Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 12
1.1. Сахарный диабет 2 типа: эпидемиология, диагностические критерии 12
1.2. Роль ожирения в развитии СД 2 типа 13
1.2.2. Патогенез инсулинорезистентности 15
1.3. Краткая характеристика медиаторов с системным действием, участвующих в регуляции метаболических реакций 17
1.3.1. Эффекты инкретинов в регуляции углеводного обмена 23
1.3.2. Роль инкретинов в патогенезе инсулинорезистентности и их использование в терапии сахарного диабета 2 типа 26
1.3.3. Взаимосвязь инкретинов с гормонами гастродуоденальной зоны в патогенезе сахарного диабета 2 типа 28
1.4. Характеристика однонуклеотидных полиморфизмов генов рецепторов к инкретинам 30
Глава II. Материалы и методы исследования 35
2.1. Объект исследования 35
2.1.1. Критерии включения и исключения 36
2.2. Материалы исследования 37
2.3. Методы исследования 38
2.3.1. Исследование биохимических показателей 38
2.3.2. Выделение ДНК 40
2.3.2.1. Аллель-специфическая ПЦР в режиме реального времени 41
2.3.3. Выделение РНК 43
2.3.3.1. Реакция обратной транскрипции РНК 43
2.3.3.2. ПЦР в режиме реального времени 43
2.3.4. Определение C-пептида, инсулина, глюкагона, грелина, GIP, GLP-1, лептина, PAI-1, резистина, висфатина в плазме крови. Проточная цитофлюориметрия 46
2.3.5. Статистический анализ 47
Глава III. Результаты исследования 49
3.1. Исследование биохимических показателей и индикаторов инсулинорезистентности в сыворотке крови у пациентов с ожирением без / с сахарным диабетом 2 типа 49
3.2 Исследование содержания адипокинов и гормонов гастродуоденальной зоны в плазме крови у пациентов с ожирением без / с сахарным диабетом 2 типа натощак и после завтрака 50
3.3. Исследование уровня относительной тканеспецифической экспрессии генов рецепторов к инкретинам 54
3.4. Исследование однонуклеотидных полиморфизмов гена GIPR 55
3.4.1. Исследование однонуклеотидного полиморфизма rs2302382 гена GIPR 55
3.4.1.1. Исследование взаимосвязи полиморфизма rs2302382 гена GIPR с повышенным риском развития СД 2 типа 55
3.4.1.2. Исследование взаимосвязи полиморфизма rs2302382 гена GIPR с содержанием адипокинов и гормонов в плазме крови 56
3.4.1.3. Исследование взаимосвязи полиморфизма rs2302382 гена GIPR с уровнем относительной экспрессии гена GIPR 57
3.4.2. Исследование однонуклеотидного полиморфизма rs8111428 гена GIPR 57
3.4.2.1. Исследование взаимосвязи полиморфизма rs8111428 гена GIPR с повышенным риском развития СД 2 типа 57
3.4.2.2. Исследование взаимосвязи полиморфизма rs8111428 гена GIPR с содержанием адипокинов и гормонов в плазме крови 58
3.4.2.3. Исследование взаимосвязи полиморфизма rs8111428 гена GIPR с уровнем относительной экспрессии гена GIPR 59
3.4.3. Исследование однонуклеотидного полиморфизма Glu354Gln (rs1800437) гена GIPR 59
3.4.3.1. Исследование взаимосвязи полиморфизма rs1800437 гена GIPR с повышенным риском развития СД 2 типа 59
3.4.3.2. Исследование взаимосвязи полиморфизма rs1800437 гена GIPR с содержанием адипокинов и гормонов в плазме крови 60
3.4.3.3. Исследование взаимосвязи полиморфизма rs1800437 гена GIPR с уровнем относительной экспрессии гена GIPR 61
3.4.4. Исследование неравновесного сцепления полиморфизмов rs2302382 rs8111428, rs1800437 гена GIPR 62
3.5 Исследование однонуклеотидных полиморфизмов гена GLP-1R 62
3.5.1. Исследование однонуклеотидного полиморфизма rs1042044 гена GLP-1R 62
3.5.1.1. Исследование взаимосвязи полиморфизма rs1042044 гена GLP-1R с повышенным риском развития СД 2 типа 62
3.5.1.2. Исследование взаимосвязи полиморфизма rs1042044 гена GLP-1R с содержанием адипокинов и гормонов в плазме крови 63
3.5.1.3. Исследование взаимосвязи полиморфизма rs1042044 гена GLP-1R с уровнем относительной экспрессии гена GLP-1R 64
3.5.2. Исследование однонуклеотидного полиморфизма rs6923761 гена GLP-1R 64
3.5.2.1. Исследование взаимосвязи полиморфизма rs6923761 гена GLP-1R с повышенным риском развития СД 2 типа 64
3.5.2.2. Исследование взаимосвязи полиморфизма rs6923761 гена GLP-1R с содержанием адипокинов и гормонов в плазме крови 65
3.5.2.3. Исследование взаимосвязи полиморфизма rs6923761 гена GLP-1R с уровнем относительной экспрессии гена GLP-1R 66
3.5.3. Исследование однонуклеотидного полиморфизма rs10305420 гена GLP-1R 67
3.5.3.1.Исследование взаимосвязи полиморфизма rs10305420 гена GLP-1R с повышенным риском развития СД 2 типа 67
.5.3.2. Исследование взаимосвязи полиморфизма rs10305420 гена GLP-1R с содержанием адипокинов и гормонов в плазме крови 67
3.5.4. Исследование неравновесного сцепления полиморфизмов полиморфизмов rs1042044, rs6923761 и rs10305420 гена GLP-1R гена GIPR 68
Глава 4. Обсуждение полученных результатов . 72
Выводы 89
Список принятых сокращений 90
Список использованной литературы 91
- Краткая характеристика медиаторов с системным действием, участвующих в регуляции метаболических реакций
- Исследование содержания адипокинов и гормонов гастродуоденальной зоны в плазме крови у пациентов с ожирением без / с сахарным диабетом 2 типа натощак и после завтрака
- Исследование взаимосвязи полиморфизма rs1800437 гена GIPR с уровнем относительной экспрессии гена GIPR
- Исследование неравновесного сцепления полиморфизмов полиморфизмов rs1042044, rs6923761 и rs10305420 гена GLP-1R гена GIPR
Введение к работе
Актуальность темы исследования. В современной медицине проблема сахарного диабета 2 (СД 2) типа является одной из наиболее приоритетных и социально значимых [IDF, 2016]. СД 2 типа и ассоциированные с ним заболевания, в частности абдоминальное ожирение, занимают лидирующие позиции среди причин смертности населения [Global Health Observatory (GHO), 2015].
Инсулинорезистентность, являясь неотъемлемым спутником СД 2 типа, характеризуется нарушением метаболического ответа инсулин-зависимых тканей (т.к. мышечная, жировая ткани, печень) на инсулин, что приводит к увеличению его концентрации в плазме крови [Finan B. et al., 2013]. Известно, что в патогенезе СД 2 типа, наряду с инсулином, важное значение имеют гормоны гастродуоденальной зоны и адипокины, медиаторы жировой ткани, осуществляющие регуляцию компонентов углеводного обмена [Finan B. et al., 2013; Vejrazkova D. et al., 2016]. Секреция целого ряда гормонов обнаружена в разных отделах кишечника, где ключевая роль принадлежит инкретинам – глюкозозависимому инсулинотропному пептиду (GIP) и глюкагоноподобному пептиду-1 (GLP-1) [Skow M. et al., 2016; Brandt S. et al., 2018].
Основной функцией инкретинов является стимуляция секреции инсулина -клетками поджелудочной железы островков Лангерганса [Yabe D. et al., 2011; Campbell J. et al. 2016]. GLP-1 способствует нормализации углеводного обмена и снижению индекса массы тела (ИМТ) [Hong X. et al., 2016], тогда как GIP проявляет разнонаправленные эффекты в отношении углеводного обмена, а его принадлежность к инкретинам или антиинкретинам до сих пор остается спорной [Finan B. et al., 2013]. Продемонстрирована убедительная взаимосвязь инкретинов с регуляцией продукции лептина и грелина – основных модуляторов углеводного обмена [Perez C. et al., 2004; Karim R. et al., 2015; Ronveaux et al., 2016].
Лептин, помимо метаболических функций, является плейотропным
медиатором, участвующим в воспалительных процессах, модулируя гомеостаз
глюкозы и высвобождение инсулина, снижая секрецию глюкагона [Vejrazkova D. et al.,
2016; Hong X. et al., 2016]. Глюкагон в свою очередь, стимулирует выработку глюкозы
в печени, предотвращая гипогликемию в нормальных физиологических условиях;
гиперглюкагонемия является признаком СД 2 типа [Vejrazkova D. et al., 2016; 7].
Установлено, что развитию инсулинорезистентности также способствует резистин
[Vejrazkova D. et al., 2016; Stofkova А., 2010]. Висфатин, обладая провоспалительными
и иммуномодулирующими свойствами, оказывает/проявляет инсулин-
сенсибилизирующий и инсулин-миметический эффекты, представляя интерес с точки зрения возможной мишени для модуляции уровня глюкозы в крови [Vejrazkova D. et al., 2016; Stofkova А., 2010].
Секреция инсулина, стимулированная инкретинами (т.н. инкретиновый эффект), составляет около 50% от общей его продукции [Kim S. et al., 2008]. Биосинтез и секреция инсулина тесно взаимосвязаны с активацией инкретиновых рецепторов [Chiang N. et al., 2016]. У пациентов с СД 2 типа чувствительность клеток к инсулину снижена и его глюкозозависимая секреция нарушается [Nielsen S. et al., 2015]. Установлено, что отсутствие/снижение ответа на терапию инкретинами у пациентов с СД 2 типа может быть связано с дизрегуляцией экспрессии или дефектами рецепторов к инкретинам [Yabe D. et al., 2013]. Принимая во внимание важную роль инкретинов в регуляции инсулиновой продукции, исследования, направленные на изучение причин нарушения
секреции инкретинов или снижения чувствительности рецепторов к ним при СД 2 типа, носят актуальный и своевременный характер.
Степень разработанности темы. Одним из основных факторов риска развития СД 2 типа является отягощенная наследственность [Global Health Observatory (GHO), 2015]. Как уже упоминалось ранее, процессы биосинтеза и секреции инсулина имеют тесную взаимосвязь с регуляцией активности рецепторов к инкретинам [Chiang N. et al., 2016]. Результаты популяционных исследований показали, что ряд однонуклеотидных полиморфизмов в генах рецепторов к инкретинам являются функционально значимыми и ассоциированы с развитием различных метаболических нарушений [Nakayama K. et al, 2014; Sauber J. et al., 2010]. Так, в гене GIPR было выявлено несколько полиморфизмов, ассоциированных с ИМТ [Nakayama K. et al, 2014], СД 2 типа и ожирением [Vogel C. et. al, 2009]. Наличие аллеля А полиморфизма rs2302382 гена GIPR повышает риск развития ожирения в немецкой популяции [Vogel C. et. al, 2009; Sauber J. et al, 2010]. Выявлена взаимосвязь полиморфизма rs1800437 с индексом инсулинорезистентности (HOMA-IR, homeostasis model assessment – insulin resistance) [Sauber J. et al., 2010], увеличением ИМТ [Nitz I. et al., 2007] и развитием инсулиннезависимого СД [Vogel C. et. al, 2009]. В гене GLP-1R однонуклеотидный полиморфизм Gly168Ser (rs6923761) связывают с изменением инсулиновой секреции у здоровых людей [de Luis D. et al, 2014]. В другом исследовании было установлено, что у тучных пациентов, имеющих аллель А полиморфизма rs6923761, после низкокалорийной диеты антропометрические параметры изменялись в большей степени, чем у носителей аллеля G [de Luis D. et al, 2013]. Таким образом, выявление пациентов с предрасположенностью к СД 2 типа, а также изучение патогенетического значения полиморфных вариантов генов рецепторов к инкретинам у больных ожирением с и без СД 2 типа имеет большую клиническую значимость, поскольку это заболевание может быть обратимым и при своевременном лечении можно добиться исчезновения или уменьшения выраженности основных его проявлений.
В связи с вышесказанным, целью исследования явился анализ патогенетического значения полиморфных вариантов генов рецепторов к инкретинам (GIPR, GLP-1R) в развитии инсулинорезистентности у больных ожирением с СД 2 типа.
Задачи исследования:
-
Провести анализ ассоциаций полиморфных вариантов rs2302382, rs8111428, Glu354Gln (rs1800437) гена GIPR и Leu260Phe (rs1042044), Gly168Ser (rs6923761), rs10305420 гена GLP-1R с риском развития СД 2 типа в восточнославянской популяции Северо-Западного региона России.
-
Установить взаимосвязь полиморфных вариантов генов GIPR и GLP-1R с уровнями гормонов гастродуоденальной зоны и адипокинов в плазме крови, участвующих в регуляции углеводного обмена, у больных ожирением без / с СД 2 типа
-
Оценить взаимосвязь полиморфных вариантов генов GIPR и GLP-1R с уровнем относительной экспрессии одноименных генов рецепторов к инкретинам в жировой ткани брыжейки тонкого кишечника у больных ожирением без / с СД 2 типа.
-
Выявить патогенетические особенности влияния полиморфизмов генов GIPR и GLP-1R на развитие инсулинорезистентности при ожирении.
Положения, выносимые на защиту.
1. Установлен вклад полиморфных вариантов rs2302382, rs1800437 гена GIPR и rs1042044, rs6923761 и rs10305420 гена GLP-1R в формирование генетической предрасположенности к СД 2 типа у лиц с ожирением, проживающих на территории Северо-Западного региона России.
-
Полиморфные варианты rs2302382 и rs8111428 гена GIPR вносят вклад в формирование содержания гормонов гастродуоденальной зоны (инсулина, грелина, GIP) и адипокинов (лептина, резистина) в плазме крови, посредством изменения уровня экспрессии его гена в жировой ткани брыжейки тонкого кишечника у больных ожирением с СД 2 типа.
-
Полиморфизмы (Leu260Phe, Gly168Ser и rs10305420) гена GLP-1R вносят вклад в формирование уровня гормонов (инсулина, грелина, глюкагона) и адипокинов (резистина, лептина и висфатина) в плазме крови у больных ожирением с СД 2 типа.
Научная новизна. В работе представлены результаты впервые осуществленного в восточнославянской популяции комплексного анализа ассоциаций полиморфных вариантов генов GIPR и GLP-1R с риском развития СД 2 типа при ожирении. Оценка неравновесного сцепления изученных полиморфных вариантов позволила впервые выявить блок сцепления rs8111428/rs2302382 в гене GIPR и rs6923761/rs1042044 в гене GLP-1R в восточнославянской популяции Северо-Западного региона России. Установлено участие инкретина GIP в развитии дислипопротеинемии у пациентов с ожирением без СД 2 типа. Впервые установлены эффекты полиморфных вариантов rs2302382, rs8111428, Glu354Gln (rs1800437) гена GIPR и Leu260Phe (rs1042044), Gly168Ser (rs6923761), rs10305420 гена GLP-1R в изменении уровней регуляторов углеводного обмена в плазме крови – гормонов и адипокинов: - изменение экспрессии гена GIPR в жировой ткани брыжейки тонкого кишечника зависит от генотипов его полиморфных вариантов rs2302382 и rs8111428, что вносит вклад в формирование уровней гормонов (инсулина, грелина, GIP) и адипокинов (лептина, резистина) в плазме крови у больных ожирением с СД 2 типа; - полиморфизмы (rs1042044, rs6923761, rs10305420) в гене GLP-1R ассоциированы с изменением уровня инсулина, резистина и грелина, глюкагона, лептина, висфатина у больных СД 2 типа.
Теоретическая и практическая значимость. Найденные в диссертационной работе ассоциации полиморфизмов генов GIPR и GLP-1R с риском развития СД 2 типа при ожирении и показанные для них эффекты расширяют понимание процессов патогенеза инсулинорезистентности и существующие в научной литературе представления о его генетических детерминантах. Выявленные в работе особенности параметров углеводного обмена при ожирении и их взаимосвязь с полиморфными вариантами генов GIPR и GLP-1R могут представлять интерес для практического здравоохранения и быть использованы для разработки новых патогенетических подходов к профилактике, диагностике, терапии и мониторингу лечения СД 2 типа при ожирении.
Результаты диссертационного исследования используются в учебном процессе на кафедре фундаментальной медицины Медицинского Института БФУ им. И. Канта и Институте Живых Систем БФУ им. И. Канта г. Калининграда.
Методология и методы исследования. Согласно поставленным задачам,
выбраны высокоинформативные методы исследования, которые выполнялись на базе
научно-исследовательской Базовой лаборатории иммунологии и клеточных
биотехнологий БФУ им. И. Канта.
В качестве материалов исследования использовали периферическую венозную кровь и биоптаты жировой ткани брыжейки тонкого кишечника, полученные у групп обследуемых лиц, принявших участие в исследовании (пациенты с ожирением, ранжированные по состоянию углеводного обмена и здоровые доноры).
Основные методы исследования.
1. Молекулярно-генетические методы исследования (выделение геномной ДНК;
аллель-специфическая ПЦР в режиме реального времени).
2. Исследование сывороточных показателей углеводного (уровень глюкозы,
гликированного гемоглобина) и липидного обменов (триглицериды, общий холестерин,
холестерин липопротеинов низкой/высокой плотности) (биохимический метод
исследования).
-
Определение содержания гормонов (С-пептида, инсулина, грелина, глюкагона, GIP, GLP-1, PAI-1) и адипокинов (лептина, резистина, висфатина) в плазме крови (проточная флуориметрия).
-
Оценка экспрессии генов рецепторов к инкретинам в биоптатах жировой ткани брыжейки тонкого кишечника (ПЦР в режиме реального времени). Статистический анализ результатов.
Степень достоверности и апробация результатов. Высокая степень достоверности полученных результатов подтверждается достаточным объемом клинико-экспериментального материала, использованием современных методов (биохимические методы исследования, проточная флуориметрия, полимеразная цепная реакция) и методических подходов, высокотехнологичного оборудования, а также адекватных критериев для статистической обработки результатов. Результаты проведенных исследований докладывались и обсуждались на Российских и международных конференциях. В работе приводятся фрагменты научно-исследовательских работ «Исследование иммунопатологических реакций при метаболическом синдроме» (ГК №П329 от 07 мая 2010г) «Исследование молекулярных и клеточных механизмов формирования хронического воспаления при метаболических нарушениях» (Соглашение № 14.A18.21.0206 от 23 июля 2012 г.) выполненных в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 печатных работ, из них 9 статей в ведущих рецензируемых журналах и изданиях, рекомендованных ВАК для опубликования основных научных результатов диссертаций, 9 статей и тезисов в материалах конференций и симпозиумов.
Структура и объем диссертации. Текст диссертации изложен на 121 странице машинописного текста и состоит из введения, четырёх глав, выводов, списка использованной литературы и приложения. Работа проиллюстрирована 21 рисунками и 21 таблицами. Библиографический указатель включает 149 источников (137 – иностранных и 12 – отечественных). Автор принимал непосредственное участие в разработке дизайна и планировании исследования. Полученные результаты проанализированы и обобщены в выводах и положениях автором лично.
Краткая характеристика медиаторов с системным действием, участвующих в регуляции метаболических реакций
ИР характеризуется снижением способности инсулина оказывать свое биологическое действие на ткани-мишени, что способствует нарушению протекания разнообразных физиологических процессов [56].
Несмотря на большой объем данных, который формирует наше понимание механизмов, лежащих в основе развития резистентности к инсулину, этот процесс является чрезвычайно сложным и многокомпонентным. Логичным представляется участие в этом генетически детерминированном процессе многих биологически активных веществ с системным и локальным действием, в частности, гормонов гастродуоденальной зоны, цитокинов, адипокинов и др. [57;58].
Инсулин - анаболический гормон, обеспечивающий нормальный метаболизм и энергетический баланс организма за счет ингибирования образования глюкозы печенью и усиления поглощения ее мышцами и жировой тканью. Синтезированный островками -клеток поджелудочной железы проинсулин заключен в секреторные гранулы, в которых он преобразуется прогормонами конвертазами (РС1/3 и РС2) и карбоксипептидазой Е в С-пептид и инсулин [15]. В процессе образования активного инсулина от проинсулина отщепляется С-пептид. Метаболическим эффектам инсулина уделяется большое внимание, поскольку его недостаточная секреция или устойчивость к его действию, приводят к метаболическим дисфункциям, в том числе ожирению и СД 2 типа [59].
Грелин участвует в регуляции энергетического баланса, включая метаболизм глюкозы [5;60;61]. Гормон имеет орексигенный эффект и известен как «гормон голода». Подавляя секрецию инсулина, грелин защищает организм от гипогликемии. У людей с нарушением толерантности к глюкозе концентрация грелина в плазме закономерно ниже, чем у здоровых лиц [62]. После перорального введения глюкозы, уровень грелина у пациентов с более выраженной резистентностью к инсулину ниже, чем у здоровых доноров [5;63].
Грелин представляет собой пептид состоящий из 28 аминокислот [64]. Ген грелина состоит из пяти экзонов [64;65]. Препрогрелин, состоящий из пяти экзонов подвергается эндопротеолитической обработке и посттрансляционной модификации для производства ацилгрелин и дезацил грелин [10]. Дезацил грелин имеет ту же аминокислотную последовательность, что грелин, но его третья аминокислота серин не ацилируется [10]. Посттрансляционная модификация грелина ацилированием ферментом грелин O-ацилтрансфераза (GOAT) определяет его функционал [66]. GOAT требуется для связывания грелина и активации его рецептора [66]. Преобладающее большинство циркулирующего общего грелина существует в форме дезацил-грелина. Около одной десятой части циркулирующего грелина представляет собой ацилгрелин. Последний характеризуется как мощный стимулятор приема пищи, в то время как воздействие дезацил-грелина на энергетический баланс не однозначно [66].
Грелин синтезируется и секретируется в желудочно-кишечном тракте и подавляет -клеточную толерантность к глюкозе. Грелин также продуцируется в переднем отделе кишечника и в эндокринных клетках, расположенных в поджелудочной железе (эпсилон клетки) [67]. Голодание вызывает экспрессию грелина в желудочном эпителии. Циркулирующие уровни ацилгрелина увеличиваются во время пищевой депривации, однако исследования грелин-дефицитных мышей показало их меньшую защищенность от гипогликемии [67]. Кроме того, фармакологическое ингибирование фермента ацилирования грелина по O-ацилтрансферазе, приводит к уменьшению его активных форм, увеличению секреции инсулина и улучшению гомеостаза глюкозы, что было продемонстрировано на животных моделях с ожирением и нарушением толерантности к глюкозе [67].
Таким образом, ингибирование грелина или его рецепторов препятствует положительному энергетическому балансу и нормализации метаболических показателей при гипергликемии, что вызывает интерес к факторам, модулирующим выработку эндогенного грелина [10].
Глюкагон является гормоном, который стимулирует выработку глюкозы в печени, предотвращая гипогликемию в нормальных физиологических условиях. Наиболее выраженный эффект глюкагона опосредован его способностью вызывать гликогенолиз в печени, увеличивая таким образом концентрацию глюкозы в крови в течение нескольких минут [68]. В норме, поступление глюкозы в организм подавляет высвобождение глюкагона. Однако при патологии, глюкозависимый механизм подавлении продукции глюкагона не столь эффективен [69]. Увеличение секреции глюкагона регистрируется у пациентов с нарушением толерантности к глюкозе, задолго до установления диагноза СД 2 типа [68]. Предполагают, что агенты, подавляющие секрецию или действие глюкагона, могут быть эффективны при лечении диабета [68].
Гиперглюкагонемия рассматривается как признак СД 2 типа. Установлено, что лица, подверженные риску развития диабета, также демонстрируют относительную гиперглюкагонемию. Механизм взаимосвязи между гиперглюкагонемией и секрецией инсулина у больных сахарным диабетом 2 типа был выяснен относительно недавно с использованием экспериментальных моделей [67]. Глюкагон действует на относительно небольшое количество клеток-мишеней и регулирует процессы, способствующие гипогликемии. В печени глюкагон связывается с Gs-парным рецептором для стимуляции синтеза циклического АМФ (цАМФ), который, в свою очередь, ассоциирован с регуляторной субъединицей протеинкиназы А (РКА) холоэнзима, высвобождая, его тем самым и активируя каталитическую субъединицу РКА.
Последующие эффекты даун-регуляции сигнализации заключаются в мобилизации глюкозы из гликогена и повышение регуляции транскрипции и активации программ глюконеогенеза [67]. Трансгенная гепатоцит-специфическая гиперэкспрессия каталитической субъединицы РКА у мышей приводит к повышению регуляции транскрипционной программы глюконеогенеза и гипергликемии [67]. При этом секреция инсулина остается недостаточной для адекватного контроля гликемии.
Аналогичным образом, селективное удаление гена, кодирующего PKA регуляторную субъединицу 1а (Prkar1a) в гепатоцитах, также приводит к увеличению производства глюкозы печенью и секреции инсулина, но в количествах, недостаточных для контроля уровня глюкозы в крови [67]. В результате дизрегуляции секреции глюкагона, чрезмерная печеночная продукция глюкозы, связанная с неправильным питанием и постпрандиальной гиперглюкагонемией, является общей чертой СД 2 типа. Влияние некоторых, широко используемых в настоящее время антидиабетических агентов, таких как метформин, агонисты GLP-1 и ингибиторы DPP-4, включает в себя частичное подавление секреции глюкагона и/или его действия. В последнее время широко исследуются аспекты/механизмы полного подавления эффектов глюкагона.
Экспериментальные исследования показали ожидаемый терапевтический потенциал данного подхода. Блокада эффектов глюкагона у животных, больных диабетом, привела к снижению продукции глюкозы печенью и гипергликемии после приема пищи, а также способствовала улучшению толерантности к глюкозе (Рисунок 3) [69].
Исследование содержания адипокинов и гормонов гастродуоденальной зоны в плазме крови у пациентов с ожирением без / с сахарным диабетом 2 типа натощак и после завтрака
В группе больных ожирением с СД 2 типа содержание С–пептида 475 (351,53 – 1037) нг/мл, GIP 82,2 (61,4 – 175,26) нг/мл и инсулина 374 (162 – 915) нг/мл натощак было выше контрольных величин 283,1 (223 – 436) нг/мл, 37,2 (26,27 – 45,1) нг/мл, 44,8 (30,2 – 61,25) нг/мл, соответственно (p 0,05) (Таблица 4). При этом значения GIP 35,1 (26,6 – 43,2) нг/мл и инсулина 144,5 (71,1 – 228,8) нг/мл натощак в данной группе превосходили аналогичные показатели, полученные в группе пациентов с ожирением без СД 2 типа (Таблица 4). У пациентов с ожирением без СД 2 типа уровни С–пептида и инсулина натощак были выше контрольных и составили: 604 (474,1 –1151) и 144,5 (71,1 – 228,8) нг/мл, соответственно (p 0,05) (Таблица 4). Во всех исследуемых группах выявлены положительные корреляционные взаимосвязи уровня С-пептида, инсулина и GIP в плазме крови после тестового завтрака (p 0,05) (Рисунок 10).
В контроле и группе больных ожирением с и без СД 2 типа установлено постпрандиальное повышение уровня С–пептида, GIP и инсулина по сравнению с тощаковым содержанием. В группе больных ожирением с СД 2 типа после завтрака данные показатели значимо превосходили контрольные величины и соответствовали 578,1 (456 – 4345), 314,9 (242 – 712) и 944,19 (316 – 2189) нг/мл, соответственно (p 0,05). При этом значения GIP 77,5 (17,3 – 146) нг/мл и инсулина 226 (72,7 – 328) нг/мл после тестового завтрака в данной группе были выше аналогичных параметров в группе пациентов с ожирением без СД 2 типа (p 0,05) (Таблица 4).
В группе больных ожирением с СД 2 типа содержание GLP–1 натощак 40,8 (15 – 62) нг/мл и после завтрака 46,7 (20,8 – 69,5) нг/мл было в 3,5 раза выше контрольных значений натощак 12,7 (10 – 13,9) нг/мл и после завтрака 13,79 (10 – 17,86) нг/мл и почти в 8 раз превышало цифры, полученные в группе пациентов с ожирением без СД 2 типа натощак 5,14 (4,4– 6,5) нг/мл и после завтрака 5,1 (2,2 – 7,69) нг/мл (p 0,05). При этом уровень GLP–1 натощак и постпрандиально в группе пациентов с ожирением без СД 2 типа оказался ниже контроля в 2 раза (p 0,05) (Таблица 4). Во всех исследуемых группах уровень инсулина в плазме положительно коррелировал с содержанием GLP-1 (p 0,05) (Рисунок 10).
В группе больных ожирением с СД 2 типа содержание глюкагона натощак и постпрандиально было сопоставимо с контролем. В группе пациентов с ожирением без СД 2 типа уровень глюкагона в плазме натощак и после тестового завтрака составил 268,5 (242,1 – 292,79) и 275 (231 – 304) нг/мл, соответственно, что было ниже значений в контроле и в группе больных ожирением с СД 2 типа (p 0,05) (Таблица 4). Постпрандиальный уровень GLP-1 в плазме крови в контроле и группе больных ожирением без СД 2 типа положительно коррелировал с глюкагоном (r=0,71 и r=0,84, р 0,05, соответственно), тогда как у больных с СД 2 типа таких взаимосвязей выявлено не было (Рисунок 10).
В группе больных ожирением с СД 2 типа содержание лептина было повышено натощак 5638 (1993 – 8439) нг/мл и после завтрака 3823,9 (2504 – 6736) нг/мл относительно контроля (натощак 402 (173 – 572) нг/мл и после завтрака 331,5 (224 – 469) нг/мл, соответственно, p 0,05). В группе пациентов с ожирением без СД 2 типа уровень лептина натощак и постпрандиально (1745 (1458 – 1906) и 1468 (600 –1547) нг/мл, соответственно) был выше контроля и ниже аналогичных показателей в группе больных ожирением с СД 2 типа (p 0,05) (Таблица 4). У больных ожирением с и без СД 2 типа была выявлена позитивная корреляция между постпрандиальными уровнями глюкагона и лептина (p 0,05) (Рисунок 10).
В группе больных ожирением с СД 2 типа постпрандиальный уровень грелина 100 (77,7 – 135) нг/мл оказался в 2 раза выше контроля 55,5 (50,8 – 81,4) нг/мл. При этом в данной группе постпрандиальное содержание грелина после тестового завтрака не отличалось от тощакового, тогда как в контрольной снижалось после тестового завтрака до (p 0,05) (Таблица 4). В группе пациентов с ожирением без СД 2 типа уровень грелина натощак составил 43,5 (34 – 57,1) нг/мл, не изменяясь после завтрака и оказался ниже аналогичных значений в контроле и группе больных ожирением с СД 2 типа (p 0,05). В контрольной группе выявлена взаимосвязь между содержанием лептина и грелина в плазме крови натощак (r=0,65, р 0,05) (Рисунок 10).
В группе больных ожирением с СД 2 типа уровень резистина натощак и после завтрака составляли: 3465 (966 – 6592) и 3203 (1398 – 7063) нг/мл, соответственно, превышая аналогичные значения контроля и группы пациентов с ожирением без СД 2 типа. В группе пациентов с ожирением без СД 2 типа тощаковый уровень резистина не отличался от показателей в других группах, тогда как его постпрандиальное содержание оказалось выше аналогичных значений контроля и ниже показателей, полученных в группе больных ожирением с СД 2 типа (p 0,05). У больных ожирением с и без СД 2 типа обнаружена корреляция постпрандиальных уровней грелина с резистином (r=0,6, r=0,69, p 0,05).
В группе больных ожирением с СД 2 типа содержание ингибитора активатора плазминогена-1 (PAI-1) в плазме крови натощак и постпрандиально (5962 (1725 – 15123) и 5962 (1725 – 15123) нг/мл, соответственно) оказалось выше контрольных значений. Следует отметить достоверное снижение уровня PAI-1 в плазме крови только в контрольной группе после тестового завтрака по сравнению с его тощаковым уровнем. В группе пациентов с ожирением без СД 2 типа уровень PAI-1 в плазме крови натощак и постпрандиально составили - 2144 (1744 – 2532) и 1991 (1311 – 2405) нг/мл, соответственно, превышая аналогичные цифры контроля и был ниже показателей в группе больных ожирением с СД 2 типа (p 0,05). Постпрандиальный уровень резистина и PAI-1 отрицательно коррелировал у больных ожирением с СД 2 типа (r=-0,56, p 0,05) и положительно у больных без него (r=0,53, p 0,05).
В группе больных ожирением с СД 2 типа уровень висфатина не отличался от контроля. У пациентов с ожирением без СД 2 типа содержание изучаемого фактора в плазме крови натощак и после завтрака оказалось ниже контрольных величин и показателей в группе больных ожирением с СД 2 типа (p 0,05). Содержание PAI-1 отрицательно коррелировало с висфатином у больных с СД 2 типа после тестового завтрака (r=-0,5, p 0,05) и положительно натощак у пациентов без СД 2 типа (r=0,68, p 0,05).
Исследование взаимосвязи полиморфизма rs1800437 гена GIPR с уровнем относительной экспрессии гена GIPR
При исследовании полиморфизма rs1042044 было установлено, что распределение частот аллелей и генотипов соответствовало равновесию Харди– Вайнберга в группе здоровых доноров (2=4,16, p=0,04), больных ожирением с СД 2 типа (2=0,19, p=0,67), и группе пациентов с ожирением без СД 2 типа (2=0,1, p=0,75). Распределение частот аллелей и генотипов полиморфизма rs1042044 гена GLP-1R представлены в таблице 10.
Анализ распределения частот аллелей и генотипов выявил ассоциацию генотипа СС полиморфизма rs1042044 гена GLP-1R с повышенным риском развития СД 2 типа в группе больных ожирением с СД 2 типа (OR=2,17, 95%CI: 1,03 – 4,56, р=0,048). В данной группе генотип СА полиморфизма rs1042044 гена GLP-1R был взаимосвязан с пониженным риском развития СД 2 (OR=0,49, 95%CI: 0,25 – 0,96, р=0,048). Распределение частот аллелей и генотипов в контроле и группе пациентов с ожирением без СД 2 типа не отличалось.
В группе больных ожирением с СД 2 типа носители генотипа повышенного риска развития СД 2 типа – СС полиморфизма rs1042044 гена GLP-1R имели более низкий постпрандиальный уровень инсулина (Рисунок 15а) и грелина (Рисунок 15б) по сравнению с пациентами с генотипом СА (р 0,05).
У лиц с генотипом СС уровень лептина натощак в плазме крови превосходил значения у носителей генотипа АА (р 0,05) (Рисунок 15в). Напротив, у пациентов без СД 2 типа с генотипом СС уровень глюкозы был выше по сравнению с носителями генотипа СА (р 0,05) (Рисунок 15д).
У больных ожирением с СД 2 типа с генотипом пониженного риска развития СД 2 типа СА полиморфизма rs1042044 гена GLP-1R отмечен более низкий тощаковый уровень глюкагона по сравнению с носителями генотипа АА (р 0,05) (рисунок 15г).
В группе больных ожирением с СД 2 типа у лиц-носителей генотипов СС и СА полиморфизма rs1042044 экспрессия гена GLP-1R в жировой ткани брыжейки тонкого кишечника оказалась ниже контроля в 100 и 77 раз соответственно (р 0,05), тогда как у пациентов с генотипом АА экспрессия изучаемого гена значимо не отличалась от контроля (Таблица 6).
Исследование неравновесного сцепления полиморфизмов полиморфизмов rs1042044, rs6923761 и rs10305420 гена GLP-1R гена GIPR
Полиморфизмы rs1042044, Gly168Ser гена GLP-1R находились в неравновесном сцеплении (D =87, r2=21) в группе пациентов с ожирением без СД 2 типа (Рисунок 18).
Взаимосвязи гаплотипов с риском развития СД 2 типа, а также уровнем гормонов и адипокинов обнаружено в плазме крови не было (Таблица 21).
Структура неравновесного сцепления (LD), описывающее положение трех полиморфизмов rs1042044, Gly168Ser и rs10305420 гена GLP-1R. А – блок сцепления полиморфизмов rs1042044, Gly168Ser в группе больных ожирением с СД 2 типа (значения коэффициента неравновесия по сцеплению LD (D )), Б - блок сцепления полиморфизмов rs1042044, Gly168Ser в группе больных ожирением с СД 2 типа (значение коэффициента корреляции (r2), представленного в процентах) B - блок сцепления полиморфизмов rs1042044, Gly168Ser в группе больных ожирением без СД 2 типа (значения коэффициента неравновесия по сцеплению LD (D )), Г - блок сцепления полиморфизмов rs1042044, Gly168Ser в группе больных ожирением без СД 2 типа (значение коэффициента корреляции (r2), представленного в процентах).
Из шести исследуемых полиморфизмов генов GIPR и GLP-1R полиморфизмы rs2302382, rs1800437 гена GIPR и rs1042044, Gly168Ser и rs10305420 гена GLP-1R были ассоциированы с риском развития СД 2 типа.
Исследование полиморфных вариантов гена GIPR выявило ассоциацию генотипа АА полиморфизма rs2302382, аллеля С и генотипа GС полиморфизма rs1800437 гена с повышенным, а генотипа СА полиморфизма rs2302382, аллеля G и генотипа GG полиморфизма rs1800437 – с пониженным риском развития СД 2 типа. Полиморфизмы rs2302382 и rs8111428 гена GIPR находились в неравновесном сцеплении в группе пациентов с ожирением без СД 2 типа, что не оказывало влияния на показатели адипокинов и гормонов в плазме крови.
У больных ожирением с СД 2 типа экспрессия гена GIPR в жировой ткани брыжейки тонкого кишечника снижалась и зависела от наличия исследуемых полиморфизмов. В данной группе установлены положительные корреляционные взаимосвязи между уровнями GIP и грелина натощак в плазме крови; уровнями резистина с GIP и инсулином натощак и после тестового завтрака. В связи с вышесказанным, одним из механизмов влияния полиморфизмов в нетранслируемой области гена GIPR на рост уровня лептина в плазме крови у носителей генотипа СС и rs2302382 и АА rs8111428 гена GIPR может стать снижение уровня относительной экспрессии гена GIPR в жировой ткани брыжейки тонкого кишечника у больных СД 2 типа. При этом в данной группе повышенный уровень инсулина и GIP у лиц с генотипом СА полиморфизма rs2302382 и AG полиморфизма rs8111428 связан с нормальным уровнем экспрессии гена GIPR в жировой ткани брыжейки тонкого кишечника. Кроме того, носители генотипа СА полиморфизма rs2302382 гена GIPR имели более высокие показатели резистина (натощак и после тестового завтрака) и грелина (натощак) в плазме крови по сравнению с носителями других генотипов в группе больных ожирением с СД 2 типа, что также может быть взаимосвязано с изменением экспрессии гена GIPR.
Анализ распределения частот аллелей и генотипов в гене GLP-1R выявил ассоциацию генотипа СС полиморфизма rs1042044, аллеля А и генотипа АА полиморфизма Gly168Ser с повышенным, а генотипа СА, аллеля G и генотипа GG полиморфизма Gly168Ser, генотипа ТТ полиморфизма rs10305420 – с пониженным риском развития СД 2 типа в группе больных ожирением с СД 2 типа.
Полиморфизмы rs1042044, Gly168Ser гена GLP-1R находились в неравновесном сцеплении в группе пациентов с ожирением без СД 2 типа, что не оказывало влияния на показатели адипокинов и гормонов в плазме крови.
Наличие генотипа повышенного риска развития СД 2 типа СС полиморфизма rs1042044 гена GLP-1R ассоциировано с ростом уровня лептина, глюкозы, и снижением уровня инсулина и грелина в плазме крови. Наличие генотипа повышенного риска развития СД 2 типа АА полиморфизма Gly168Ser гена GLP-1R взаимосвязано с повышением уровня лептина, глюкагона в плазме крови у больных СД 2 типа.
У лиц-носителей генотипа СС и СА полиморфизма rs1042044 гена GLP-1R экспрессия гена GLP-1R в жировой ткани брыжейки тонкого кишечника снижалась. Уровень экспрессии гена GLP-1R оказался понижен вне зависимости от варианта генотипа полиморфизма Gly168Ser гена GLP-1R.
У носителей генотипа пониженного риска СА полиморфизма rs1042044 отмечено снижение уровня глюкагона в плазме крови в группе больных ожирением с СД 2 типа. А у лиц с генотипом GG полиморфизма Gly168Ser гена GLP-1R - постпрандиальное снижение уровня инсулина, глюкагона (натощак и постпрандиально) в плазме крови в группе больных ожирением с СД 2 типа (р 0,05). У пациентов с генотипом ТС зарегистрировано повышение уровня С-пептида, глюкозы и лептина.
Уровень GLP-1 в плазме крови положительно коррелировал с уровнем инсулина натощак и постпрандиально, который после тестового завтрака отрицательно взаимосвязан с секрецией глюкагона. При этом постпрандиальный уровень глюкагона положительно коррелировал с продукцией лептина и PAI-1, которые взаимосвязаны друг с другом. Кроме того, уровень инсулина в плазме крови имел взаимосвязь с уровнем грелина натощак и постпрандиально в данной группе.