Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 12
1.1. Антимикробные пептиды и белки в иммунной системе организма 12
1.1.2. Понятие о врождённом и приобретённом иммунитете 12
1.1.2. Антимикробные компоненты нейтрофильных гранулоцитов 15
1.2. АМП: история, структура, классификация 24
1.3. Свойства и механизмы действия АМП 1.3.1. Механизм микробоцидного действия АМП 33
1.3.2. Селективность действия АМП в отношении микробных клеток. Зависимость структура-активность 39
1.3.3. Бактериальная резистентность к АМП 40
1.3.4. Другие биологические свойства АМП 1.4. Проблемы и перспективы практического использования АМП 48
1.5. Многообразие применяемых в клинике антибиотиков: краткий обзор 49
1.6. Наночастицы серебра: антимикробные и цитотоксические эффекты 51
1.7. Антимикробные свойства желчных кислот 54
1.8. Сочетанное действие веществ. Виды взаимодействия и методы их определения 1.8.1. Модели возникновения синергизма 57
1.8.2. Синергизм, антагонизм, аддитивность и потенцирование 58
1.8.3. Независимость Блисса и аддитивность Лёве 59
1.8.4. Математические подходы к изучению сочетанного действия 60
1.8.5. Методы определения характера сочетанного антимикробного действия веществ 64
2. Материалы и методы исследования 66
2.1. Объекты исследования 66
2.1.1. Антибиотические и поверхностно-активные вещества 66
2.1.2. Бактериальные клетки 67
2.1.3. Эукариотические клетки 67
2.2. Выделение и очистка дефенсина HNP-1 из лейкоцитов человека 68
2.2.1. Этапы выделения и очистки дефенсина HNP-1 из лейкоцитов человека 68
2.2.2. Аналитический диск-электрофорез в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях в присутствии додецилсульфата натрия 70
2.2.3. Обращённо-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография 72
2.2.4. Спектрофотометрический метод определения концентрации белка в растворе при помощи коэффициента молярной экстинкции 73
2.3. Методы исследования антимикробного действия веществ на бактериальные клетки 74
2.3.1. Оценка антимикробной активности исследуемых препаратов. Метод серийных разведений в жидкой питательной среде, содержащей микроорганизмы 74
2.3.2. Оценка совместного микробоцидного действия исследуемых антимикробных пептидов и белков и небелковых антибиотических агентов. Серийные разведения по методу "шахматной доски" 76
2.3.3. Фотометрический метод оценки способности препаратов влиять на проницаемость наружной и цитоплазматической мембран E.coli ML-35p для маркерных молекул 78 2.3.4. Флуориметрический метод оценки влияния исследуемых препаратов на дыхательную активность бактерий 82
2.3.5. Полярографический метод оценки влияния исследуемых препаратов на потребление кислорода микроорганизмами 84
2.4. Методы исследования цитотоксического действия веществ на эукариотические клетки 90
2.4.1. Анализ гемолитической активности препаратов 90
2.4.2. Выделение нейтрофилов и мононуклеарных лейкоцитов из цельной периферической крови человека 91
2.4.3. Подсчёт клеток в камере Горяева с использованием витального красителя трипанового синего 93
2.4.4. Оценка цитотоксического действия препаратов в отношении эукариотических клеток. МТТ-тест 94
2.4.5. Оценка доли клеток, вступивших на путь апоптоза и некроза при помощи набора реактивов, содержащего аннексин V 96
2.4.6. Спектрофотометрический метод определения активности каспазы 3 98
2.5. Статистическая обработка данных 100
3. Результаты 101
3.1. Исследование совместного действия АМП и белков нейтрофильных гранулоцитов человека 101
3.1.1. Выделение и очистка дефенсина HNP-1 из лейкоцитов человека 102
3.1.2. Совместное антибактериальное действие АМП и белков нейтрофильных гранулоцитов человека 105
3.1.3. Совместное цитотоксическое действие АМП и белков нейтрофильных гранулоцитов человека 109
3.2. Исследование совместного действия АМП и применяемых в клинике антибиотиков... 111
3.2.1. Совместное антибактериальное действие АМП и конвенциональных антибиотиков 114
3.2.2. Влияние сочетаний АМП и конвенциональных антибиотиков на проницаемость наружной и внутренней мембран E.coli ML-35p 123
3.2.3. Влияние сочетаний АМП и конвенциональных антибиотиков на интенсивность метаболических процессов бактериальной клетки 130
3.2.4. Совместное действие АМП и конвенциональных антибиотиков на эукариотические клетки 136
3.3. Исследование сочетанной антимикробной активности АМП с наночастицами серебра и
особенностей биологического действия их конъюгатов 142
3.3.1. Совместное антибактериальное действие АМП и наночастиц серебра 142
3.3.2. Исследование антибактериальной активности конъюгатов АМП и белков с наночастицами серебра 144
3.3.3. Изучение действия препаратов на наружную и цитоплазматическую мембраны грамотрицательной бактерии E.coli ML-35p 151
3.3.4. Изучение влияния препаратов на интенсивность метаболических процессов бактериальной клетки 153
3.3.5. Оценка влияния препаратов на потребление кислорода бактериальной культурой 154
3.3.6. Оценка цитотоксичности конъюгатов АМП и белков с наночастицами серебра в отношении эукариотических клеток 156
3.4. Исследование совместного антибактериального действия АМП с желчными кислотами и синтетическими детергентами 161
3.4.1. Определение характера совместного антибактериального действия АМП с желчными кислотами и синтетическими детергентами 162
3.4.2. Влияние сочетаний АМП с природными и синтетическими детергентами на проницаемость наружной и внутренней мембран E.coli ML-35p 166
3.5. Исследование сочетанного цитотоксического действия АМП и применяемых в клинике
противоопухолевых препаратов на опухолевые клетки 171
3.5.1. Определение характера совместного цитотоксического действия АМП с противоопухолевыми антибиотиками 171
3.5.2. Исследование характера клеточной гибели при сочетанном действии АМП с противоопухолевыми препаратами на опухолевые клетки 174
4. Обсуждение 177
Заключение 190
Выводы 191
Список сокращений 193
Список литературы 195
- АМП: история, структура, классификация
- Выделение и очистка дефенсина HNP-1 из лейкоцитов человека
- Совместное антибактериальное действие АМП и белков нейтрофильных гранулоцитов человека
- Изучение действия препаратов на наружную и цитоплазматическую мембраны грамотрицательной бактерии E.coli ML-35p
Введение к работе
Актуальность проблемы. Система врожденного иммунитета участвует в осуществлении многих защитных функций организма, в частности, обеспечивает оперативный ответ при инфекции [Abbas A.K. & Lichtman A.H., 2012]. Изучение молекулярно-клеточных механизмов функционирования данной системы является перспективным для решения актуальных проблем биологии и медицины.
Одними из главных эффекторных клеток системы врождённого иммунитета являются нейтрофильные гранулоциты. В гранулярном аппарате этих клеток сосредоточены биологически активные компоненты, ответственные за инактивацию патогенных микроорганизмов, в частности, обширный набор антимикробных белков и пептидов. Данные соединения действуют как внутри фагосом, так и при секреции их во внеклеточное пространство в ходе развития инфекционного процесса [Маянский А.Н. и Маянский Д.Н., 1989; Кокряков В.Н., 2006]. Известно, что их антимикробные эффекты многократно усиливаются при совместном действии этих соединений на микроорганизмы, как это происходит in vivo [Lai Y. & Gallo R.L., 2009]. Хотя механизм этого явления до конца не ясен, полагают, что вещества, одновременно оказывающие свой эффект на микроорганизмы, имеют разные мишени, затрудняя эффективную защиту бактерий от такого многофакторного воздействия. В концентрациях, превышающих антимикробные, ряд белков и пептидов нейтрофилов токсичен для клеток макроорганизма [Hu J. et al., 2011; Steckbeck J.D. et al., 2014]. Однако подобные эффекты при совместном действии этих соединений остаются практически не охарактеризованными. Не изучено, усиливается ли цитотоксическое действие в отношении нормальных или опухолевых клеток для комбинаций антимикробных пептидов и других компонентов гранул нейтрофилов, при использовании которых экспериментально показано синергическое микробоцидное действие.
Среди известных защитных молекул системы врождённого иммунитета ключевую роль в реализации её противоинфекционной функции играют антимикробные пептиды (АМП) [Кокряков В.Н., 1999]. Они обладают широким спектром противомикробного действия [Phoenix D.A. et al., 2013]. Некоторые АМП проявляют высокую активность против обладающих множественной устойчивостью к антибиотикам штаммов микроорганизмов [Steckbeck J.D. et al., 2014], борьба с которыми является актуальной задачей современной медицины. Кроме того, для ряда пептидов показано ранозаживляющее и иммуномодулирующее действие. Поэтому они рассматриваются как прототипы для создания новых эффективных противоинфекционных лекарственных препаратов [Ramesh S. et al., 2016]. Однако цитотоксическое действие АМП в отношении нормальных клеток макроорганизма является одним из препятствий для внедрения создаваемых на их основе препаратов в медицину. Одним из путей решения этой проблемы является снижение эффективной концентрации данных веществ, в связи с чем актуальным представляется рассмотрение совместного применения АМП и белков с другими микробоцидными агентами с целью выявления синергетических эффектов [Baker K.R. et al., 2016; Knappe D. et al., 2016, Adams E.K. et al., 2016].
Применяемые в медицине антибиотики имеют разнообразные механизмы и мишени антимикробного действия, что позволяет предположить возможность
синергизма в антибиотической активности некоторых из них с АМП. Исследование особенностей сочетанного действия природных пептидов и используемых в медицинской практике антибиотиков с известными механизмами антимикробного действия может предоставить важную информацию о природе синергических эффектов и выявить комбинации, наиболее перспективные с точки зрения практического применения, а в случае АМП человека (дефенсинов, кателицидина) позволит установить, применение каких антимикробных препаратов может способствовать повышению активности эндогенных АМП. При этом немаловажным является выяснение, не усиливается ли при использовании комбинаций АМП и антибиотиков и их токсическое действие на собственные клетки организма.
Перспективным для медицины представляется также изучение возможности применения комплексов природных АМП и небелковых антибиотических средств, в частности, конъюгатов АМП с наночастицами серебра [Орлов Д.С. и др., 2010].
Мембранолитическая активность АМП имеет некоторое сходство с действием катионогенных детергентов. В контексте изучения механизмов антибиотического действия АМП представляется интересным рассмотреть их совместные эффекты с другими группами поверхностно-активных веществ (ПАВ): анионогенными и неионогенными. Эти соединения широко представлены как в промышленной и бытовой сфере, так и в природе, поэтому рассмотрение их влияния на активность АМП может иметь и прикладное значение. Примером природных анионных ПАВ являются также желчные кислоты. Недавние исследования показали, что они обладают прямой и непрямой антимикробной активностью и могут принимать участие в обеспечении иммунной защиты тонкого кишечника [Hofmann A.F. & Eckmann L., 2006]. АМП осуществляют своё противомикробное действие не только в лизосомальных гранулах фагоцитов, но и на поверхности кожи и слизистых. Таким образом, исследование их сочетанного действия с желчными кислотами важно и для расширения представлений о молекулярных механизмах врождённого иммунитета.
В настоящее время получены экспериментальные данные, позволяющие рассматривать АМП нейтрофилов млекопитающих и их структурные синтетические аналоги не только как антимикробные, но и как перспективные противоопухолевые терапевтические агенты для лечения заболеваний, связанных с развитием опухолей, резистентных к применяемым фармакологическим средствам [Phoenix D.A. et al., 2013, Gaspar D. et al., 2013]. Однако данные о совместном действии природных АМП с противоопухолевыми препаратами, используемыми в клинике, пока также немногочисленны.
Таким образом, актуальность представленной работы в первую очередь связана с проблемой развития у патогенных микроорганизмов резистентности к применяемым в клинике терапевтическими препаратам, что диктует необходимость постоянной разработки новых антибиотических средств, либо повышения эффективности уже имеющихся. Последнее может осуществляться, в частности, за счёт сочетанного применения антимикробных препаратов.
Выявление путей повышения активности эндогенных АМП человека открывает возможности для увеличения эффективности функционирования собственных защитных систем организма. Создание конъюгатов АМП и других антибиотических соединений также является путём, объединяющим возможности сочетанного
применения антимикробных веществ с оптимизацией их свойств. Рассмотрение функциональной активности и особенностей действия биоконъюгатов является необходимым этапом на пути внедрения подобных им комплексов в медицину.
Резистентность к применяемым препаратам является актуальной проблемой в лечении не только инфекционных, но и опухолевых заболеваний. В связи с этим изучение возможности усиления противоопухолевого эффекта применяемых средств за счёт их совместного использования с пептидами, обладающими антибиотической активностью в отношении опухолевых клеток, может стать одним из путей решения этой проблемы.
Таким образом, изучение молекулярных механизмов врожденного иммунитета,
включающее анализ возможностей взаимодействия АМП с другими
антибиотическими агентами и ПАВ, как эндогенными, так и поступающими в организм извне, позволяет выявить новые пути коррекции патологических процессов, связанных с инфекцией, воспалением, опухолевым ростом.
Целью работы являлось изучение молекулярно-клеточных механизмов сочетанного действия антимикробных белков и пептидов системы врожденного иммунитета на микробные и эукариотические клетки, а также их совместного антибиотического действия с синтетическими антибиотическими и поверхностно-активными средствами.
Задачи работы включали:
1. Изучение сочетанного антимикробного действия белков и пептидов системы
врождённого иммунитета в отношении грамотрицательных и грамположительных
бактерий, в том числе антибиотикоустойчивых штаммов, при использовании
комбинаций:
антимикробных пептидов и белков нейтрофилов человека (LL-37 и эластаза, дефенсины и эластаза, LL-37 и катепсин G, дефенсины и катепсин G);
антимикробных пептидов животных и человека, имеющих разную структуру (дефенсины человека, LL-37, протегрин-1, бактенецин), и антибиотиков, применяемых в медицине (рифампицин, оксациллин, гентамицин, полимиксин В, офлоксацин), а также наночастиц серебра;
антимикробных пептидов человека и животных (протегрин-1, бактенецин, дефенсины) с природными и синтетическими ПАВ.
-
Изучение антимикробного действия конъюгатов природных антимикробных полипептидов с наночастицами серебра.
-
Изучение механизмов синергических эффектов комбинаций и особенностей антимикробного действия конъюгатов (влияния индивидуальных фракций веществ и их комбинаций на барьерную функцию цитоплазматической мембраны бактерий, интенсивность процессов метаболизма).
-
Изучение возможностей усиления гемолитического действия и токсических эффектов в отношении нормальных и опухолевых клеток для АМП при их совместном применении с антимикробными белками нейтрофилов или небелковыми антибиотиками.
-
Изучение гемолитической и цитотоксической активности конъюгатов антимикробных полипептидов с наночастицами серебра.
-
Изучение сочетанного цитотоксического действия АМП и
противоопухолевых препаратов, используемых в медицине (доксорубицина и др.), в отношении опухолевых клеток, в том числе устойчивых к противоопухолевым препаратам. Анализ механизмов их сочетанного действия.
Научная новизна. Впервые совместное действие пептидов и белков нейтрофилов
охарактеризовано одновременно в отношении бактериальных культур и в отношении
нормальных и опухолевых клеток человека. Получены новые данные об эффектах
сочетанного действия АМП, в частности, эндогенных пептидов человека, и
применяемых в клинике антибиотиков, обладающих различными механизмами
противомикробной активности. Обнаружены сочетания, при которых имеет место
синергизм. Выявлены закономерности, свидетельствующие в пользу того, что в основе
синергетического действия данных групп соединений лежит облегчение доступа
антибиотика к его внутриклеточным мишеням, а также того, что и присутствие
антибиотика может влиять на динамику мембранотропного действия АМП. Получены
новые сведения о влиянии анионогенных и неионогенных детергентов на
антимикробную активность и развитие повреждающего действия АМП в отношении
бактериальных мембран. Получены приоритетные данные о механизмах
микробоцидной активности конъюгатов антимикробных полипептидов с
наночастицами серебра, а также об их цитотоксических свойствах по отношению к клеткам человека. Впервые рассмотрены возможности сочетанного применения АМП и противоопухолевых препаратов на опухолевые клетки, в том числе обладающие лекарственной устойчивостью.
Теоретическое и практическое значение. Изучение взаимодействия белков и пептидов гранулярного аппарата нейтрофилов, а также АМП и желчных кислот является важным для расширения представлений о механизмах функционирования эффекторных молекул врожденного иммунитета. Рассмотрение сочетанной антибиотической активности эндогенных АМП человека и применяемых в клинике противоинфекционных препаратов, а также воздействия детергентов на антимикробную активность АМП представляется значимым в контексте исследования влияния лекарственных веществ на функции иммунной системы. Анализ совместного действия природных защитных соединений с синтетическими антибиотиками и противоопухолевыми препаратами, а также биологических свойств и особенностей действия биоконъюгатов антимикробных полипептидов с наночастицами серебра позволяет оценить перспективность применения подобных подходов для внедрения препаратов на основе АМП в медицину.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Дефенсины и сериновые протеиназы нейтрофилов обладают синергизмом антимикробного действия, при этом не наблюдается прямой взаимосвязи в усилении антимикробных и цитотоксических для собственных клеток организма свойств.
-
АМП проявляют синергизм антимикробного действия с конвенциональными антибиотиками. Преимущественно наблюдается проявление синергизма с антибиотиками, влияющими на внутриклеточный синтез биомолекул. Одним из механизмов синергических эффектов может быть облегчение проникновения антибиотика в клетку, а также влияние с его стороны на динамику взаимодействия АМП с бактериальными мембранами.
3. Микробоцидные эффекты АМП и скорость развития их повреждающего
действия на мембраны бактерий могут усиливаться в присутствии и анионных, и неионогенных ПАВ.
-
АМП проявляют синергизм антимикробного действия с наночастицами серебра, стабилизированными желатином. Конъюгаты антимикробных полипептидов с наночастицами серебра обладают выраженной бактерицидной активностью в отношении широкого спектра микроорганизмов, в том числе антибиотикрезистентных штаммов.
-
Конъюгаты АМП с наночастицами оказывают повреждающее действие на наружную мембрану грамотрицательных бактерий, зависящее от мембранолитических свойств входящего в их состав антимикробного полипептида, при этом они не вызывают увеличения проницаемости цитоплазматической мембраны бактерии. Их действие характеризуется быстрым снижением интенсивности метаболических процессов в бактериальной клетке и потребления кислорода. Они обладают низкой гемолитической активностью и низкой цитотоксичностью в отношении нормальных эукариотических клеток в сравнении с трансформированными.
-
АМП способны оказывать синергетическое действие в сочетании с противоопухолевыми препаратами на опухолевые клетки, в частности, обладающие лекарственной устойчивостью.
Личный вклад автора работы заключался в составлении плана
экспериментальных исследований, самостоятельном их выполнении, обработке
полученных данных, анализе и интерпретации результатов, их трактовке и
обобщении. Исключение составлял масс-спектрометрический анализ образцов после
хроматографического разделения (выполнен в ЦКП «Аналитическая
спектрометрия»). Диссертантом также осуществлялось непосредственное написание статей и тезисов (в тех публикациях, где он указан первым автором), либо принималось активное участие в подготовке соответствующих материалов.
Благодарности. Автор исследования выражает глубокую благодарность
сотруднику Института цитологии РАН Арцыбашевой И.В. (руководитель научной
группы – к.б.н. Т.М. Гринчук) за предоставление культуры устойчивых к
доксорубицину клеток линии К-562; группе сотрудников Института химии
силикатов им. В.И. Гребенщикова РАН под руководством к.х.н. Голубевой О.Ю. за
сотрудничество в сфере изучения свойств наночастиц серебра и их конъюгатов с
антимикробными полипептидами, а также непосредственно за синтез и
характеристику физико-химических параметров указанных соединений;
сотрудникам лаборатории общей патологии ФГБНУ «ИЭМ», любезно
предоставившим ранее выделенные из нейтрофилов человека очищенные препараты эластазы и катепсина G и сотруднику Института физиологии им. И.П. Павлова РАН к.х.н. Щеголеву Б.Ф. за активную консультативную помощь в вопросах компьютерного моделирования и в анализе его результатов.
Апробация работы. Апробация диссертации состоялась 20.06.2016 г. на
заседании отдела общей патологии и патологической физиологии ФГБНУ «Институт
экспериментальной медицины» (г. Санкт-Петербург). Основные положения
диссертации были представлены на Всероссийской межвузовской научно-технической конференции студентов и аспирантов «ХL неделя науки СПбГПУ» (Санкт-Петербург,
5–10 декабря 2011 г.), IV и V Международных симпозиумах «Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и патологии» (Санкт-Петербург, 18–21 июня 2013 г., 23–26 июня 2015 г.), XVI, XVII и XVIII всероссийских медико-биологических конференциях молодых исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина – человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 20 апреля 2013 г., 19 апреля 2014 г., 18 апреля 2015 г.)
По теме работы опубликованы 22 печатные работы: 7 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ и 15 тезисов докладов.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 222 страницах машинописного текста; состоит из семи разделов: введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов, их обсуждения, заключения и выводов – и приложения; содержит 21 таблицу и 75 рисунков. Список использованных источников включает 378 наименований, из них 39 – отечественные, 339 – зарубежные.
АМП: история, структура, классификация
Образование внеклеточных ловушек происходит как в гибнущих, так и в активированных иммунных клетках [35] в ответ на различные стимулы, включая рецепцию бактериальных эндо- и экзотоксинов [44], специфические взаимодействия с тромбоцитами [35]. Возможны различные механизмы формирования NETs, в частности выброс митохондриальной ДНК (рис.1.5) [45, 46]. В последних исследованиях показано, что образование внеклеточных ловушек может происходить без разрушения цитоплазматической мембраны, при этом нейтрофилы могут осуществлять основные функции и сохраняют способность к хемотаксису и фагоцитозу. В соответствии с этим NETоз подразделяют на витальный и суицидальный [47]. Показано участие в инициации процесса активных форм кислорода и компонентов нейтрофильных гранул – МПО [43, 47], эластазы [43], LL-37 [48]. В результате из клеток выбрасываются нити ДНК, связанные с гистонами и антимикробными белками и пептидами, в которых бактериальные клетки запутываются и инактивируются [43, 46]. В норме вскоре после формирования начинается лизис NETs под действием ферментов плазмы крови (ДНКаз), препятствующий презентации аутоантигенов и возможному развитию аутоиммунных патологий [33, 47, 49]. Нарушение этого процесса может играть роль в патогенезе таких заболеваний как системная красная волчанка, АНЦА1-ассоциированный васкулит, диабет II типа, атеросклероз, ревматоидный артрит, псориаз и подагра [41, 47].
Помимо NETs о физиологической значимости антимикробной активности ядерных белков может свидетельствовать обнаружение АМП, гомологичного N-концевому фрагменту гистона Н2А – буфорина I, присутствующего в составе желудочной слизи азиатской жабы Bufo gargarizans, а также в желудочном соке свиньи, крупного рогатого скота и человека. Показано, что в клетках слизистой желудка жабы гистон Н2А синтезируется в количествах больших, чем требуется для упаковки ДНК. Часть новосинтезированного белка ацетилируется и направляется в ядро, а неацитилированный гистон секретируется в просвет желудка, где происходит его процессинг под действием одной из изоформ пепсина до буфорина I. Этот АМП проявляет активность против грамотрицательных и грамположительных бактерий, а также грибов. При этом он действует по механизму, не приводящему к увеличению проницаемости бактериальных мембран, что среди АМП встречается довольно редко. Основой его бактерицидного действия является внутриклеточное связывание нуклеиновых кислот. Транслокация буфорина I через мембрану связана с наличием в его структуре двух спиральных участков, соединённых содержащей пролин перемычкой. Помимо широкого спектра антимикробного действия буфорин обладает и другими видами биологической активности: связывает эндотоксины, способен ингибировать ботулотоксин, оказывает противоопухолевое действие [34].
О наличии у прокариот пептидных веществ, обладающих антимикробной и фунгицидной активностью, было известно с 1939 года, когда из Bacillus brevis были выделены грамицидины [50, 51]. Однако вопрос о первых работах, посвящённых эукариотическим АМП, различными исследователями рассматривается по-разному [8].
Представления о наличии у высших позвоночных антибактериальных соединений, ответственных за инактивацию микроорганизмов в фаголизосомах лейкоцитов, были заложены И.И. Мечниковым [52] в фагоцитарной теории иммунитета (1903). В 1905 г. А. Петтерсон (A. Petterson) выделил из лейкоцитов гноя человека антимикробные субстанции, которые, по
АНЦА – антинейтрофильные цитоплазматические антитела. заключению автора, представляли смесь катионных протеинов, родственных по ряду свойств протаминам рыб [53], для которых к тому времени были показаны антимикробные свойства in vitro. В 1922 г. А. Флемингом был открыт бактериолитический фермент лизоцим [37], который можно считать первым белковым антибиотическим веществом животного происхождения с установленной первичной структурой [4]. Однако механизм антимикробного действия лизоцима долгое время считался чисто энзиматическим, и лишь в начале 90-х годов ХХ века было показано, что он может осуществлять антимикробное действие и по неферментативному механизму, характерному для АМП [8].
Многие исследователи относят начало систематического изучения АМП эукариот к 60-м годам ХХ века и связывают возросший интерес к этим соединениям с окончанием «Золотого века» антибиотиков [8]. В 1960-х годах Зея (Zeya) и Шпицнагелем (Spitznagel) было показано, что катионные низкомолекулярные белки нейтрофильных гранулоцитов человека ответственны за кислород-независимый киллинг микроорганизмов [8, 29, 54, 55]. Один из первых АМП высших животных – бомбинин желтобрюхой жерлянки Bombina variegate – был выделен и описан в 1962 году [56]. Однако изначально в исследовании делался акцент на гемолитической активности пептида, и, несмотря на последующее исследование антимикробных свойств в 1969 году [57], эта работа не привлекла внимания широкой научной общественности [58]. Также в 1960-х годах были описаны антимикробный белок лактоферрин [59], выделенный из молока, и небольшие антимикробные молекулы, индуцибельно синтезирующиеся в гемолимфе личинок восковой моли [60]. Тем не менее, активное исследование АМП началось лишь спустя почти 20 лет, в 1980-х годах [19, 58]. В конце 70-х – начале 80-х годов был выделен и описан ряд АМП лейкоцитарного происхождения, в том числе -дефенсины кролика [61] и человека [62]. Вместе с тионинами растений, первый из которых – пуротионин – был получен из эндосперма пшеницы в 1942 году [63], эти пептиды стали одними из первых описанных АМП, стабилизированных дисульфидными связями [8]. В 1980 году Боманом (Boman) и коллегами [64] были выделены первые АМП, имеющие -спиральную конформацию – цекропины из гемолимфы куколки тутового шелкопряда Hyalophora cecropia [8, 29, 58]. В 1987 группа Заслова выделила и описала катионные АМП гладкой шпорцевой лягушки Xenopus laevis, получившие название «магейнины» от древнееврейского «щит» [65]. Несколько лет спустя были выделены -дефенсины, отличающиеся от -дефенсинов конфигурацией дисульфидных мостов, из гранулоцитов коровы [66] и макроциклические пептиды – -дефенсины лейкоцитов макак-резусов [67]. В середине 1990-х Брогден (Brogden) и коллеги выделили первый анионный АМП из X. laevis и описали ряд подобных пептидов у жвачных животных, в частности коз и овец [68]. Выделение и описание АМП из различных источников быстро набрало обороты: они были выявлены как в клетках миелоидной линии, так и эпителиальной природы; найдены в организме млекопитающих, амфибий, рыб, насекомых, птиц, растений и др. [40]. Таким образом, сложилось современное представление о том, что АМП являются эволюционно древним компонентом системы врождённого иммунитета большинства многоклеточных организмов [69, 8]. Они присутствуют на протяжении всей эволюционной цепочки от бактерий до высших растений, животных и грибов, и вырабатываются различными тканями (рис.1.6) [69]. Их синтез может как быть конститутивным, так и индуцироваться в случае инфекции или раневого поражения [8].
Различные ткани организма продуцируют индивидуальные наборы АМП, состав которых может изменяться в зависимости от физиологических условий. Отдельные АМП могут преобладать в той или иной ткани, однако лишь небольшое их число вырабатывается исключительно определённой тканью или типом клеток [8]. Несмотря на то, что первоначально АМП рассматривались как чисто антимикробные соединения, дальнейшие исследования показали, что они проявляют широкий набор физиологических свойств: от прямого киллинга (умерщвления) проникающих в организм патогенных микроорганизмов до модуляции иммунного ответа и других биологических реакций, различающихся для конкретных представителей данного класса соединений [5, 70].
Выделение и очистка дефенсина HNP-1 из лейкоцитов человека
Потенциально АМП могут быть использованы: (1) как самостоятельные противоинфекционные или противоопухолевые агенты, (2) в комбинации с другими антибиотиками или антивирусными препаратами для получения аддитивных или синергических эффектов, (3) как иммуностимулирующие агенты, (4) в качестве нейтрализаторов бактериальных эндотоксинов для предотвращения возможных осложнений, таких как септический шок [22, 34, 88]. Подробное изучение различных, в частности немембранолитических, механизмов действия АМП может выявить новые жизненно-важные молекулы-мишени микробных и раковых клеток, а сами они – послужить моделями для синтеза непептидных аналогов [106].
С терапевтической точки зрения к преимуществам АМП можно отнести их активность против широкого спектра микроорганизмов (бактерий, вирусов, грибов), быстрый киллинг, потенциально низкую вероятность развития резистентности, сопутствующий спектр противовоспалительных свойств. Основными недостатками являются: высокая стоимость синтеза, а, следовательно, как исследований, так и полномасштабного производства; системная и местная токсичность; снижение активности под действием солей, компонентов сыворотки крови, рН; подверженность протеолизу; возможные аллергические эффекты; сопутствующие биологические свойства (например, стимуляция ангиогенеза) [22]. Необходимо отметить, что в решении проблемы получения пептидов к настоящему времени заметны существенные успехи. Так, например, удалось преодолеть ряд сложностей, возникающих при продуцировании рекомбинантных АМП в гетерогенных системах, содержащих бактерии, связанных с антибактериальной активностью конечного продукта [201, 69].
Распространение бактериальных штаммов, резистентных к классическим антибиотикам, вызывает рост интереса к изучению активности АМП, как потенциально нового класса антибиотиков, действенного против мультирезистентных патогенов. Однако, несмотря на большой прогресс в лабораторных исследованиях, лишь несколько производных АМП на сегодняшний день используются в клинике (плектазин – дефенсин, P-113 – производное гистатина, несколько синтетических аналогов индолицидина и др. [77]) или находится на заключительных стадиях клинических испытаний, причём большинство предназначено для местного, а не системного применения [88, 34].
Несмотря на сравнительно низкую вероятность развития резистентности, подобная перспектива в случае применения природных АМП должна быть тщательно оценена, так как они занимают важное место в системе иммунной защиты, и это может привести к значительному увеличению вирулентности микроорганизмов [28]. В настоящее время появляется всё больше работ, посвящённых разработке небелковых миметиков, синтетических модификаций, рассмотрению возможности создания комплексных препаратов АМП с другими веществами, так как описанные стратегии позволяют снизить или устранить различные негативные эффекты их применения, а также повысить устойчивость, селективность действия или, например, снизить экономические затраты [202, 77, 69].
АМП могут применяться не только как непосредственно терапевтические агенты. Пептидные молекулы могут быть использованы для изготовления биосенсоров, чувствительных к присутствию микроорганизмов [203], или иммобилизованы на поверхности биомедицинского оборудования с целью предотвращения формирования биоплёнок [74]. Рассматриваются перспективы применения в системах лекарственной доставки и для борьбы с биоплёнками препаратов на основе полимерных наночастиц и АМП [74]. Предложены подходы к использованию АМП с радиоактивной меткой в радиофармакологии для дифференциальной диагностики инфекционных и неинфекционных воспалительных процессов при проведении ПЭТ [204]. Обсуждается возможность применения АМП в сельскохозяйственной и пищевой промышленности, например, в качестве альтернативы современных фунгицидов, опасных для здоровья человека [30]. Одной из новых стратегий является стимуляция продукции эндогенных АМП с использованием, например, витамина D или фенилбутирата [100, 58].
Одним из революционных прорывов в медицине, сделавших её такой, какой мы видим её сейчас, стала концепция микробной этиологии заразных болезней, основанная на работах Луи Пастера (1861) и Роберта Коха (1876) [205]. Вторым поворотным моментом явилось открытие антибиотиков (пенициллин был открыт А.Флемингом в 1929 г.). Сам термин "антибиотик" введён в 1942 г. американским микробиологом и химиком З.А. Ваксманом. Согласно его определению, "антибиотики являются химическими веществами, образуемыми микроорганизмами, которые обладают способностью подавлять рост или даже разрушать бактерии и другие микроорганизмы". В настоящее время это определение значительно расширено. Например, по Н.С.Егорову (1986), антибиотики – специфические продукты жизнедеятельности или их модификации, обладающие высокой физиологической активностью по отношению к определённым группам микроорганизмов (вирусам, бактериям, грибам, простейшим, водорослям) или к злокачественным опухолям, избирательно задерживающие их рост или полностью подавляющие их развитие. Иногда антибиотики немикробного происхождения называют "антимикробными химиопрепаратами" [4].
Независимо от источника происхождения, антибиотики характеризуются двумя основными признаками: высокой антибиотической активностью по отношению к микробам или чувствительным клетками и избирательностью их действия [4, 206]. Этим они отличаются от антисептиков, которые действуют на микроорганизмы не избирательно и применяются для их уничтожения в живых тканях, и дезинфектантов, предназначенных для неизбирательного уничтожения микроорганизмов вне живого организма (предметы ухода, поверхности и пр.) [206].
В настоящее время в клинике применяется несколько сотен антимикробных препаратов. В основу их классификации можно положить различные принципы, но основными являются подразделения по классу и спектру антимикробного действия, химической природе и биохимическому пути воздействия на микробную клетку [205, 207].
По классу действия антибиотики делят на (1) антибактериальные; (2) противовирусные; (3) противогрибковые; (4) противопаразитарные и (5) противоопухолевые [205, 206]. Традиционно выделяют препараты с "узким" (например, бензилпенициллин) и "широким" (тетрациклины) спектром активности [206].
По химической природе выделяют (1) -лактамные антибиотики (пенициллины, цефалоспорины); (2) тетрациклины (тетрациклин, морфоциклин); (3) макролиды (эритромицин); (4) аминогликозиды (гентамицин); (5) гликопептиды (ванкомицин); (6) амфениколы (левомицетин) и др. [208, 209]. Также в зависимости от источников получения антибиотики делят на три группы: (1) природные – продуцируемые микроорганизмами (например, пенициллин); (2) полусинтетические – получаемые в результате модификации природных структур (ампициллин); (3) синтетические (сульфаниламиды, хинолоны). Однако в настоящее время последняя систематизация отчасти утратила актуальность, так как некоторые природные антибиотики (хлорамфеникол и др.) получают исключительно путём химического синтеза [206].
По механизму действия на микробную клетку (приводимая классификация актуальна, главным образом, в отношении антибактериальных антибиотиков) противомикробные препараты делятся на (1) ингибиторы синтеза компонентов клеточной стенки; (2) ингибиторы синтеза белка на рибосомах; (3) ингибиторы синтеза или функций нуклеиновых кислот (ДНК и РНК); (4) вещества, нарушающие отдельные функции клеточных мембран и (5) ингибиторы определённых метаболических процессов (рис.1.14) [205, 207, 209].
Тип действия антибиотиков бывает цидным (бактерицидным, фунгицидным, вирицидным и т.д.), под которым понимается необратимое нарушение жизнедеятельности (гибель) инфекционного агента, и статическим (бактериостатическим, фунгистатическим, виристатическим и т.д.), при котором прекращается или приостанавливается размножение возбудителя. Неприятной особенностью антибиотических препаратов, заставляющей исследователей искать всё новые и новые вещества данного класса, является то, что их активность имеет тенденцию снижаться со временем, что обусловлено формированием у микробов или раковых клеток лекарственной устойчивости (резистентности).
Совместное антибактериальное действие АМП и белков нейтрофильных гранулоцитов человека
При установлении статистически значимых различий соответствующих параллелей проб с контролем интактных клеток (критерий Манна-Уитни), совместное действие исследуемых веществ расценивалось как независимое (при отсутствии статистически значимых отличий для обоих сочетаний концентраций), аддитивное (при наличии статистически значимых отличий только для сочетания МЭКі + Уг МЭКг) или синергетическое (при наличии статистически значимого отличия от контроля для обоих сочетаний концентраций). Вывод делался на основании трёх независимых экспериментов. Столбовые диаграммы оптической плотности соответствующих проб и контролей приведены на рис.3.8. Оптическая плотность на длине волны 540 нм (при вычитании фоновой оптической плотности на длине волны 690 нм) в рамках применяемого МТТ-теста прямо пропорциональна числу живых клеток в пробе.
Исходя из полученных результатов, при уровне значимости р 0.01 можно сказать, что для сочетаний катепсина G с дефенсинами взаимное усиление цитотоксической активности не характерно. Для сочетания эластазы и -дефенсина человека HNP-1 наблюдается аддитивность цитотоксического действия как в отношении нормальных, так и опухолевых клеток. Цитотоксическое действие комбинации эластазы с -дефенсином hBD-3 более выражено в отношении трансформированных клеток крови, чем нормальных: при воздействии на линию клеток миелоидной лейкемии К-562 наблюдается синергетический эффект, тогда как против мононуклеаров и нейтрофилов, выделенных из периферической крови здоровых доноров, действие данного сочетания может быть охарактеризовано как независимое. При действии сочетания эластазы и протегрина-1 избирательность цитотоксического действия менее выражена: синергизм наблюдается как в отношении опухолевых клеток линии К-562, так и нормальных нейтрофильных гранулоцитов человека (при уровне значимости р 0.05 эффект в отношении мононуклеаров также может быть оценен как синергетический).
Цитотоксическая активность комбинаций АМП и антимикробных белков нейтрофилов человека в отношении нормальных мононуклеаров и нейтрофилов периферической крови человека и клеток линии К562. Указана оптическая плотность OD540 (с поправкой на вычитание фоновой СЮб9о) прямо пропорциональная числу жизнеспособных клеток в пробе для контроля интактных клеток и параллелей, содержащих сочетания исследуемых веществ в концентрациях МЭК + Уг МЭКг и МЭК + Ул МЭКг. Статистически значимое отличие от контроля интактных клеток согласно U-критерию Манна-Уитни при уровне значимости р0.05 (#) или р0.01 ( ) (число проб в параллели 3-6 шт.)
Таким образом, можно заключить, что прямой зависимости между взаимным усилением антимикробных и цитотоксических свойств не наблюдается. Предположительно, усиление совместного цитотоксического действия на эукариотические клетки более вероятно для комбинаций высокоактивных мембранолитических пептидов и белков, повреждающее действие которых направленно на поверхностные структуры клетки.
Исследование совместного действия АМП и применяемых в клинике антибиотиков АМП и белки - обширный класс природных полипептидных соединений, обладающих широким спектром противомикробной активности. В настоящее время они рассматриваются в качестве перспективных средств для борьбы с инфекциями, вызванными, в частности, мультирезистентными микроорганизмами, устойчивыми к действию конвенциональных антибиотиков. Однако существует ряд препятствий их внедрению в клиническую практику [69,
Одной из стратегий преодоления возникающих сложностей, связанных, в том числе, с рядом негативных влияний АМП и белков на макроорганизм, является снижение эффективных концентраций действующих веществ.
Известно, что при совместном применении терапевтических средств возможно (взаимное или нет) усиление или ослабление их эффектов. Усиление может проявляться в простом аддитивном суммировании действия, либо эффекты одного вещества в присутствии другого могут возрастать в разы. В том случае, если оба вещества относятся к одной группе терапевтических препаратов, т.е., например, оба являются антибиотиками, и, соответственно, оба обладают усиливающимся видом активности, говорят о синергизме их совместного действия. Если одно из веществ рассматриваемым видом активности само по себе не обладает, подобный эффект называют потенцированием. В любом случае такого рода взаимодействие позволяет значительно снизить действующие концентрации препаратов при их совместном применении [209].
При совместном действии терапевтических средств на уровне клеток их взаимодействие может иметь фармакодинамическую или физико-химическую природу. Первое проявляется в изменении условий контакта с рецепторами, ионными каналами, другими структурами клетки-мишени за счёт единовременного влияния на неё второго вещества; второе – в непосредственном взаимодействии применяемых веществ (электростатическом, гидрофобном, образовании химических связей), что, в свою очередь, меняет характер их действия на клетку, вплоть до смены всего молекулярно-биохимического механизма оказания эффекта [209].
Изучение антибактериальной активности АМП и белков в различных комбинациях с другими антимикробными агентами с целью выявления возможных синергетических эффектов являлось одной из центральных задач данной работы. Первой крупной рассмотренной группой таких противомикробных средств были применяемые в клинике антибиотики, которые, как правило, имеют микробное происхождение.
В свете крайнего разнообразия химических структур как АМП, так и классических антибиотиков, главным принципом, по которому осуществлялся выбор конкретных веществ для постановки дальнейших экспериментов, было различие путей антимикробного действия препаратов на бактериальную клетку.
Механизм действия АМП в отношении микроорганизмов изучен не полностью, однако известно, что он является неферментативным. Микробоцидный эффект большинства АМП связывают с повреждением бактериальных мембран, приводящим к нарушению их барьерной функции. Тем не менее, для отдельных представителей данной группы показаны немембранолитические механизмы микробного киллинга, свидетельствующие о наличии внутриклеточных мишеней их действия [113]. Антимикробные белки, в отличие от АМП, могут подавлять рост и размножение микроорганизмов как за счёт неферментативных, так и ферментативных механизмов [34].
С целью возможно более полного охвата разнообразных антимикробных эффектов АМП и белков для экспериментов по совместному действию нами были выбраны протегрин-1, бактенецин нейтрофилов козы с молекулярной массой 3,4 кДа и яичный лизоцим, показатели биологической активности которого близки к показателям активности лизоцима нейтрофилов человека. Первый имеет конформацию -шпильки, стабилизированной двумя дисульфидными мостами, и является одним из наиболее активных АМП с мембранолитическим типом действия [337]; второй относится к группе пролин-богатых пептидов, в антимикробной активности которых отмечена двойственность: в высоких концентрациях они также нарушают целостность бактериальных мембран, тогда как в низких действуют на внутриклеточные мишени без заметного повреждения клеточных оболочек [106, 338, 339]. Лизоцим – небольшой антимикробный белок (129 аминокислотных остатков) – способен вызывать гибель микроорганизмов как по неферментативному механизму, так и за счёт мурамидазной активности, т.е. расщепления пептидогликана клеточной стенки, приводящего к последующему лизису клеток под действием осмотического давления [3, 4].
Кроме того, представляло интерес рассмотрение совместного действия конвенциональных антибиотиков с АМП человека с позиции выявления препаратов, способных усиливать эффекты собственных защитных систем организма. Поэтому в рассмотрение были включены кателицидин человека LL-37, -дефенсины HNP-1 и HNP-4 и -дефенсины hBD-2 и hBD-3. LL-37 в растворе не имеет упорядоченной конформации, однако при контакте с бактериальной мембраной принимает форму -спирали и образует олигомерные структуры [105, 189, 330]. -Дефенсины, стабилизированные тремя дисульфидными связями, в пространстве образуют тройной антипараллельный -слой [340]. -Дефенсины отличаются от них порядком образования цистеиновых мостиков и наличием дополнительного -спирального участка на N-конце, который предположительно способствует заякориванию молекул пептида в бактериальной мембране [94, 341]. Для всех трёх групп пептидов механизм антимикробного действия связывают с повреждением бактериальных мембран, однако отмечают, что антимикробная активность -дефенсинов выражена менее, чем у или LL-37, и их отрицательное влияние на барьерную функцию мембран развивается достаточно медленно, сопровождаясь при этом резким снижением синтеза ДНК, РНК и белков и потерей бактерией способности к образованию колоний [87]. Для -дефенсина HNP-1 твердотельная ЯМР спектроскопия показала, что в модельных мембранах пептид образует поры c «димерной» топологией [342], не вызывающие значительного нарушения упаковки мембранных липидов в отличие от тороидальных пор [87], к модели которых исследователи склоняются для LL-37 [105] и -дефенсинов [94]. Согласно последним исследованиям hBD-3 и HNP-1 способны также ингибировать синтез клеточной стенки бактерий за счёт взаимодействия с липидом II [143,144].
Изучение действия препаратов на наружную и цитоплазматическую мембраны грамотрицательной бактерии E.coli ML-35p
Данная работа посвящена изучению сочетанной активности АМП с другими антибиотическими агентами и детергентами в области прямого антибактериального и цитотоксического действия и выявлению закономерностей, способных дать информацию о возможных механизмах проявления синергетических эффектов.
Изучение совместного антимикробного действия и его молекулярно-клеточных основ проводили в модельных системах in vitro, в которых использовались суспензии микроорганизмов в жидких питательных средах. Выбор жидких сред был обусловлен как возможностью одновременного рассмотрения большого числа проб, параллелей и разведений при относительно низкой время- и трудозатратности, так и способностью дефенсинов связывать гликопептиды и другие углеводосодержащие молекулы, что может влиять на их диффузию в агарозных гелях [87]. При установлении характера сочетанного действия, как антибактериального, так и цитотоксического, производили расчёт индексов фракционной концентрации компонент, аналогичных концентрационному индексу, предложенному в работах Чоу и Талалай [270], и использовали изоболографический метод. Учитывая погрешности, свойственные методам двукратных серийных разведений в целом и методу разведений по принципу «шахматной доски» в частности, а также возможные отклонения от линейности аддитивной зависимости [275, 276], синергизму сопоставляли значения индексов меньше либо равные 0,5, а антагонизму – большие двух, в соответствии с имеющимися в литературе рекомендациями [282].
В первую очередь сочетанные эффекты были рассмотрены для комбинаций АМП и антимикробных белков нейтрофилов, колокализованных в лизосомальных гранулах названных клеток, либо способных к сочетанному действию при секреции данных веществ в очагах воспаления. Синергизм антимикробного действия АМП и белков нейтрофилов известен и описан в литературе [327, 331, 5]. Эффекты усиления противомикробной активности дефенсинов в присутствии антимикробных белков описаны, в частности, в работах сотрудников лаборатории общей патологии ФГБНУ «ИЭМ», на базе которой было выполнено и данное исследование [324, 325]. Тем не менее, в связи с тем, что и антимикробные, и токсические свойства АМП связывают с их эффектами в отношении биологических мембран, представляется важным оценить, происходит ли одновременное усиление обоих видов активности: микробоцидной и цитотоксической – для одних и тех же сочетаний.
Синергетический характер совместного действия был выявлен для сочетаний -дефенсина hBD-3 с эластазой в отношении грамотрицательной бактерии E.coli ML-35p, а также для -дефенсина HNP-1 с катепсином G и эластазой в отношении грамотрицательных бактерий и с эластазой – в отношении грамположительных. Подобные эффекты согласуются с представлениями о синергетическом взаимодействии дефенсинов и антимикробных белков нейтрофилов [5, 332], при этом были использованы чёткие математические критерии, позволяющие отличить синергизм от простого аддитивного усиления.
Следует отметить, что -дефенсины и серпроцидины, к которым относятся эластаза и катепсин G, in vivo колокализованы в азурофильных гранулах нейтрофилов [34], что может свидетельствовать о том, что наблюдаемый in vitro синергетический эффект может иметь и важное биологическое значение.
Исследование сочетанного цитотоксического действия катепсина и эластазы с дефенсинами человека не выявило синергизма токсического действия в отношении эукариотических клеток для обладающих синергизмом антимикробной активности сочетаний за исключением случая совместного действия эластазы и hBD-3 на клетки эритромиелоидной лейкемии человека К-562, что в целом согласуется с представлениями о том, что мембраны опухолевых клеток вследствие происходящих в них изменений становятся более удобными мишенями для действия АМП [190, 191]. Тем не менее, для сочетания эластазы и одного из наиболее активных мембранолитических АМП млекопитающих протегрина-1 свиньи синергизм цитотоксического действия наблюдался как в отношении трансформированных, так и нормальных клеток.
Можно заключить, что одновременное синергетическое усиление антимикробного и цитотоксического действия для комбинаций АМП и антимикробных серпроцидинов нейтрофилов человека в целом не характерно и синергетическое взаимодействие можно считать специфическим, направленным против микроорганизмов. Однако для пептидов с сильно выраженной мембранолитической активностью и склонностью к токсическим эффектам вероятностью проявления синергизма обоих свойств пренебречь нельзя.
Рассмотрение сочетанного действия АМП и конвенциональных антибиотиков представляло интерес по нескольким причинам. С одной стороны совместное применение АМП и антибиотиков может быть рассмотрено в контексте возможных путей борьбы с мультирезистентными бактериальными инфекциями [161]. С другой – попадающие в организм антибиотики, очевидно, взаимодействуют с иммунной системой [344] и могут, в частности, действовать кооперативно в очагах воспаления с собственными АМП организма, поэтому представляется важным рассмотреть их сочетанный эффект.
Были рассмотрены представители основных классов АМП человека: кателицидин LL-37, -дефенсины HNP-1 и HNP-4, -дефенсины hBD-2 и hBD-3; высокоактивные АМП млекопитающих PG-1 с выраженным мембранотропным действием и СhBac3,4 – представитель обогащенных пролином АМП, для которых описывают двойственный тип действия: помимо мембранолитических свойств, проявляемых более активно в высоких концентрациях, отмечают наличие выраженных внутриклеточных механизмов антимикробной активности; а также антимикробный белок лизоцим, для которого помимо ферментативного механизма был выявлен неферментативный противомикробный эффект. Из конвенциональных антибиотиков рассматривали ряд веществ, отличающихся механизмом антибактериального действия.
Основными гипотезами, объясняющими возникновение синергетических эффектов, как упоминалось в п.1.8.1, являются модель ингибирования параллельных биохимических путей и модель повышения биодоступности. Принимая во внимание основной – мембранотропный – механизм действия АМП, второй сценарий в их случае выглядит более вероятным. Отчасти это предположение подтверждается тем, что большинство случаев синергизма наблюдалось между АМП, обладающими выраженным действием на проницаемость бактериальных мембран, и антибиотиками, влияющими на синтез белка и нуклеиновых кислот, которым для оказания своих микробоцидных эффектов требуется проникнуть внутрь клетки. Наиболее часто синергизм проявлялся в сочетаниях АМП с аминогликозидом гентамицином (позднее, сходные эффекты были показаны и для другого аминогликозида – амикацина), влияющим на синтез белка, тогда как эффекты совместного действия с влияющими на синтез нуклеиновых кислот антибиотиками (рифампицином и офлоксацином) проявлялись реже. Можно предположить, что определённую роль здесь играет скорость развития повреждающего эффекта: нарушения синтеза нуклеиновых кислот сказывается на жизнеспособности клетки в более отдалённой перспективе и не успевают внести существенный вклад на фоне быстрых повреждений, наносимых пептидом. Другим фактором может служить наличие жесткой сопряженной структуры из нескольких ароматических колец в составе молекул офлоксацина и рифампицина, тогда как ароматические кольца аминогликозидов не связаны столь жестко и способны к относительно свободному повороту друг относительно друга. Возможно, вызываемое этим различие в геометрических размерах молекул приводит к различной их способности проникать сквозь поры, образуемые АМП (подобное детергентам действие с полным разрушением бактериальных мембран при концентрациях пептида, меньших МИК, маловероятно).