Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1 Боковой амиотрофический склероз, общая информация 11
1.2 Клинические признаки и диагностика БАС 12
1.3 Генетика бокового амиотрофического склероза 14
1.3.1 БАС-ассоциированные мутации 15
1.3.2 Дополнительные генетические факторы бокового амиотрофического склероза 20
1.3.3 Генетические риски развития бокового амиотрофического склероза 22
1.4. Патологические включения при боковом амиотрофическом склерозе 23
1.5 Патогенетические механизмы БАС 27
1.5.1 Гибель мотонейронов 28
1.5.1 Белок SOD1 29
1.5.2 Белок TDP-43 31
1.5.3 Локус C9ORF72 34
1.5.4 Белок FUS 37
2. Материалы и методы исследования 48
2.1 Работа с животными 48
2.1.1 Линии лабораторных мышей 48
2.1.2 Манипуляции с ранними эмбрионами и хирургические процедуры на мышах 48
2.1.3 Инструментальные методы анализа двигательной функции мышей 50
2.2 Молекулярно-биологические методы 51
2.2.1 Трансгенноая кассета 51
2.2.3 Введение трансгена в геном мыши 51
2.2.4 Детекция трансгенной кассеты в геноме мыши 52
2.3 Биохимические методы 53
2.3.1 Анализ ДНК в агарозном геле 53
2.3.2 Экстракция белков 53
2.3.3 Денатурирующий гель-электрофорез по Леммли 54
2.3.4 Иммуноблоттинг 54
2.4 Гистологический анализ 55
2.4.1 Подготовка тканей и приготовление срезов. 55
2.4.2 Окраска по методу Ниссля 56
2.4.3 Иммуногистохимическое окрашивание 57
2.4.4 Стереологический подсчет нейронов 58
2.5 Статистичекая обработка данных 60
3 Результаты исследования и обсуждение 61
3.1 Получение линии трансгенных мышей Thy-1/FUS 1-359 и их общая фенотипическая характеристика 61
3.1.1 Трансгенная кассета и модификация генома мыши. 63
3.1.2 Биохимический анализ результатов трансгенеза в линии мышей Thy-1/FUS 1-359 65
3.1.3 Генетический фон линии мышей Thy-1/FUS 1-359 68
3.1.4 Фенотипический анализ мышей линии Thy-1/FUS 1-359 70
3.2 Патогистологическая характеристика FUSопатии в спинном мозге мышей линии Thy-1/FUS 1-359 76
3.3 Исследование динамики дегенерации и гибели двигательных нейронов спинного мозга у THY-1/FUS 1-359 мышей. 82
3.4 Анализ миелинированных фибрилл в передних и задних
корешках спинного мозга Thy-1/FUS 1-359 мышей 91
3.5 Анализ уровня нейротрофического фактора BDNF 97
3.6 Манифестация клинических признаков прогрессии
нейродегенеративного процесса у мышей линии THY-1/FUS 1-359.
100
3.7 Анализ некоторых показателей регенеративного процесса в спинном мозге мышей линии Thy-1/FUS 1-359 106
Выводы 110
Практические рекомендации 111
Список работ, опубликованных по теме диссертации 112
Список использованной литературы 116
- БАС-ассоциированные мутации
- Инструментальные методы анализа двигательной функции мышей
- Иммуногистохимическое окрашивание
- Фенотипический анализ мышей линии Thy-1/FUS 1-359
Введение к работе
Актуальность исследования. Боковой амиотрофический склероз (БАС)
является третьим по частоте встречаемости нейродегенеративным
заболеванием в мире с частотой возникновения 1,5-2,5 на 100 000 в год.
Непосредственные молекулярные механизмы, лежащие в основе
патологических процессов, ведущих к селективной гибели двигательных
нейронов, остаются недостаточно изученными. Это является главной
причиной отсутствия прогресса в разработке эффективных методов лечения
бокового амиотрофического склероза. тяжелого летального заболевания
нервной системы. Актуальной задачей до настоящего времени остается
создание адекватных животных моделей, в которых возможно
воспроизведение основных характеристик патогенеза БАС и выявление
ключевых молекулярных мишеней для разработки патогенетической
терапии данного заболевания. Полученные в различных лабораториях
данные о возможном участии ДНК/РНК-связывающего белка FUS в
патогенезе БАС послужили основой для создания гипотезы о его важной
роли в патологических механизмах избирательного повреждения
двигательных нейронов. Эта гипотеза требовала прямых
экспериментальных доказательств. Mоделирование FUSопатии, которая
приводит к развитию у трансгенных животных фенотипа,
воспроизведящего основные патогенетические признаки БАС, является наиболее убедительным методом доказательства ключевой роли белка FUS в инициации и прогрессии патологического процесса, характерного для данного заболевания. Именно эта актуальная задача и была выбрана для диссертационного исследования.
Цель работы и основные задачи исследования. Целью данной работы являлось получение экспериментальных доказательств того, что направленное нарушение структуры и функции белка FUS, приводящее к
развитию FUSопатии, может быть достаточным для воспроизведения патогенетической цепи событий, приводящей к селективной гибели двигательных нейронов. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
-
Получить линию трансгенных мышей с нейроспецифической эктопической экспрессией аберрантной формы белка FUS человека;
-
Охарактеризовать прогрессию FUSопатии, вызванную эктопической экспрессией аберрантной формы FUS человека;
-
Провести анализ динамики нейродегенеративного процесса в спинном мозге трансгенных мышей;
-
Описать клинические проявления и особенности течения модельного заболевания, вызванного прогрессией FUSопатии у трансгенных мышей. Научная новизна работы. Недавно проведенные широкомасштабные медико-генетические исследования позволили выявить мутации в ДНК/РНК-связывающих белках FUS и TDP-43, которые ассоциированы с рядом наследственных форм БАС. Изучение патологии метаболизма РНК, в регуляцию которого вовлечены белки FUS и TDP-43, является в настоящий момент центральным предметом многочисленных исследований молекулярных механизмов специфического поражения двигательных нейронов, однако прямые доказательства их причинной роли отсутствовали. В данной диссертационной работе впервые получены прямые доказательства центральной роли FUSопатии в развитии нейродегенеративного процесса, характеризующегося специфической потерей двигательных нейронов. Создана первая модельная линия трансгенных мышей, в которых эктопическая экспрессия укороченной формы белка FUS человека 1-359 позволила воспроизвести классическую FUSопатию. Впервые экспериментально доказано, что прогрессия FUSопатии у Thy-1/FUS 1-359 мышей вызывает развитие нейродегенеративного процесса с селективной потерей двигательных
нейронов, то есть путем экспрессии аберрантной формы белка FUS, без участия каких-либо других патогенных факторов, удалось воспроизвести в лабораторных мышах основные патогенетические признаки БАС. Получены новые данные, позволяющие рассматривать образование аберантной укороченной формы белка FUS в качестве оригинальной молекулярной мишени для разработки патофизиологической терапии определенных форм БАС.
Tеоретическая и практическая значимость. Воспроизведение основных
характеристик БАС в трансгенных модельных животных позволяет
расширить возможности изучения патогенеза заболевания и
оптимизировать разработку методов его коррекции. Данное
диссертационное исследование, результатом которого явилась разработка и
характеристика животной трансгенной модели БАС, существенно
расширило современные представления о патогенезе и осбенностях
прогрессии тех форм БАС, где на первый план выступает нарушение
структуры и функции белка FUS. Теоретическая значимость полученных
результатов заключается в первую очередь в доказательстве положения, что
нарушение функции одного лишь белка FUS, приводящее к развитию
FUSопатии, достаточно для инициации и воспроизведения всей
патогенетической цепи, заканчивающейся селективной гибелью
двигательных нейронов. Практическую ценность представляет получение линии трансгенных мышей Thy-1/FUS 1-359, которая может быть использована для разработки и тестирования новых соединений, действие которых направлено на коррекцию нарушенной функции белка FUS.
Положения, выносимые на защиту.
1. Получены прямые доказательства центральной роли FUSопатии в
развитии нейродегенеративного процесса, характеризующегося
специфической потерей двигательных нейронов.
-
Создана модельная линия трансгенных мышей, у которых путем нейроспецифической экспрессии укороченной формы белка FUS человека с удаленным сигналом ядерной локализации и нарушенным сайтом РНК-связывания индуцирована классическая FUSопатия.
-
У созданной линии трансгенных мышей Thy-1/FUS 1-359 описано модельное заболевание, воспроизводящее основные клинические и патогистологические характеристики БАС.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены: на V Всероссийском с международным участием медико-биологическом конгрессе молодых ученых «Симбиоз-Россия 2012» (Тверь, Россия, 2012), на XIX межгородской конференции молодых учёных «Актуальные проблемы патофизиологии – 2013» (Санкт-Петербург, Россия, 2013), на 17-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых, (Пущино, Россия, 2013), на I Национальной конференция с международным участием «От фундаментальной неврологической науки к клинике» (Москва, Россия, 2014), на Международной молодежной научной конференции "Современные проблемы генетики, клеточной биологии и биотехнологии" (Томск, Россия, 2014), на 3 европейской конференции по медицинским и биологическим наукам (Вена, Австрия, 2014), на 14 конгрессе по неврологии Азии и Океании (AOCN 2014) (Макао, Китай, 2014).
Публикации и личный вклад автора. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 5 статей и 7 публикаций в сборниках докладов научных конференций. Личный вклад автора заключается в участии в разработке научного плана исследования, непосредственном получении основных экспериментальных результатов и их интерпретации. Автор принимал непосредственное участие на всех этапах работ, сделанных в соавторстве с другими исследователями и участвовал в написании научных публикаций, в которые вошли данные его диссертации.
Структура и объём работы. Диссертация содержит: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы и библиографический указатель, включающий работы на русском (20) и иностранных языках (260). Диссертация изложена на 159 страницах машинописного текста и содержит 3 таблицы и 30 рисунков.
БАС-ассоциированные мутации
Так же, как и для TARDBR, мутации в гене FUS выявлены только у 4% больных с наследственными формами и в 1% спорадических случаев. Большая часть этих мутаций имеет доминантный тип наследования, исключением является редкая рецессивная мутация G517Q [Kwiatkowski T.J., Jr. et al., 2009]. У пациентов с FUS-БАС в первую очередь развиваются симптомы поражения нижних мотонейронов, а также бульбарный синдром. Для данной формы характерен ранний дебют и быстрая прогрессия заболевания [Al-Chalabi A. et al., 2013]. Примечательно, что было описано несколько случаев БАС c ювенильным дебютом, ассоциированных мутациями в гене FUS [Baumer D. et al., 2010]. Кроме FUS и TDP-43 существуют и другие РНК-связывающие белки, аберрантные формы которых могут быть вовлечены в патогенез БАС. В 2013 году были обнаружены мутации в областях, кодирующих прионоподобные домены белков hnRNPa1 и hnRNPa2b1, которые могут являться причиной развития мультисистемной протеинопатии и БАС [Kim H.J. et al., 2013]. В 2014 были обнаружены БАС-ассоциированные мутации в гене MATR3, кодирующем другой РНК-связывающий белок matrin-3 [Johnson J.O. et al., 2014]. Совсем недавно были выявлены точечные мутации в гене GLE1, кодирующем общий фактор процессинга мРНК hGle1 [Kaneb H.M. et al., 2015], которые также были аасоциированы с БАС. Эти данные послужили основой для выдвижения гипотезы, согласно которой нарушениям метаболизма мРНК могут отводилась центральная роль в патогенезе БАС. Выявление точных молекулярных механизмов патогенетических процессов является актуальным направлением современных биомедицинских исследований. C9orf72. Открытием, по значимости сопоставимое с выявлением роли измененного метаболизма РНК, является идентификация экспансированного гексануклеотидного повтора в локусе C9orf72 у больных с БАС. В некоторых популяциях данная мутация ассоциирована примерно с 40% семейных форм и 7% всех всех спорадических форм [Majounie E. et al., 2012]. Примечательно, что мутации в генах, кодирующих белки SOD1, TDP-43 и FUS, приводят главным образом к развитию моторной дисфункции и редко сочетаются с ФТД [Huey E.D. et al., 2012] [Katz J.S. et al., 2012]. При данной же патологии, напротив, характерно развитие ФТЛД и БАС-ФТЛД [DeJesus-Hernandez M. et al., 2011], что дополнительно указывает на патогенетическую связь между этими двумя заболеваниями. Характерная GGGGCC (G4C2) последовательность в норме обычно представлена в виде 2-19 повторов, а у больных число таких повторов увеличивается и достигает 250-1500. Но даже относительно небольшое увеличение количества повторов до 20-22 уже может приводить к развитию заболевания [Gomezortosa E. et al., 2013]. Описаны случаи, когда у больных с БАС число повторов доходило до 2500-3000 [van Blitterswijk M. et al., 2013]. При том, что эти гексамерные последовательности не являются кодирующими, они транскрибируются. Транскрипция таких повторов приводит к образованию экспансированных РНК, что в свою очередь ведет к нарушению процессинга РНК [Renton A.E. et al., 2011].
Мутации в генах, кодирующих протeасомные белки, также могут приводить к развитию БАС, хотя доля таких случаев для семейных и спорадических форм БАС не превышает одного процента. Среди протеасомных белков подобные нарушения показаны для валозин-содержащего белка (VCP) [Johnson J.O. et al., 2010], оптинейрина (OPTN) [Maruyama H. et al., 2010], убиквитина 2 (UBQLN2) [Deng H.X. et al., 2011] и p62 [Teyssou E. et al., 2013]. Эти данные говорят о том, что нарушение внутриклеточных механизмов контролируемой деградации и утилизации белков может быть дополнительным патогенетическим фактором в механизмах развития БАС. Более того, недавние исследования в этой области показали, что мутации в гене TBK1, которые раннее связывали с повышенным риском развития БАС [Cirulli E.T. et al., 2015], могут играть роль этиологиекогого фактора для некоторых форм заболевания [Freischmidt A. et al., 2015]. Возникновение подобных мутаций приводят к тому, что измененная форма TANK–связывающей киназы 1 (TANK1) не способна взаимодействовать с оптинейрином, что в свою очередь ведет к нарушению каскада взаимодействий, лежащих в основе путей внутриклеточной утилизации белка.
Кроме того, существуют и другие гены, которые возможно играют определенную роль в патогенезе некоторых форм БАС. Так с ювенильными формами БАС ассоциированы мутации в генах, кодирующих белки профилин 1 (PFN1), необходимый для поддержания нормальной структуры цитоскелета [Wu C.H. et al., 2012], алсин [Hadano S. et al., 2001], спатаксин [Orlacchio A. et al., 2010], сенатаксин [Chen Y.Z. et al., 2004] и сигма неопиоидный рецептор первого типа (sigma 1) [Al-Saif A. et al., 2011]. Мутации в генах ELP3 [Simpson C.L. et al., 2009], FIG4 [Chow C.Y. et al., 2009], DCTN1 [Munch C. et al., 2004], VAPB [Nishimura A.L. et al., 2004], NEFH [Al-Chalabi A. et al., 1999], ANG [Greenway M.J. et al., 2006] and CHCHD10 [Bannwarth S. et al., 2014] так же были описаны для некоторых случаев БАС, однако их непосредственная роль в развитии патологии остается неясной и не доказанной. Помимо вышеописанных мутаций при широкомасштабном медико-генетическом скрининге больных с БАС были выявлены de novo мутации. В качестве примера таких мутаций можо привести нарушение структурной области генов, кодирующих хроматин-регулирующие белки, в том числе белок CREST [Chesi A. et al., 2013]. Однако причинная роль выявленных мутаций для подавляющего большинства случаев остается не доказанной, что стимулирует дальнейшие активные исследования в данной области.
Инструментальные методы анализа двигательной функции мышей
Анализ походки. Тестирование походки проводили в узком коридоре длиной 50 см. Непосредственно перед тестированием животных проводили несколько тренировочных пробежек. Затем на передние конечности мыши наносили синие, на задние – красные нетоксичные чернила (гуашь), выстилали дно коридора разленованной бумагой и осуществляли тестовую пробежку.
Тест «Вращающаяся платформа». Для оценки состояния двигательной функции животных и их способности к обучению двигательным навыкам использовали модифицированный вариант теста «вращающийся стержень». Вместо вращающегося валика на тестовом аппарате была установлена платформа размером 80455 мм, которая, вращалась с постоянной скоростью 10 об/мин. На предварительном этапе проводили адаптацию экспериментальных животных в возрасте 90 дней к вращающейся платформе, после чего проводили основное тестирование. Регистрировалась способность животного удерживаться на вращающейся платформе в течение 300 секунд в пяти повторениях. Для статистического обсчета использовали средние значения показателей.
Анализ мышечной силы передних конечностей. Количественную оценку мышечной силы животных проводили с помощью грипометра (Grip Strength Test). Силу хватки измеряли с помощью пружинного динамометра, соединенного с решеткой для захвата конечностями. Каждое животное тестировали 3 раза без предварительного обучения, для анализа использовали среднее значение показаний динамометра.
Трансгенная кассета содержала последовательность гена FUS человека, кодирующую укороченную форму белка с удаленными аминокислотам с 1-й по 359-ю, в составе плазмидного вектора 323-pTSC21k. Плазмидную ДНК получали из бактериальных культур.
Для трансформации компетентныe клетки E.coli DH5a подвергали тепловому шоку на водяной бане в течение 45 сек при 42С, помещали на лед и добавляли 750 мкл восстановительной среды SOC, инкубировали в течениe 1 часа при 37С и высевали на чашки Петри с 1,8% агаром на питательной LB средe. В качестве селективного агента использовали канамицин в конечной концентрации 50 мкг/мл. Инкубировали чашки в перевернутом положении в течение ночи при 37С. Отдельные колонии использовали для инокуляции жидкой LB среды (Invitrogen, США). Бактериальные культуры наращивали в инкубаторе-качалке (Biosan ES-20, Латвия) в течение ночи. Осаждали бактерии центрифугированием 10 минут при 4000хg при 4оС, осадки промывали холодным физраствором и выделяли плазмидную ДНК с помощью набора для выделения ДНК QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (Qiagen, Германия). Концентрацию ДНК определяли с помощью спектрофотометра NanoDrop ND 100. Плазмидную ДНК линеаризовали перевариванием с рестрикционной эндонуклеазой NotI в течение 1 часа при 37оС и очищали в агарозном геле и далее использовали для микроинъекций в пронуклеус.
Для микроинъекций в пронуклеус использовали раствор линеаризованной плазмидной ДНК в концентрации 5 нг/мкл. Рекомбинантную ДНК микроинъецировали в пронуклеус зигот мыши на стадии двух пронуклеусов. Ранние эмбрионы помещали в камеру, состоящую из двух покровных стекол. Стекла были закрепленны параллельно одно над другим. На микроскопе Axiovert 200 («Zeiss», Германия) пронуклеусы визуализировали с помощью DIC-оптики. Иглы для микроинъекции вытягивали из стеклянных капилляров G100 («Narishige», Япония) с помощью пуллера P97 (Shutter instruments, США). Из капилляров GD1 («Narishige», Япония) готовили держатель эмбрионов на пуллере pc-10 («Narishige», Япония) с использованием микрокузницы mf-900 («Narishige», Япония). Инъецированные эмбрионы инкубировали в атмосфере 5% СО2 при 37оС в течение 2 часов для восстановления. Выжившие эмбрионы с четко выраженной зоной Пелюцида пересаживали самкам-реципиентам от 8 до 12 эмбрионов на мышь в воронку яйцевода унилатерально.
Иммуногистохимическое окрашивание
Одной из главных задач, которую предполагается решать с помощью создания животных генетических моделей протеинопатий, является воспроизведение клинической картины моделируемого заболевания и установление взаимосвязи биохимических показателей патологической агрегации и формирования отложений в нейронах с клинической манифестатацией нейродегенеративного процесса и манифестацией симптомов моделируемого заболевания. FUSопатии активно изучаются и предпринимаются попытки их моделирования в животных [Vaccaro A. et al., 2012]. До сих пор не были получены успешные модели, основанные на экспрессии абберантной формы белка FUS. [Verbeeck C. et al., 2012b]. Поэтому необходимо было провести подробную характеристику манифестации клинических признаков прогрессии нейродегенеративного процесса у мышей линии Thy-1/FUS 1-359. Осмотр всех животных в контрольных и экспериментальных группах проводился еженедельно. Исследовалась подвижность каждой из конечностей, способность развернуться на перекладине, общая подвижность животного, регидность хвоста, клинические признаки. После регистрации первых внешних признаков развития неврологической симптоматики осмотр животного проводился ежедневно. При этом фиксировались длительность симптоматического периода, характеризовалась тяжесть его течения, регистрировалась дата смерти. В ряде случаев смерть животных наступала при отсутствии предварительных клинических симптомов, что объяснется стремительностью течения модельного заболевания, которое может длиться меньше, чем одну неделю.
Поскольку нами было показано, что развитие нейродегенеративного процесса у Thy-1/FUS 1-359 мышей связано с избирательной гибелью двигательных нейронов, то, как и ожидалось, на первый план выступали показатели нарушения моторных функций. На ранней стадии развития заболевания регестрировалось общее снижение двигательной активности, затем развивались прогрессирующие односторонние парезы передних и задних конечностей. Именно на этой стадии развития клинических признаков удавалось регистрировать изменение объективных показателей, полученных с применением инструментальных методов анализа. Модельное заболевание стремительно прогрессирует и в течения от двух до пяти дней в среднем моторная дисфункция выражается уже в параплегии конечностей, животные на этой стадии теряют способность самостоятельно передвигаться и самостоятельно питаться. На данном этапе происходило критическое снижение массы тела, обусловленное главным образом мышечной атрофией. Для последующей терминальной стадии модельного заболевания характерно развитие тетраплегии, полная утрата моторных фукций, ярко выраженная мышечная атрофия, а также паралич дыхательной мускулатуры. Из гуманных соображений на терминальной стадии заболевания животных подвергали медикаментозной эвтаназии.
Для оценки прогрессии модельного заболевания, состояния двигательной функции животных и их способности к обучению двигательным навыкам использовали теста «вращающаяся платформа». Этот тест был разработан нами для того, чтобы найти методы выявления нарушения показателей моторной функции до визуальной регистрации неврологической симптоматики у модельных животных. Чтобы определить, как время «удержания на вращающейся платформе» изменяется при развитии нейродегенерации в скрытых формах (пресимптоматическая стадия) был проведен ретроспективный анализ данных за последние 6 недель жизни для чего все тестируемые животные были синхронизированы относительно дня гибели, т.е. первым днем анализа являлся последний день жизни. Как видно из графика (Рисунок 27 А) на протяжении всего времени тестирования наблюдается непрерывное снижение показателя «длительность удержания на платформе». Особенно оно заметно между 21 и 7 днем до момента гибели животных. В качетсве критерия для определения наличия клинических симптомов был принято пороговое значение регистрируемого показателя на уровне половинных значений от нормы, это позволяет безошибочно определить наличие развитых симптомов у животного. Исследуемый показатель составляет половину от своих нормальных значений в среднем за 14 дней до гибели животных.
Анологичная схема анлиза была применена для оценки мышечной силы и выносливости с использованием теста «сила хватки» на грипометре. Все животные были также синхронизированы относительно последнего дня жизни, и строился обобщенный график для последних 35 дней. Как видно из графика (Рисунок 27Б) падение силовых показателей происходит неравномерно, с периодами подъема и спада, однако общий тренд на ухудшение силы хватки является очевидным. Значительное изменение данного показателя, так же, как и для теста «удержание на платформе», выявляется за 14 дней до гибели, когда сила хватки уменьшается по крайней мере в два раза в сравнении с первоночальными зачениями.
Фенотипический анализ мышей линии Thy-1/FUS 1-359
Средняя продолжительность симптоматической стадии заболевания, которая связана с регистрацией и постепенной прогрессией клинических симптомов у модельных животных составляет в среднем 7 дней. Таким образом, тесты «вращающаяся платформа» и «сила хватки» позволяют детектировать начало проявления паталогического процесса в среднем за 7 дней до манифестации клинических симптомов. Учитывая скоротечность заболевания, а также относительно небольшой возраст дебюта заболевания (в среднем 102 дня жизни) можно заключить, что описанные тесты могут использоваться при тестировании болезнь-модифицирующих препаратов и являются информативными. Относительная простота исполнения и легкость интерпритации получаемых результатов делает их удобными тестами, которые могут рутинно использоваться при проведении доклинических испытаний и оценки специфической активности нейропротекторных препаратов на данной модельной тест-системе.
Возраст начала симптоматической стадии и продолжительность симптоматической стадии модельного заболевания у трасгенных животных Thy-1/FUS 1-3 Фенотипические показатели Значение, дни Средний возраст начала симптоматики 102±4,64 Средняя длительность симптоматической стадии 6,8±2,33 Общее число обследованных животных Массовая гибель клеток нервной системы сопровождает развитие как острых, так и медленно-текущих нейродегенеративных заболеваний.
Перспективным направлением в поиске новых стратегий лечения ассоциированных с ними патологических процессов может быть изучение возможностей репарации поврежденных или уже утерянных клеточных структур [Curtis M.A. et al., 2003]. Для нейродегенеративных заболеваний, сопровождающихся моторной дисфункцией, в том числе и для БАС, одной из основных областей повреждения является спинной мозг. [Kwiatkowski T.J., Jr. et al., 2009]. Последние достижения в биотехнологических разработках для медицины, базирующиеся на результатах фундаментальных исследований дифференцировки стволовых клеток в различные типы нейронов [Aleksandrova M.A. et al., 2001] сделали принципиально возможным создание методов репаративной заместительной коррекции утерянных нейронов с использованием стволовых клеток [Репин В.С. et al., 2007] Однако, при конститутивном нарушении собственных репаративных процессов в двигательных нейронах эффект от заместительной клеточной терапии окажется не продолжительным. Для повышения эффективности лечения потребуется параллельная коррекция собственного нейрогенеза, как элемент комплексной патогенетической терапии. Принципиальная возможность коррекции патологического фенотипа, развивающегося у мышей в моделях БАС (линия мышей G93A-SOD1), с помощью стимуляторов нейрогенеза была показана в работах Tesla с соавторами [Tesla R. et al., 2012]. В связи с этим, интересным представляется вопрос о состоянии системы обновления нервной ткани в зонах локализации патологических процессов. С целью исследования интенсивности нейрогенеза в спинном мозге мышей линии Thy-1/FUS 1-359 был использован метод мечения делящихся клеток 5 бром-2 -дезоксиуридином (BrdU). Аналог тимидина, нуклеозида, входящего в состав ДНК, BrdU конкурентно встраивается во время процесса репликации в каждую вновь образованную цепь. Рисунок 28 – BrdU-позитивные клетки в спинном мозге Тhy-1/FUS 1-359 мышей. А – окраска антителами против BrdU, Б – окраска DAPI, В – наложение. Увеличение 400Х. Тhy-1/FUS 1-359 мышам на пресимптоматической стадии заболевания вводили BrdU и через 30 дней проводили забор биологического материала. Методом иммуногистохимического окрашивания осуществляли идентификацию BrdU-положительных клеток в зоне сегментов L3-L5 поясничного отдела спинного мозга (Рисунок 28). Проводили подсчет BrdU-положительных ядер на пяти срезах, расстояние между каждым срезом составляло 80 мкм. Для подтверждения локализации сигнала в ядерном компартменте использовали окраску DAPI.
Нами было показано что в спинном мозге трансгенных мышей на досимптоматической стадии развития заболевания содержитяся значительно меньшее число BrdU-положительных клеток, чем у контрольных нетрансгенных животных из тех же пометов. (Рисунок 29). Для анализа пространственного распределения BrdU-положительных клеток спинной мозг разделяли на три отдела: вентральную, латеральную и дорзальную и проводили подсчет BrdU-положительных ядер в каждом отделе. В каждом из трех исследованных отделов нами было выявлено характерное снижение числа BrdU-положительных клеток (Рисунок 30).
Количество BrdU-положительных клеток в поясничном отделе спинного мозга трансгенных (ТГ) и нетрасгенных (НТГ) мышей линии Thy-1/FUS 1-359. (Тест Стьюдента, Student s test; - p 0,05; n = НТГ-3, ТГ-3). Эти данные указывают на то, что снижение выживаемости пролиферирующих клеток может являться одним из патогенетических звеньев в развитии протеинопатии, либо быть следствием истощения компенсаторных механизмов нервной системы. Дальнейшие исследование данного вопроса позволит понять, как происходит обновление клеток в нервной системе в условиях развития нейродегенеративного процесса и какую роль это играет в патогенезе заболевания.