Роль тканеспецифической продукции адипокинов и провоспалительных молекул в развитии инсулинорезистентности при ожирении Василенко Мария Александровна

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Обзор литературы 13

1.1. Морфология и состав жировой ткани 13

1.2.Адипогенез 15

1.3. Особенности белой жировой ткани разной локализации 16

1.4. Изменение активности иммунокомпетентных клеток в жировой ткани при ожирении

1.5. Основные факторы, влияющие на передачу инсулинового сигнала 24

1.5.1. Влияние воспаления в жировой ткани на развитие ИР 25

1.6. Новое в реализации инсулинового сигнала. Участие медиаторов в интеграции воспалительной реакции и обмена веществ при ожирении

ГЛАВА 2. Материал и методы исследований 44

2.1. Объект исследования 44

2.2. Критерии включения и исключения 47

2.3. Материал исследования 48

2.4. Методы исследования 48

2.4.1. Исследование биохимических показателей

2.4.1.1. Исследование углеводного обмена 49

2.4.1.2. Исследование липидного обмена 52

2.4.1.3. Исследование белкового обмена 53

2.4.2.Определение содержания провоспалительных молекул (IL-6 и TNFa) в сыворотке крови и химерина в плазме крови

2.4.3. Определение васпина в плазме крови 55

2.4.4. Определение C-пептида, инсулина, лептина, адипонектина, адипсина в плазме крови

2.4.5. Выделение тотальной РНК из жировой ткани 57

2.4.6 Обратная транскрипция образцов тотальной РНК 59

2.4.7 Определение уровней относительной экспрессии генов методом количественной ПЦР в режиме реального времени

2.4.8. Методы статистического анализа данных 66

ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований

3.1. Исследование биохимических показателей и индикаторов инсулинорезистентности у лиц с избыточной массой тела

3.2 Исследование биохимических показателей и индикаторов инсулинорезистентности у пациентов с I степенью ожирения без или с сахарным диабетом 2 типа

3.3. Исследование биохимических показателей и индикаторов инсулинорезистентности у пациентов со II степенью ожирения без или с сахарным диабетом 2 типа

3.4. Исследование биохимических показателей и индикаторов инсулинорезистентности у пациентов с III степенью ожирения без или с сахарным диабетом 2 типа

3.5. Оценка содержания адипокинов (лептина, адипонектина, адипсина, васпина и химерина) в плазме крови у пациентов с избыточной массой тела.

3.6. Исследование содержания адипокинов (лептина, адипонектина, адипсина, васпина и химерина) в плазме крови у пациентов с I степенью ожирения без или с сахарным диабетом 2 типа

3.7. Исследование содержания адипокинов - лептина, адипонектина, адипсина, васпина и химерина в плазме крови у пациентов со II степенью ожирения без или с сахарным диабетом 2 типа

3.8. Исследование содержания адипокинов - лептина, адипонектина, адипсина, васпина и химерина в плазме крови у пациентов с III степенью ожирения без или с сахарным диабетом 2 типа

3.9.1 Исследование содержания провоспалительных цитокинов (IL-6 и TNF) в 83 сыворотке крови у пациентов с избыточной массой тела

3.9.2 Исследование содержания провоспалительных молекул (IL-6 и TNF) в сыворотке крови у пациентов с I степенью ожирения без или с сахарным диабетом 2 типа

3.9.3 Исследование содержания провоспалительных цитокинов (IL-6 и TNF) в сыворотке крови у пациентов со II степенью ожирения без или с сахарным диабетом 2 типа

3.9.4 Исследование содержания провоспалительных цитокинов (IL-6 и TNF) в сыворотке крови у пациентов с III степенью ожирения без или с сахарным диабетом 2 типа

3.10. Оценка экспрессии мРНК генов адипокинов и провоспалительных цитокинов в жировой ткани разной локализации у пациентов с ожирением без или с сахарным диабетом 2 типа

3.10.1. Исследование тканеспецифической экспрессии гена CFD (кодирующего адипсин) у пациентов с ожирением без или с сахарным диабетом 2 типа

3.10.2. Исследование тканеспецифической экспрессии гена LEP (кодирующего лептин) у пациентов с ожирением без или с сахарным диабетом 2 типа

3.10.3. Исследование тканеспецифической экспрессии гена ADIPOQ 89

(кодирующего адипонектин) у пациентов с ожирением без или с сахарным диабетом 2 типа .10.4. Исследование тканеспецифической экспрессии гена SERPINA12(кодирующего васпин) у пациентов с ожирением без или с сахарным диабетом 2 типа

3.10.5. Исследование тканеспецифической экспрессии гена RARRES2 92

(кодирующего химерин) у пациентов с ожирением без или с сахарным диабетом 2 типа

3.10.6. Исследование тканеспецифической экспрессии гена IL-6 (кодирующего 94 IL-6) у пациентов с ожирением без или с сахарным диабетом 2 типа

3.10.7. Исследование тканеспецифической экспрессии гена TNFа (кодирующего 95 TNFа) у пациентов с ожирением без или с сахарным диабетом 2 типа

ГЛАВА 4. Обсуждение полученных результатов

Выводы 150

Список литературы

• Особенности белой жировой ткани разной локализации
• Исследование биохимических показателей
• Исследование биохимических показателей и индикаторов инсулинорезистентности у пациентов со II степенью ожирения без или с сахарным диабетом 2 типа
• Исследование содержания адипокинов - лептина, адипонектина, адипсина, васпина и химерина в плазме крови у пациентов с III степенью ожирения без или с сахарным диабетом 2 типа

Введение к работе

Актуальность темы исследования. Ожирение – эпидемия XXI века. Связь висцерального ожирения с развитием сердечно-сосудистых заболеваний, сахарного диабета 2-го типа (СД 2 типа), а также влияние ожирения на качество и продолжительность жизни, обусловливают серьезный интерес к этой проблеме (Wajchenberg B.L., 2000; Fain J.M. et al., 2004; Jain S.K., 2015; Goh J. et al., 2016; De Lorenzo A. et al., 2016; Choe S.S. et al., 2016). В то же время, механизмы, приводящие к накоплению жира именно в брюшной области, остаются невыясненными. Основными «игроками» в гомеостазе глюкозы в организме являются печень, мышцы и жировая ткань (ЖТ). Установлено, что ЖТ регулирует гомеостаз глюкозы не за счет ее поглощения, а опосредованно, путем регуляции липидного гомеостаза (Walther T.C., Farese R.V. 2012). Нарушение последнего может приводить к системной дизрегуляции углеводного обмена (УО) и формированию инсулинорезистентности (ИР) (Herrero L. et al., 2010).

Степень разработанности темы. Известен факт, что при ожирении ЖТ действует в качестве эндокринного и паракринного органа, который регулирует выработку адипокинов и других молекул, в частности, цитокинов, ростовых факторов и др. (Ouchi N. et al., 2011; Jung U.J., Choi M.S., 2014). В связи с этим, особое значение при ожирении приобретает оценка системного влияния адипокинов на функциональную активность органов, ткани которых зависят от состояния УО (печень, мышцы, сердце, -клетки поджелудочной железы и др.). Относительно недавно доказана способность жировой ткани формировать иммунологический фон, благоприятный для развития ИР (Hirabara S.M. et al., 2012; , 2013; Lee B.C., Lee J., 2014). Так, одна из самых обсуждаемых и популярных гипотез развития ИР при ожирении тесно связана с воспалением в жировой ткани (ЖТ) (Hirabara S.M. et al., 2012; Donath M.Y. et al., 2013; Fuentes E. et al., 2013; еt al., 2013; Mathis D., 2013; Lee B.C., Lee J., 2014), которое имеет свои особенности. Воспалительная реакция реализуется в ткани, составляющей весьма внушительную часть организма (до 50% и более от массы тела), что может приводить к системным последствиям (Lee B.C. et al., 2016; Wensveen F.M. et al., 2015). В контексте изучаемой тематики следует учитывать, что причинно-значимые молекулы, участвующие в патогенезе ожирения, воспаления ЖТ и, как следствие, в формировании ИР при ожирении, не следуют строго парадигме про- или противовоспалительных реакций, повышают или снижают чувствительность к инсулину и т.д. (Wallenius V. et al., 2002). В частности, некоторые медиаторы ЖТ необходимы для инициации воспаления, индуцированного ожирением и ИР на ранней стадии развития ожирения, однако, они могут не участвовать в патологических реакциях на более поздних стадиях ожирения (Lee B.C. et al., 2016). Другая реальность состоит в том, что одного медиатора недостаточно для реализации сложного процесса, ассоциированного с индукцией воспаления в ЖТ и развития ИР (Giralt M. et al., 2015). Необходимо участие нескольких молекул, координирующих развитие болезни, иными словами, в патогенезе любого заболевания всегда участвуют сети медиаторов, объединенных или разобщенных тем или иным свойством, механизмом действия. В связи с вышесказанным, возникает необходимость определения спектра молекул, принимающих участие в формировании ИР, с определением граней их функциональной активности, в интеграции воспалительных и метаболических реакций при ожирении.

В то же время, данные научной периодики имеют весьма противоречивые сведения относительно особенностей тканеспецифической продукции медиаторов жировыми депо при ожирении, сопровождающемся СД 2 типа и без такового. Доминирует точка зрения, что в патогенезе нарушений УО при ожирении играет висцеральная ЖТ (Fain J.N. et al., 2004; Liu K.H. et al., 2005; Maurige P. et al., 2015; Ozcelik F. et al., 2016; Garrido-Snchez L. et al., 2016), тогда как данные о роли

подкожного депо жировой ткани, учитывая ее объем в контексте общего ожирения, в гомеостазе глюкозы носят весьма ограниченный и противоречивый характер.

В связи с вышесказанным, целью нашего исследования явилось сравнительное изучение продукции различными типами жировой ткани (подкожной и висцеральной) медиаторов с метаболической и провоспалительной активностью, с оценкой их вклада в формирование инсулинорезистентности у больных ожирением в зависимости от состояния углеводного обмена.

Задачи исследования:

1. Дать комплексную оценку метаболических нарушений у больных ожирением, в зависимости от состояния углеводного обмена;

2. Провести оценку содержания адипокинов (адипонектина, адипсина, лептина, химерина и васпина), гормонов поджелудочной железы (инсулина и С-пептида) в плазме крови, концентрации провоспалительных молекул (IL-6, TNF) в сыворотке крови у больных ожирением, ранжированных по состоянию углеводного обмена;

3. Оценить уровень относительной экспрессии мРНК генов адипокинов CFD, LEP, ADIPOQ, SERPINA12 и RARRES2 (кодирующих адипсин, лептин, адипонектин, химерин и васпин) и генов провоспалительных молекул (IL-6, TNF) в биоптатах жировой ткани разной локализации (висцеральной и подкожной) у больных ожирением с разным состоянием углеводного обмена.

4. Установить общие закономерности и особенности тканеспецифической продукции жировой тканью медиаторов с метаболическим и провоспалительным действием в формировании инсулинорезистентности у больных ожирением.

Научная новизна

Приоритетными являются данные о тканеспецифических особенностях продукции жировой тканью адипокинов и провоспалительных молекул у больных с разным состоянием УО. Впервые показано, что в поддержании референсных значений глюкозы значимую роль играет функциональная активность подкожной жировой ткани, тогда как в патогенез инсулинорезистентности при ожирении значимый вклад вносит висцеральная жировая ткань, преимущественно, брыжейка тонкого кишечника. Впервые продемонстрировано, что нормальный уровень глюкозы в сыворотке крови больных ожирением (<40 кг/м²) обеспечивается системным и ауто- и паракринным действием адипокинов: адипонектина, адипсина, химерина и IL-6, тогда как при морбидном ожирении ( 40 кг/м²) -эффектами химерина и адипонектина. Доказано, что в формировании инсулинорезистентности при ожирении значимая роль принадлежит: лептину, васпину, химерину и провоспалительному фактору - TNF. Впервые продемонстрирована двойственная роль химерина и IL-6 при ожирении в отношении гомеостаза глюкозы: протекторная - при ожирении без нарушений УО и потенцирующая развитие ИР – при ожирении, осложненном нарушением углеводного гомеостаза. Приоритетными являются данные о снижении уровней относительной экспрессии мРНК генов SERPINA12, RARRES2 и LEP (кодирующих васпин, химерин и лептин) в биоптатах висцеральной жировой ткани (большой сальник) у всех больных морбидным ожирением, свидетельствующие об изменении функциональной активности адипоцитов. Убедительно продемонстрировано участие адипокинов и провоспалительных молекул в кооперации воспалительных и метаболических реакций при ожирении без или с нарушениями углеводного обмена.

Теоретическое и практическое значение работы. Получены знания фундаментального характера об особенностях метаболической активности различных типов жировой ткани (подкожной и висцеральной) в отношении продукции адипокинов и провоспалительных молекул, их вклада в формирование ИР у больных ожирением. Практическая значимость работы обусловлена новыми данными о роли тканеспецифической продукции медиаторов жировой ткани в интеграции воспалительных реакций с обменом веществ, которые могут быть использованы для разработки новых методов профилактики и/или лечения

ожирения и инсулинорезистентности, основанных на (пато)физиологических особенностях метаболизма жировой ткани.

Результаты диссертационного исследования используются в учебном процессе на кафедрах фундаментальной медицины медицинского института БФУ им. И. Канта и молекулярной физиологии, и биофизики химико-биологического института БФУ им. И. Канта г. Калининграда.

Методология и методы исследования

Согласно поставленным задачам, выбраны высокоинформативные методы исследования, которые выполнялись на базе современной научно-исследовательской лаборатории иммунологии и клеточных биотехнологий БФУ им. И. Канта. В качестве материалов исследования использовали периферическую венозную кровь и биоптаты жировой ткани разной локализации, полученные у групп обследуемых лиц, принявших участие в исследовании (пациенты с ожирением, ранжированные по ст. ожирения и состоянию углеводного обмена, группа сравнения и здоровые доноры).

Основные методы исследования:

5. Комплексное исследование биохимических показателей (оценка углеводного, белкового, жирового обменов) (методы биохимического анализа);

6. Определение содержания адипокинов (адипонектина, адипсина, лептина), инсулина, С-пептида в плазме крови (проточная флуориметрия).

7. Оценка концентрации провоспалительных молекул в сыворотке крови (IL-6 и TNF), химерина и васпина в плазме крови (иммуноферментный анализ);

8. Определение уровней относительной экспрессии мРНК генов IL-6, TNF, AdipoQ, CFD, LEP, SERPINA12, RARRES2 и B2M в биоптатах жировой ткани разной локализации, методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.

9. Статистический анализ результатов.

Положения, выносимые на защиту:

10. У больных ожирением, ранжированных по состоянию углеводного обмена, регистрируются тканеспецифические особенности продукции жировой тканью адипокинов и провоспалительных молекул: в поддержании референсного уровня глюкозы в сыворотке крови значимую роль играет функциональная активность подкожной жировой ткани, тогда как в патогенез инсулинорезистентности при ожирении существенный вклад вносит висцеральная жировая ткань, преимущественно, брыжейка тонкого кишечника.

11. При ожирении адипокины (лептин, химерин, васпин, адипсин, адипонектин) и провоспалительные молекулы (TNF и IL-6), наряду с системным, имеют локальный (аутокринно-паракринный) механизм действия в пределах жировой ткани, регулирующий ее чувствительность к инсулину, что подтверждается многочисленными, имеющими разную направленность (в зависимости от состояния углеводного обмена) корреляциями плазменных концентраций гормонов жировой ткани и уровней экспрессии их генов (в разных депо жировой ткани) с показателями углеводного обмена и гормонами поджелудочной железы.

12. При ожирении без или с нарушениями углеводного обмена установлено прямое и опосредованное участие адипокинов и провоспалительных молекул в интеграции воспалительных и метаболических реакций.

Степень достоверности и апробация результатов

Высокая степень достоверности полученных результатов подтверждается достаточным объемом клинико-экспериментального материала, использованием современных методов (биохимические методы исследования, иммуноферментный анализ, проточная цитофлуориметрия, полимеразная цепная реакция) и методических подходов, высокотехнологичного оборудования, а также адекватных критериев для статистической обработки результатов.

Результаты проведенных исследований докладывались и обсуждались на XVIII межгородской научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2012); II международной конференции «Биотехнология. Взгляд в будущее» (Казань, 2013); IV

Международной научной Интернет-конференции «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии» (Казань, 2013); I Международной конференции молодых ученых биотехнологов, молекулярных биологов и вирусологов (Новосибирск, 2014); XV Всероссийском научном форуме с международным участием им. Академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2015); 9-й Международной конференции по лечению сахарного диабета 2 типа (9th International Conference on Advanced Technologies & Treatments for Diabetes) (Италия, Милан, 2015); IV Международной научно-практической телеконференции «Достижения в науке и технике» (Advances in Science and Technology) (Пенза, 2016); Московском международном бариатрическом конгрессе (Москва, 2016); Всероссийской конференции с международным участием «Командный подход в современной эндокринологии» (Санкт-Петербург, 2016); 11-й Европейской конференции по биологии и медицинским наукам «Восток-Запад» (11th European Conference on Biology and Medical Sciences «East West») (Вена, 2016).

В работе приводятся результаты научно-исследовательских работ «Исследование иммунопатологических реакций при метаболическом синдроме» (ГК №П329 от 07 мая 2010 г.); «Исследование молекулярных и клеточных механизмов формирования хронического воспаления при метаболических нарушениях» (Соглашение № 14.A18.21.0206 от 23 июля 2012 г.); выполненных в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 22 печатные работы, из них 9 статей в ведущих рецензируемых журналах и изданиях, определенных ВАК РФ, 1 монография и 12 статей и тезисов в материалах конференций и симпозиумов.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 191 странице машинописного текста и состоит из введения, четырёх глав, выводов и списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 23 рисунками и 15 таблицами. Библиографический указатель включает 419 источника (21 - отечественных и 398 - иностранных).

Автор принимал непосредственное участие в разработке дизайна и планировании исследования. Результаты получены, проанализированы и обобщены в выводах и положениях автором лично.

Особенности белой жировой ткани разной локализации

Взаимодействия между адипоцитами и резидентными иммунокомпетентными клетками ЖТ при ожирении приводят к появлению короноподобных клеток (CLS), представляющих собой апоптотические гипертрофические клетки, окруженные макрофагами, тучными клетками (ТК) а также другими иммунными клетками. Число CLS увеличивается пропорционально числу гипертрофированных адипоцитов (Feng D. et al., 2011; Ghigliotti G. et al., 2014). Известно несколько механизмов, за счет которых адипоциты при ожирении вызывают поляризацию макрофагов ЖТ в М1-направлении. Один из них – повышение секреции клетками ЖТ цитокинов и адипокинов с провоспалительными свойствами: хемокинов - МСР-1 и RANTES, лептина, TNF, IL-6, висфатина, апелина, оментин, васпина, липокалина - ретинол-связывающего протеина-4 и др. (Шварц В.Я., 2009). Напротив, продукция адипонектина, вызывающего поляризацию макрофагов в М2-направлении, при ожирении снижается (C awla A. et al, 2011). На функцию макрофагов оказывает влияние липидный гомеостаз адипоцитов. В гипертрофированных адипоцитах нарушается инсулиновый сигнал и, как следствие, усиливается липолиз, что приводит к повышению концентрации ЖК. Ненасыщенные ЖК, взаимодействуя с TLR-4, имитируют бактериальную опасность и поляризуют макрофаги ЖТ в М1-фенотип, запуская процесс воспаления (Hotamisligil G.S., 2006; Haversen L., 2009; Wen H. et al., 2011; Liu Y.C. et al., 2014).

Как уже упоминалось, ожирение приводит к увеличению апоптотических адипоцитов (CLS). Хотя превращение адипоцитов в CLS не зависит от окружения макрофагов, фагоцитируемые фрагменты адипоцитов эффективно стимулируют дифференцировку макрофагов ЖТ в М1-направлении (C awla А. et al., 2011; Feng D. et al., 2011). Помимо фагоцитирования некротических адипоцитов (CLS), макрофаги принимают участие в образовании экстрацеллюлярного матрикса, ангиогенезе, а также в пролиферации и дифференцировке адипоцитов (Sun K. et al., 2011; Zaragosi L.E. et al., 2011; Williams C.B. et al., 2016). Описаны механизмы, с помощью которых провоспалительные макрофаги вызывают воспаление ЖТ и развитие ИР. Так, М1-поляризованные CD11c+ макрофаги, способны снижать чувствительность адипоцитов к инсулину, блокируя транспортер GL T4, опосредованно, через TNF ( raz . et al., 2014). Провоспалительные макрофаги вызывают избыточное накопление коллагена и других компонентов экстрацеллюлярного матрикса, вызывая развитие фиброза и воспаления в ЖТ. Кроме того, М1-поляризованные CD11c+-макрофаги вызывают рекрутирование и активацию других иммунных клеток ЖТ благодаря секреции хемокинов, костимулирующих белков - CD 40/ CD 40L, презентации антигенов к молекулам HC и (Patsouris D. et al., 2008; Chawla A. et al., 2011).

Таким образом, при ожирении, кроме повышения числа макрофагов, меняются их фенотипические и функциональные характеристики - от антивоспалительного фенотипа М2 (продуцирующего IL-4, -10, -13) к провоспалительному - М1 (с экспрессией TNF, индуцибельной NO-синтазы-2 и CD11c) (Lumeng C.N. et al., 2008; Wentworth J.M. et al., 2010). В процессе модуляции локального иммунного ответа, резидентные макрофаги ЖТ взаимодействуют с другими клетками врожденного и адаптивного иммунитета: нейтрофилами, TLR-тучными клетками (TLR-ТК), эозинофилами, регуляторными Т-клетками (Tre s) и др. (Bouloumie A. et al., 2008; Kintscher U. et al., 2008; Abraham S.N., 2010; Schipper H.S., 2012) (рисунок 3).

Существует гипотеза, что при ожирении TLR-ТК и нейтрофилы мигрируют в ЖТ до увеличения числа макрофагов и могут даже регулировать приток макрофагов, благодаря секреции хемотаксического протеина-1 макрофагов (МСР-1), TNFa и IFNy (Liu J. et al., 2009; Altintas M.M. et al., 2011; Wong N. et al., 2011; Yang X. et al., 2011; Imig J.D. et al., 2013). Взаимодействуя с макрофагами, TLR-ТК модулируют липидный и углеводный метаболизм в адипоцитах, ремодулирование экстрацеллюлярного матрикса (ЕС ) и ангиогенез, принимают участие в формировании воспаления ЖТ (Williams C.B. et al., 2016).).

В отличие от ТК и нейтрофилов, Эо подавляют воспаление ЖТ и ИР, за счет экспрессии основных противовоспалительных молекул: IL-4, IL-5, IL-13, играющих ключевую роль в поляризации М2 макрофагов ЖТ. В эксперименте установлено, что число резидентных Эо ЖТ уменьшается на фоне обогащенной жирами диеты (Odegaard J., 2012). Немаловажную роль в сохранении иммунного гомеостаза ЖТ играют регуляторные Т-клетки (Tre s), имеющие фенотип -CD4+CD25+Foxp3+. ВЖТ грызунов богат Tre s, однако их уровень сильно снижается по мере развития ожирения (Feuerer M. et al., 2009). Кроме того, экспериментальное истощение Tre s в ЖТ способствует формированию ИР (Ilan Y. et al., 2010; Eller K. et al., 2011; Onodera T. et al., 2015). В отличие от периферических, Tre s из ВЖТ, как и М2-макрофаги, экспрессируют PPAR- (Odegaard J.I. et al., 2007; Cipolletta D. et al., 2012). Лиганды РРАR-, связываясь с рецептором, стимулируют экспрессию генов, регулирующих дифференцировку преадипоцитов в зрелые жировые клетки. Активация PPAR- повышает чувствительность к инсулину в жировой и мышечной тканях благодаря подавлению TLR- и IFN – зависимых воспалительных реакций (Chiarelli F. at al., 2008; Tontonoz P.I., 2008).

Есть сообщения о причастности к формированию ИР и воспалению ЖТ натуральных киллеров (NK) (Шварц В., 2009 Mathis D., 2013). Таким образом, ожирение обеспечивает метаболический сигнал, который вызывает дифференцировку макрофагов в М1-направлении и запуск Тh1 иммунного ответа, вызывая развитие метаболического воспаления в ЖТ. Безусловно, важное значение в модуляции субклинического хронического воспаления имеет клеточная кооперация макрофагов ЖТ с клетками естественного иммунитета – ТК, нейтрофилами и Эо.

Исследование биохимических показателей

В основу настоящей работы положены результаты комплексного клинико-лабораторного обследования 262 человек (100 мужчин и162 женщины в возрасте от 25 до 60 лет, средний возраст – 42,61±8,46 лет).

В обследование были включены 155 пациентов с ожирением (ИМТ от 30 и 40 кг/м), 34 человека с избыточной массой тела (ИМТ 25 – 29,9 кг/м). Группу контроля составили 43 практически здоровых человека, не имеющих ожирения (ИМТ 18,9-24,9 кг/м) (таблица 1). Все группы были сопоставимы по возрасту и полу. Всеми лицами было подписано информированное согласие на участие в исследовании.

Протокол исследования одобрен этическим комитетом Инновационного парка БФУ им. И. Канта (№ 4 от 23.10.13 г.). У всех пациентов, вошедших в исследование, ожирение имело алиментарно конституциональный характер с абдоминальным типом локализации, гипертрофическим по морфологии. Диагноз ожирение устанавливали после детального клинико-инструментального обследования в условиях специализированного стационара, согласно критериям, рекомендованных Всемирной организацией здравоохранения (1999, 2000). Для постановки диагноза ожирения проводили антропометрические измерения: определяли рост, вес, окружность талии и бедер, индекс массы тела (ИМТ). Избытком массы тела считали показатели ИМТ от 25 до 29,9 кг/м2, ожирением – ИМТ свыше 30 кг/м2. При андроидном типе ожирения соотношение окружности талии к окружности бедер (ОТ/ОБ) у мужчин было больше 1,0, у женщин – больше 0,8. Данные анамнеза показали наличие сахарного диабета (СД) 2 типа у 63 пациентов, установленные на основании детального клинико-инструментального обследования в условиях специализированного стационара, руководствуясь критериями Международной федерации диабета (IDF 2013, ВОЗ 1999-2013); у 122 пациентов, согласно классификации артериальной гипертензии по уровню артериального давления (EHS/ESC 2003-2013), диагностирована гипертоническая болезнь. Общая характеристика групп исследования представлена в таблице 1. Верификация диагноза и набор пациентов в группы исследования осуществлялся врачами: зав. отделением реконструктивной и пластической хирургии, канд. мед. наук, Затолокиным П.А.; канд.мед.наук, эндокринологом Н.И. Миронюк на базе областной клинической больницы г. Калининграда (главный врач - заслуженный врач РФ, Поляков К.И.). Биохимические и молекулярные исследования проводились в лаборатории иммунологии и клеточных биотехнологий БФУ им. И.Канта (зав. лабораторией - д-р мед. наук, Л.С. Литвинова).

Все включенные в исследование пациенты были комплексно обследованы с помощью стандартизованных методов. На каждого больного заполняли индивидуальную карту, в которой регистрировали анамнестические и клинические данные, результаты физикального обследования и лабораторные показатели. Все участники исследования были разделены на группы, в зависимости от степени (ст.) ожирения (по индексу массы тела, ИМТ) и состоянию углеводного обмена (наличие/отсутствие СД 2 типа).

Распределение обследованных пациентов по подгруппам осуществлялось следующим образом (таблица 1):

ИМТ 30-34,9 кг/м2 (I ст. ожирения). В эту группу было включено 40 пациентов (18 мужчин, 22 женщины) с установленным диагнозом ожирение I ст. Пациенты данной группы были ранжированы на 2 подгруппы в зависимости от наличия или отсутствия СД 2 типа. Уровень глюкозы в пределах референсных значений регистрировался у 28 пациентов, из них 10 имели гипертоническую болезнь II степени, риск 3. СД 2 типа был диагностирован у 12 пациентов, 8 из них имели гипертоническую болезнь II степени, риск 3. Средний возраст в подгруппе 43,0±8,65 лет.

ИМТ 35 - 39,9 кг/м2 (II ст. ожирения). В группу были включены 46 пациентов (22 мужчины, 24 женщины) с диагнозом ожирение II ст. В этой группе 26 пациентов не имели нарушений углеводного обмена, у 23 человек протекала гипертоническая болезнь II ст., риск 4. СД 2 типа был диагностирован у 20 пациентов, из них 19 - с гипертонической болезнью II ст., риск 4. Средний возраст составил 44±7,58 лет.

ИМТ 40 кг/м2 (III ст. ожирения). В группу были включены 69 пациентов (20 мужчин, 49 женщин) с диагнозом ожирение III ст. 38 больных не имели нарушений углеводного обмена, из них 21 человек страдал гипертонической болезнью II ст., 4 риск. СД 2 типа диагностирован у 31 пациента, у всех была гипертоническая болезнь II ст., риск 4. Средний возраст составил 45,3±12,5 лет.

Пациенты с СД 2 типа, принявшие участие в исследовании, не получали инсулинотерапию. Группа пациентов с ожирением, осложненным СД 2 типа, а также больные морбидным ожирением (ИМТ 40 кг/м) без нарушений УО, получали консервативное лечение ожирения, включающее - изменение образа жизни: диета (ограничение потребления пищи с высоким содержанием жиров и углеводов), физические нагрузки прием метформина в дозе от 500 до 1500 мг в сутки и эксенатида (инкретин) в дозе 5 мкг 2 раза в день) в течение года и более. Все пациенты с ожирением, включенные в исследование, посещали школу ожирения при КОКБ г. Калининграда (ведущий специалист – канд. мед. наук, врач-эндокринолог Н.И. Миронюк). Продолжительность (стаж) СД 2 типа у обследованных пациентов составила 2,0±1,3 года. Вновь выявленные случаи СД 2 типа регистрировались у 18% пациентов, принявших участие в исследовании.

Для более полной характеризации тканеспецифической продукции адипокинов и провоспалительных молекул в протокол исследования была включена группа лиц с избыточной массой тела (ИМТ 25 – 29,9 кг/м): 34 человека (13 мужчин, 21 женщина): у одного человека - гипертоническая болезнь I степени, риск 3, у 1 пациента диагностирована нарушенная толерантность к глюкозе (НТГ). Средний возраст в подгруппе 42,2±9,92 лет.

Для сопоставления результатов исследования по определению уровней тканеспецифической экспрессии мРНК генов (IL-6, AdipoQ, TNF, CFD, LEP, SERPINA12, RARRES2, B2M) в жировой ткани разной локализации, была введена группа сравнения, в которую были включены 30 пациентов (из них 16 женщин, 14 мужчин) с нормальным ИМТ (18,9-24,9 кг/м).

Исследование биохимических показателей и индикаторов инсулинорезистентности у пациентов со II степенью ожирения без или с сахарным диабетом 2 типа

Количественное определение C-пептида, инсулина, лептина, адипонектина и адипсина в плазме оценивали методом проточной флюориметрии на двухлучевом лазерном автоматизированном анализаторе (B -Plex Protein Assay System, Bio-Rad, США) с использованием коммерческих тест-систем (B -PlexProHuman Diabetes 10-Plex Assay и B -PlexPro Human Diabetes Adipsin and Adiponectin Assays, Bio-Rad, США).

Принцип метода. Суть метода заключается в связывании исследуемых молекул со специфическими антителами, адсорбированными на поверхности микросфер (магнитных гранул), что позволяет определять до 100 аналитов в одной лунке.

Ход исследования. В работе использовались 96-луночные планшеты формата Bio-Plex, в которые добавляли по 50 мкл микросфер, затем дважды промывали буферным раствором с помощью промывочной станции (B -PlexPr WashStations, Bio-Rad, США). Далее, согласно протоколу, вносили по 50 мкл раствора бланка, стандартных и исследуемых образцов, в соответствующие ячейки планшета и инкубировали 30 мин в темноте, при комнатной температуре при непрерывном встряхивании (300 об/мин). Далее, 3-х кратной отмывки добавляли 25 мкл специфических антител. По окончании второй инкубации проводилась 3-х кратная отмывка, после чего вносили 100 мкл стрептавидина–РЕ, который связывался с биотинилированными антителами. Инкубировали в темноте, при комнатной температуре 10 мин при 300 об/мин. После 3-х кратной отмывки, вносили в каждую лунку по 125 мкл буфера, затем после 30 сек встряхивания при 1100 об/мин. помещали планшет на платформу микропланшет B -Plex.

Считывание результатов производилось с помощью автоматического фотометра для микропланшет B -Plex (Bio-Plex 200 Systems, B -Rad, США) и программы B -PlexManager (Bio-Rad, США). Концентрацию исследуемых веществ определяли по стандартной кривой каждого набора (определяемый динамический диапазон 2-32 000 пг/мл) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя. При статистической обработке значения уровня цитокинов, выходящие за нижнюю границу чувствительности метода ( 2 пг/мл), принимались за 1 пг/мл.

Для выявления нарушения толерантности к глюкозе определяли индекс HOMA-IR (homeostasis model assessment – insulin res sta ce), который рассчитывали по формуле: НОМА-IR = (Инс х Гл) /22,5, где Инс – инсулин плазмы натощак (мкЕд/мл) Гл – глюкоза плазмы натощак (ммоль/л). Пересчет концентрации инсулина с пг/мл на мкЕд/мл осуществляли, используя программу-калькулятор для пересчета - SI Unit Conversion Calculator(http://www.socbdr.org/rds/authors/unit_tables_conversions_and_genetic_dicti onaries/conversion_in_si_units/index_en.html).

Для предотвращения деградации РНК в клетках, полученные образцы жировой ткани помещали в стабилизационный буфер (RNAlaterRNA Stab l zat Rea e t, «QIAGEN», Германия). До проведения эксперимента образцы хранили в стабилизирующем буфере, согласно протоколу производителя.

Для выделения тотальной РНК в образцы добавляли по 1 мл ExtractRNA (водный раствор фенола и гуанидин-изотиоцианата) (ExtractRNA kit «Евроген», Россия) и инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин. После инкубации центрифугировали 10 минут при 15000 («Еppe d rf», Ce tr f e 5804R, Германия). Отбирали лизат и переносили его в подготовленную заранее микроцентрифужную пробирку типа эппендорф. Затем в полученный лизат добавляли 0,2 мл хлороформа («Вектон», Россия) и активно перемешивали содержимое (вручную) в течение 15 секунд. Инкубировали смесь 5 минут при комнатной температуре, периодически встряхивая образец. Затем центрифугировали 15 минут при 15000 при 4С. Из полученной трехфазной смеси аккуратно отбирали водную фазу, содержащую тотальную РНК и добавляли 0,5 мл 100% изопропанола.

Полученную смесь инкубировали при комнатной температуре 10 мин, затем центрифугировали при 12000 в течение 10 мин при комнатной температуре. Тщательно отбирали супернатант, оставив осадок РНК на дне пробирки. Затем добавляли 2 мл 75% этанола и центрифугировали в течение 5 мин при 15000g при комнатной температуре. Затем удаляли супернатант и высушивали осадок на воздухе в эппердорфе с открытой крышкой в течение 7 мин. Растворяли полученную РНК в 30 мкл деионизованной дистиллированной воды, свободной от РНКаз. Полученные образцы замораживали на -80С, до дальнейшего использования.

Чистоту препаратов выделенной РНК определяли с помощью спектрофотометра (Na v e Pl s, GE Healt care B -Sc e ces, Швеция). Анализировали результат отношения значений поглощения на длинах волн 260 нм и 280 нм (А260 нм/280 нм). Значения варьировали в диапазоне 2,7-2,9 усл.ед.

Качество (целостность) выделенных образцов тотальной РНК определяли методом электрофоретического разделения в 1,5% агарозном геле и трис-ацетатном буфере (ТАЕ) по соотношению плотности бэндов, соответствующих большой (28S) и малой (18S) рибосомным субъединицам рРНК. Образцы выделенной РНК считали пригодными для последующего аналитического этапа, если плотность бэнда, соответствующего малой субъединице не превышала плотность бэнда, соответствующего большой субъединице (индекс RIN (RNA I te r ty N mber) был равным 1:2).

Исследование содержания адипокинов - лептина, адипонектина, адипсина, васпина и химерина в плазме крови у пациентов с III степенью ожирения без или с сахарным диабетом 2 типа

Содержание васпина в плазме крови составило 2,28(1,92-2,57) нг/мл и достоверно отличалось от контроля (р 0,05). Плазменный уровень адипсина у пациентов со II ст. ожирения так же достоверно повышался до 3,41(2,69-4,41) пг/мл относительно контроля (р 0,05), но не отличался при этом от аналогичных показателей в группе с избыточной массой тела и I ст. ожирения (таблица 6).

Корреляционный анализ позволил выявить зависимости между плазменными уровнями лептина и ИМТ (r=0,945, p 0,05), ОТ (r=0,989, p 0,05) адипонектина с ТГ (r=-0,812, p 0,05), адипсином (r=-0,767, p 0,05), лептином (r=-0,739, p 0,05). Уровень адипсина в плазме крови коррелировал с С-пептидом (r=-0,768, p 0,05), лептином (r=-0,978, p 0,05), васпином (r=0,956, р 0,05) HbA1с (r=-0,891, p 0,05); химерин с TNF (r=-0,943, р 0,05) васпин с HbA1с (r=-0,829, р 0,05), индексом HOMA-IR (r=-0,669, p 0,05) и IL-6 (r=0,833, р 0,05) адипсин с ТГ (r=0,71, p 0,05) и ЛПНП (r=0,53, p 0,05), лептином (r= - 0,348, p 0,05); лептин и инсулин (r=0,945, p 0,05).

Изменение плазменных уровней, изученных адипокинов в плазме крови у больных СД 2 типа со II ст. ожирения носило аналогичный характер с закономерностями, выявленными у пациентов с аналогичным ИМТ без нарушения углеводного обмена. Так, количество адипонектина не изменялось относительно контрольных величин и соответствовало 3,26(2,9-4,68) мкг/мл) (таблица 6). В данной группе больных уровень химерина оказался пониженным и составлял 131(130-170) против 194(149-195) нг/мл у пациентов без нарушений УО, имеющих II ст. ожирения. Плазменная концентрация адипсина превышала таковую в контроле и была равной 2,7(2,1-3,4) пг/мл (р 0,05) (таблица 6). Количество лептина в плазме крови у пациентов со II ст. ожирения с СД 2 типа повышалось по сравнению с контролем (р 0,05) и было равным 5,60(4,24-5,78) нг/мл. При этом значения данного показателя оказались выше аналогичных значений у пациентов с избыточной массой тела и с I ст. ожирения, независимо от состояния углеводного обмена (р 0,05 в обоих случаях) (таблица 6). Содержание васпина в плазме крови составило 2,47(2,13-2,76) нг/мл, достоверно превышая контроль, группу с избыточной массой тела и с I ст. ожирения без нарушений УО (р 0,05). Содержание химерина было сопоставимо с контролем (таблица 6).

Исследование корреляционных ассоциаций у больных СД 2 типа со II ст. ожирения выявило наличие сильных взаимосвязей между плазменным содержанием адипонектина и адипсина (r=-0,934, p 0,05) лептина и HOMA-IR (r=0,841, p 0,05), инсулина (r=0,786, p 0,05) и гликированным гемоглобином (r=0,834, p 0,05) химерина и ТГ (r=0,912, р 0,05), адипонектина (r=-0,940, p 0,05), адипсина (r=-0,956, p 0,05), HbA1с (r=0,712, р 0,05) васпина с адипсином (r=0,907, р 0,05) адипсин с ТГ (r=0,91, p 0,05), ЛПНП (r=0,73, p 0,05), СРБ (r=0,56, r=0,829), TNF (r=0,902).

У пациентов с III ст. ожирения (n=38) без нарушений УО, плазменный уровень адипонектина снижался относительно контрольных значений и такового у больных без СД типа с I ст. ожирения до 2,38(1,87-3,21) мкг/мл (р 0,05 в обоих случаях) (таблица 6). Плазменные уровни адипсина и лептина у этой категории пациентов сохраняли тенденцию к повышению. Так, содержание адипсина относительно контроля возрастало до 3,54(2,78-3,86) пг/мл, а лептина - до 5,52(3,90-6,52) нг/мл, что значимо превышало контрольные значения и аналогичные показатели в группе с избыточной массой тела (р 0,05 во всех случаях). Уровни васпина и химерина определяемые в плазме пациентов данной группы достоверно превышали аналогичные показатели контроля (р 0,05) (таблица 6).

Корреляционный анализ позволил выявить в этой группе пациентов сильные взаимосвязи между ИМТ и плазменным содержанием адипонектина (r=-0,683, p 0,05) адипсином и ОХ (r=0,810, p 0,05), ЛПНП (r=0,762, p 0,05), ТГ (r=0,738, p 0,05), С-пептидом (r=0,823, p 0,05), адипонектином (r=-0,761, p 0,05) лептином и ОБ (r=0,900, p 0,05), глюкозой (r=0,900, p 0,05), адипонектином (r=-0,42, p 0,05); химерином и IL-6 (r=-0,875, р 0,05), TNF (r=0,821, р 0,05) васпином и адипонектином (r=-0,967, p 0,05), лептином (r=0,934, p 0,05), HbA1с (r=0,900, р 0,01), индексом HOMA-IR (r=0,54, p 0,05).

В группе больных с ИМТ 40 кг/м2 и СД 2 типа (n=31) регистрировались более выраженные изменения плазменных уровней, изучаемых адипокинов. Так, количество адипонектина в плазме крови оказалось самым низким в сравнении со значениями в ранее описанных группах пациентов и соответствовало 1,85(1,8-3,7) мкг/мл (таблица 6). Плазменное содержание васпина составило 2,52(2,32-2,84) нг/мл и достоверно отличалось от контроля, групп с избыточной массой тела и I ст. ожирения независимо от состояния углеводного обмена (р 0,05). Уровень адипсина в плазме крови, как и в группе с аналогичным ИМТ (с нормальным уровнем глюкозы), повышался относительно контроля (р 0,05) до 3,34(2,68-3,89) пг/мл. Количество лептина в плазме крови больных с нарушениями углеводного обмена, достигших III ст. ожирения, превышало показатели контроля, а также значения, полученные в группах с избыточной массой тела и с I ст. ожирения независимо от состояния углеводного обмена (р 0,05 во всех случаях), однако значимо не отличалось от значений в группе с аналогичным ИМТ без нарушений УО (таблица 6). Плазменное содержание химерина у этой группы пациентов снижалось относительно значений в группе с нормальным уровнем глюкозы и соответствовало контрольным (таблица 6).

Корреляционный анализ изучаемых показателей у пациентов с III ст. ожирения с СД 2 типа позволил выявить наличие взаимосвязей между плазменным содержанием адипсина с ОТ (r=0,663, p 0,05), ТГ (r=0,81, p 0,05) и ЛПНП (r=0,36, p 0,05), адипонектином (r=-0,82, p 0,05); лептина с инсулином (r=0,879, p 0,05) и адипонектином (r=-0,856, p 0,05) васпина с химерином (r=0,723, р 0,05) и отношением ОТ/ОБ (r=0,657, р 0,05).