Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 17
1.1. Клеточный материал, применяемый в саногенетической терапии и регенеративной медицине 17
1.1.1. Проблемные вопросы клеточных трансплантаций 27
1.2. Современные аспекты тканевой инженерии .28
1.2.1. Основные принципы построения тканеинженерных конструкций 28
1.2.2. Основные типы биоматериалов, применяемых для внеклеточного матрикса, в тканевой инженерии 36
1.2.3. Методы изготовления межклеточных матриксов 47
1.2.4. Конструктивное разнообразие тканеинженерных конструкций 49
1.2.5. Преимущества и недостатки современных тканеинженерных материалов 52
1.3. Биомедицинские материалы – сплавы на основе никелида титана 55
1.3.1. Структура и свойства пористого никелида титана 59
1.4. Заключение к обзору литературы. 68
Глава 2. Материал и методы 70
2.1. Материал исследования 70
2.2. Клеточные линии 74
2.3. Характеристика медицинских пористо–проницаемых материалов из сплавов на основе никелида титана, использованных для изготовления внеклеточных матриксов 74
2.4. Дизайн исследования .77
2.5. Технология имплантации клеток, иммобилизованных на внеклеточном матриксе из никелида титана 80
2.6. Методы определения биосовместимости внеклеточного матрикса из никелида титана. 81
2.7. Культуральные методы исследования 84
2.8. Биохимические методы исследования 85
2.9. Гистохимические окраски 85
2.10. Моделирование злокачественного опухолевого роста 86
2.11. Методы оценки эффективности саногенетических воздействий, при злокачественном росте 87
2.12. Создание печеночной тканеинженерной конструкции 94
2.13. Комбинированное введение клеток печени и стромальных клеток костного мозга на внеклеточном матриксе из никелида титана .96
2.14. Создание тканеинженерной конструкции поджелудочной железы .98
2.15. Сочетанное введение клеток поджелудочной железы и стромальных клеток костного мозга на внеклеточных матриксах из никелида титана 99
2.16. Сканирующая электронная микроскопия 100
2.17. Методы статистической обработки .100
2.18. Биоэтические аспекты исследования 101
Глава 3. Результаты собственных исследований 102
3.1. Параметры биосовместимости внеклеточных матриксов из никелида титана и модуляция ими клеточной жизнеспособности 102
3.1.1. Физико–технические параметры внеклеточных матриксов из никелида титана 102
3.1.2. Результаты испытаний биологической совместимости внеклеточных матриксов из никелида титана .104
3.1.2.1. Изменение клеточной биосовместимости при модификации поверхности образцов внеклеточного матрикса из никелида титана 105
3.1.2.2. Влияние модифицированной поверхности и архитектоники образцов внеклеточного матрикса из никелида титана на гемолитическую способность эритроцитов и цитотоксичность с фибробластами 111
3.1.3. Характеристика клеточной интеграции в зависимости от размеров и архитектоники образцов внеклеточного матрикса из никелида титана 115
3.1.4. Модуляция активности клеточных популяций на внеклеточных матриксах из никелида титана при воздействии светодиодного излучения 122
3.2. Тканеинженерные конструкции с использованием стромальных клеток костного мозга и внеклеточного матрикса из никелида титана 127
3.2.1. Основные аспекты трансплантации тканеинженерных конструкций из никелида титана .127
3.2.2. Цитотоксическая активность внеклеточных матриксов из никелида титана с различной средней пористостью со стромальными клетками костного мозга 130
3.2.3. Дифференцировка стромальных клеток костного мозга на внеклеточном матриксе из никелида титана .132
3.2.4. Развитие стромальных клеток костного мозга во внеклеточных матриксах из никелида титана 138
3.2.5. Противоопухолевое и антиметастатическое действие клеток аллогенного костного мозга на внеклеточных матриксах из никелида титана. 142
3.2.5.1. Противоопухолевое действие клеток аллогенного костного мозга на внеклеточных матриксах из никелида титана 142
3.2.5.2. Влияние трансплантации клеток аллогенного костного мозга на внеклеточных матриксах из никелида титана на морфофизиологические параметры иммунокомпетентных органов. .147
3.2.5.3. Трансплантация клеток аллогенного костного мозга на внеклеточных матриксах из никелида титана и адаптационные реакции организма 153
3.2.5.4. Влияние аллогенных клеток костного мозга на внеклеточном матриксе из никелида титана на неспецифические факторы иммунитета при опухолевом росте .155
3.2.5.5. Пролиферативный ответ спленоцитов на митогены после трансплантации аллогенных клеток костного мозга 159
3.2.5.6. Cубпопуляционный состав лимфоцитов селезенки после трансплантации аллогенных клеток костного мозга на внеклеточных матриксах из никелида титана 162
3.3. Трансплантация клеток печени на внеклеточных матриксах из никелида титана .165
3.3.1. Тестирование биосовместимости клеток печени с внеклеточными матриксами из никелида титана 165
3.3.2. Исследование развития клеток печени во внеклеточных матриксах методом электронной микроскопии 169
3.3.3. Саногенетическое действие тканеинженерных конструкций на основе внеклеточного матрикса из никелида титана с иммобилизованными клетками печени при экспериментальном CCl4–индуцированном гепатите .172
3.3.4. Сочетанное введение клеток печени совместно со стромальными клетками костного мозга на внеклеточных матриксах из никелида титана 185
3.3.4.1. Выявление оптимального соотношения клеток печени и стромальных клеток костного мозга при культивировании и получении эффективного терапевтического ответа 185
3.3.4.2. Саногенетическая эффективность сочетанной трансплантации клеток печени и стромальных клеток костного мозга на внеклеточных матриксах из никелида титана 189
3.3.4.3. Исследование гематологических показателей после сочетанного введения клеток печени и стромальных клеток костного мозга на фоне ССl4–индуцированного гепатита 197
3.4. Тканеинженерные конструкции на основе клеток поджелудочной железы, иммобилизованных на внеклеточных матриксах из никелида титана 202
3.4.1. Методология культивирования и имплантации клеток поджелудочной железы на внеклеточных матриксах из никелида титана 202
3.4.2. Развитие клеток поджелудочной железы в поровой структуре внеклеточного матрикса из никелида титана in vivo 205
3.4.3. Саногенетическое действие тканеинженерных конструкций на основе внеклеточного матрикса из никелида титана с клетками поджелудочной железы у экспериментальных животных с аллоксановым диабетом 208
3.4.4. Показатели периферической крови и костного мозга после трансплантации клеток поджелудочной железы на внеклеточном матриксе из никелида титана при аллоксаниндуцированном диабете 215
3.4.5. Сочетанное введение клеток поджелудочной железы со стромальными клетками костного мозга на внеклеточных матриксах из никелида титана 222
3.4.5.1. Выявление оптимального соотношения клеток поджелудочной железы и стромальных клеток костного мозга при совместном культивировании и получении эффективного терапевтического ответа 222
3.4.5.2. Саногенетическая эффективность сочетанного введения клеток поджелудочной железы и стромальных клеток костного мозга на внеклеточных матриксах из никелида титана 226
3.4.5.3. Изменение гематологических параметров после сочетанного введения клеток поджелудочной железы и стромальных клеток костного мозга на внеклеточных матриксах из никелида титана .230
Заключение. 235
Выводы 253
Список сокращений 255
Список литературы. 256
Приложения 295
- Основные принципы построения тканеинженерных конструкций
- Методы оценки эффективности саногенетических воздействий, при злокачественном росте
- Саногенетическое действие тканеинженерных конструкций на основе внеклеточного матрикса из никелида титана с иммобилизованными клетками печени при экспериментальном CCl4–индуцированном гепатите
- Изменение гематологических параметров после сочетанного введения клеток поджелудочной железы и стромальных клеток костного мозга на внеклеточных матриксах из никелида титана
Основные принципы построения тканеинженерных конструкций
Регенеративная медицина с использованием клеток включает в себя терапевтические и хирургические клеточные технологии (англ. аналог: organ regeneration and tissue engineering), направленные на частичную или полную компенсацию функций поврежденных или утраченных тканей (органов) [111, 140]. В настоящее время уровень науки и техники может предложить несколько путей замены или восстановления поврежденных, или пораженных патологией тканей и органов:
– биостимуляция регенерации тканей пациента с помощью биоактивных материалов;
– клеточная терапия, связанная со стимулированием клеточной/тканевой регенерации (cell–based tissue regeneration) при помощи трансплантации стволовых клеток в чистом виде или в совокупности с соматическими клетками и как разновидность – трансплантация 3D– организованных тканевых сфероидов;
– тканевая инженерия в виде пересадки клеток на различных матриксах для восстановления поврежденных тканей органов и их функций.
Одним из современных направлений регенерационной клеточной терапии является временное подключение биореакторов (культиваторов) с микрофрагментами ткани или изолированными клетками в экстракорпоральных контурах систем типа «биоискусственная печень» [388, 399, 481]. Данные способы клеточной терапии имеют существенные недостатки – это короткие сроки воздействия на орган вследствие низкой жизнеспособности донорских изолированных клеток (несколько часов). Методом предварительной посадки клеток на внеклеточные матриксы можно увеличивать сроки выживания изолированных клеток, это дает адгезивным клеткам возможность контактного взаимодействия, увеличивает жизнеспособность и адаптирует их к действию различных внешних факторов [481]. Но при этом возникают следующие проблемы:
– требуется включение в контур перфузионных систем дополнительных механизмов для оксигенации и детоксикации крови больного и соответствующих управляющих блоков, а это в свою очередь приводит к повышению себестоимости метода;
– нужно использовать специальные гомогенизаторы для получения кусочков тканей необходимого размера, следовательно, возрастает риск инфицирования донорского материала;
– необходимо использовать большее количество донорского материала, а это приводит к избыточной активации иммунной системы реципиента и соответственно сокращается период функционирования клеточного материала;
– требует использования в биореакторах клеток в совокупности с фрагментами биосовместимого материала, которые необходимы для адгезии клеток и не дают слипаться микрофрагментам тканей, но это приводит к гибели клеток в глубоких слоях микрофрагментов;
– вследствие постоянной профилактики таких систем их подключают периодически, что исключает непрерывность регуляторной поддержки больного.
Многочисленные ограничения, возникающие при использовании экстракорпоральных перфузионных систем, приводят к необходимости разработки устройств, создающих условия непрерывного функционирования и метаболической поддержки больного–интракорпоральных биомодулей, способных обеспечить постоянную и долговременную коррекцию патологического органа. Многие исследователи при использовании методов клеточной трансплантации столкнулись с малой эффективностью трансплантированных донорских клеток в организме больного, такая трансплантация не обеспечивает необходимый терапевтический результат, при этом низкий уровень приживления клеток не дает нужного результата на регенерационный процесс [59, 60, 133]. После первых клинических исследований стало понятно, для того чтобы клеточная терапия заняла свое место в арсенале методов лечения различных патологий, она должна иметь превосходящую эффективность по отношению к традиционным методам лечения. Так трансплантация изолированных гепатоцитов в настоящее время остается малоэффективной из–за слабого приживления и массовой гибели клеток после трансплантации [440]. Трансплантация островковых клеток перед трансплантацией всего органа имеет яркие преимущества, но результаты алло– и ксенотрансплантаций поджелудочной железы остаются не удовлетворительными. Что связано, в основном, с небольшой продолжительностью антидиабетического эффекта и требует многократной трансплантации клеток. Продолжительность функционирования островковых клеток составляет около 6–12 мес. [78]. Область трансплантации (большой сальник, пульпа селезенки или печени, воротная вена и т.д.) существенно не влияет на выживаемость клеток, основной объективной причиной гибели клеток является реакция иммунного отторжения [191, 309, 326, 467]. При этом для снижения отторжения несовместимых трансплантированных клеток используют различные препараты–иммунодепрессанты. Но постоянное длительное применение таких препаратов приводит к тяжелым побочным эффектам: снижению сопротивляемости инфекциям, почечной недостаточности, развитию злокачественных новообразований [192].
Полагают, что основной причиной низкой эффективности применения суспензий адгезирующих клеток является отсутствие возможности контактного взаимодействия и прикрепления клеток с формированием функциональной тканевой архитектоники обеспечивающей необходимое регуляторное воздействие на поврежденный орган [47]. Вследствие этого одним из вариантов введения клеток в клеточной терапии является трансплантация их не в кровеносное русло, а в брюшную полость, селезенку, подкожную клетчатку или паренхиму печени.
Следующей причиной, ограничивающей внутрипортальное или внутриселезеночное введения гепатоцитов, является ограниченное количество клеток, которое можно вводить в эти органы без осложнений [388]. При этом клетки, изолированные из тканей, теряют морфологию взрослых клеток и специфичные функции, после их культивирования в суспензии или монослое [131]. Огромное значение для клеточной функциональности имеет сохранение клетками объёмной структуры и цитоскелета. Для этого ученые стремятся разработать культуральные модели, основанные на натуральной архитектуре ткани, чтобы воссоздать ее сложное микроокружение. Моделирование внеклеточного матрикса может включать вариации, как в составе биоматериала, так и в архитектуре самой пористой конструкции.
Вначале использовали двухмерные имплантируемые конструкции с клетками, интегрируя конструкцию с окружающими тканями [277]. В дальнейшем с накоплением определенного опыта и применением новых технологий в качестве внеклеточного матрикса для клеточного материала стали использовать трехмерные материалы [407]. Как показали Ise H. с соавт. [Ise H. et al.,1999] гепатоциты мыши в трехмерных объемных культурах на 0,3% агарозном геле в отличие от монослойных культур обладали большей (около 3 недель) выживаемостью, высоким уровнем синтеза альбумина, низкой активностью лактатдегидрогеназы, высокой самосборкой тканеподобных агрегатов [290]. Культивирование гепатоцитов крысы на ЗD–матриксе полимолочной кислоты приводило к медленному уменьшению числа клеток на матриксе в течение 2–х недель до 71% от первоначального количества клеток, в то же время не происходило уменьшения экспрессии гепатоцит–специфических генов. При этом клетки, культивируемые в унифицированной культуральной посуде в монослое, стали погибать уже на 3 день, и к 7 дню жизнеспособных клеток уже не было [302]. В других работах было показано преимущество выживания и длительного культивирования гепатоцитов на 3D матриксах из коллагена и поливинилового спирта вместе с клетками поджелудочной железы по сравнению с монослойным культивированием. Здесь клетки на 3D–матриксах сохраняли свою функциональную активность продолжительное время до 6 месяцев in vivo [304, 310, 311]. Также отмечена лучшая выживаемость гепатоцитов на 3D–матриксах из полимолочной кислоты (PLA) [303], полигликолевой кислоты (PGA) и их сополимерах [372] по сравнению с аналогичными 2D– матриксами.
Главной целью тканевой инженерии является создание анатомо–функциональных заменителей тканей, трехмерная структура которых соответствует поврежденным органам [248, 266] путем биологического имитирования существующих естественных прототипов с применением биосовместимых клеточных матриксов в сочетании с донорскими клетками и/или биоактивными веществами [390, 480], которые будучи имплантированными или трансплантированными в организм реципиента будут восстанавливать и/или замещать пораженную ткань или больной орган. Необходимым компонентом для реализации этой стратегии становятся внеклеточные матриксы – биоматериалы трехмерного строения (их называют клеточными носителями, матриксами, матрицами, англ. аналог – scaffold), которые имитируют естественные внеклеточные среды организма, служат субстратом для адгезии различных клеток, способствуют поддержанию их пролиферативной активности и направленной дифференцировки, с помощью которых осуществляется направленная доставка клеток в область дефекта и стабильное нахождение в реципиентном ложе [345], а также определяют форму и физико–механические свойства медицинского изделия. Одним из ключевых этапов создания тканеинженерного эквивалента необходимой ткани является выбор оптимального внеклеточного матрикса для трансплантируемых клеток [58].
К современным биоматериалам, из которых изготовлен скаффолд, предъявляют многочисленные строгие требования. Параметры, которым должен соответствовать «идеальный внеклеточный матрикс»: тканегенность (наличие клеточных источников для процесса репаративной регенерации), специфическая тканеиндуктивность (способность активировать элементы реципиентного ложа), тканепротективность (способность частично или полностью выполнять биологические функции ткани на время имплантации), тканекондуктивность (свойство быть проводником для роста воссоздаваемой ткани) [59, 86]. Эти конструкции должны быть нетоксичными, не канцерогенными, инертными в отношении к биологическим тканям, иметь достаточный запас механической прочности, быть стойкими к воздействию факторов внутренней среды организма. Анатомо–физиологическое предназначение клеточных матриксов – создание структурной поддержки (обеспечение адгезии и миграции клеток), возможностей васкуляризации и ремоделирования регенерирующей ткани, оптимальных условий для метаболизма и дифференцировки клеток. При этом матрикс должен соответствовать биомеханическим свойствам ткани, в которую имплантируют конструкции (эластичность, прочность) [231], так как главное предназначение, которого – биомеханический каркас для клеток [446]. Матриксы должны иметь ряд параметров, которые позволят им сформировать полноценную ткань взамен поврежденной. Структура матрикса должна осуществлять элиминацию продуктов метаболизма, активный перенос и доставку питательных веществ, кислорода, регуляторных факторов роста и за счет прорастания в него сосудов и для предотвращения ишемического повреждения и гибели клеток. Технология получения и обработки данного биоматериала матриксов должна позволять изготавливать соответствующую по форме, структуре и размерам конструкцию тканевого дефекта, который необходимо восстановить для быстрого и полноценного тканегенеза за счет плотного прилегания материала имплантата к ткани реципиента. Особое значение имеет также простота стерилизации и дешевизна при производстве как материала скаффолда, так и изготовления из него различных конструкций.
Методы оценки эффективности саногенетических воздействий, при злокачественном росте
Материал для исследований забирали на 18-й день роста опухоли после цервикальной дислокации мышей. Эффективность терапии оценивалась по торможению роста опухоли и метастазирования. Оценку противоопухолевой и антиметастатической активности исследуемых агентов проводили с использованием принятых в экспериментальной онкологии методов [149].
Динамика роста опухолей оценивалась путем измерения циркулем 3-х взаимноперпендикулярных диаметров опухоли и вычисления ее объема по формуле:
V= LOD7I/6, [Millar J.L., 1980],
где L - наибольший диаметр, С, D - диаметры, перпендикулярные к нему. Эффективность лечения оценивали по проценту торможения роста опухоли (ТРО), который вычислялся по формуле:
ТРО = (Vk - Vo) / Vk х 100%,
где Vk - объём опухоли в контроле, Vo - объём опухоли в опыте.
По окончании эксперимента определяли массу опухолевого узла. Распространенность метастатического процесса оценивали по частоте метастазирования и по среднему количеству метастазов в легких, приходящемуся на 1 животное. Метастазы определялись под бинокулярным микроскопом с 4-х кратным увеличением. Антиметастатическое действие трансплантата оценивали по следующим показателям: частота и интенсивность метастазирования, суммарный объем метастатических колоний в легких. Степень метастазирования характеризовал индекс ингибирования метастазирования, вычисляемый по формуле:
ИИМ = ((Ак х Вк - А х В)/ Ак х Вк) х 100%, где Ак и А - частота метастазирования в легкие у мышей контрольной и опытной групп, Вк и В - среднее число метастазов в контрольной и опытной группах.
Общий объем метастазов вычисляли, исходя из диаметра отдельных метастатических узлов: V (мм3) = 0,52 D (мм) [15].
Получение суспензии клеток селезенки [Шахов В. П., Дамбаев Г. Ц., Зайцев К. В. и др., 2004] Селезенку асептически удаляли из брюшной полости. С помощью пинцета и скальпеля отделяли строму от клеток паренхимы. Ткань гомогенизировали в стерильном стеклянном гомогенизаторе, затем центрифугировали в течение 5 минут при 4оС со скоростью 450g. Осадок ресуспендировали в среде RPMI–1640 с добавлением 10% инактивированной бычьей сыворотки и 40 мкг/мл гентамицина. Все операции проводили при 4оС. Удаление прилипающих к пластику клеток осуществляли путем инкубации суспензии спленоцитов в чашках Петри в среде RPMI– 1640 с 10% инактивированной ЭТС при 37ОС в атмосфере 5% СО2 в течение 1 часа. Фракцию не прикрепившихся клеток собирали и ресуспендировали в полной культуральной среде.
Подсчет числа клеток и определения их жизнеспособности [Шахов В. П., Дамбаев Г. Ц., Зайцев К. В. и др., 2004] Для определения числа клеток в суспензии и их жизнеспособности использовали 0,4% растворы трипанового синего. Число клеток в камере Горяева определяли по формуле: Х = А х В х 104,
где А – число клеток в 25 исчерченных квадратах камеры Горяева В – разведение.
Техника постановки цитостатического теста [Gadiot (1982) и модифицированная И. В. Богдашиным (1986)].
Свежевыделенные клетки–мишени Р–815 или клетки К–562 (2х105 клеток на лунку) инкубировали совместно с клетками–эффекторами в соотношении 20:1 в течение 14 часов в 96– ти луночных плейтах в полной культуральной среде.
Затем в каждую лунку добавляли 3Н – тимидин (1мкКи/лунку, удельная активность 5 Ки/мм, «Изотоп», Россия), клетки инкубировали 4 часа при 37оС в атмосфере 5% СО2, после чего переносили с помощью 12–ти канального сборщика фракций на фильтры (Flow, Англия), промывали ячейки изотоническим физиологическим раствором (200 мл на ряд), холодным 5% раствором трихлоруксусной кислоты (200 мл на ряд) и 96% этиловым спиртом (50 мл на ряд). Измерение радиоактивности проводили на счетчике Mark – 3 (Trakor Analytic, Голландия).
Индекс цитостазиса вычисляли по формуле:
ИЦС (%) = (1 – О/К) х 100%,
где, О – количество импульсов в опытных лунках
К – количество импульсов в лунках, где инкубировались одни клетки–мишени.
Реакция бластной трансформации лимфоцитов
[Хоробрых В. В. и др., 1986].
Под влиянием митогенов и антигенов лимфоциты трансформируются в бластные формы, способные синтезировать ДНК и делиться. Интенсивность этого процесса можно оценивать по включению меченного изотопом тимидина в ДНК делящейся клетки. В качестве митогена, селективно стимулирующего Т–клетки, используется фитогемагглютинин (ФГА, «Sigma») в концентрации 5–10 мкг/мл, в качестве стимулятора бластогенеза В–лимфоцитов – липополисахарид (ЛПС, «Sigma») 20–50 мкг/мл и в качестве митогена в концентрации 50 мкг/мл стимулирующего Т–лимфоцитарное звено – конканавалин А. В лунку помещались 5х105 спленоцитов мышей в 0,2 мл культуральной среды и добавлялись митогены в оптимальных дозах в количестве 10 мкл, либо такое же количество полной культуральной среды. Планшеты находились в СО2–инкубаторе в абсолютно влажной атмосфере с 5% СО2 в течение 48 часов. Затем в каждую лунку добавляли 0,5 мкКи 3Н–тимидина и инкубировали еще 24 часа. Дальнейшая обработка проводилась так же, как при постановке цитостатического теста. Результаты представлялись индексом стимуляции, который вычислялся по формуле:
ИС = О/К, где
О – включение метки (число имп/мин) в культуре клеток, стимулированной митогенами,
К – число имп/мин в культуре клеток без митогена.
Тестирование активности нейтрофилов [Nathan С. F., 1980]
Хемилюминесцентную реакцию нейтрофилов оценивали по методу Nathan С. F., основанному на регистрации активных форм кислорода (АФК). Для индукции кислородного взрыва использовали 1% раствор опсонизированного зимозана в конечной концентрации 1 мкМ/мл. Продукцию АФК нейтрофилами регистрировали хемилюминометрически с помощью прибора «Luminometer–1251» (LKB, Швеция) в присутствии люминофора люминола. Раствор люминола готовили последовательным разведением коммерческого препарата в диметилсульфоксиде и растворе Хенкса до концентрации 253 мкМ. В измерительные виалы помещали 800 мкл крови мышей, разведенной в 10 раз раствором Хенкса. Добавляли 100 мкл люминола. Виалы помещали в термостатируемую (37оС) карусель люминометра и выдерживали 10 минут для прогревания пробирок, а затем производили запуск программы измерения.
После регистрации спонтанной хемилюминисценции (ХЛ) в опытные виалы добавляли 100 мкл раствора опсонизированного зимозана, а в контрольные виалы – 100 мкл раствора Хенкса и продолжали запись. Обработку данных производили на персональном компьютере с использованием программы «Lumograf», разработанной сотрудниками лаборатории иммунологии НИИ онкологии и кибернетического центра Томского политехнического университета [174].
Интервал между двумя измерениями был не более 4–х минут, время интегрирования светового импульса в одной виале – 5 секунд. В качестве показателя реактивной ХЛ использовался интеграл, выраженный как светосумма сигнала, посчитанного за 60–и минутный период, начиная с момента добавления стимула.
Индекс активации И(а), вычисляли по формуле:
И(а) = Х(стимул) – Х(контроль), где
Х(стимул) – светосумма ХЛ ответа нейтрофилов за 60 минут от момента добавления стимулятора респираторного взрыва у макрофагов,
Х(контроль) – светосумма ХЛ ответа нейтрофилов за 30 минут от момента добавления раствора Хенкса.
Определение субпопуляционного состава лимфоцитов селезенки Субпопуляционный состав иммунокомпетентных клеток селезенки мышей определяли иммуноцитохимическим методом с использованием моноклональных антител (МКА) к дифференцировочным и активационным антигенам лимфоцитов. Результат реакции учитывали визуально по свечению флюоресцентного красителя на люминесцентном микроскопе. В работе использовались моноклональные антитела следующих специфичностей: Thy–1+ – зрелые Т– клетки («Медбиоспектр»; Москва); CD4+ – Т–хелперы/индукторы («Sigma»; США); CD8+ – цитотоксические Т–лимфоциты («Sigma», США); CD25+ –клетки с рецептором к интерлейкину 2 («Sigma», США); HLA–DR – В–лимфоциты, несущие рецепторы HLA–DR+ («Медбиоспектр»; Москва).
Саногенетическое действие тканеинженерных конструкций на основе внеклеточного матрикса из никелида титана с иммобилизованными клетками печени при экспериментальном CCl4–индуцированном гепатите
В настоящей работе впервые для имплантации использовали модифицированные пористо–проницаемые никелидтитановые внеклеточные матриксы, используемые в предыдущих исследованиях (глава 3). При имплантации интактных внеклеточных матриксов из никелида титана в сальник крыс они не вызывали воспалительной реакции у экспериментальных животных, сохраняли присущую им пористую структуру в течение длительного эксперимента – до 1,5 лет [50].
Эти данные свидетельствуют о стабильности (коррозионной устойчивости) пористой конструкции, надежном биосовместимом потенциале, а также о возможности применения модифицированных образцов из пористого никелида титана, в качестве внеклеточных матриксов, для разработки имплантируемых тканеинженерных печеночных конструкций.
В то же время интактные пористые матриксы из никелида титана не насыщенные клетками после имплантации в сальник заселялись адипоцитами и другими клетками хозяина (клетки крови, фибробласты) [49]. Модификация матриц путем изменения поверхности скаффолда (кислотная обработка) не препятствовала пролиферации клеток в культуре, а плотное насыщение пористой конструкции клетками печени позволило предотвратить массовое заселение чужеродными клетками пористых матриксов после имплантации. Следует отметить, что положительный терапевтический эффект от имплантации матриц, заселенных клетками печени, проявлялся уже в течение первой недели после инициации ССl4–индуцированного гепатита и сохранялся до конца срока наблюдения.
Исследование оценки корригирующих возможностей клеток печени проводили в виде клеточной суспензии и имплантируемых тканеинженерных конструкций. Измерение биохимических показателей после моделирования печеночной недостаточности и трансплантации клеток в виде клеточной суспензии и тканеинженерных конструкций проводили в течение 1,5 месяца. В эти сроки у животных в сыворотке крови измеряли динамику изменения концентрации общего белка, альбумина, фибриногена, лактата, общего билирубина, концентрации печеночных трансаминаз: алланинаминотрансферазы (АЛТ) аспартатаминотрансферазы (АСТ), и щелочной фосфатазы (ЩФ).
Как известно из литературных данных развитие ССl4–индуцированного гепатита сопровождается появлением очагов некроза, локализованных центролобулярно, дистрофии гепатоцитов и в дальнейшем всей печени [9]. В наших исследованиях эти изменения наблюдались в связи с увеличением ферментов трансаминаз: АЛТ, АСТ и ЩФ (рисунки 63, 64, 65).
Показатели биохимических анализов сыворотки крови, взятой через сутки после окончания введения тетрахлорметана, показали существенное увеличение уровня энзима аспартаттрансферазы – с 45 до 101. Ед./л (в 2,24 раза), что свидетельствовало о разрушении клеток печени (цитолиз), вызванного токсическим влиянием на печень хлористого углерода. Проба Маклагана (белково–синтетическая функция печени) была также положительна, увеличение составило 2,5 раза – с 2,1 до 5,2 Ед. (Н – S). В группе, где клетки печени имплантировались инъекционно, происходило быстрое снижение концентрации данного фермента на 15–е сутки, но в дальнейшем (на 30, 45–е сутки) отмечено возрастание его концентрации до уровня CCl–контроля. В те же сроки в опытной группе активность аспартаттрансферазы неуклонно снижалась в течение всего периода исследования, достигнув 51 Ед/л на 45–е сутки исследования (рисунок 63).
Сыворотка крови, взятая через сутки после окончания введения тетрахлорметана, показала существенное увеличение уровня энзима аспартаттрансферазы – с 30 до 60 Ед/л (в 2 раза), что свидетельствовало о токсическом влиянии хлоруглерода на структуру печени, вызывая повреждения гепатоцитов. В группе, где клетки печени имплантировались инъекционно, происходило быстрое снижение концентрации данного фермента на 15–сутки после инъекции, однако на 45–е сутки отмечено относительное повышение этого фермента, что говорит о непродолжительном воздействии инъекционно вводимых клеток печени. В группе «КП+TiNi» активность аланинтрансферазы постепенно снижалась в течение всего периода исследования, составив 37 Ед/л на 45–й терминальный день исследований (рисунок 64).
Анализ крови, взятой через сутки после окончания введения хлористого углерода, показал значительное увеличение уровня энзима щелочной фосфатазы – с 96 до 178 Ед/л (в 1,9 раз), указывающее на значительные повреждения энзиматического аппарата печени после введения тетрахлорметана. При этом у животных с имплантированными интактными матриксами было отмечено недостоверное повышение активности данного фермента по сравнению с группой без оперативного вмешательства (рисунок 65).
В другой группе, где клетки печени имплантировались инъекционно, на 15–е сутки после инъекции происходило резкое снижение концентрации данного фермента, хотя на 45–е сутки было отмечено достоверное возрастание фермента, по сравнению с группой «КП+TiNi», что говорит о непродолжительном воздействии инъекционно вводимых клеток печени. Щелочная фосфатаза в группе «КП+TiNi» последовательно снижалась в течение всего периода исследования, уменьшившись до показателей здоровых интактных животных на 45–е сутки исследования (рисунок 65).
Таким образом, показано, что активность всех трансфераз (рисунки 63–65) в группах «CCl» и «TiNi» повышалась на 0–30–е сутки после введения тетрахлорметана и к 30–м суткам стабилизировалась на определенном уровне. Имплантация внеклеточных матриксов с иммобилизованными клетками печени нивелировала повышение активности трансфераз на 30–е и 45–е сутки после введения, а АЛТ – в течение всего периода наблюдения (р 0,05) по сравнению с группой, где клетки печени вводились инъекционно.
В опытной группе животных после введения клеток печени на внеклеточном матриксе из никелида титана биохимические показатели крови (АЛТ, АСТ, ЩФ) приблизились к первоначальным значениям интактных здоровых животных, что свидетельствовало о купировании некротических и дистрофических процессов в печени и восстановлении её функциональной активности.
Изучение динамики развития ССl4–индуцированной печеночной недостаточности позволило установить, что на первые сутки после моделирования печеночной недостаточности общий белок сыворотки крови резко снизился (с 68 до 43 г/л) (рисунок 66). Стал нарастать ацидоз (повысилась концентрация молочной кислоты) (с 1,5 до 4,4 ммоль/л) (рисунок 67) и резко увеличился уровень печеночных ферментов (рисунки 63–65). Оперативное вмешательство по имплантации пористо–проницаемого никелида титана без клеток не вызвала значительных колебаний регистрируемых показателей у подопытных животных. Были отмечены лишь небольшие сдвиги исследуемых показателей, не приводящие к достоверно значимым результатам. Введение клеток печени инъекционно приводило к достоверному увеличению общего белка сыворотки до 58 г/л (рисунок 66) и снижению ацидоза в сыворотке крови, что показывает уменьшение лактата до 2,8 ммоль/л. Эти данные коррелируют с изменением уровня цитолитических ферментов, описанных ранее. На 30–е сутки происходило резкое снижение концентрации общего белка сыворотки крови в данной группе и постепенное возвращение к норме на 45–е сутки эксперимента. Показанное снижение мы связываем с кратковременным действием инъекционно вводимых клеток, функциональность которых быстро падает под воздействием иммунных факторов, действующих на незащищенные аллогенные клетки.
Имплантация ВМНТ с клетками печени оказывало стабилизирующее влияние на течение ССl4–индуцированного гепатита. Это воздействие наглядно демонстрировало стабильное увеличение концентрации общего белка сыворотки крови в разные сроки исследования, достигая 63 г/л в терминальные сроки исследования (45–е сутки) приближаясь к показателям контрольной группы. Концентрация лактата также стабильно снижалась до 1,7 ммоль/л, достигая показателей контрольной группы интактных животных на 45–е сутки исследования, тем самым приводя к нормализации параметры кислотно–щелочного состава крови у опытных животных (рисунок 67).
При анализе показателей плазменного звена гемостаза было отмечено, что до моделирования печеночной недостаточности у крыс имел место сдвиг в сторону гиперкоагуляции. Этот сдвиг характеризовался повышенным уровнем протромбинового индекса – 133% (рисунок 68), высоким содержанием фибриногена – 6000 мг/л (рисунок 69) и снижением агрегационной активности тромбоцитов – 9%.
После введения хлористого углерода изменения, активированного частичного тромбопластинового времени, не происходило, уровень протромбинового индекса через сутки составил 154% (рисунок 68), значительно увеличился уровень тромбинемии (растворимые комплексы фибрин–мономера составили 28 мг%).
Изменение гематологических параметров после сочетанного введения клеток поджелудочной железы и стромальных клеток костного мозга на внеклеточных матриксах из никелида титана
Курсовое введение аллоксана приводило к уменьшению общего количества лейкоцитов периферической крови (рисунок 100).
Динамика изменения общего числа лейкоцитов (109/л) периферической крови крыс стока Wistar после совместной трансплантации клеток поджелудочной железы (КПЖ) и стромальных клеток костного мозга (СККМ) на внеклеточном матриксе из никелида титана (ТІМ) при аллоксаниндуцированном диабете; - различия достоверны при р 0,05 по отношению к группе «Аллоксан».
Отмечено их снижение по сравнению с контрольной группой интактных животных в 1,5 раз на первые сутки эксперимента. В группе с введением КПЖ без СККМ на матриксе из никелида титана уровень лейкоцитов стабилизировался и возрастал в течение всего периода эксперимента с 9,7х109 л на 7-е сутки до 12,8х109 л на 21-е сутки. Наиболее высокие значения лейкоцитов в крови по сравнению с другими группами были отмечены в группе «КПЖ+СККМ+ТІМ» в конечной стадии эксперимента (21 сутки) и достигали 13,2x109 л. (рисунок 100). При этом не было отмечено достоверного отличия с группой «КПЖ+ТІМ».
Исследование динамики содержания отдельных форм лейкоцитов выявило некоторые изменения в показателях этого звена между группами с однородным и сочетанным введением клеток на внеклеточных матриксах из никелида титана, так после введения аллоксана на 7-21-е сутки исследования наблюдалось резкое снижение числа сегментоядерных лейкоцитов и лимфоцитов в крови животных.
В группе, где клетки поджелудочной железы вводили без СККМ, наблюдался стабильный подъем сегментоядерных лейкоцитов, при этом подъем этой субпопуляции клеток крови в группе с сочетанным введением КПЖ и СККМ был более существенным и превышал показатели аллоксанового контроля, но при этом достоверно не отличался от группы с моноклеточной трансплантацией, за исключением терминальной стадии эксперимента, где он достоверно вырос на 19%, сравнявшись с показателями интактного здорового контроля (рисунок 101).
Введение аллоксана также вызывало существенное уменьшение содержания и циркулирующих палочкоядерных нейтрофилов у мышей опытной группы через сутки.
Отмечено, что введение аллоксана заметно снижало общее количество миелокариоцитов в 1,5 раза на 7–е сутки. После введения единообразной популяции клеток на ВМНТ количество миелокариоцитов возрастало с 14–х суток эксперимента и оставалось на таком уровне до 21–х суток (рисунок 102), что говорит об ускоренной компенсации костномозгового клеточного обновления.
При этом нормализация количества миелокариоцитов шла более быстрыми темпами в опытной группе по сравнению с группой с моноклеточным введением на ВМНТ и не превышала показатели интактного контроля во все периоды исследования, что говорит о стабилизирующем влиянии сочетанного введения клеток на процессы костномозгового гемопоэза (рисунок 102).
В данном эксперименте также было зафиксировано изменение количества эритробластов костного мозга. Так в контрольной группе, без клеточных введений, было продемонстрировано выраженное увеличение числа эритробластов на протяжении всего эксперимента, с максимумом в 2,8 раза от исходных значений контрольной группы интактных животных на 7–е сутки исследования. Снижение этого показателя происходило очень медленно, что говорит о выраженном токсическом влиянии аллоксана на эритроидный росток, даже на 21–е сутки исследования показатели всех групп не сравнялись, с показателями интактных животных.
Введение монокультуры КПЖ на ВМНТ приводило к снижению этого показателя в терминальной стадии эксперименте (21–е сутки). Наиболее эффективной группой, оказалась группа с сочетанным введением КПЖ и СККМ, здесь количество эритробластов значительно снизилось на 14–21–е сутки исследования и достоверно отличалось от всех групп аллоксанового контроля. При этом на 21–е сутки исследования данные опытной группы были наиболее близки к показателям интактной группы здоровых животных (рисунок 103).
Эти данные говорят о неспецифическом характере изменений и они, очевидно, связаны с активацией стрессреализующих систем организма при формировании патологии поджелудочной железы с помощью аллоксана. На это указывает изменения картины периферической крови и костного мозга, посредством общего токсического влияния аллоксана на стволовые и региональные клетки различных классов. При этом сочетанное введение клеток на ВМНТ по сравнению с трансплантацией одних КПЖ не оказывало существенного влияния на показатели периферического звена кроветворения, но позволяло достоверно корректировать костномозговой гемопоэз. Сочетанное введение клеток на внеклеточном матриксе из никелида титана нормализовало параметры костномозгового гемопоэза посредством стромальных клеток костного мозга, что может быть в дальнейшем применяться для коррекции патологий гемопоэза связанных с сахарным диабетом.