Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Современное состояние проблемы 13
1.1. Статистика заболеваемости раком репродуктивных органов в России и мире 13
1.2. Характеристика предраковых процессов в органах репродуктивной системы 14
1.3. Ранние механизмы канцерогенеза
1.3.1. Генетические факторы 21
1.3.2. Эпигенетика 23
1.3.3. Сигнальные пути и факторы транскрипции 28
1.3.4. Пролиферация и апоптоз 31
1.3.5. Воспаление, цитокины и факторы роста 36
1.3.6. Опухолевые стволовые клетки 37
1.3.7. Гормональный канцерогенез 39
1.3.8. Инфицирование ВПЧ
1.4. Прородные соединения, обладающие фармакологической активностью в отношении механизмов раннего канцерогенеза 44
1.5. Активные субстанции I3C, DIM и EGCG
1.5.1. Влияние на генетические механизмы 47
1.5.2. Влияние на эпигенетическую регуляцию 48
1.5.3. Регуляция сигнальных путей 50
1.5.4. Влияние на клеточный цикл (пролиферация/апоптоз) 51
1.5.5. Противовоспалительные свойства 52
1.5.6. Ингибирование ОСК 53
1.5.7. Влияние на гормон-зависимые сигнальные пути 54
1.5.8. Противовирусный потенциал в отношении ВПЧ 56
1.6. Заключение 57
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований 59
2.1. Изучаемые субстанции и препараты 59
2.2. Материалы и методы экспериментальных исследований на лабораторных животных 59 2.2.1. Лабораторные животные и их содержание 59
2.2.2. Лабораторные исследования 61
2.2.3. Исследования общей физиологии 61
2.2.4. Патоморфологические исследования 63
2.3. Исследования фармацевтической активности препарата (работа с клеточными линиями) 63
2.3.1. Опухолевые клетки 63
2.3.2. Модель in vitro 64
2.3.3. Модель in vivo 65
2.4. Эпигенетическая и гормональная активность в экспериментах на животных 68
2.4.1. Изучение влияния на гистондеацетилазу 68
2.4.2. Изучение влияния на метилирование генов-онкосупрессоров 68
2.4.3. Изучение влияния на метаболизм эстрогенов 69
2.5. Клинические исследования 69
2.5.1. Изучение баланса факторов роста в канцерогенезе в предстательной железе... 69
2.5.2. Изучение метилирования генов-онкосупрессоров в предраковых процессах в эндометрии и шейке матки 71
2.5.3. Изучение метаболитов эстрогенов при диспластических заболеваниях молочной железы 72
2.6. Статистическая обработка данных 74
ГЛАВА 3. Отбор соединений для последующего изучения процессов раннего канцерогенеза и создания средств их коррекции 75
3.1. Разработка прототипов лекарственных форм 76
3.2. Токсикологические исследования прототипов лекарственных форм
3.2.1. Общая токсичность 80
3.2.2. Специфическая токсичность 130
3.3. Заключение 136
ГЛАВА 4. Исследование влияния соединений-кандидатов на механизмы раннего канцерогенеза на животных моделях 138
4.1. Влияние соединений-кандидатов на эпигенетические механизмы раннего канцерогенеза 138
4.1.1. Эпигенетическая активность дииндолилметана 138
4.1.2. Эпигенетическая активность эпигаллокатехинов 140
4.2. Влияние соединений индольного ряда на гормональные механизмы раннего канцерогенеза 141
4.3. Влияние дииндолилметана на туморогенность клеток линий злокачественных опухолей и раннее развитие опухоли 143
4.4. Механизмы активности дииндолилметана in vitro 146
4.5. Заключение 150
ГЛАВА 5. Исследование механизмов раннего канцерогенеза и способов их коррекции у человека 151
5.1. Роль баланса факторов роста в канцерогенезе в предстательной железе 151
5.2. Роль метилирования генов-онкосупрессоров в предраковых процессах в эндометрии и шейке матки
5.2.1. Метилирование генов в эпителии шейки матки 153
5.2.2. Метилирование генов в эндометрии 157
5.3. Роль канцерогенных метаболитов эстрогенов при диспластических заболеваниях
молочной железы и предстательной железы 159
5.4. Заключение 162
ГЛАВА 6. Обсуждение результатов исследований 164
6.1. Ранние механизмы канцерогенеза в органах репродуктивной системы человека 164
6.2. Перспективы проведения мультитаргетной химиопрофилактики онкологических заболеваний 172
Выводы 175
Практические рекомендации 177
Список литературы 178
- Эпигенетика
- Лабораторные животные и их содержание
- Токсикологические исследования прототипов лекарственных форм
- Влияние соединений индольного ряда на гормональные механизмы раннего канцерогенеза
Введение к работе
Актуальность исследования
Развитие молекулярно-генетических подходов позволило изменить ряд принципиальных позиций в диагностике и лечении злокачественных новообразований и наметить конкретные перспективы по их предотвращению. Однако успехам в лечении и профилактике одних видов опухолей сопутствовал рост заболеваемости и смертности от других. Особенно это касается рака репродуктивных органов. За последние десять лет в Российской Федерации летальность в течение первого года после постановки диагноза различных видов рака органов репродуктивной системы возросла на 12-36 %.
Для значительной части онкологических заболеваний репродуктивных органов существуют эффективные методики доклинического выявления. Одновременно с этим необходимо совершенствовать существующие и разрабатывать новые подходы к адекватной (селективной и безопасной) молекулярной противоопухолевой терапии, а также шире внедрять методы патогенетической профилактики. Именно с активной онкохимиопрофилактикой, как и с ранней доклинической диагностикой, связаны надежды по преодолению этого грозного недуга в будущем. Имеющаяся научная и практическая информация однозначно свидетельствует о том, что онкологическое заболевание может быть излечено только на ранних стадиях образования опухоли, когда неоплазия еще не стала необратимой и с болезнью можно справиться без использования тяжелых (с точки зрения их переносимости и влияния на организм больного) методов терапии.
Таким образом, решение научных и научно-технологических проблем должно базироваться на альтернативных способах лечения, методиках ранней диагностики, а также на профилактических программах для различных слоев населения.
Лекарственные средства, применяемые с целью онкохимиопрофилактики, должны подавлять неоплазию и гиперплазию в органах-мишенях и предотвращать тем самым появление злокачественных новообразований. Еще одна особенность онкохимиопрофилактики заключается в том, что препарат, назначаемый с профилактической целью, как правило, предусматривает очень длительные (иногда даже пожизненные) курсы лечения. А это возлагает определенные требования к самим химиопрофилактическим средствам (минимальная токсичность и т.д.).
Таким образом, актуальность исследования обусловлена необходимостью разработки новых лекарственных препаратов для проведения специфической химиопрофилактики.
Цель исследования
Определение новых молекулярных маркеров и ключевых механизмов раннего канцерогенеза в органах репродуктивной системы человека и способов их коррекции.
Задачи исследования
-
Определить природные соединения, обладающие фармакологической активностью в отношении механизмов раннего канцерогенеза.
-
Предложить перспективные прототипы лекарственных форм дииндолилметана (DIM) и эпигаллокатехина 3-галлата (EGCG) и определить их общую и специфическую токсичность.
-
Изучить механизмы влияния отобранных соединений на процессы раннего канцерогенеза (гормональный канцерогенез, эпигенетические нарушения и баланс факторов роста).
-
Определить активность соединений-кандидатов в отношении клеток линий злокачественных опухолей in vitro, а также на моделях канцерогенеза в органах репродуктивной системы in vivo.
-
Определить значимость различных механизмов раннего канцерогенеза в органах репродуктивной системы человека.
-
Установить терапевтическую эффективность перспективных прототипов лекарственных форм DIM и EGCG в отношении предраковых и фоновых заболеваний органов репродуктивной системы человека.
-
Обосновать применение перспективных мультитаргетных препаратов для онкохимиопрофилактики злокачественных опухолей репродуктивной системы человека.
Положения, выносимые на защиту
-
Перспективные прототипы лекарственных форм DIM и EGCG обладают низкой общей и специфической токсичностью при применении как у лабораторных животных, так и у человека.
-
DIM in vitro проявляет сходную подавляющую активность в отношении как гормон-зависимых, так и гормон-независимых клеточных линий рака простаты.
-
DIM in vivo проявляет ингибирующий эффект в отношении гистондеацетилазы, нормализует метаболизм эстрогенов, снижает туморогенность и тормозит рост ксенографтов опухолей линий рака простаты человека.
-
EGCG in vivo способствует деметилированию генов-онкосупрессоров.
-
Перспективный прототип лекарственной формы DIM обладает терапевтической эффективностью на ранних стадиях канцерогенеза
в предстательной железе и способствует обратному развитию гиперпластических и предраковых процессов.
-
Лекарственная форма I3C обладает терапевтической эффективностью в отношении диспластических заболеваний молочной железы и состояний, ассоциированных с повышенным риском рака молочной железы.
-
Гиперпластические процессы и ранние стадии канцерогенеза в органах репродуктивной системы характеризуются комплексом молекулярно-генетических изменений, включающих в себя гормональную гиперстимуляцию, эпигенетическую блокаду генов-онкосупрессоров и активацию протоонкогенов, а также сдвиг баланса ростовых факторов и цитокинов в сторону стимулирующих пролиферацию, со снижением активности факторов, подавляющих пролиферацию.
Научная новизна
Роль механизмов гормонального канцерогенеза, метилирования генов-
онкосупрессоров и факторов роста в патогенезе гиперпластических заболеваний
и раннего канцерогенеза изучена и подтверждена на моделях их подавления in
vitro и in vivo. Выбраны природные соединения, обладающие наибольшим
потенциалом для создания лекарственных средств, направленных на подавление
гормонального канцерогенеза, метилирования генов-онкосупрессоров и
дисбаланса ростовых факторов. Получены данные, доказывающие
эффективность соединений индольного ряда и эпигаллокатехинов в отношении ранних стадий канцерогенеза у животных (на моделях с использованием эндометрия и шейки матки, а также на моделях перевиваемых опухолей линий рака простаты). Детально описана общая и специфическая токсичность перспективных прототипов лекарственных форм DIM и EGCG на лабораторных животных. Оценено влияние указанных соединений на ряд молекулярных
маркеров раннего канцерогенеза у человека (ростовые факторы в тканях
предстательной железы, метилирование генов-онкосупрессоров в эндометрии и
шейке матки, канцерогенные метаболиты эстрогенов при дисплазии молочной
железы). Получены данные о влиянии перспективных прототипов
лекарственных форм DIM и EGCG на гиперпластические процессы и ранние
стадии канцерогенеза в репродуктивных органах человека - при простатической
интраэпителиальной неоплазии, доброкачественной дисплазии молочной
железы, гиперплазии эндометрия и цервикальной интраэпителиальной
неоплазии. Сформулирована концепция раннего канцерогенеза в органах
репродуктивной системы и на ее основе предложены принципы
онкохимиопрофилактики.
Практическая значимость
Предложенная концепция раннего канцерогенеза в органах
репродуктивной системы может быть использована для проведения научных
исследований канцерогенеза и в других органах и тканях. Разработанные в
рамках работы принципы воздействия на патогенетические механизмы
процессов раннего канцерогенеза могут быть положены в основу выбора
будущих соединений-кандидатов в лекарственные средства. Результаты
исследования способов коррекции данных патогенетических механизмов могут
быть использованы для обоснования возможности онкохимиопрофилактики и
лечения гиперпластических процессов в органах репродуктивной системы.
Отобранные соединения-кандидаты и их лекарственные формы могут быть
использованы для создания лекарственных средств для лечения
гиперпластических и неопластических заболеваний органов репродуктивной системы.
Методология и методы диссертационного исследования
Для решения поставленных задач был использован комплекс
экспериментальных и клинических методов исследования. В
экспериментальных исследованиях in vitro применены методы культивирования
клеточных культур. В экспериментальных исследованиях in vivo применены
токсикологические методы исследования на органном, системном и
организменном уровнях, и методы моделирования патологических процессов
канцерогенеза у лабораторных животных. В клинических исследованиях
применены лабораторные и инструментальные методы для изучения изменений
эпигенетической регуляции, метаболизма, тканевого гомеостаза и
морфологического строения тканей на фоне интервенционных воздействий на патогенетические механизмы канцерогенеза.
Апробация работы
Результаты работы изложены на Юбилейном Всероссийском конгрессе с международным участием «Амбулаторно-поликлиническая помощь – в эпицентре женского здоровья» (Москва, 2014) и Всероссийской Байкальской Научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы современной медицины» (Иркутск, 2014), XIII молодёжной международной научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Наука XXI века: новый подход» (Санкт-Петербург, 2015) и на Международной научной конференции «Клиническая и профилактическая медицина: опыт и новые открытия»(Москва, 2015), на заседании кафедры общей патологии и патологической физиологии имени В.А. Фролова медицинского института РУДН, 2017 г.
Публикации
По тематике диссертации опубликовано 36 научных работ, в том числе 27 статей в периодических изданиях, рекомендуемых ВАК министерства образования и науки РФ для публикации основных результатов диссертаций на соискание учёной степени доктора наук. 6 статей опубликовано в международных изданиях, индексируемых в библиографических базах данных Scopus и Medline. Получены патенты Российской Федерации: 2 патента на изобретения и 1 патент на полезную модель.
Внедрение результатов работы в практику
Результаты исследований включены в учебный процесс на кафедре общей
патологии патологической физиологии имени В.А. Фролова Медицинского
института РУДН. Данные, полученные при проведении доклинических
исследований безопасности и эффективности препаратов Инфемин
(дииндолилметан) и Каспазол (эпигаллокатехин), включены в соответствующие разделы досье препаратов. Данные клинического исследования препарата ИндинолФорто (индолкарбинол) включены в отчет о клинических исследованиях. Получено разрешение на использование лекарственного средства в медицинской практике: ИндинолФорто, Регистрационное удостоверение Минздрава РФ № ЛП-002010 от20.02.2013 г.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 218 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований и их обсуждения, представленных в 6 главах, выводов, практических рекомендаций, библиографического указателя литературы, включающего 44 отечественных и 283 иностранных научных источников. Диссертация иллюстрирована 61 таблицей и 6 рисунками.
Эпигенетика
Фоновые (доброкачественные) процессы шейки матки составляют 80-90% случаев всех патологий шейки матки, соответственно 10-20% приходится на предраковые и злокачественные заболевания этого органа. Доброкачественные заболевания шейки матки сопровождаются нарушением системы защиты организма и развитием системной патологии в виде очаговых пролиферативных изменений. К фоновым заболеваниям относятся истинные эрозии, эктопии, эндометриоз, цервициты. К предопухолевым поражениям относят плоскоклеточную гиперплазию и дисплазию – цервикальную интраэпителиальную неоплазию (CIN). По степени утяжеления неоплазии выделяют три степени CIN: легкая (CIN I), средняя (CIN II) и тяжелая (CIN III). Также выделяют преинвазивный рак – cаrcinoma in situ (CIS). Важно подеркнть, что данная классификация отражает этапность канцерогенеза при развитии патологических процессов шейки матки. В связи с этим изучение доброкачественных и предраковых заболеваний имеет большое значение в профилактике РШМ. РШМ оставался ведущей причиной смерти от рака среди женщин до широкого внедрения Pap-теста (мазка Папаниколау), позволяющего идентифицировать высокодифференцированные предраковые изменения. Учитывая, что одним из самых важных этиологических факторов являются инфекции, передаваемые половым путем, и особенно ВПЧ, в настоящее время ВПЧ-ориентированная модель цервикального канцерогенеза постепенно замещает старые морфологические модели, основанные только на цитологии и гистологии [Villa L.L., 2006]. Большинство случаев инфицирования ВПЧ носит кратковременный характер. Через 1-2 года после заражения происходит спонтанное выздоровление, в то время как у некоторых женщин инфекция сохраняется и прогрессирует до РШМ. Заболеваемость тяжелой формой цервикальной интраэпителиальной неоплазии (CIN 3) составляет около 1-2 случаев на 10 женщин с CIN 1. При отсутствии лечения примерно треть случаев прогрессирует в РШМ [Trottier H., 2006; Gravitt P.E. 2011] Следовательно, преимуществами раннего воздействия на предраковые новообразования является возможность свести к минимуму случаи развития РШМ.
Кроме того, следует учитывать, что приблизительно у 35% женщин с диагнозом РШМ, прошедших курс химиотерапии, возникает рецидив заболевания, причем у 90% из них – в течение трех лет после стартовой терапии [Pectasides D., 2008]. Подобная статистика показывает актуальность поиска субстанций и препаратов, позволяющих предотвратить рецидив заболевания.
Женщины с такими доброкачественными гинекологическими заболеваниями, как миома матки (лейомиома) и эндометриоз, могут иметь повышенный риск развития злокачественных опухолей. Тем не менее, не всегда удается оценить связь между РЭ и предшествующими гинекологическими заболеваниями. Трудность интерпретации связана с тем, что многие случаи эндометриоза или лейомиомы не выявляются, особенно когда протекают бессимптомно. В других случаях пациентки могут подвергнуться гистерэктомии и/или удалению этих доброкачественных опухолей, тем самым устраняя и будущий риск развития рака [Brinton L.A., 2005].
Лейомиома встречается у 70% женщин до 50 лет [Day B.D., 2003]. Согласно современным исследованиям, женщины с миомой матки подвергаются повышенному риску развития РЭ. Более тщательный мониторинг женщин с миомой в период пременопаузы может иметь важное значение для раннего выявления РЭ [Verit F.F., 2013]. Cогласно литературным данным, риск злокачественных преобразований, в результате которых из доброкачественной лейомиомы может развиться саркома матки, составляет всего 0,13-0,81% [Adewuyi S. A., 2010].
Частота эндометриоза колеблется от 7 до 15% у женщин репродуктивного возраста [Varma R., 2004]. Связи между эндометриозом, воспалительными заболеваниями органов малого таза, внутриутробными инфекциями и РЭ обнаружено не было [Rowlands I.J., 2011]. Однако во многих исследованиях подтверждено, что эндометриоз приводит к увеличению риска развития РЯ на 50%. Скрининг пациенток с эндометриозом с целью профилактики РЯ в настоящее время не оправдан [Pearce C. L. 2012].
Между нормальной тканью эндометрия и патологической эндометриоидной тканью наблюдаются различия не только на гистологическом уровне, но и на молекулярном. В патологической ткани наблюдаются структурные модификации, аномальная пролиферация, изменение состояния компонентов иммунной системы, нарушение производства стероидов и цитокинов, экспрессии генов и продукции адгезионных молекул [Shubina A.N., 2013]. Классические методы лечения эндометриоза приводят к неблагоприятным побочным эффектам: вазомоторным симптомам, подавлению репродуктивной функции, негативному влиянию на качество жизни, а также рецидивам после отмены терапии. Действие современных препаратов направлено на снижение эстрогенной активности, усиление прогестагенной и антипролиферативной активности [Moore C., 1999] и блокирование других патогенетических каскадов, оказывая противовоспалительное, антиангиогенное и проапоптотическое действие. Активно обсуждаются и разрабатываются новые методы лечения эндометриоза, которые позволят предотвратить или уменьшить побочные эффекты. Особое внимание уделяется препаратам, позволяющим модулировать молекулярные изменения, лежащие в основе эндометриоза.
Лабораторные животные и их содержание
Кровь у животных отбиралась натощак. В рамках гематологических исследований у животных определялись: содержание гемоглобина в крови, гематокрит, содержание эритроцитов, ретикулоцитов, тромбоцитов, лейкоцитов, лейкограмма (лейкоцитарная формула), СОЭ.
В рамках биохимических исследований крови у животных определялись: общий белок, щелочная фосфатаза, аланинаминотрансфераза (АЛТ), аспартатаминотрансфераза (АСТ), лактатдегидрогеназа, щелочная фосфатаза, глюкоза, мочевина, креатинин, холестерин, общие липиды, билирубин, калий, натрий, кальций.
При выполнении общего анализа мочи определялись: плотность, реакция (pH), проводилась микроскопия осадка, наличие белка, глюкозы, кетоновых тел, желчных пигментов.
Гексеналовая проба. Детоксицирующая функция печени определялась по длительности гексеналового сна. Крысе внутрибрюшинно вводился 2% р-р гексенала в дозировке 90 мкл/кг. Регистрировалось время наступления сна (по переходу в боковое положение) и пробуждения (вставание).
Офтальмологическое исследование предусматривало осмотр слизистых оболочек, определение роговичных рефлексов, измерение величины зрачка и ширины глазной щели.
Измерение артериального давления и запись ЭКГ. Крыс помещали в специальные пеналы. АД регистрировали у крыс на хвосте с помощью пьезoэлектрического датчика и манжетки. Определение ректальной температуры делалось с помощью электрическoго медицинскoго термoметра ТПЭМ-1 (точность ±1%). Исследования аллергизирующего действия препаратов проводились на 3 группах морских свинок по 6 животных, которые получали две дозы препарата или воду (в контрольной группе). Введение препарата осуществлялось внутрижелудочно в течение 5 дней.
Для проведения реакции иммунных комплексов через 10 суток после последнего введения препарата внутрикожно вводили его разрешающую дозу. Эту дозу определяли на интактных животных с наибольшим разведением препарата, не вызывающим видимых изменений в коже через час после внутрикожной инъекции. В контроле вводили растворитель. Учет степени реакции происходил визуально через полчаса пoсле введения разрешающей дозы.
Кoнъюнктивальная проба проводилась также через 10 дней от окончания введения препарата. Для этого препарат в разведении 1:10 закапывался в конъюнктивальный мешок под верхним веком. Для контроля в другой глаз закапывался физраствор. Учет проводился визуально через 15 минут.
Для оценки реакции общей анафилаксии через 30 дней от окoнчания введения препарата внутрибрюшинно животным вводилась разрешающая доза препарата. Оценку анафилаксии осуществляли в индексе по Weigle [Weigle W.O., 1960]: при гибели всех животных в группе индекс Weigle составляет 4(++++). При тяжелом шоке – 3(+++), при умеренном шоке – 2(++), при слабом шоке – 1(+), при отсутствии анафилактоидных реакций у морских свинок – индекс равен 0. Для oценки реакции непрямoй дегрануляции тучных клетoк через 10 дней от начала введения препарата отбиралась сыворотка крови. Полученная сыворотка использовалась для проведения эксперимента на тучных клетках крыс. Для этого крысам после эвтаназии вводили внутрибрюшинно 6-7 мл теплого раствора Тироле без глюкозы (37 градусов), затем делался массаж брюшной стенки, выполнялся разрез по средней линии, и собирался экссудат экссудат, стекающий из брюшной полости. Препараты готовились на предметных стеклах, которые были заранее прокрашены 0,3% р-ром нейтральнoго краснoго. Смешивалась взвесь тучных клеток (30 мкл) с сывороткой морской свинки, и раствора препарата. Далее препараты покрывали покровным стеклом и инкубировали 15 мин. при 37C. Препараты микроскопировали под увеличением x20. Оценку результатов проводили путем подсчета индекса дегрануляции тучных клеток: ИДТК = (a + 2 b + 3 c + 3 d) / 100, где: a, b, c, d - число дегранулирoвавших клетoк с разной степенью дегрануляции (слабoвыраженной, умереннoй, резкoвыраженной и полностью дегранулированных клетщк). Если ИДТК превышал 0,2, то реакция считалась положительной.
Токсикологические исследования прототипов лекарственных форм
Некропсия была проведена после окончания эксперимента. Определение массовых коэффициентаов органов (отношение массы органа к массе тела) у белых крыс из всех экспериментальных групп не выявтло каких-либо межгрупповых отличий.
Ниже представлены общие данные некропсии крыс из каждой группы, поскольку макроскопическое исследование органов животных различий межгрупповых различий не обнаружило.
Шерсть опрятная, без очагов облысения. Выделений из естественных отверстий нет. Телосложение и конечности без изменений и деформаций. Зубы без видимых нарушений. Слизистые бледного цвета, блестящие и гладкие.
У самок молочные железы не содержали уплотнений. У самцов половые органы без видимых нарушений.
Брюшная, грудная полости не содержат выпотов. Нормальное положение внутренних органов. Плевра, брюшина и перикард гладкие и блестящие.
Подчелюстные лимфоузлы и слюнные железы розовато-беловатого цвета, округлой овальной формы и умеренно плотной консистенции.
Щитовидная железа умеренно плотноватой консистенции, к гортани прилежит плотно; нормальной величины и формы. Ткань на разрезе розоватого цвета. Тимус беловатого цвета, треугольной формы, плотноватой консистенции.
Аорта имела гладкую, блестящую, беловатую интиму; сужений просвета нет. Величина и форма сердца обычные. Мышца сердца коричневатой окраски, умеренно плотная. Клапаны сердца имели гладкую, блестящую окраску, без утолщений. Полости сердца содержали небoльшое кoличество жидкoй крoви.
При вскрытии грудной полости легкие спадаются. Их форма и величина нормальные, поверхность однородной бледно-розовой окраски, на ощупь ткань воздушная. Трахея и крупные бронхи имеют равномерный просвет, без сужений, цвет слизистой бледно-розовый, блестящий.
Слизистая пищевода гладкая и блестящая. Желудок обычных размеров с пищевым содержимым внутри. Слизистая желудка розоватого цвета, складчатая, бе признаков гиперемии и раздражения. Цвет слизистой оболочки тонкой кишки – розоватый, поверхность гладкая и блестящая. Признаков раздражающего действия исследуемого препарата (гиперемии, эрозий и кровоизлияний) не было.
Цвет слизистой оболочки 12-перстной кишки – розоватый, поверхность гладкая и блестящая, просвет без изменений. Цвет слизистой оболочки тонкой кишки – розоватый, поверхность гладкая и блестящая. Слизистая толстой кишки также гладкая, блестящая, сероватого цвета.
Печень нормальной форма и величины, умеренно полнокровная, с гладкой и однородной поверхностью темно-красного цвета и ткой же окраски на разрезе. Печеночная капсула тонкая и прозрачная. Ткань печени имеет обычную консистенцию и плотность.
Поджелудочная железа дольчатого строения, нормальной формы и величины, ткань ее бледно-розовая, имеет плотноватую консистенцию.
Селезенка нормальной формы и величины. Ткань темно-вишневого цвета и плотной консистенции, поверхность гладкая, консистенция плотноватая. На разрезе ткани заметны мелкoклеточные фолликулы сероватой окраски.
Почки нормальной формы и величины. Капсула почек снимается легко, поверхность коричневато-сероватого цвета, гладкая, однородная. Корковое и мозговое вещество при разрезе почек хорошо различимо. Консистенция ткани почек умеренно плотная. Надпочечники были беловатого цвета, округлой формы, нормальной величины и умеренно плотные. Мозговое вещество надпочечников отчетливо выделялось на разрезе, имело темно-коричневый цвет.
Мочевой пузырь: слизистая оболочка бледная, гладкая и блестящая. В просвете прозрачная, светлая моча.
У самок яичники красноватого цвета, умеренно плотные, с неровной поверхностью. Матка умеренно плотная, обычной формы и размера, ткань темно-красной окраски. У самцов яички беловатого цвета, округлые и гладкие. Оболочки головного мозга тонкие, гладкие и блестящие. При фронтальном разрезе мозга расширения желудочков нет. Ткань мозга плотноватая, поверхность гладкая. Итак, по результатам некрoпсии ежедневное внутрижелудочное введение Инфемина в 3 дозах 90 дней не вызывает у крыс обоего пола раздражения либо вoспаления ЖКТ, и не вызывает макроскопических изменений внутренних органов.
Можно сделать заключение, что применение Инфемина у половозрелых крыс в течение 90 дней в дозировках до1000 мг/кг не оказывает влияние на биохимические показатели крови и oсновные физиoлогические параметры oрганизма, а также не приводит к патоморфологическим изменениям, что что позволяет сделать вывод о приемлемом профиле доклинической безопасности препарата [Друх В.М., 2013].
Влияние соединений индольного ряда на гормональные механизмы раннего канцерогенеза
У мышей в опытной группе наблюдается увеличение соотношения 2-ОНЕ1/16-ОНЕ1, тогда как в контрольной группе оно не меняется. По окончании эксперимента соотношение 2-ОНЕ1/16-ОНЕ1 в экспериментальной группе выросло до 3,8±0,91, тогда как в контрольной оно осталось столь же низким, как и до начала эксперимента – 0,84±0,36. Увеличение относительного уровня метаболита 2-ОНЕ1 (не обладающего канцерогенным действием) в группе мышей, получающих DIM, свидетельствует о благоприятном изменении метаболизма эстрогенов. Полученные нами результаты позволяют доказать в качестве значимого механизма действия DIM в отношении торможения роста ксенографтов опухолей влияние на метаболизм эстрогенов и эстрогеновую регуляцию пролиферации путем стимуляции преимущественного образования 2-ОНЕ1, обладающего антипролиферативным действием.
Эксперименты состояли из проверки прямого противоопухолевого действия на ранних стадиях развития злокачественного новообразования и проверки влияния на туморогенность опухолевых клеток линии рака простаты человека. В работе использовались клетки рака простаты человека CRL-1740 (LNCaP) и CRL-1435 (PC-3). После окончания периода карантина и разделения на группы животным подкожно перевивали клетки линий рака простаты. В исследовании влияния Инфемина на ксенографты опухолей через 3 дня после имплантации раковых клеток животных разделяли на 4 экспериментальных группы, по 30 животных в каждой, и начинали лечение исследуемым препаратом (контрольные группы получали плацебо) [Kiselev V.I., 2014].
Как было установлено, с 31 по 42 дни после перевивки препарат оказывал выраженный противоопухолевый эффект на развитие рака простаты человека CRL-1740 (LNCaP); значение торможения роста опухоли в группе, получавшей Инфемин, по сравнению с контрольной группой на 31-42 дни составляло 55,5% и 16,9% (таблица 52). Данные отличия были статистически значимы.
В эксперименте с линией CRL-1435 (PC-3) также было установлено (см. таблицу 53), что с 33 по 42 дни после перевивки препарат оказывал выраженный противоопухолевый эффект на развитие рака простаты человека CRL-1435 (PC-3); значение торможения роста опухоли в группе Инфемин по сравнению с контрольной группой на 33-42 дни составляло 69,3% и 26,0%. Данные отличия были статистически значимы.
Противоопухолевое воздействие препарата отразилось также на продолжительности жизни экспериментальных животных. Средняя продолжительность жизни мышей контрольной группы с перевитыми опухолевыми клетками рака простаты человека CRL-1740 (LNCaP) составила 30,4 дня. Введение препарата Инфемин также статистически значимо увеличило продолжительность жизни у мышей (до 67,8 дней), при этом процент увеличения продолжительности жизни по сравнению с контролем составил 123%. Средняя продолжительность жизни мышей контрольной группы с перевитыми опухолевыми клетками линии рака простаты человека CRL-1435 (PC-3) составила 30,1 дня. Введение препарата Инфемин значимо увеличило продолжительность жизни у мышей (до 64,8 дней), при этом процент увеличения продолжительности жизни по сравнению с контролем составил 115%.
В исследовании влияния препарата на туморогенность клеток опухолей в день имплантации раковых клеток животных разделяли на 4 экспериментальных группы, по 20 животных в каждой, и начинали лечение исследуемым препаратом по аналогичной схеме, но при этом использовалась в два раза уменьшенная прививочная доза клеток – 2,5х106 клеток. Частота образования опухолей в опытной и контрольной группах в эксперименте по изучению влияния Инфемина на туморогенность опухолевых клеток представлена в таблице 54.
Влияние препарата Инфемин на частоту имплантации опухолей рака простаты человека при перевивке у мышей Линия клеток Прививочная доза Интервенция Количествомышей спальпируемойопухолью Частотаимплантацииопухолей CRL-1740 (LNcaP) 2,5x106 клеток растворитель 18 90,0 % 2,5x106 клеток Инфемин, 133 мг/кг 11 55,0 % 145 CRL-1435 (PC-3) 2,5x106 клеток растворитель 19 95,0 % 2,5x106 клеток Инфемин, 133 мг/кг 13 65,0 % — значимые отличия от контроля (p 0.05 по критерию хи-квадрат)
Полученные результаты указывают на способность препарата Инфемин снижать туморогенность клеток линий рака простаты человека CRL-1740 (LNCaP) и CRL-1435 (PC-3). Частота образования опухолей снижается на 30-35%. Таким образом, в результате проведенных исследований можно сделать следующие основные выводы:
1. Инфемин обладает способностью снижать туморогенность клеток линий рака простаты человека.
2. Инфемин проявляет выраженное противоопухолевое действие in vivo и тормозит рост опухолевых клеток рака простаты человека у мышей, что проявилось в достоверном увеличении продолжительности жизни, а также в торможении роста опухоли.
3. Данные эффекты не зависят от наличия либо отсутствия гормончувствительности клеток, что свидетельствует о том, что в подавлении туморогенности не задействованы гормональные механизмы.
Необходимо подчеркнуть, что аналогичные результаты по подавлению роста ксенографтов опухолей были получены и отношении клеточных линий рака эндометрия [Киселев В.И., 2014].
Для экспериментов были использованы клетки линий рака простаты крысы CRL-2376 (MAT-Ly-Lu) и рака простаты человека CRL-1740 (LNCaP) и CRL-1435 (PC-3). Выживаемость опухолевых клеток после 48 часов инкубации с препаратом оценивали с помощью МТТ-теста, выражая в процентах от соответствующего контроля.
Было проведено пять независимых экспериментов. Одна точка в эксперименте представляла собой среднюю величину из пяти параллельных измерений. Величину IC50 определяли по графику зависимости остаточной выживаемости клеток (процент живых клеток относительно контроля) от концентрации DIM. Для этой цели был проведен регрессионный анализ и получено уравнение экспоненциальной регрессии, описывающее экспоненциальную линии тренда путем расчета точек методом наименьших квадратов. Полученное уравнение использовалось для расчета IC50. Графики зависимости выживаемости клеток от концентрации препарата представлены на рисунках 2-4.