Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Роль гиперпаратиреоза в формировании иммунного статуса при хронической почечной недостаточности (обзор литературы) 15
1.1. Современные представления о патогенезе изменений иммунного статуса при хронической почечной недостаточности 15
1.1.1. Механизм изменений врожденного и адаптивного иммунитета при хронической почечной недостаточности 16
1.2. Роль гиперпаратиреоза в изменении гомеостаза при хронической почечной недостаточности 21
1.2.1. Изменение фосфорно-кальциевого гомеостаза и патогенез гиперпаратиреоза при хронической почечной недостаточности 21
1.2.2. Механизмы и последствия изменений гомеостаза при гиперпаратиреозе, плейотропные эффекты паратиреоидного гормона 27
1.2.3. Паратиреоидный гормон и иммунный статус 35
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 44
2.1. Общая характеристика исследуемых клинических групп 44
2.2. Экспериментальная часть исследований
2.2.1. Эксперименты в условиях in vivo 46
2.2.2. Эксперименты в условиях in vitro 50
2.3. Методы исследования 52
2.3.1. Иммунологические методы исследования 52
2.3.1.1. Исследование врожденного иммунитета 52
2.3.1.2. Исследование адаптивного иммунитета 54
2.3.1.3. Определение концентрации некоторых цитокинов в плазме крови человека и крыс 57
2.3.1.4 Исследование апоптоза лимфоцитов 57
2.3.2. Биохимические методы исследования 58
2.3.3 Статистические методы исследования 62
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований и их обсуждение 64
3.1. Иммунный статус у больных с хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе 64
3.1.1. Врожденный иммунитет у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе 64
3.1.2. Адаптивный иммунитет у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе 68
3.1.3. Цитокиновый профиль и его роль в изменении иммунного статуса у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе 71
3.1.4. Показатели фосфорно-кальциевого гомеостаза и их роль в изменении иммунного статуса больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе 75
3.2. Патогенез изменения иммунного статуса при экспериментальной хронической почечной недостаточности 78
3.2.1. Показатели врожденного и адаптивного иммунитета при экспериментальной хронической почечной недостаточности 78
3.2.2. Концентрация некоторых цитокинов в плазме крови при экспериментальной хронической почечной недостаточности 82
3.2.3. Концентрация веществ низкой, средней молекулярной массы в плазме крови при экспериментальной хронической почечной недостаточности 85
3.2.4. Показатели свободно-радикального окисления в плазме крови и в лимфоцитах периферической крови при экспериментальной хронической почечной недостаточности 88
3.2.5. Показатели гибели лимфоцитов периферической крови при экспериментальной хронической почечной недостаточности 94
3.2.6. Показатели фосфорно-кальциевого гомеостаза при экспериментальной хронической почечной недостаточности 96
3.3. Патогенез изменений иммунного статуса при экспериментальном гиперпаратиреозе 99
3.3.1. Фосфорно-кальциевый гомеостаз при экспериментальном гиперпаратиреозе 99
3.3.2. Показатели врожденного и адаптивного иммунитета при экспериментальном гиперпаратиреозе 101
3.3.3. Концентрация некоторых цитокинов в плазме крови при экспериментальном гиперпаратиреозе
3.3.4. Содержание веществ низкой, средней молекулярной массы в плазме крови при экспериментальном гиперпаратиреозе 107
3.3.5. Показатели свободно-радикального окисления в плазме крови и в лимфоцитах периферической крови при экспериментальном гиперпаратиреозе 108
3.3.6. Показатели гибели лимфоцитов при экспериментальном гиперпаратиреозе 113
3.3.7. Влияние ПТГ на функциональную активность нейтрофилов в экспериментальных условиях in vitro 1 1 8
3.3.8. Влияние ПТГ на показатели секреторной способности монуклеаров периферической крови в экспериментальных условиях in vitro 120
3.3.9. Влияние ПТГ на показатели гибели лимфоцитов периферической крови в экспериментальных условиях in vitro 122
3.4. Влияние амлодипина на иммунный статус при экспериментальном гиперпаратиреозе 124
3.4.1. Влияние амлодипина на фосфорно-кальциевый гомеостаз при экспериментальном гиперпаратиреозе 125
3.4.2. Влияние амлодипина на показатели врожденного и адаптивного иммунитета при экспериментальном гиперпаратиреозе 126
3.4.3. Влияние амлодипина на цитокиновый профиль в крови при экспериментальном гиперпаратиреозе 132
3.4.4. Влияние амлодипина на содержание веществ низкой, средней
молекулярной массы в крови при экспериментальном гиперпаратиреозе 133
3.4.5. Влияние амлодипина на показатели свободно-радикального окисления в плазме крови и в лимфоцитах периферической крови при экспериментальном гиперпаратиреозе 134
3.4.6. Влияние амлодипина на показатели гибели лимфоцитов в крови при экспериментальном гиперпаратиреозе 139
3.5. Влияние амлодипина на иммунный статус при экспериментальной хронической почечной недостаточности 141
3.5.1. Влияние амлодипина на фосфорно-кальциевый гомеостаз при экспериментальной хронической почечной недостаточности 141
3.5.2. Влияние амлодипина на показатели врожденного и адаптивного иммунитета при экспериментальной хронической почечной недостаточности 141
3.5.3. Влияние амлодипина на цитокиновый профиль в крови при экспериментальной хронической почечной недостаточности 147
3.5.4. Влияние амлодипина на содержание веществ низкой, средней молекулярной массы в плазме и в лимфоцитах периферической крови при экспериментальной хронической почечной недостаточности 147
3.5.5. Влияние амлодипина на показатели свободно-радикального окисления в плазме крови и в лимфоцитах периферической крови при экспериментальной хронической почечной недостаточности 148
3.5.6. Влияние амлодипина на показатели гибели лимфоцитов в крови при экспериментальной хронической почечной недостаточности 153
Заключение 155
Выводы 168
Список используемых сокращений
- Роль гиперпаратиреоза в изменении гомеостаза при хронической почечной недостаточности
- Исследование адаптивного иммунитета
- Показатели фосфорно-кальциевого гомеостаза и их роль в изменении иммунного статуса больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе
- Влияние ПТГ на функциональную активность нейтрофилов в экспериментальных условиях in vitro 1
Введение к работе
Актуальность проблемы. Хроническая почечная недостаточность (ХПН) является одной из важнейших медико-социальных проблем в связи с высокой распространенностью, смертностью и значительным ухудшением качества жизни больных. В последние годы наблюдается неуклонный рост количества больных с ХПН в России и в мире. Согласно данным Российского регистра заместительной почечной терапии, на конец 2013 года количество пациентов, находящихся на заместительной почечной терапии, составляло 35305 человек, ежегодный прирост составляет около 10% (Бикбов Б.Т., 2015). Большинство пациентов с ХПН в России – люди трудоспособного возраста. Наиболее важной проблемой является снижение вероятности развития осложнений при ХПН с целью увеличения продолжительности и улучшения качества жизни таких пациентов.
Высокая летальность и снижение качества жизни больных с терминальной стадией ХПН в большинстве случаев обусловлены кардиоваскулярными и инфекционно-воспалительными осложнениями, патогенез которых связывают с вторичной иммунной дисфункцией (Stewart J.H., 2009; Betjes M.G., 2012; Costa A.F., 2014). В литературе представлены многочисленные, зачастую противоречивые сведения об изменении иммунного статуса при ХПН. Большинство исследователей констатируют активацию врожденного и депрессию адаптивного иммунитета при ХПН (Осиков М.В., 2013, 2015; Cohen G., 2012; Vaziri N.D., 2012). Точный механизм формирования иммунного статуса при ХПН до конца не определен. В патогенезе изменений иммунного статуса имеют значение накопление продуктов метаболизма в крови, оксидативный стресс, нарушение обмена железа, изменение кислотно-основного и водно-электролитного баланса и другие факторы (El Kelany M.A., 2009; Eleftheriadis T., 2011; Kamanna V.S., 2012; Wahl P., 2012).
Гиперпаратиреоз является непременным атрибутом терминальной стадии ХПН и характеризуется повышением продукции паращитовидными железами паратиреоидного гормона (ПТГ) и сопутствующими изменениями фосфорно-кальциевого гомеостаза (Даугирдас Д.Т., 2003; Ермоленко В.М., 2011; Brito Galvao J.F., 2013). В последние годы плейотропные эффекты ПТГ, связанные с регуляцией гемопоэза, углеводного и липидного обмена, сосудистого тонуса и др., являются объектом пристального внимания многих научных групп (Soldati L., 2000; Seeliger S., 2003; McCarty M.F., 2005; Hjelmesth J., 2009; Tassone F., 2009; Nikodimopoulou M., 2011; Gandhi S., 2013; Romero J.R., 2013). Повышение концентрации ПТГ в крови связывают с увеличением риска смерти среди лиц пожилого возраста от кардиоваскулярных заболеваний, злокачественных опухолей и низким качеством жизни у диализных пациентов (Kritchevsky S.B., 2012; van Ballegooijen A.J., 2013; Cheng S.P., 2014). Рецепторы для ПТГ обнаружены на большинстве иммунокомпетентных клеток, что предполагает его иммунотропные эффекты, сведения о которых в доступной литературе малочисленны (Yamamoto I., 1983; Perry H.M.III, 1984; Geara A.S., 2010). Отмечают роль ПТГ в патогенезе синдрома системного воспалительного ответа в связи с увеличением синтеза интерлейкина-6 (ИЛ-6), туморнекротического фактора-альфа (ТНФ-), реактантов острой фазы (Lowik C.W.G.M., 1989; Mitnick M.A., 2001; Packard R.R., 2008). При гиперпаратиреозе
различного генеза изменяется концентрация цитокинов в крови (Grey A., 1996; Guo C-Y., 2000; Оgard C.G., 2005; Chertok-Shacham E., 2008; Farahnak P., 2011; Emam A.A., 2012).
Полагают, что одним из ключевых факторов изменения активности, пролиферации и жизнеспособности иммунокомпетентных клеток при гиперпаратиреозе является увеличение внутриклеточной концентрации кальция (Doherty C.C., 1988; Alexiewicz J.M., 1995; Horl W.H., 1995; Seyrek N., 1997; Deicher R., 2005). В связи с этим, целесообразным для коррекции изменений врожденного и адаптивного иммунитета при ХПН может оказаться применение блокаторов кальциевых каналов.
Цель исследования – изучить роль паратиреоидного гормона и вторичного гиперпаратиреоза в комплексе патогенетических факторов формирования иммунного статуса и коррекцию его изменений амлодипином при хронической почечной недостаточности в клинических и в экспериментальных условиях.
Задачи исследования:
-
Исследовать состояние врожденного иммунитета, адаптивного иммунитета, концентрацию в крови некоторых цитокинов, ПТГ, общего кальция и неорганического фосфора у больных ХПН в динамике диализной процедуры.
-
Исследовать состояние врожденного иммунитета, адаптивного иммунитета, концентрацию в крови некоторых цитокинов, ПТГ, общего кальция и неорганического фосфора при экспериментальной ХПН.
-
Определить наличие и характер связи между показателями иммунного статуса и показателями гибели лимфоцитов периферической крови, концентрацией веществ низкой и средней молекулярной массы (ВНиСММ), продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в плазме и в лимфоцитах, активностью ферментов антиокислительной защиты в сыворотке, содержанием в крови ПТГ, общего кальция и неорганического фосфора при ХПН в клинических и в экспериментальных условиях.
-
Изучить состояние врожденного иммунитета, адаптивного иммунитета и некоторые механизмы их формирования при экспериментальном гиперпаратиреозе.
-
В экспериментальных условиях in vitro оценить влияние ПТГ на функциональную активность нейтрофилов, секреторную способность мононуклеаров, показатели гибели путем апоптоза и некроза лимфоцитов периферической крови.
-
Изучить при экспериментальном гиперпаратиреозе влияние амлодипина на показатели врожденного иммунитета, адаптивного иммунитета, концентрацию в крови некоторых цитокинов, показатели гибели лимфоцитов периферической крови, концентрацию ВНиСММ, продуктов ПОЛ в плазме и в лимфоцитах, активность ферментов антиокислительной защиты в сыворотке, содержание в крови ПТГ, общего кальция и неорганического фосфора.
-
Изучить при экспериментальной ХПН влияние амлодипина на показатели врожденного иммунитета, адаптивного иммунитета, концентрацию в крови некоторых цитокинов, показатели гибели лимфоцитов периферической крови, концентрацию ВНиСММ, продуктов ПОЛ в плазме и в лимфоцитах, активность ферментов антиокислительной защиты, содержание в крови ПТГ, общего кальция и неорганического фосфора.
Научная новизна. Впервые в клинических и в экспериментальных условиях проведено
комплексное исследование врожденного и адаптивного иммунитета при ХПН в связи с
данными о состоянии фосфорно-кальциевого гомеостаза, процессов свободно-радикального
окисления, накоплении ВНиСММ в плазме и в лимфоцитах периферической крови, гибели
лимфоцитов в крови. При ХПН повышается поглотительная, нитросиний тетразолий (НСТ)-
редуцирующая способность, лизосомальная активность, снижается функциональный резерв
нейтрофилов периферической крови, снижается количество эффекторов клеточного (CD3+,
CD4+, CD8+, CD16+) и гуморального (CD20+, CD45RA+) иммунитета, подавляется Th1- и Th2-
зависимый иммунный ответ, изменяется цитокиновый профиль в крови. Продемонстрировано,
что изменения врожденного и адаптивного иммунитета при ХПН ассоциированы с повышением
концентрации в крови ПТГ, общего кальция, накоплением продуктов ПОЛ в плазме и в
лимфоцитах периферической крови, снижением активности супероксиддисмутазы (СОД) и
каталазы в сыворотке, повышением концентрации ВНиСММ в плазме и в лимфоцитах,
активацией гибели лимфоцитов в крови путем некроза и апоптоза. Показано, что вектор
изменений иммунного статуса при изолированном диета-индуцированном гиперпаратиреозе у
крыс соответствует изменениям иммунного статуса при ХПН: активируется функциональная
активность нейтрофилов, снижается количество в крови CD3+ и CD45RA+ лимфоцитов,
угнетается Th1- и Th2-зависимый иммунный ответ, увеличивается концентрация ИЛ-1 и
уменьшается концентрация ИЛ-4 и интерферона-гамма (ИФН-) в плазме. Впервые в
экспериментальных условиях in vitro продемонстрировано, что ПТГ оказывает прямое действие
на иммунокомпетентные клетки, выделенные из цельной крови здоровых людей: дозо-зависимо
активирует поглотительную и НСТ-редуцирующую способность нейтрофилов и гибель путем
апоптоза и некроза лимфоцитов, выделенных из периферической крови здоровых людей;
независимо от дозы повышает секрецию ИЛ-8, снижает секрецию ИЛ-2 и ИЛ-10
мононуклеарами. Впервые в экспериментальных условиях in vivo показано, что применение
амлодипина при ХПН и гиперпаратиреозе полностью или частично восстанавливает показатели
иммунного статуса, а механизм иммунотропного действия амлодипина связан с ПОЛ-
ограничивающим эффектом в плазме и в лимфоцитах периферической крови, повышением
активности СОД в сыворотке, ограничением гибели лимфоцитов периферической крови путем
апоптоза и некроза. По результатам исследований получены приоритетные справки на
изобретения: «Способ комплексной оценки и мониторинга изменений гомеостаза при
экспериментальном гиперпаратиреозе с использованием модели лабораторных животных», «Способ повышения иммунологической эффективности терапии хронической почечной недостаточности в эксперименте с использованием блокатора кальциевых каналов препарата Амлодипин».
Теоретическая и практическая значимость работы. В ходе проведенного исследования в клинических и в экспериментальных условиях уточнены закономерности изменений иммунного статуса в терминальную стадию ХПН. В частности, показано, что усиление функциональной активности эффекторов врожденного иммунитета, снижение представительства лимфоцитов в крови, угнетение Th1- и Th2-зависимого иммунного ответа, изменение цитокинового профиля в крови ассоциированы с повышением концентрации в крови
ПТГ, общего кальция, активацией процессов свободно-радикального окисления, накоплением продуктов метаболизма в плазме и в лимфоцитах периферической крови, активацией гибели лимфоцитов в крови путем некроза и апоптоза. В экспериментальных условиях in vivo и in vitro продемонстрирована роль вторичного гиперпаратиреоза и ПТГ в формировании иммунного статуса при ХПН. Установлена роль блокатора кальциевых каналов амлодипина в коррекции изменений иммунного статуса при ХПН и показано, что механизм иммунотропного действия амлодипина связан с ПОЛ-ограничивающим эффектом в плазме и в лимфоцитах периферической крови, повышением активности СОД в сыворотке, ограничением гибели лимфоцитов периферической крови путем апоптоза и некроза.
Полученные результаты могут быть использованы в практической работе нефрологов, клинических иммунологов, а также в преподавании соответствующих разделов на теоретических и клинических кафедрах медицинских ВУЗов. Полученные сведения о влиянии ПТГ на иммунный статус и его коррекции блокатором кальциевых каналов амлодипином являются предпосылкой для проведения дальнейших исследований по изучению патогенеза изменений иммунного статуса и поиску патогенетически обоснованных методов его коррекции при ХПН.
Внедрение результатов исследования в практику. Результаты исследования внедрены в учебный процесс кафедр патологической физиологии, микробиологии, вирусологии, иммунологии и клинической лабораторной диагностики ГБОУ ВПО ЮУГМУ Минздрава России, в научную работу научно-образовательного центра «Проблемы фундаментальной медицины», НИИ Иммунологии ГБОУ ВПО ЮУГМУ Минздрава России.
Положения, выносимые на защиту:
-
У больных ХПН, находящихся на гемодиализе, и при экспериментальной ХПН повышается поглотительная, НСТ-редуцирующая способность, лизосомальная активность, снижается функциональный резерв нейтрофилов периферической крови, развивается лимфоцитопения, в том числе снижается количество эффекторов клеточного (CD3+, CD4+, CD8+, CD16+) и гуморального (CD20+, CD45RA+) иммунитета, подавляется Th1- и Th2-зависимый иммунный ответ, изменяется цитокиновый профиль в крови.
-
Факторами патогенеза изменений иммунного статуса при ХПН выступают накопление первичных и вторичных продуктов ПОЛ в плазме и в лимфоцитах периферической крови, снижение активности СОД и каталазы в сыворотке, повышение концентрации ВНиСММ в плазме и в лимфоцитах, активация гибели лимфоцитов в крови путем апоптоза и некроза, повышение концентрации в крови ПТГ, общего кальция.
-
При экспериментальном гиперпаратиреозе увеличивается НСТ-редуцирующая способность нейтрофилов, снижается количество лимфоцитов в крови, в том числе CD3+ и CD45RA+, угнетается Th1- и Th2-зависимый иммунный ответ, увеличивается концентрация ИЛ-1 и уменьшается концентрация ИЛ-4 и ИФН- в плазме. В условиях in vitro ПТГ активирует функциональную активность нейтрофилов, гибель лимфоцитов, повышает секрецию ИЛ-8, снижает секрецию ИЛ-2 и ИЛ-10 мононуклеарами, выделенными из крови здоровых людей.
-
Применение амлодипина при экспериментальной ХПН и экспериментальном гиперпаратиреозе приводит к полному или частичному восстановлению показателей
иммунного статуса за счет ПОЛ-ограничивающего эффекта в плазме и в лимфоцитах периферической крови, повышения активности СОД в сыворотке, ограничения гибели лимфоцитов периферической крови.
Личный вклад автора. Основная идея, планирование научной работы, включая формулировку рабочей гипотезы, цели и задач, разработка дизайна исследования, анализ современной отечественной и зарубежной литературы, интерпретация экспериментальных данных, статистическая обработка данных, написание и оформление рукописи диссертации, представление результатов работы в научных публикациях и в виде докладов на международных и всероссийских конференциях осуществлялись соискателем лично на всех этапах исследования. Иммунологические и биохимические исследования выполнены автором лично при участии научных сотрудников НИИ Иммунологии ГБОУ ВПО ЮУГМУ Минздрава России.
Соответствие паспорту специальности. Результаты и научные положения диссертации
соответствуют формуле специальности 14.03.03 – патологическая физиология, конкретно –
пунктам 2, 5, 8 и 10 паспорта специальности. Результаты и научные положения диссертации
соответствуют формуле специальности 14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология и
следующим областям исследований этой специальности: изучение патогенеза
иммунозависимых заболеваний (иммунодефицитных состояний, аллергической и
аутоиммунной патологии), разработка и усовершенствование методов диагностики, лечения и профилактики аллергических и иммунопатологических процессов.
Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на II международной научно-практической конференции студентов и молодых ученых «Пироговские чтения» (Челябинск, 2012); V Международной (XII-ой итоговой) научно-практической конференции молодых ученых, посвященной 70-летию ЮГМУ (Челябинск, 2014); VIII международной научно-практической конференции молодых ученых-медиков (Воронеж, 2014); VI Международной (XIII-ой итоговой) научно-практической конференции молодых ученых, посвященной 70-летию победы (Челябинск, 2015); XVII Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2015). Апробация работы состоялась на расширенном заседании Проблемной комиссии №1, кафедры патологической физиологии, НОЦ «Проблемы фундаментальной медицины» ГБОУ ВПО ЮУГМУ Минздрава России 26 февраля 2016 года.
Публикации. Соискатель имеет 25 опубликованных работ по теме диссертации, из которых 12 – в научных журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации для публикации основных результатов диссертации, 2 приоритетные справки на изобретения.
Структура и объем и диссертации. Диссертация изложена на 212 страницах, содержит 83 таблицы и 2 рисунка; состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Список литературы включает 351 источник (34 – отечественных и 317 – зарубежных авторов).
Методология диссертационной работы была спланирована в соответствии с целью и задачами исследования. Исследование проведено в клинических и экспериментальных условиях и одобрено этическим комитетом ГБОУ ВПО ЮУГМУ Минздрава России (протоколы № 11 от 25.11.2012 г., № 1 от 22.01.2016).
В клинических условиях проведено краткосрочное, открытое, проспективное исследование иммунного статуса у больных с терминальной ХПН, находящихся на программном гемодиализе в ГБУЗ Челябинская областная клиническая больница. С учетом критериев отбора в исследовании приняли участие 45 человек, в т.ч. 25 женщин и 20 мужчин, средний возраст составил 54 года. Сформировано 3 группы: группа I (n=24) – здоровые люди – добровольцы, сопоставимые по возрасту и полу с группами II и III (n=24); группа II - больные ХПН до процедуры гемодиализа (n=45); группа III – больные ХПН после процедуры гемодиализа (n=45).
III этап:
статистическая
обработка
результатов
т
IV этап: заключительный
>
методы:
иммунологические;
биохимические;
статистические
определение характера распределения и равенства дисперсий признаков в группах; оценка значимости изменений признаков; анализ связи между признаками
обсуждение результатов, формулировка выводов и положений
Рис. 1. Дизайн клинического фрагмента работы
Эксперименты in vivo выполнены на 283 белых нелинейных крысах-самцах массой 200-220 г., находящихся в стандартных условиях вивария на типовом рационе в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (ETSIN 123, 18 марта 1986 г.), включая приложение А от 15.06.2006, с Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского союза по охране животных, используемых в научных целях от 22.09.2010 г.
Модель хронической почечной недостаточности. Моделирование ХПН у крыс создавали путем двухэтапной оперативной резекции 5/6 почечной ткани (Шуркалин Б.К., 2010; Santos, 2006; Yang Н., 2010). Для исследования иммунного статуса при экспериментальной ХПН 128 белых нелинейных крыс были случайным образом разделены на 3 группы. Группа I – контрольная, ложнооперированные животные (n=44). Группа II – животные с ХПН (n=46).
Группа III – животные, которым на фоне ХПН вводили блокатор кальциевых каналов (n=38). Животным III группы, начиная с 21 суток эксперимента, per os ежедневно вводили блокатор кальциевых каналов амлодипин в дозе 0,25 мг/кг в сутки в течение 7 дней, суммарная доза составила 1,75 мг/кг. Исследования во всех группах проводили на 28 сутки эксперимента.
Моделирование экспериментального гиперпаратиреоза у крыс осуществляли с помощью гиперфосфатной диеты (Draper H.H.,1972). Крыс ежедневно кормили синтетической гиперфосфатной смесью в течение 120 дней из расчета 0,15 г смеси на 1 г массы животного в сутки. Для исследования иммунного статуса при экспериментальном гиперпаратиреозе 155 белых нелинейных крыс были случайным образом разделены на 3 группы. Группа I – контрольная, интактные животные (n=71). Группа II – животные с гиперпаратиреозом (n=42). Группа III – животные, которым на фоне гиперпаратиреоза вводили блокатор кальциевых каналов (n=42). Животным III группы, начиная с 121 суток эксперимента, ежедневно в течение 7 дней per os вводили блокатор кальциевых каналов амлодипин в дозе 0,25 мг/кг в сутки, суммарная доза составила 1,75 мг/кг. Исследования во II и III группах проводили на 128 сутки эксперимента.
Кровь для исследований забирали путем пункции сердца в области левого желудочка после торакотомии, под эфирным наркозом в соответствии с правилами эвтаназии (AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition).
Эксперименты в условиях in vitro. Использована цельная кровь 30 клинически здоровых людей – добровольцев. Исследовали: влияние ПТГ на функциональную активность нейтрофилов; влияние ПТГ на секреторную способность мононуклеаров; влияние ПТГ на гибель лимфоцитов периферической крови. Использован рекомбинантный человеческий паратиреоидный гормон в составе препарата «Форстео» (международное непатентованное название: терипаратид, «Лилли Франс», Франция) в концентрациях 5010-9 г/мл; 50010-9 г/мл и 500010-9 г/мл, что соответствует 100%, 1000%, 10000% от его нормальной концентрации в сыворотке.
Иммунологические методы исследования. Количество лейкоцитов в крови и
лейкоцитарную формулу определяли общепринятыми методами. Поглотительную способность
фагоцитов исследовали с частицами монодисперсного полистирольного латекса, учитывали
активность, интенсивность фагоцитоза и фагоцитарное число (Фрейдлин И.С., 1986). Кислород-
зависимый метаболизм нейтрофилов исследовали, учитывая активность и интенсивность
спонтанного и индуцированного НСТ-теста и функциональный резерв клеток (Маянский А.Н.,
1979). Лизосомальную активность нейтрофилов определяли c раствором акридинового
оранжевого (Фрейдлин И.С., 1986). Определение концентраций С3 и С5 компонентов
комплемента в сыворотке крови проводили с помощью диагностических наборов «ИФА-С3» и
«ИФА-С5» ООО «Хема» (Россия). Определение популяционного и субпопуляционного спектра
лимфоцитов в крови человека (СD3+, СD4+, СD8+, СD11b+, СD16+, СD22+, CD25+, CD95+,
HLA-DR+) проводили с помощью иммунофенотипирования методом непрямой
иммунофлюоресценции с использованием моноклональных антител производства НИИ «Препарат» (Россия). Определение популяционного спектра лимфоцитов в крови крыс проводили с использованием специфических крысиных моноклональных антител фирмы
«eBioscience» (США) по маркёрам CD45RA+ (экспрессируется преимущественно на В-лимфоцитах, а также на моноцитах, наивных Т-клетках) и CD3+ (экспрессируется на Т-лимфоцитах). Анализ окрашенных клеток проводили на проточном цитофлуориметре «Navios» («Beckman Coulter», США). На автоматическом иммуноферментном анализаторе «Personal LAB» (Италия) с применением тест-систем производства фирмы «Вектор-Бест» (Россия) определяли концентрацию иммуноглобулинов A, M и G в сыворотке крови человека; концентрацию в плазме крови человека ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10, ТНФ-, ИФН- и концентрацию в супернатанте человеческих мононуклеаров ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10; с применением специфических крысиных тест-систем фирмы «Cloud-clone» (США) -концентрацию в плазме крови крыс ИЛ-1, ИЛ-4, ИФН-. Апоптоз лимфоцитов оценивали на проточном цитофлуориметре «Navios» («Beckman Coulter», США) с использованием тест-системы для окрашивания клеток конъюгированным с флюорохромом аннексином V (Annexin-5-FITC) и 7-аминоактиномицином D (7-AAD) из набора «Annexin 5 - FITC/7-AAD kit» («Beckman Coulter», США). Дифференцировали интактные клетки (Annexin-5-FITC–/7-AAD–), клетки с ранними признаками апоптоза (Annexin-5-FITC+/7-AAD–), клетки с поздними признаками апоптоза и частично некротические клетки (Annexin-5-FITC+/7-AAD+). Оценку гуморального иммунного ответа крыс проводили по количеству антителообразующих клеток (АОК) в селезенке крыс, иммунизированных аллогенными эритроцитами. Реакцию гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) у крыс, иммунизированных аллогенными эритроцитами, оценивали по выраженности воспалительного отека стопы (Волчегорский И.А., 2000).
Биохимические методы исследования. На автоматическом иммуноферментном
анализаторе «Personal LAB» (Италия) определяли концентрацию ПТГ в человеческой плазме с
помощью тест-системы фирмы «Biomerica» (США); концентрацию ПТГ в плазме крови крыс с
использованием специфической для крыс тест-системы компании «Cloud-clone» (США). На
биохимическим анализаторе «Analette» (США) определяли концентрацию неорганического
фосфора в сыворотке крови человека и крыс с использованием тест-системы фирмы «Вектор-
бест» (Россия); концентрацию общего кальция в сыворотке крови человека и крыс с
использованием тест-систем фирмы «Вектор-бест» (Россия). В плазме и в лимфоцитах
периферической крови крыс определяли концентрацию ВНиСММ (Кирковский В.В., Моин В.М., Лобачева Г.А., 1994). В плазме и в лимфоцитах определяли содержание изопропанол- и гептан-растворимых первичных, вторичных и конечных продуктов ПОЛ (Волчегорский И.А., 1989, 2000; Львовская Е.И., 1991). В сыворотке крови крыс определяли активность СОД (Чевари С.И., 1985) и каталазы (Королюк М.А., 1988; Коробейникова Э.Н., 2002).
Статистические методы исследования. Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета прикладных программ «Statistica v. 8.0 for Windows». Характеристика выборок представлена в формате «М±m», где М-среднее арифметическое значение признака, m-стандартная ошибка среднего. Проверку статистических гипотез в группах проводили с использованием непараметрических критериев (Краскела-Уоллиса, Манна-Уитни, Вальда-Вольфовитца, парного критерия Вилкоксона). Для выявления связи между изучаемыми параметрами
использовали коэффициент корреляции Спирмена (R). Отличия считали статистически значимыми при р <0,05.
Роль гиперпаратиреоза в изменении гомеостаза при хронической почечной недостаточности
Увеличение количественного представительства фагоцитов в кровотоке связывают с ограничением гибели клеток путем апоптоза [97]. С другой стороны, приводят данные об активации апоптоза нейтрофилов и снижении их количества в крови у больных ХПН, находящихся на гемодиализе, связанной с увеличением производства кислородных радикалов [283, 344].
Ряд исследователей констатируют активацию генерации АФК фагоцитами периферической крови при терминальной стадии ХПН [56, 62, 181]. Одним из механизмов выступает блокада антиоксидантного фермента супероксидисмутазы (СОД), снижение экспрессии гена СОД-2 в нейтрофилах, а также снижение поступления в организм естественных антиоксидантов с растительной пищей у больных с ХПН [241]. Нейтрофилы рассматривают в качестве ключевого фактора окислительного стресса при ХПН и как следствие прогрессирования кардиоваскулярной патологии [46, 300]. Приводят и противоположные данные о снижении или отсутствии сдвигов оксидативного потенциала в крови при ХПН [126, 155]. Sardenberg C. et al. констатируют угнетение функции фагоцитов, независимое от вида заместительной терапии и определяемое концентрацией уремических токсинов [270].
В литературе представлены данные о нарушении взаимодействия антигенпрезентирующих клеток с Т-лимфоцитами из-за снижения экспрессии костимулирующей молекулы В7-2 (CD86) на антигенпрезентирующих клетках (АПК) и избыточной активации АПК в ходе процедуры гемодиализа [119, 149, 296].
По всей видимости, накопление широкого спектра метаболитов в плазме, включающего более 90 наименований, в различной концентрации может оказывать неоднозначное влияние на состояние врожденного иммунитета при терминальной стадии ХПН [113, 318]. По данным различных источников, разнонаправленное действие на фагоциты при ХПН оказывают фенилацетат, динуклеозид полифосфаты, гуанидиновые соединения, индол и крезол, метилглиоксаль, кретинин, мочевина, гомоцистеин, адипокины лептин, резистин и др. В отношении адаптивного иммунитета у больных ХПН, представленные в литературе сведения, констатируют дефицит количества субпопуляций Т- и В-лимфоцитов в периферической крови, а также нарушение клеточных и гуморальных звеньев иммунного ответа.
Многие исследования демонстрируют у больных с ХПН независимо от возраста В-лимфоцитопению, включая диффузное снижение субпопуляций B1 (CD19+CD5+), В2 (CD19+CD5-), переходных В-клеток (CD19+CD10+CD27-), наивных В-клеток (CD19+CD27-) и В-клеток памяти (CD19+CD27+) [183, 245]. Одним из механизмов выступает снижение экспрессии на поверхности В-лимфоцитов рецепторов к ростковым факторам BAFF и ИЛ-7, особенно на субпопуляции переходных клеток. При этом, концентрация в крови самих ростковых факторов BAFF и ИЛ-7 у больных ХПН значительно повышена. Интересно, что уремические В-лимфоциты обладают высоким секреторным потенциалом в отношении провоспалительных цитокинов – ТНФ-, ИЛ-6 и ИЛ-10 после инкубации с агонистом Toll-подобного рецептора-9 (TLR9), что свидетельствует об их участии в патогенезе SIRS при уремии [55, 250].
Другими факторами патогенеза В-лимфоцитопении при ХПН могут выступать повышенная восприимчивость клеток к апоптозу в условиях азотемии. Fernndez-Fresnedo G. et al. полагают, что активация апоптоза связана с дизрегуляцией на уровне про- и антиапоптогенных сигналов, снижением экспрессии Bcl-2 [133]. Кроме этого, в условиях уремии нарушается дифференцировка и созревание переходных В-клеток (CD19+CD10+CD27-) в зрелые В-лимфоциты. Ряд исследователей полагают, что В-лимфоциты у больных ХПН являются функционально полноценными и адекватно реагируют на антигенную стимуляцию [189]. Плазменные уровни IgG, IgM, IgA у больных ХПН, находящихся на гемодиализе, обычно не отличаются от нормальных, однако активность антител на различные антигены значительно снижена. Имеются данные о повышении уровня антиэндотоксинового IgG у больных ХПН на программном гемодиализе более чем в 2 раза, по сравнению с уровнем этих антител у здоровых людей, при этом выявлено повышение С-реактивного белка, что может свидетельствовать о недостаточной эффективности антиэндотоксинового иммунитета [2]. Многие исследователи полагают, что результаты оценки В-клеточного звена иммунитета, полученные в образцах крови от больных с ХПН, недостаточны для полного понимания происходящих изменений в этом секторе иммунного ответа, необходимы дополнительные исследования костного мозга, периферических лимфоидных тканей, которые важны для созревания и функционального развития В-лимфоцитов [97, 320].
У больных ХПН наблюдается Т-лимфоцитопения и дисфункция Т лимфоцитов, дизрегуляция Т-клеточного иммунитета. При ХПН в периферической крови снижается количество субпопуляций Т-лимфоцитов из-за активации апоптоза и преждевременного старения клеток под влиянием уремических токсинов, избытка свободного железа, дислипопротеинемии, окислительного стресса, гиперфосфатемии, гемодиализной процедуры [63]. Осиковым М.В. и соавторами показана активация апоптоза лимфоцитов у больных ХПН, находящихся на гемодиализе, а также при экспериментальной терминальной ХПН, в экспериментальных условиях in vitro убедительно продемонстрировано, что уремическая плазма является индуктором апоптоза лимфоцитов [24]. Дефицит эндогенного эритропоэтина как одного из факторов, определяющих пролиферативный потенциал лимфоцитов прямо или косвенно, вносит определенный вклад в развитие лимфоцитопении, а применение экзогенного ЭПО при экспериментальной ХПН полностью или частично восстанавливают показатели иммунного статуса, в том числе в связи с его антиоксидантными и эфферентыми свойствами [25, 27].
Снижение количества Т-лимфоцитов, а также уменьшение секреции ими ИЛ-2 и недостаточный пролиферативный потенциал Т-клеток приводят к неадекватной реакции на вирусы и опухолевые клетки [297, 201]. Уровень ИЛ-2 прогрессивно снижается от преддиализной стадии до минимальных значений у больных на диализе [211]. У Т-лимфоцитов при ХПН нарушен ответ на ТНФ- как вариант предрасположенности к тахифилаксии [319].
Исследование адаптивного иммунитета
Эксперименты in vivo выполнены на 283 белых нелинейных крысах-самцах массой 200-220 г., находящихся в стандартных условиях вивария на типовом рационе в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (ETSIN 123, 18 марта 1986 г.), включая приложение А от 15.06.2006 г., c Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и совета европейского союза по охране животных, используемых в научных целях от 22.09.2010 г.
Модель хронической почечной недостаточности. Моделирование ХПН у крыс создавали путем двухэтапной оперативной резекции 5/6 почечной ткани по методу Шуркалина Б.К. и соавт. в модификации Santos L.S. et al. и Hai-Chun Yang et al [34, 269, 337]. В условиях масочного эфирного наркоза, спонтанного дыхания крысу размещали на операционном столике с подогревом в положении на спине с фиксацией конечностей. Выстригали шерсть в области операционного поля (передняя брюшная стенка), поле обрабатывали антисептиком «Соната-Септ» (ООО «Уралхимфарм-плюс», Россия), после чего выполняли срединную лапаротомию с рассечением кожи, подкожной жировой клетчатки и мышц. Длина разреза составляла в среднем 3,5 см. I этап моделирования ХПН - правосторонняя нефрэктомия. После проведения лапаротомии в брюшную полость вводили 2-3 салфетки, смоченные водным раствором 0,05% хлоргексидина с целью ограничения операционного поля от окружающих тканей. Дном операционной раны являлась правая почка, стенками - боковая стенка брюшной полости и тампоны. Затем рассекали печеночно-почечную связку, вскрывали предпочечную фасцию, почку вывихивали на почечной ножке в вентральном направлении, вокруг почечной ножки накладывали и затягивали лигатуру из шелка № 3. Наложение лигатуры повторяли с целью предотвращения её случайного соскальзывания. После этого проводили отсечение почки дистальнее наложенных лигатур. Проводили контроль гемостаза, извлекали тампоны из брюшной полости, послойно ушивали операционную рану. В послеоперационном периоде животных содержали в одиночных клетках с максимальным соблюдением требований асептики и антисептики. II этап моделирования ХПН проводили на 7 сутки. Осуществляли повторную лапаротомию, рассекали предпочечную фасцию, после чего проводили коагуляцию 80% поверхности единственной почки электроножом «ЭХВЧ 200-1» («Политом–1», Россия). ХПН развивалась на 21 сутки эксперимента. Для верификации ХПН определяли концентрацию в сыворотке креатинина, мочевины, мочевой кислоты. Для исследования иммунного статуса при экспериментальной ХПН 128 белых нелинейных крыс были случайным образом разделены на 3 группы. Группа I – контрольная, ложнооперированные животные (n=44). Группа II – животные с ХПН (n=46). Группа III – животные, которым на фоне ХПН вводили блокатор кальциевых каналов (n=38) Контрольной группе животных (группа I) проводилась срединная лапаротомия с рассечением кожи, подкожной жировой клетчатки и мышц с последующим послойным ушиванием операционной раны.
Животным III группы, начиная с 21 суток эксперимента, per os ежедневно вводили блокатор кальциевых каналов в составе препарата «Амлодипин-Тева» (международное непатентованное название: амлодипин, «Тева», Израиль) в дозе 0,25 мг/кг в сутки в течение 7 дней, суммарная доза составила 1,75 мг/кг.
Исследования во всех группах проводили на 28 сутки эксперимента. Кровь для исследований забирали путем пункции сердца в области левого желудочка после торакотомии, под эфирным наркозом в соответствии с правилами эвтаназии AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. Модель экспериментального гиперпаратиреоза. Для изучения иммунного статуса в условиях избытка паратиреоидного гормона с помощью гиперфосфатной диеты у крыс моделировали гиперпаратиреоз по методу Draper H.H. et al [111]. Повышение концентрации паратиреоидного гормона в крови у крыс достигалось содержанием крыс на гиперфосфатной диете. Крыс ежедневно кормили синтетической гиперфосфатной смесью в течение 120 дней из расчета 0,15 грамм смеси на 1 грамм массы животного в сутки. Синтетическая гиперфосфатная смесь, включала 0,6% кальция и 4,2% фосфора. Ее полный состав представлен в таблице 1. Группа III – животные, которым на фоне гиперпаратиреоза вводили блокатор кальциевых каналов (n=42). Животным III группы, начиная со 121 дня кормления синтетической гиперфосфатной смесью, ежедневно, в течение 7 дней, per os вводили блокатор кальциевых каналов амлодипин в составе препарата «Амлодипин-Тева» (международное непатентованное название: амлодипин, «Тева», Израиль) в дозе 0,25 мг/кг в сутки, суммарная доза составила 1,75 мг/кг.
Исследования во II и III группах проводили на 128 сутки эксперимента. Кровь для исследований забирали в путем пункции сердца в области левого желудочка после торакотомии, под эфирным наркозом в соответствии с правилами эвтаназии AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition.
Показатели фосфорно-кальциевого гомеостаза и их роль в изменении иммунного статуса больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе
При экспериментальной ХПН в периферической крови определяли концентрацию ИЛ-1, ИФН-, ИЛ-4. Как известно, ИЛ-1 секретируется в основном макрофагами и моноцитами, является провоспалительным цитокином активирующим нейтрофилы, стимулирующим синтез белков острой фазы, повышающим фагоцитоз, проницаемость сосудистой стенки, цитотоксическую и бактерицидную активность. ИФН- продуцируется в основном цитотоксическими Т-лимфоцитами и Т-хэлперами 1 типа, выступает активатором мононуклеарных макрофагов, нейтрофилов, NK-клеток, стимулирует дифференцировку Т- и В-лимфоцитов, индуцирует экспрессию антигенов главного комплекса гистосовместимости на макрофагах, Т- и В-лимфоцитах. ИЛ-4 продуцируется главным образом Т-хэлперами 2 типа, стимулирует выработку антител В-лимфоцитами, подавляет генерацию цитотоксических лимфоцитов и NK-клеток.
Выявлено, что концентрация ИЛ-1 в крови статистически значимо увеличивается по сравнению с контрольной группой ложнооперированных животных, концентрация ИЛ-4 и ИФН- статистически значимо снижается (таблица 18). Учитывая, что ИЛ-1 участвует в реализации воспалительных реакций, повышенная его концентрация в крови может приводить к активации функциональной активности нейтрофилов и других фагоцитов. Принимая во внимание влияние ИЛ-4 и ИФН- на рост и дифференцировку лимфоцитов, снижение их концентрации в крови может вносить вклад в развитие лимфоцитопении и депрессию Th1- и Th2-зависимого иммунного ответа при ХПН. Для проверки высказанных предположений проведен корелляционный анализ между показателями функциональной активности нейтрофилов, адаптивного иммунного ответа и концентрацией исследуемых цитокинов в плазме крови у крыс с экспериментальной ХПН (таблица 19).
Выявлена положительная статистически значимая связь между концентрацией ИЛ-1 в крови и поглотительной и НСТ-редуцирующей способностью нейтрофилов. Между концентрацией ИЛ-1 в крови и количеством АОК в селезенке выявлена отрицательная связь средней силы. Обнаружена положительная статистически значимая связь между концентрацией ИЛ-4 в крови и количеством в крови клеток с маркёрами преимущественно В-лимфоцитов (CD45RA+) и количеством АОК в селезенке. Между концентрацией ИФН- и интенсивностью спонтанного НСТ-теста наблюдается обратная средней силы связь. Между концентрацией ИФН- в крови и количеством клеток с маркёрами Т-лимфоцитов (CD3+), выраженностью реакции ГЗТ выявлена положительная связь средней силы.
Ассоциация между концентрацией ИЛ-1 в крови и поглотительной, НСТ редуцирующей способностью нейтрофилов периферической крови свидетельствует о наличии связи, но не указывает на причинно-следственные взаимоотношения между указанными показателями: повышение концентрации ИЛ-1 в крови может приводить к повышению функциональной активности нейтрофилов, в тоже время активированные нейтрофилы могут секретировать ИЛ-1 и приводить к повышению концентрации последнего в крови. Уменьшение продукции ИЛ-4 ассоциировано со снижением роста и дифференциации В-лимфоцитов (CD45RA+) и уменьшением антителообразования, а уменьшение образования ИФН- ассоциировано с Т-лимфоцитопенией (CD3+), снижением Т-клеточного иммунного ответа, реакции ГЗТ [200, 201].
Анализируя иммунологические показатели у больных ХПН, находящихся на гемодиализе, и при экспериментальной ХПН отметим, что изменения иммунного статуса при ХПН как в клинических, так и в экспериментальных условиях включают лимфоцитопению, в том числе снижение эффекторов клеточного и гуморального иммунитета, депрессию Th1- и Th2-зависимого иммунного ответа, повышение функциональной активности нейтрофилов периферической крови, увеличение концентрации ИЛ-1.
Особенностями иммунного статуса при экспериментальной ХПН являются повышение не только кислород-зависимого метаболизма, но и поглотительной способности нейтрофилов периферической крови, снижение концентрации ИЛ-4 и ИФН-. Повышение ИФН- (наряду с ИЛ-1) у больных ХПН может отражать хроническую активацию клеток-продуцентов этого цитокина (нейтрофилов, моноцитов и других клеток) компонентами экстракорпорального контура во время процедуры гемодиализа.
Для изучения патогенеза изменений иммунного статуса при ХПН, в частности, роли эндогенной интоксикации, процессов свободно-радикального окисления, апоптоза лимфоцитов, кальциево-фосфорного обмена на следующем этапе работы исследовали концентрацию ВНиСММ в плазме и в лимфоцитах, концентрацию продуктов ПОЛ в плазме и в лимфоцитах, активность ферментов антиокислительной защиты в сыворотке, показатели гибели лимфоцитов периферической крови, маркеры кальциево-фосфорного гомеостаза.
Влияние ПТГ на функциональную активность нейтрофилов в экспериментальных условиях in vitro 1
Полагаем, что развитие лимфоцитопении, сопутствующая ей депрессия Th1-и Th2 – зависимого иммунного ответа при экспериментальном гиперпаратиреозе могут быть связаны с усилением гибели лимфоцитов периферической крови путем апоптоза и/или некроза в условиях активации процессов свободно-радикального окисления в плазме крови и в лимфоцитах, изменения цитокинового профиля в крови и других механизмов. Результаты исследования количественного состава в крови лимфоцитов с маркерами апоптоза и некроза представлены в таблице 48. Выявлено, что при экспериментальном гиперпаратиреозе значимо не изменяется содержание в крови лимфоцитов с фенотипом Annexin-5-FITC–/7-AAD– и Annexin-5-FITC+/7-AAD–, но увеличивается содержание лимфоцитов с фенотипом Annexin-5-FITC+/7-AAD+, то есть с признаками поздней стадии апоптоза и некроза.
Показатели гибели лимфоцитов при экспериментальном гиперпаратиреозе (M±m) Показатели Группа 1Интактные(n=10) Группа 2Гиперпаратиреоз(n=10) Значение р Annexin-5-FITC–/7-AAD–, % клеток 93,96±0,69 93,18±0,29 0,05 Annexin-5-FITC+/7-AAD–, % клеток 5,86±0,66 5,96±0,22 0,05 Annexin-5-FITC+/7-AAD+, % клеток 0,16±0,04 0,70±0,14 0,05 Примечание. р - показатель значимости различий между группами по критерию Манна-Уитни. Для определения наличия и характера связи между показателями апоптоза и некроза лимфоцитов, показателями ПОЛ в лимфоцитах, показателями адаптивного иммунного ответа при экспериментальном гиперпаратиреозе проведен корелляционный анализ (таблица 49). Поскольку статистически значимо изменилось только количество лимфоцитов с поздними признаками апоптоза и некроза, то и при корреляционном анализе мы учитывали только наличие связи с этим показателем. Количество лимфоцитов с признаками позднего апоптоза и некроза обратно кореллирует с общим количеством лимфоцитов и количеством CD3+ лимфоцитов в крови, выраженностью реакции ГЗТ, количеством АОК в селезенке. Прямая связь средней силы установлена между количеством лимфоцитов с признаками позднего апоптоза и концентрацией первичных и конечных продуктов ПОЛ в изопропанольной фракции липидного экстракта лимфоцитов периферической крови. Обнаруженные связи позволяют предположить, что фактором угнетения иммунного ответа, уменьшения количества лимфоцитов в крови при экспериментальном гиперпаратиреозе является усиление гибели лимфоцитов, которое нарастает по мере увеличения содержания первичных и конечных продуктов ПОЛ в изопропанольной фракции липидного экстракта лимфоцитов периферической крови. Для проверки предположения о роли повышения концентрации в крови ПТГ, кальция в изменении иммунного статуса при экспериментальном гиперпаратиреозе проведен корелляционный анализ между показателями адаптивного иммунитета, НСТ-редуцирующей способностью нейтрофилов и показателями кальциево-фосфорного обмена (таблица 50). Концентрация ПТГ при экспериментальном гиперпаратиреозе имеет обратную связь средней силы с концентрацией Т-лимфоцитов (CD3+) и В-лимфоцитов (CD45RA+), отрицательную связь высокой силы с активностью ГЗТ и количеством АОК в селезенке и положительную средней силы связь с НСТ-редуцирующей способностью нейтрофилов и количеством лимфоцитов с признаками позднего апоптоза и некроза.
Таким образом, изменения иммунного статуса при экспериментальном гиперпаратиреозе включают активацию НСТ-редуцирующей способности нейтрофилов, лимфоцитопению, в том числе снижение количества в крови CD3+ и CD45RA+, угнетение Th1- и Th2-зависимого иммунного ответа, повышение в крови концентрации ИЛ-1 и снижение концентрации ИЛ-4 и ИФН-.
В патогенезе изменений иммунного статуса при экспериментальном гиперпаратиреозе имеют значение накопление продуктов ПОЛ в плазме и в лимфоцитах, снижение активности ферментов антиокислительной защиты в сыворотке, активация гибели лимфоцитов путем некроза и апоптоза. Изменения иммунного статуса при экспериментальном гиперпаратиреозе прогрессируют по мере повышения концентрации ПТГ в крови.
Исследовано влияние различных концентраций ПТГ на функциональное состояние нейтрофилов периферической крови здоровых людей в условиях in vitro по показателям поглотительной и НСТ-редуцирующей способности. Использовали ПТГ в концентрациях 5010-9 г/мл; 50010-9 г/мл и 500010-9 г/мл, что соответствует 100%, 1000%, 10000% от его нормальной концентрации (5010-9 г/мл) в сыворотке (таблица 51).
Инкубация ПТГ в концентрации 5010-9 г/мл с суспензией нейтрофилов приводит к повышению интенсивности фагоцитоза и фагоцитарного числа. ПТГ в концентрации 50010-9 г/мл увеличивает поглотительную способность нейтрофилов по показателям активности фагоцитоза, интенсивности фагоцитоза, фагоцитарного числа, а также усиливает кислород-зависимый метаболизм нейтрофилов по показателям активности спонтанного НСТ-теста, активности индуцированного НСТ-теста, интенсивности индуцированного НСТ-теста. Контакт нейтрофилов с ПТГ в дозе 500010-9 г/мл увеличивает показатели поглотительной способности: активность фагоцитоза, интенсивность фагоцитоза, фагоцитарное число и показатели генерации АФК фагоцитами: активность спонтанного НСТ-теста, интенсивность спонтанного НСТ-теста, активность индуцированного НСТ-теста, интенсивность индуцированного НСТ-теста. ПТГ во всех используемых дозах не оказывал значимого влияния на функциональный резерв нейтрофилов, оцениваемый по активности и интенсивности НСТ-теста.
Для проверки наличия дозо-зависимого эффекта ПТГ на показатели функциональной активности нейтрофилов периферической крови использован корреляционный анализ. Установлено наличие прямой средней силы связи между дозой ПТГ и показателями активности фагоцитоза, интенсивности фагоцитоза, фагоцитарного числа, активности спонтанного НСТ-теста, интенсивности спонтанного НСТ-теста (таблица 52).