных расстройством адаптации – секреторный актин-связывающий белок и белок специфического фактора удлинения глюкокортикоидных рецепторов AF1.
-
У больных эндогенными расстройствами выявлено увеличение количества белка метаботропного глутаматного рецептора, z-1 субъединицы NMDA
рецептора и глутамата, которые являются важными патогенетическими
факторами нарушения глутаматергической нейротрансмиссии.
3. У больных психогенными расстройствами обнаружен белок специфического
фактора удлинения глюкокортикоидных рецепторов, который в сочетании с
двукратным увеличением концентрации кортизола, подтверждает
вовлеченность механизмов гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой
регуляции в патогенез расстройства адаптации.
Степень достоверности и апробация результатов диссертации. Результаты
проведенных исследований доложены и обсуждены на конференциях всероссийского
и международного уровней, таких, как международная научно-студенческая
конференция «Молекулярная медицина и безопасность» (Москва, 2010); 66-я
Всероссийская научно-практическая конференция молодых ученых и студентов с
международным участием «Актуальные вопросы современной медицинской науки и
здравоохранения» (Екатеринбург, 2011); I Международная интернет-конференция
«Молекулярные механизмы шизофрении» (Казань, 2011); XIV Всероссийская медико-
биологическая конференция молодых исследователей с международным участием
(Санкт-Петербург, 2011); Российская научно-практическая конференция «Адаптация
больных шизофренией» (Томск, 2013); Современные проблемы психических и
соматических расстройств: грани соприкосновения (Томск, 17-18 июня 2014);
Российский форум с международным участием "Актуальные вопросы
фундаментальной медицины" (Екатеринбург, 23-25 октября, 2014); XVII Отчетная научная сессия ФГБУ «НИИ психического здоровья» (Томск, 6 октября 2015); XVI съезд психиатров России (Казань, 23-26 сентября 2015); VII Российский симпозиум «Белки и пептиды» (Новосибирск, 12-17 июля 2015); “Mental Health, Direction and Challenges”WPA Regional Conference (Tbilisi, 27-30 April 2016); Российская конференция с международным участием и школы-семинара молодых ученых «Биомаркеры в психиатрии: поиски и перспективы» (Томск, 12—13 мая 2016); 12 международный междисциплинарный конгресс «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, Крым, Россия, 5-11 июня 2016); The 10th anniversary International Multiconference «Bioinformatics of Genome Regulation and Structure\ Systems Biology» (Novosibirsk, 29 August – 2 September 2016); V Съезд физиологов СНГ, V съезд биохимиков России и Конференции ADFLIM (Сочи, Россия, 4–8 октября 2016); 10-я конференция по протеомике стран Восточной и Центральной Европы: «10th Central and Eastern European Proteomic Conference» (Венгрия, Будапешт, 11-14 октября 2016); 6th European Conference on Schizophrenia Research: Advancing Research-Promoting Recovery (Германия, Берлин, 14-16 сентября 2017 г.); International Conference «Clinical Proteomics. Postgenome Medicine» (Москва, 30 октября-1 ноября 2017г.) и другие.
Работа выполнялась в рамках междисциплинарного интеграционного проекта СО РАН «Медицинская протеомика и метаболомика человека. Химические и генетические подходы к персонализированной терапии», №90, 2009-2011 гг. и поддержаны государственным контрактом № 14.740.12.0819 Федеральная Целевая Программа «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы и интеграционным проектом СО РАН и СО РАМН №5 от 09 февраля 2012 года «Медицинская протеомика: поиск маркеров социально значимых психических расстройств (2012-2014 годы)». Грант РНФ 14-15-00480 «Поиск ключевых биомаркеров патогенеза социально значимых эндогенных психических расстройств» (2014-2016).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 50 печатных работ, из которых 5 статей в центральных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ, одна статья подана в международную печать; 4 патента на изобретение РФ, 2 новые медицинские технологии.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 237 страницах машинописного текста, состоит из введения, трех глав, выводов, списка использованной литературы, содержащего 472 источника, в том числе 99 отечественных и 373 зарубежных. Диссертация иллюстрирована 23 таблицами и 12 рисунками.
Личное участие автора. Автор принимал непосредственное участие в разработке дизайна и планировании исследования, подборке и анализе литературы, проведении всех экспериментальных работ, обработке данных масс-спектрометрии, статистической обработке полученных данных и интерпретации результатов.
Особенности патогенеза эндогенных психических расстройств
Психические расстройства относятся к социально значимым заболеваниям человека в связи с достаточно высокой частотой их распространенности в популяции, прогредиентностью и тяжестью социальных последствий. Острые приступообразные психические расстройства (биполярное аффективное расстройство, рекуррентная и приступообразно-прогредиентная шизофрения) составляют около 45% расстройств шизофренического спектра, выявленных в популяции (Жариков Н.М., Тюльпин Ю.Г., 2002).
К эндогенным ПР относят расстройства, в возникновении которых основное значение придается внутренним причинам, заложенным в самом организме, а не к воздействию внешних факторов. Но нельзя исключить влияние внешних факторов при наличии предрасположенности к психическим расстройствам при нарушении существующего неустойчивого равновесия, которое влечёт за собой расстройство психики. В развитии эндогенных расстройств основное значение придается наследственным факторам, но их природа и пути передачи по наследству остаются не изученными. Наследственная предрасположенность может реализоваться в болезнь, а может так и остаться не приведенной в действие и передаться следующему поколению (Коркина М.В. и др., 2006).
В основе ПР лежат нарушения функционирования нейромедиаторных систем, которые связаны с изменением скорости синтеза или распада нейромедиатора, а также процессов выброса в синаптическую щель или обратного захвата медиатора, с возможными модификациями структуры соответствующего рецептора и т.д. В большинстве случаев можно выделить основную ведущую медиаторную систему, сбой в работе которой приводит к развитию конкретной патологии (Александровский Ю.А., Чехонин В.П., 2005). Шизофрения – прогрессирующее психическое заболевание неустановленной этиологии и патогенеза, склонное к хроническому течению. Согласно данным ВОЗ распространенность шизофрении составляет 1% населения (Harrison P.J., Roberts G.W., 2000). В основном заболевают молодые люди до 30 лет, однако есть и детская шизофрения, иногда встречается манифестация заболевания в более зрелом возрасте (Логвинович Г.В., Семке А.В., 1995).
В клинике психических расстройств шизофрения проявляется типичными изменениями личности больного, часто приводящими к стойким нарушениям социальной адаптации и трудоспособности (Тиганов А.С., 2011; Семке А.В. и др., 2011). У больных шизофренией характерным признаком является бред физического воздействия и преследования, своеобразные двигательно-волевые (кататонические) нарушения, при этом пациент может находиться в состоянии кататонического ступора (полной заторможенности). При этом пациенты слышат в голове «голоса» тех людей, которые на них действуют, управляют их мыслями, эмоциями, движениями, избавиться от которых они не могут (Tandon R., Nasrallah H.A., Keshavan M.S., 2010; Шмуклер А.Б., 2011). По мере течения болезни возможны периоды ее обострения и, наоборот, периоды ремиссии (Логвинович Г.В., Семке А.В., 1995; Рахмазова Л.Д., 2000).
Несмотря на достижения мировой психиатрии в области нейробиологии шизофрении и установление некоторых ключевых механизмов действия высокоактивных антипсихотических средств (Arranz M.J., Rivera M., Munro J.C., 2011; Boyd K.N., Mailman R.B., 2012), причины, а также патогенетические механизмы этого заболевания остаются недостаточно изученными. Поэтому до сих пор не существует не только единой концепции этиологии и патогенеза шизофрении, но и представлений, которые бы разделяли все психиатрические школы. На современном этапе развития психиатрии могут быть выделены множество различных теорий патогенеза шизофрении. Из них наиболее широкое распространение в последнее время получила глутаматергическая гипотеза. Изначально в её основе были положены психотомиметические эффекты фенциклидина и кетамина, действие которых связано с влиянием на NMDA-рецепторы (Baldridge E.B., Bessen H.A., 1990). Нарушение функций NMDA рецепторов подтверждено рядом работ (Bowie D., 2008; Ivanova S., Loonen A.J.M., 2012; Timms A.E. et al., 2013; Zink M., Correll C.U., 2015). Посмертные исследования демонстрируют изменения в уровне глутаматергических рецепторов в различных областях мозга больных шизофренией, включая префронтальную кору. В лимбических отделах и лобной коре пациентов обнаружено снижение ГАМК-ергических нейронов и увеличение рецепторной плотности (Ideker T. et al., 2001; Laruelle M., Abi- Dagham A., 1999; Fukata Y. et al., 2002).
Остаётся высоким интерес к ведущей гипотезе шизофрении, долгое время игравшей основную роль – дофаминовой гипотезе, в основе которой лежит дисфункция дофаминергической системы обусловленная усилением или уменьшением выработки дофамина в некоторых структурах мозга. Дофаминовая гипотеза родилась на основе двух групп психофармакологических данных: 1) клинически эффективные нейролептики разных химических групп обладают общей способностью блокировать постсинаптические дофаминовые D2-рецепторы; 2) агонисты дофамина типа амфетамина могут вызывать психозы, имеющие сходство с параноидной шизофренией (Тиганов А.С. и др., 1999; Laruelle M., Abi- Dagham A., 1999). Использование современных методов нейровизуализации, показали, что уровень дофамина в полосатом теле у больных шизофренией повышен (Landek-Salgado M.A. et al., 2016). Несколько противоречивые исследования на основании тех же методов продемонстрировали исследования D2 рецепторов: так показано достоверное увеличение их плотности в стриатуме (Laruelle M., 2014) и уменьшение – в таламусе и височной коре у больных шизофренией (Kuepper R. et al., 2012). Работы последнего десятилетия представляют модифицированную гипотезу, которая предполагает гиперактивацию дофаминовой трансмиссии в мезолимбических структурах и гипоактивацию её префронтальной коре у больных шизофренией (Da Silva Alves F. et al., 2008; Brisch R. et al., 2014). После появления нового класса нейролептиков – атипичных, которые отличает высокая антипсихотическая активность при отсутствии в частности, экстрапирамидных побочных эффектов, оказалось, что они связывают не только дофаминовые, но и серотониновые (5-НТ2), адренергические и гистаминовые рецепторы.
Ранее дофаминовой гипотезе предшествовала серотониновая, на современном этапе снова набирающая популярность. Согласно серотониновой гипотезе заболевание шизофренией обусловлено, в том числе и недостаточностью серотонинергической нейротрансмиссии (Weiner I., 2003), являющейся следствием блокирования серотониновых рецепторов. На участие серотонинергической системы в патогенезе шизофрении указывают психомиметические эффекты диэтиламида лизергиновой кислоты (ЛСД) и диметилтриптамина. Оба препарата действуют на серотонинергические рецепторы. Но полного понимания всей сложности эффектов нейролептиков и участи их в механизме действия нейромедиаторных систем, пока нет.
Другой, достаточно распространенной в настоящее время, теорией является гипотеза дизонтогенеза – нарушение развития мозга. Положения теории дизонтогенеза указывают, что повреждение мозга (токсическое, инфекционное и др.) может наблюдаться в период внутриутробного развития, в течение II-III триместров беременности, т.е. на 6-9-м месяце, когда идет формирование лимбической системы (Лебединский В.В., 2003; Смулевич А.Б., 2009; Baldridge E.B., Bessen H.A., 1990). Происходящие при этом структурные изменения, будучи компенсированными за счёт высокой пластичности развивающегося мозга, могут предшествовать манифестации болезни без прогрессирования (Pino O. et al., 2014). Согласно этим представлениям, человек рождается с определённым набором генов, предрасполагающих к развитию болезни, которые в определённый период развития, могут оказаться триггерами к развитию шизофрении. Соответствующие повреждения головного мозга могут появиться у человека до начала проявления характерных клинических симптомов, но не проявляться до определённого периода (Fatemi S.H., Folsom T.D., 2009; Rapoport J.L., Giedd J.N., Gogtay N., 2012).
Значительно меньшее количество авторов постулирует наличие нейротоксических процессов в мозге больных шизофренией, и предполагают, вследствие этого, существование нейродегенеративных процессов (Rund B.R., 2009). Ранее эта гипотеза получила название аутоинтоксикационной. Теория, связана с обнаружением в организме больных шизофренией разнообразных токсических белковых и низкомолекулярных веществ, оказывающих нейротропные эффекты, либо изменяющие нейрональную активность (Prabakaran S. et al., 2004). Она допускает, что аутоинтоксикация организма больного токсическими продуктами обмена веществ способна вызывать нарушение деятельности центральной нервной системы (Harrison P.J., Roberts G.W., 2000). В последнее время предлагается объединить гипотезы дизонтогенеза и нейродегенерации в одну модель расстройства нейроразвития. Она включает в себя следующие предпосылки: 1) пренатальное начало; 2) бессимптомное развитие до определённого момента; 3) постепенное снижение массы мозга на протяжении заболевания 4) снижение когнитивных и иных функций головного мозга (Gross G., Huber G., 2008; Pino O. et al., 2014).
Протеомные исследования у пациентов с психическими расстройствами
Работы по исследованию протеома больных психическими расстройствами в мире немногочисленны и часто противоречивы их результаты представлены в основном на постмортальном материале. Так Martins-de-Souza, Horvth S и другие внесли свой вклад в решении задачи по анализу транскриптома и протеома тканей головного мозга и выявили ряд белков, принимающих участие в процессе миелинизации олигодендроцитов при шизофрении (Martins-de-Souza D. et al., 2010, 2015; Horvth S. et al., 2011). В работе Fukata Y. описан белок – дигидропиримидин-связывающий белок 2 (CRMP-2), белок из семейства гомологов дигидропиримидиназы, участвующий в стимулируемом каскаде остановки аксонального роста в процессе развития нервной ткани (Fukata Y., Kimura T., Kaibuchi K., 2002).
Его повышенное содержание может объяснить увеличение количества аксональных связей в мозге больных шизофренией. В префронтальной коре больных шизофренией Pinacho R. и др. обнаружили снижение уровня белков, которые участвуют в цитоархитектуре, синаптической функции и т.д. (Pinacho R. et al., 2016).
Таким образом, последнее время транскриптомика и протеомика стали важным инструментом в раскрытии патофизиологических механизмов шизофрении и других психических расстройств. По изучению протеомов сыворотки крови этих больных имеются буквально единичные работы с небольшим количеством выявленных белков. Ding Y.H. С коллегами при сравнительном протеомном исследовании сыворотки крови больных шизофренией, депрессией и здоровых лиц, вывили две аминокислотные последовательности у больных шизофренией в отличии от больных с депрессией и здоровых людей. Эти белки были идентифицированы как N-концевые фрагменты фибриногена (Ding Y.H. et al., 2015). Исследованиями Saia-Cereda и Horvath было показано, что белки связанные с энергетическим обменом, цитоскелетом и клеточной сигнализации, возможно, являются ключом к разгадке патогенеза шизофрении (Saia-Cereda V.M. et al., 2015; Horvath S., Mirnics K., 2015). Так в постмортальном материале были идентифицированы белки, большинство из которых представляют собой ферменты, участвующие в регуляции энергетического метаболизма (Martins-de-Souza D., 2011). Было установлено, что ферменты гликолиза, такие как ALDOC (альдолаза C), TPI1 (триозофосфатизомераза 1), GAPDH (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа), PGAM1 (фосфоглицерата мутаза 1) и ENO2 (енолаза 2), значительно выражены в зоне Вернике, и вероятно, влияют на метаболизм глюкозы у пациентов с шизофренией (Martins-de-Souza D. et al., 2009). Результаты исследования Liu M. по количественному определению уровня 13 метаболитов глюкозы в мононуклеарных клетках периферической крови людей, больных шизофренией и тяжёлой депрессией, свидетельствуют о нарушении метаболизма глюкозы у больных шизофренией. Возможно, процессы обмена глюкозы могут принимать участие в патогенезе шизофрении (Liu M. et al., 2015).
Кроме нарушений энергетического обмена, в литературных источниках приводятся исследования нарушения обмена фосфопротеинов. Не смотря на то, что работ на эту тему не так много, но уже было доказано, что у больных шизофренией в сыворотке крови имеются аномалии в путях фосфорилирования белков, задействованных в процессах коагуляции и острых реакциях (Jaros J. et al., 2012). У больных шизофренией было идентифицировано 68 фосфорилированных белков в области мозолистого тела, отвечающего за связь между полушариями (Fitsiori A. et al., 2011), и по данным нейрофизиологических и морфологических исследований, измененных у больных шизофренией (Guo H. et al., 2000; Innocenti G.M. et al., 2003; Rotarska-Jagiela A. et al., 2008). Большинство из обнаруженных фосфопротеинов связаны с сигнальными системами клетки, в том числе и белок цилиарного нейротрофического фактора (CNTF). По мнению многих исследователей, ЦНТФ играет важную роль в патогенезе различных заболеваний, в частности нейродегенеративных. Например, широко изучается связь ЦНТФ с болезнями Альцгеймера (Kazim S.F., Iqbal K., 2016) и Паркинсона (Nam J.H. et al., 2015). Белки фосфоинозитид 3-киназа (PI3K) и так называемая мишень рапамицина у млекопитающих (mammalian target of rapamycin, mTOR) также ассоциированы с путями клеточной сигнализации (Gururajan A., van den Buuse M., 2013, Hou L., Klann E., 2004), которые имеют отношение к дизрегуляции синаптической пластичности у пациентов с шизофренией (Weickert T.W. et al., 2000).
В работе Omaetxebarria выявлено существенное увеличение количества белка пероксиредоксин 6, являющимся бифункциональным ферментом с двумя различными активными центрами. Белок участвует в регуляции защиты клетки от окислительного повреждения путем уменьшения уровня H2O2 (Chen J.W. et al., 2000) и обмена фосфолипидов. Известно, что у больных шизофренией в лобной доле коры наблюдается увеличение фосфолипидного обмена, активируемого фосфолипазой А2. Тогда как усиление активности Ca2+- зависимой фосфолипазы A2 может привести к снижению дофаминергической активности (Omaetxebarria M.J. et al., 2006; Wang D. et al., 2006). Следует также отметить, что фосфатидилэтаноламин-связывающий белок 1 (PEBP1) проявляет ингибиторную активность в отношении нескольких сериновых протеаз, включая тромбин, химотрипсин, трипсин (Hengst U. et al., 2001). Из других нарушений связанных с обменом фосфопротеинов следует отметить работу Knochel C. и др. в которых авторы исследовали, являются ли потенциальные различия в белках плазмы крови больных шизофренией и биполярным расстройством, связанными с когнитивными нарушениями и нарушениями мозговых структур, лежащих в их основе. В частности, была выявлена тенденция к повышению уровня аполипопротеина С при шизофрении, а также изменение уровня аполипопротеина (APO) может выступать как фактор риска для нескольких психоневрологических заболеваний, например, болезни Альцгеймера. Кроме того, эти данные подтверждают гипотезу о том, что изменения в концентрации апопротеина С могут быть вовлечены в патфизиологию шизофрении (Knochel C. et al., 2016).
В своей работе Cafe-Mendes C.C. и др. провели исследование постмортальных мозговых тканей передней височной доли и мозолистого тела у больных шизофренией с помощью жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией. В результате исследования в передней височной доле и мозолистом теле было обнаружено уменьшение количества фрагмента гистона типа Н2В 1-H внутриклеточного ядерного пептида и снижение количества внутриклеточного пептида PepH у пациентов, страдающих шизофренией, белок PepH как предполагается, обладает потенциальной цитопротекторной активностью (Cafe-Mendes C.C. et al., 2016).
В работах Wan C. И др. по исследованию в китайской популяции Хань на выявление изменений белков плазмы, ассоциированных с шизофренией, с использованием протеомных технологий и изучению связи между шизофренией и гаптоглобиновым (Hp) генотипом. Авторами было выявлено изменение экспрессии белка Hp у больных шизофренией по сравнению здоровыми лицами. Это демонстрирует, что гаптоглобин участвует в процессах патогенеза шизофрении (Wan C. et al., 2007).
Song Y.R. с коллегами провели сравнительное протеомное исследование белков плазмы больных биполярным расстройством с разными нарушениями настроения и здоровых лиц. В результате исследования, они выявили, что из 32 исследуемых белков, 16 белков были нарушены у больных биполярным расстройством независимо от состояния настроения, а 16 белков были специфически связаны с определенными состояниями настроения биполярного расстроства, по сравнению с контрольной группой. У больных биполярным расстройством, независимо от типа настроения идентифицированны белки: аполипопротеин (Apo) A1 и Apo L1. Song Y.R. с коллегами предполагают, что патофизиология биполярных расстройств может быть связана с ранними нарушениями липидного обмена. Также, они обнаружили у больных биполярным расстройством, зависимого от настроения, белок – карбоангидраза 1 (СА-1). Предположительно, данный белок вовлечен в патофизиологию депрессивных эпизодов биполярного расстройства (Song Y.R. et al., 2015).
Изучение белков плазмы крови у больных шизофренией и БАР в сравнительном аспекте представлены в литературе небольшим количеством работ в основном по единичным белкам. Например, в плазме крови больных шизофренией и биполярным аффективным расстройством было обнаружено изменение количества белка рилина, секретируемого экстраклеточным матриксом головного мозга (Fatemi S. et al., 2001). Также известно, что кальций-связывающий белок S100B вовлечен в патогенез как биполярного аффективного расстройства, так и шизофрении и его концентрация в плазме крови этих больных по сравнению с контрольной группой значительно повышена (Dagdan E., Morris D., Campbell M., 2011).
Изменения в электрофоретическом распределении белков сыворотки крови в исследуемых группах
Для анализа различий электрофоретического распределения белков сыворотки крови больных расстройствами шизофренического спектра, БАР, РА и здоровых лиц проведено электрофоретическое разделение белков сыворотки крови больных и расчет молекулярной массы белков, разделённых методом вертикального электрофореза с помощью системы гель-документации Alliance 2.7 (Uvitec, Англия). Для сравнения качественных признаков с малыми частотами применялся точный тест Фишера.
По результатам электрофоретического разделения белков сыворотки крови больных шизофренией и здоровых лиц мы обнаружили достоверные отличия в спектре распределения белков в 13 областях молекулярных масс (таблица 11).
Выявленные изменения представлены во всех областях молекулярных масс: высоких, средних и низких. Наличие большого количества достоверных изменений говорит о вовлеченности большого количества белков сыворотки крови в патогенезе шизофрении.
Результаты нашего исследования согласуется с результатом, полученным японскими коллегами Y. Tanaka et al. в области 180 и 120-128 кДа. В работе Tanaka Y. обнаружены изменения в плазме крови больных шизофренией в следующих областях белкового спектра: 180, 140, 120, 75, 68 и 52 кДа (Tanaka Y., Yoshida S., Shimada Y., 2007). При исследовании пота больных шизофренией также было обнаружено 17 белков, которых нет у здоровых лиц (Prabakaran S. et al., 2007). Как было сказано выше, на начальных этапах болезни шизофрения и БАР имеют сходную клиническую картину. Однако, исход заболеваний разный: для шизофрении характерно нарушение эмоциональной сферы, ведущее к формированию дефекта личности, хронизации и инвалидизации, а у больных БАР – в период ремиссий не наблюдается дефекта психических функций. Поэтому сравнение электрофоретических картин распределения белков сыворотки крови при этих заболеваниях было особенно актуальным.
При сравнении распределения белков сыворотки крови у больных шизофренией и БАР со здоровыми лицами получены достоверные отличия в распределении белков в 16 областях молекулярных массах (таблица 12). Такое большое количество достоверных отличий белкового спектра больных БАР и здоровых лиц также говорит о большом количестве изменённых белков при этом заболевании.
При анализе этих картин распределений обращает на себя внимание тот факт, что часть белковых областей даёт достоверные отличия в одних и тех же областях молекулярных масс при той и другой болезни: 206, 180, 97, 94, 40, 20 кДа. Поэтому возникает необходимость посмотреть различия в распределении белков между этими эндогенными психическими расстройствами. При сравнении белков сыворотки крови больных шизофренией и БАР в спектре их распределения были выявлены достоверные отличия в 13 областях распределения молекулярных масс (таблица13).
На основании анализа этих трёх таблиц можно констатировать следующее. Белки, дающие достоверные отличия в области 200, 150, 84, 75, 49 кДа выявлены у больных БАР. В областях 128, 88, 32, 30, 28 кДа – у больных шизофренией. Кроме этого обращают на себя внимание две белковых области 138 и 56 кДа – в этих областях выявлены отличия только между этими двумя группами. Этот факт, скорее всего можно объяснить тем, что у больных одной из групп происходит выявление каких-либо белков, не дающих различий с группой здоровых лиц, а у больных другой группы – выраженное снижение количества белков с этой же молекулярной массой. Таким образом, именно две этих белковых области могут представлять собой максимально перспективные области для выявления потенциальных белков дифференциальной диагностики этих двух эндогенных психических расстройств.
Сравнительному протеомному анализу при биполярном аффективном расстройстве и шизофрении последнее время стало уделяться достаточно много внимания в мировой биологической психиатрии. В лаборатории Стэнли методом двухмерного электрофореза было изучено белое вещество дорсальной префронтальной коры больных шизофренией и биполярным аффективным расстройством. Было найдено 70 белковых пятен, которые отличались у больных по сравнению с контрольной группой, из них 46 белков были идентифицированы с помощью метода масс-спектрометрии (English J. et al., 2009).
При анализе различий в распределении белков сыворотки крови больных шизофренией и шизотипическим расстройством достоверных различий между группами обнаружено не было. По результатам электрофоретического разделения белков сыворотки крови больных расстройством адаптации и здоровых лиц мы обнаружили достоверные отличия в спектре распределения белков в 9 областях молекулярных масс (таблица 14).
При этом мы видим, что часть белковых областей обнаруживших достоверные отличия между больными и здоровыми совпадают с уже выявленными при других психических расстройствах: 180, 97, 16. По всей видимости, находящиеся там белки неспецифично выявляются при всех видах психических расстройств.
При сравнении белков сыворотки крови больных расстройством адаптации и шизофренией в спектре их распределения были выявлены достоверные отличия в 12 областях распределения молекулярных масс (таблица15).
Таким образом, мы видим, что белковые спектры сыворотки крови больных шизофренией и расстройством адаптации достаточно серьёзно отличаются.
При сравнении белков сыворотки крови больных расстройством адаптации и БАР в спектре их распределения были выявлены достоверные отличия в 10 областях распределения молекулярных масс (таблица 16).
Последним этапом этой работы было выявление специфичных белковых областей, характерных только для одного заболевания. Проанализировав и сопоставив все полученные результаты исследования по всем изученным группам, были выявлены области белкового спектра, специфично характерные только для одного заболевания (таблица 17).
Таким образом, при изучении электрофоретического разделения белков сыворотки крови больных расстройством шизофренического спектра и БАР, выявлено большое количество белковых областей, дающих достоверные различия между разными видами психических расстройств. Наличие областей белкового спектра, характерных только для одного вида психического расстройства подтверждено следующими клиническими примерами.
Исследование количества глутамата в сыворотке крови больных эндогенными психическими расстройствами
В результате масс-спектрометрического анализа белкового спектра сыворотки крови больных шизофренией был выявлен белок метаботропного глутаматного рецептора 6 (mGluR6). После проведения количественного масс-спектрометрического определения белка mGluR6 в сыворотке крови больных шизофренией с использованием синтетических пептидных стандартов, меченных, стабильными изотопами, нами было получено достоверное увеличение концентрации данного белка у больных шизофренией. В связи с выявленными изменениями было решено изучить количество самого нейротрансмиттера глутамата в сыворотке крови больных расстройствами шизофренического спектра и БАР.
Статистическая обработка результатов исследования проведена с помощью параметрического критерия Стьюдента.
На рисунке 8 представлены различия в концентрации глутамата в сыворотке крови больных шизофренией, БАР и здоровых лиц. Обнаружено, что у здоровых лиц уровень глутамата составляет 12,18±5,33 нмоль/мл. Это значение достоверно отличается от уровня глутамата больных биполярным аффективным расстройством 15,89±4,00 нмоль/мл (р=0,0009) и больных шизофренией 15,12±4,81 нмоль/мл (р=0,014). Между больными шизофренией и БАР достоверных различий не выявлено. У больных шизотипическим расстройством отмечался самый высокий уровень глутамата в сыворотке крови (18,95±5,86 нмоль/мл), в 1,5 раза превышающий контрольные значения (р=0,0042).
На основании полученных результатов был разработан и получен патент «Лабораторный способ диагностики шизотипического расстройства» (Смирнова Л.П. и др., 2015) и внедрена новая медицинская технология «Лабораторная диагностика шизотипического расстройства на основе определения количества глутамата в сыворотке крови» (Смирнова Л.П. и др., 2015).
В качестве иллюстрации приводим следующий клинический пример больного с диагнозом шизотипическое расстройство.
Пациент А.В.И., 25 лет, проживает в г. Томске, тренер–инструктор.
Находился на лечении в отделении эндогенных расстройств НИИ с 25.06.13 по 2.08.13 гг. с диагнозом «Шизотипическое расстройство» (F 21), история болезни № 660.
Анамнез: пациент родился единственным ребенком в полной семье. Мать пациента, 49 лет, по образованию экономист, работает бухгалтером. По характеру тревожная и беспокойная; склонная к мнительности, сомнениям и чрезмерной осторожности; педантичная («правильная»). Отец, 53 года, предприниматель. По характеру «высокомерный» («на окружающих смотрит свысока»), заносчивый, раздражительный, склонный занимать внешне обвиняющую позицию («считает, что все вокруг виноваты»). Приблизительно в течение 20 лет страдает алкогольной зависимостью. За наркологической помощью по этому поводу никуда не обращался, продолжает периодически запойно алкоголизироваться. В течение последних 12 лет проживает отдельно от семьи, и пациент с ним отношений практически не поддерживает («очень редко видимся, общение дежурно–положительное»). Родная бабушка по линии матери по характеру холодная, отстраненная, увлекается различными эзотерическими учениями, астрологией, оздоровительными программами. Двоюродная бабушка по линии матери предположительно страдала шизофренией, лечилась в психиатрической больнице.
Беременность и роды у матери протекали физиологично. В детстве пациент умственно и физически развивался без отклонений. Детских страхов, снохождений, энуреза не было; в детстве был тихим, замкнутым ребенком, предпочитая игры в одиночестве; друзей практически не было. ДДУ посещал с 3–х лет, адаптировался не сразу, общался с одним близким другом. Простудными заболеваниями болел редко. С детства (предположительно, с 5–6 лет) по настоянию отца стал посещать занятия в секции каратэ, а с 8 лет – еще и бассейн, т.к. отец «всегда хотел, чтобы он был сильным и мог постоять за себя».
В школу пошел в 7 лет, учился с желанием и усердием. С одноклассниками общался мало, был замкнутым; имел одного близкого друга. С учителями отношения были «разные»: часть относились к нему «холодно», причиной чему были, замкнутость и плохой эмоциональный резонанс со стороны пациента; с кем–то из учителей отношения были очень хорошие («был в любимчиках»). Успеваемость в школе была неровная, «плавающая», т.к. временами учиться «надоедало». В начальной школе успеваемость была, в целом, хорошей, а затем постепенно стала падать, пропал интерес к обучению. В подростковом возрасте стал немного активней и общительней, появились друзья, в компании которых проводил много времени, играя в различные игры (футбол, баскетбол). В это же время стал меняться по характеру: стал непослушным, импульсивным и драчливым. В это время отец пациента стал особенно сильно алкоголизироваться, в связи с чем дома между родителями часто вспыхивали ссоры, семейная атмосфера стала напряженной, поэтому пациент «не любил бывать дома». Когда ему было 13 лет, отец после очередного скандала ушел из дома и стал с этого момента проживать отдельно. Пациент с ним встречался достаточно редко (в среднем, 1 – 2 раза в год); общение было поверхностным, но доброжелательным («никто ни к кому с расспросами не приставал»).
В связи с плохой успеваемостью по настоянию матери в старших классах пациент стал посещать репетитора по математике (с 8 класса и до конца обучения в школе), в связи с чем постепенно «усилилась вера в свои силы», успеваемость улучшилась, – сперва по математике, а впоследствии и по остальным предметам. В это же время «во всем стало нравиться видеть симметрию» (в окружающих предметах, в людях и т.п.); тогда же возникло ощущение несимметричности собственного тела (что правая половина тела развита сильнее, чем левая). В стрессовых ситуациях, «чтобы успокоиться», стал мысленно представлять четные цифры, либо правильные геометрические фигуры.
В старших классах школы также посещал секцию волейбола (в т.ч. участвовал в соревнованиях), но в общественных мероприятиях школы участия не принимал. Свободное время зачастую проводил в одиночестве за просмотром телевизора, компьютерными играми, пользованием интернетом, прослушиванием музыки, либо в компании немногочисленных друзей. Алкоголь стал употреблять с 14 лет, – изредка, в компании приятелей. Никогда не курил и не употреблял наркотики. В возрасте 13 – 16 лет часто беспокоило ощущение «как будто бы что–то чешется», в связи с чем «часто моргал, хрюкал, воротил носом». Сохранялось ощущение, что «тело несимметрично».
В 16 лет случайно увидел телевизионную передачу, посвященную паркуру. Сразу же «загорелся», нашел интересующихся этим людей с помощью интернета, стали тренироваться вместе («придумывали что–то сами»).
В 17 лет начал встречаться с девушкой по ее инициативе, но через полгода расстались, т.к. она предпочла другого парня. В 22 года возобновил отношения с первой девушкой. В настоящее время проживает вместе с ней и ее отцом.
После окончания 11 классов школы по настоянию родителей поступил в ТПУ, где обучался по специальности «Инженер электрооборудования». Адаптировался, но учиться не нравилось; чувствовал себя «не в своей тарелке», что «не туда попал». Испытывал проблемы с успеваемостью («постоянно был в числе отстающих»), в связи, с чем пытался «как–то выжить» (использовал шпаргалки, пытался договориться с преподавателями и т.п.). Чувствовал из–за этого постоянный стыд; казалось, что всем преподавателям это известно. В свободное время много занимался паркуром. С 2009 года сформировалась команда, стали арендовать различные залы для тренировок. С этого же времени стал увлекаться йогой, т.к. считал, что занятия ею помогают укрепить «энергетическую оболочку организма». По–прежнему считал свое тело «несимметрично развитым», в связи, с чем в тренировках большее внимание уделял слабой его половине (левой).
Во время занятий спортом неоднократно получал травмы: растяжение связок левого и правого голеностопа, подвывих левой ключицы, вывих правого плечевого сустава, в связи, с чем обращался за медицинской помощью в различные учреждения города, посещал мануального терапевта. После полученных травм возникали опасения, что «не сможет восстановиться» («тело остановится в развитии») и вернуться к занятиям, но с течением времени они постепенно проходили. В процессе лечения и реабилитации тренировки прекращал, четко соблюдал все полученные рекомендации. В это время практиковал йогу.
В 2011 году окончил ТПУ и стал искать подходящую работу. В конце ноября 2011 г., во время выполнения упражнения на тренировке упал, получив легкий вывих левого плеча. Во время падения на мгновение возникла внезапная очень сильная тревога («необъяснимый сильный страх»), головокружение и ощущение «невесомости» («как будто бы тело перестало мне принадлежать»). Пациент «какие–то секунды не мог пошевелиться, все тело было как ватное», а затем «пришел в себя», почувствовал боль в левом плече и, увидев вывих, вправил его самостоятельно. За помощью ни к кому не обращался, прекратил занятия, «чтобы тело восстановилось», продолжал практиковать йогу. В декабре 2011 устроился на работу инженером в одну из организаций города, где проработал до июня 2012 г. С обязанностями справлялся, но работал без интереса («делал, что просили, но не более»); отношения с коллегами были формальными.