Роль полиморфных вариантов гена эндотелиальной NO-синтазы в патогенезе метаболического синдрома Фаттахов Николай Сергеевич

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Обзор литературы 13

1.1. Диагностические критерии и эпидемиологические аспекты метаболического синдрома 13

1.2. Образование, механизм действия и биологические эффекты оксида азота 18

1.3. Характеристика гена NOS3 и его полиморфных вариантов 25

1.4. Структура эндотелиальной NO-синтазы 26

1.5. Механизмы развития инсулинорезистентностии и эндотелиальной дисфункции 28

1.6. Нарушения продукции и активности эндотелиальной NO-синтазы при метаболическом синдроме 36

ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 43

2.1. Объект исследования 43

2.2 Материал исследования 48

2.3. Методы исследования 48

2.3.1. Антропометрические методы исследования 48

2.3.2. Молекулярно-генетические методы исследования

2.3.2.1. Выделение геномной ДНК 48

2.3.2.2. Аллель-специфическая полимеразная цепная реакция 49

2.3.3. Биохимические методы исследования 51

2.3.3.1. Исследование показателей углеводного и липидного обменов 51

2.3.3.2. Определение содержания нитритов в сыворотке крови 54

2.3.3.3. Определение содержания эндотелиальной NO-синтазы в сыворотке крови 54

2.3.3.4. Определение уровней эндотелина-1 в сыворотке крови 55

2.3.3.5. Определение уровней растворимых форм молекул адгезии в сыворотке крови 56

2.3.3.6. Определение содержания фактора Виллебранда в плазме крови 56

2.3.3.7. Определение содержания фактора некроза опухоли-, интерлейкина-6, интерлейкина-8 и фактора роста эндотелия сосудов в сыворотке крови...57

2.3.3.8. Определение концентрации лептина в плазме крови 58

2.3.3.9. Определение концентрации С-реактивного белка в сыворотке крови 59

2.3.3.10. Определение концентрации инсулина в плазме крови 59

2.3.4. Методы статистического анализа данных 60

ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 62

3.1. Исследование ассоциации полиморфных вариантов гена NOS3 с риском развития метаболического синдрома 62

3.2. Исследование ассоциации полиморфных вариантов гена NOS3 с антропометрическими показателями при метаболическом синдроме 65

3.3 Исследование ассоциации полиморфных вариантов гена NOS3 с маркерами эндотелиальной дисфункции при метаболическом синдроме 71

3.4. Исследование ассоциации полиморфных вариантов гена NOS3 с провоспалительными молекулами при метаболическом синдроме 78

ГЛАВА 4. Обсуждение полученных результатов 83

Выводы 118

Список литературы

• Образование, механизм действия и биологические эффекты оксида азота
• Механизмы развития инсулинорезистентностии и эндотелиальной дисфункции
• Аллель-специфическая полимеразная цепная реакция
• Исследование ассоциации полиморфных вариантов гена NOS3 с маркерами эндотелиальной дисфункции при метаболическом синдроме

Введение к работе

Актуальность темы исследования. Метаболический синдром (МС) является одной из наиболее актуальных проблем современной медицины и представляет собой кластер факторов повышенного риска развития сердечно-сосудистых заболеваний и сахарного диабета (СД) 2 типа [Kaur J., 2014]. Во всём мире распространенность МС довольно высока и колеблется от 10% до 84% в зависимости от региона, среды проживания (городской или сельской), состава популяции (пола, возраста, расы и этнического происхождения) и используемых критериев МС [Moore J.X. et al., 2017; Ranasinghe P. et al., 2017]. Согласно данным многочисленных исследований, в том числе близнецовых, МС и его отдельные компоненты в определенной степени зависят от генетических факторов [Song Y.M. et al., 2015; Brown A.E., Walker M., 2016]. Особый интерес в этом отношении представляет изучение вклада аллельных вариантов в гене эндотелиальной NO-синтазы (NOS3) в патогенез МС. В исследованиях на моделях животных было показано, что инактивация гена NOS3 приводит к развитию инсулинорезистентности (ИР), артериальной гипертензии (АГ) и гипертриглицеридемии, т.е. фенотипам МС [Vecoli C. et al., 2014; Wong S.K. et al., 2016]. В связи с вышесказанным, лучшее понимание этиологических факторов и поиск молекулярно-генетических предикторов МС открывает возможности поиска новых точек воздействия в профилактике данного симптомокомплекса и лечении его компонентов.

Степень разработанности темы. Оксид азота (NO) является относительно стабильным газом, легко диффундируемым через клеточную мембрану и играющим важную роль в регуляции сердечно-сосудистой системы, передаче нервного сигнала и различных гомеостатических процессах. NO, продуцируемый под действием eNOS в эндотелиальных клетках, обеспечивает вазодилатацию, препятствует агрегации тромбоцитов, а также модулирует пролиферацию гладкомышечных клеток сосудов [Sansbury B.E., Hill B.G., 2014]. Нарушение метаболизма NO и функционирования eNOS при МС может способствовать эндотелиальной дисфункции (ЭД), формирование которой, вероятно, происходит на ранней стадии развития ИР и играет ключевую роль в патогенезе атеросклероза [Li H., Forstermann U., 2013; Li M. et al., 2017; Sipahioglu N.T. et al., 2017]. Учитывая тот факт, что все компоненты МС оказывают неблагоприятное воздействие на эндотелий, дизрегуляция функционирования эндотелия выявляется у таких больных не всегда и в определенной степени обусловлена генетическими факторами [El Assar M. et al., 2013; Kaur J., 2014]. В последнее время научным сообществом ведется активный поиск генотипов и аллелей в различных генах, ассоциированных с компонентами МС. Известно более 100 полиморфных вариантов гена NOS3, локализованных в хромосоме 7q35-36. Единственным, наиболее распространенным однонуклеотидным полиморфизмом в кодирующей области гена NOS3 является G894T (Glu298Asp, или rs1799983). Данные, касающиеся ассоциаций полиморфизма G894T гена NOS3 с активностью eNOS носят весьма неоднозначный характер [Fairchild T.A.et al., 2011]. Полиморфный вариант T-786C (rs2070744) в промоторной области гена NOS3 является наиболее важным в отношении регуляции скорости транскрипции данного гена [Elakkad A.M. et al., 2017]. Сравнительно недавно также стали появляться работы по изучению роли синонимичного полиморфного варианта C774T (rs1549758) в 6-м экзоне гена NOS3 в развитии кардиоваскулярных патологий, однако данные также неоднозначны [Levinsson A. et al., 2014]. Результаты исследований продемонстрировали, что синонимичные мутации также могут быть причастны к развитию заболеваний, изменяя структуру, функции и экспрессию белков [Fernndez-Calero T. et al., 2016]. Ранее для полиморфизмов T-786C и G894T в гене NOS3 было показано наличие ассоциаций с риском формирования МС и его компонентов в

некоторых популяциях [Alkharfy K.M. et al., 2012; ladowska-Kozowska J. et al., 2015; Nasr H.B. et al., 2016; Shahid S.U. et al., 2017], однако полученные данные могли варьироваться в пределах одной популяции. Разночтения в результатах разных популяционных исследований типа «случай-контроль», по-видимому, связаны с клиническими характеристиками пациентов, размерами и этническими особенностями выборок, а также наличием анализа гаплотипных блоков. Оба полиморфных варианта гена NOS3 не были изучены в отношении развития МС в восточнославянской популяции, а полиморфизм C774T гена NOS3 не был ни в одном ассоциативном исследовании, связанном с данным симптомокомплексом. Механизмы реализации эффектов всех вышеуказанных полиморфизмов, включая их сочетанное влияние на развитие МС, до сих пор остаются неясными. В связи с вышесказанным, целью исследования явилось изучение патогенетического значения полиморфных вариантов гена NOS3 (T-786C, G894T и C774T) в развитии метаболического синдрома.

Задачи исследования:

1. Изучить распределение аллелей, генотипов и гаплотипов полиморфных вариантов гена NOS3 (T-786C, G894T и C774T) в выборках пациентов с метаболическим синдромом и условно здоровых доноров, относящихся к восточнославянской популяции Северо-Западного региона России.

2. Провести анализ ассоциаций полиморфных вариантов гена NOS3 (T-786C, G894T и C774T) с риском развития метаболического синдрома в восточнославянской популяции Северо-Западного региона России.

3. Оценить содержание маркеров эндотелиальной дисфункции (нитритов, eNOS, ЭТ-1, iCAM-1, vCAM-1, VEGF, vWF) и медиаторов воспаления (IL-6, TNF-, IL-8, СРБ, лептина) в сыворотке/плазме крови у больных метаболическим синдромом, ранжированных по степени ожирения.

4. Установить взаимосвязь полиморфных вариантов гена NOS3 (T-786C, G894T и C774T) с антропометрическими показателями, маркерами эндотелиальной дисфункции, липидного и углеводного обменов и медиаторами воспаления у пациентов с метаболическим синдромом.

Научная новизна. В настоящей работе представлены результаты впервые осуществленного в восточнославянской популяции комплексного анализа ассоциаций полиморфных вариантов гена NOS3 (T-786C, G894T и C774T) с риском развития МС. Оценка неравновесия по сцеплению изученных полиморфных вариантов гена NOS3 позволила впервые выявить гаплотип 894T/774T, ассоциированный с риском развития МС в восточнославянской популяции СевероЗападного региона России. Продемонстрирована высокая информативность гаплотипического подхода в анализе ассоциаций методом «случай – контроль». Впервые показано парадоксальное повышение продукции eNOS при МС на системном уровне, имеющее компенсаторный характер, вследствие ингибирующего воздействия провоспалительных и окислительных факторов.

Впервые описаны механизмы реализации эффектов для полиморфных вариантов G894T и C774T гена NOS3 в развитии МС, связанные как с модулированием синтеза самой eNOS, так и взаимосвязанным повышением продукции отдельных медиаторов воспаления (IL-8) и маркеров ЭД (vCAM-1).

Убедительно продемонстрировано, что ЭД начинает формироваться у пациентов с МС на стадии морбидного ожирения. Показано, что ЭД у пациентов с МС (независимо от степени ожирения) не ассоциирована с изменениями синтеза NO, главного вазодилатирующего медиатора эндотелия, а связана с преобладанием вазоконстрикторного звена (повышение продукции ЭТ-1).

Положения, выносимые на защиту:

5. Минорные аллели полиморфных вариантов G894T и C774T в кодирующей области гена NOS3 как в составе генотипов, так и в виде образуемого ими гаплотипа, ассоциированы с риском развития метаболического синдрома. При метаболическом синдроме не происходит изменений в сывороточных уровнях эндогенных нитритов на фоне повышенной продукции эндотелиальной NO-синтазы, которая зависит от носительства генотипов несинонимичного полиморфизма G894T гена NOS3.

6. Эндотелиальная дисфункция у пациентов с метаболическим синдромом характеризуется увеличением сывороточных уровней вазоконстриктора эндотелина-1, которые зависят от генотипов полиморфизмов G894T и C774T гена NOS3. Наиболее выраженный характер эндотелиальная дисфункция у пациентов с метаболическим синдромом приобретает при третьей степени ожирения и наличии инсулинорезистентности, что проявляется повышенной системной продукцией молекулы адгезии сосудистого эндотелия 1-го типа и фактора Виллебранда.

7. У пациентов с метаболическим синдромом отмечается повышенное содержание в сыворотке крови медиаторов воспаления: C-реактивного белка, лептина и интерлейкина-8. Полиморфный вариант G894T гена NOS3 вносит вклад в рост сывороточного содержания интерлейкина-8 при метаболическом синдроме.

Теоретическая и практическая значимость. Найденные в диссертационной работе ассоциации полиморфизмов и гаплотипов гена эндотелиальной NO-синтазы с риском развития МС и показанные для них механизмы реализации эффектов расширяют понимание процессов патогенеза МС и существующие в научной литературе представления о его генетических детерминантах. Выявленные в работе особенности параметров ЭД при МС и их взаимосвязь с полиморфными вариантами гена NOS3 могут представлять интерес для практического здравоохранения и быть использованы для разработки новых патогенетических подходов к профилактике, диагностике, терапии и мониторингу лечения при МС.

Результаты диссертационного исследования используются в учебном процессе на кафедре фундаментальной медицины медицинского института и Институте живых систем БФУ им. И. Канта г. Калининграда.

Методология и методы исследования

Экспериментальный блок исследования выполнен с использованием современных молекулярно-биологических, генетических и биохимических методов исследования.

Основные методы исследования:

8. Молекулярно-генетические методы исследования (выделение геномной ДНК; аллель-специфическая полимеразная цепная реакция в режиме реального времени).

9. Определение антропометрических показателей (индекс массы тела, объем талии, объем бедер, соотношение «ОТ/ОБ»).

10. Оценка показателей липидного и углеводного обменов (глюкоза, ТГ, ХС-ЛПВП, общий холестерин, холестерин липопротеинов низкой плотности), уровней инсулина.

11. Определение содержания показателей эндотелиальной дисфункции в сыворотке/плазме плазме крови (нитритов, eNOS, ЭТ-1, iCAM-1, vCAM-1, VEGF, vWF).

12. Оценка содержания медиаторов воспаления в сыворотке/плазме крови (IL-6, TNF-, IL-8, СРБ, лептина).

6. Статистический анализ результатов.
Степень достоверности и апробация результатов. Высокая степень

достоверности полученных данных обеспечивается достаточным объемом выборок

(общее количество пациентов с МС и условно здоровых доноров, включенных в исследование – 228), использованием современных современными молекулярно-генетических, биохимических и статистических методов исследования.

Основные результаты исследования по теме выполненной диссертационной работы были доложены и обсуждены на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Трансляционные исследования в инновационном развитии здравоохранения» (Санкт Петербург, 2014); Международной конференции молодых ученых биотехнологов, вирусологов и молекулярных биологов в рамках площадки открытых коммуникаций OpenBio (наукоград Кольцово, 2014); X научной конференции «Генетика человека и патология: проблемы эволюционной медицины» (Томск, 2014); Всероссийской конференции с международным участием «Командный подход в современной эндокринологии» (Санкт Петербург, 2016), 12-ом Гёттингенском заседании немецкого нейронаучного общества (Гёттинген, Германия, 2017). Выполненная научно-исследовательская работа получила высокую оценку экспертной комиссии по присуждению премии Калининградской области «Эврика», вручаемой за достижения в области науки, технологий и инновационной деятельности (Калининград, 2014). В работе приводятся фрагменты научно-исследовательской работы «Исследование молекулярных и клеточных механизмов формирования хронического воспаления при метаболических нарушениях» (Соглашение № 14.A18.21.0206), выполненной в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе

5. статей в ведущих рецензируемых журналах и изданиях, рекомендуемых ВАК РФ, и

6. тезисов в материалах российских и зарубежных конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 145 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырёх глав, выводов и списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 22 рисунками и 25 таблицами. Библиографический указатель включает 283 источника (3 - отечественных и 280 -иностранных). Личное участие автора. Автор принимал непосредственное участие в разработке дизайна и планировании исследования. Результаты получены, проанализированы и обобщены в выводах и положениях автором лично.

Образование, механизм действия и биологические эффекты оксида азота

Первые диагностические критерии МС были утверждены Всемирной организацией здравоохранения (WHO) в 1998 году, в которых ИР признавалась главным критерием. Помимо ИР, критерии WHO включали в себя нарушенную НТГ или нарушенную гипергликемию натощак (НГН), СД 2 типа и два или более из четырех критериев: отношение «окружность талии/окружность бедер (ОТ/ОБ)» 0,9 у мужчин и 0,85 у женщин и/или индекс массы тела (ИМТ) 30 кг/м2, артериальное давление (АД) 140/90 мм рт. ст., уровень триглицеридов (ТГ) 1,7 ммоль/л или сниженный холестерин липопротеинов высокой плотности (ХС ЛПВП) (менее 0,9 ммоль/л у мужчин и менее 1,0 ммоль/л у женщин), микроальбуминурия (более 20 мкг/мин или отношение уровня альбумина к креатинину 3,3 мг/ммоль).

В 1999 году были сформирулированы критерии Европейской группы по изучению ИР (EGIR), которые, в первую очередь, были ориентированы на ИР, диагностируемую на основании гиперинсулинемии. Принципиальным моментом такого подхода стало исключение из списка предлагаемых критериев для диагностики МС наличие СД 2 типа. Позднее, в 2001 году Группой экспертов Национальной образовательной программы США по холестерину, создающей рекомендации по лечению взрослых, были представлены критерии NCEP–ATPIII: ОТ 102 см у мужчин и 88 см у женщин, уровень ТГ 1,7 ммоль/л, АД 130/85 мм рт.ст., уровень глюкозы (ГЛ) натощак 6,1 ммоль/л, ХС ЛПВП 1,0 ммоль/л у мужчин и 1,3 ммоль/л у женщин. Для выявления МС необходимо наличие трёх из пяти перечисленных факторов [Cleeman J.I., 2001]. Данные критерии были сформулированы, прежде всего, с целью выявления пациентов высокого кардиоваскулярного риска, нуждающихся в изменении физической активности образа жизни.

В настоящее время критерии МС определяются рекомендациями Международной федерации диабета (IDF), предложенными в 2005 году [Alberti K.G. et al., 2005]. Согласно данному определению МС, его обязательным критерием является абдоминальное ожирение (АО) (ОТ у мужчин 94 см, у женщин 80 см (для лиц европеоидной расы)), которое должно сочетаться, по крайней мере, с двумя признаками: концентрация ТГ 150 мг/дл (1,7 ммоль/л) или специфическое лечение по поводу данного нарушения липидного обмена, концентрация ХС-ЛПВП в сыворотке крови 40 мг/дл (1,03 ммоль/л) для мужчин и 50 мг/дл (1,29 ммоль/л) для женщин или специфическое лечение по поводу данного нарушения липидного обмена, АД 130/85 мм рт. ст. или лечение ранее диагностированной АГ, уровень ГЛ натощак 100 мг/дл (5,6 ммоль/л) или ранее диагностированный СД 2 типа.

Хотя каждое определение МС обладает общими признаками, существует несколько параметров, которые отличаются друг от друга, что приводит к трудностям с точки зрения применимости, единообразия и положительного прогностического значения перечисленных определений. Определения WHO и EGIR, в основном, сосредоточены на ИР, определяемой с помощью теста на толерантность к глюкозе и гиперинсулинемического эугликемического клэмпа. Однако этот трудоемкий метод в основном используется в научно-исследовательской сфере. Определение NCEP–ATPIII, напротив, включает лабораторные измерения, которые легкодоступны для врачей и облегчают клиническое и эпидемиологическое применение разработанных критериев, послуживших основой для последующих классификаций. Тем не менее, одной из основных проблем критериев WHO и NCEP–ATPIII является сложность в их применимости к различным этническим группам, поскольку разные популяции, этнические группы и национальности имеют различные распределения нормальных значений веса и ОТ. В частности, для азиатских популяций характерно наличие ИР при меньших показателях ИМТ и ОТ и относительно повышенной генетической предрасположенности к СД. IDF, признав трудности в применении единых критериев МС, которые подходили бы ко всем этническим группам, предложила новый набор пороговых значений ОТ с учетом этнических/расовых специфических различий.

Во всём мире распространенность МС варьируется от 10% до 84% в зависимости от региона, городской или сельской среды, состава популяции (пола, возраста, расы и этнического происхождения) и применяемых критериев МС [Moore J.X. et al., 2017; Ranasinghe P. et al., 2017]. В целом, по оценкам IDF, четверть взрослого населения мира имеет МС [Alberti K.G. et al., 2005]. Распространенность МС, согласно критериям NCEP-ATPIII, составляет во всем мире от 8% до 43% у мужчин и от 7% до 56% у женщин во всем мире [Cameron A.J. et al., 2004]. Наблюдаемая распространенность МC с использованием критериев NCEP-ATPIII в III национальном обследовании состояния здоровья и питания, проводимого в США с 1988 по 1994, составила 5% среди лиц с нормальным весом, 22% среди лиц с избыточным весом и 60% среди людей, страдающих ожирением [Park Y.W. et al., 2003]. В рамках этой же программы было проведено исследование по сравнению распространенности МС с использованием двух групп критериев: NCEP-ATPIII и WHO. Среди 8608 участников в возрасте 20 лет и более, распространенность МС при использовании критериев NCEP-ATPIII составила 23,9%, и 25,1%, согласно определению WHO. После появления критериев IDF, распространенность МС была оценена в США в течение 1999-2002 годов для выборки, включающей 3601 человека в возрасте 20 лет и более, с помощью критериев NCEP–ATPIII и IDF [Ford E.S., 2005]. На основании критериев NCEP– ATPIII распространенность МС составила 34,5±0,9% в общей группе, 33,7±1,6% среди мужчин и 35,4±1,2% среди женщин. На основании критериев IDF, суммарная распространенность синдрома составила 39±1,1% при 39,9±1,7% среди мужчин и 38,1±1,2% среди женщин. Авторами исследования был сделан вывод о том, что критерии IDF завышали распространенность МС по сравнению с критериями NCEP–ATPIII в США. Более того, применение критериев IDF в Германии также увеличивало распространенность МС по сравнению с критериями NCEP–ATPIII, однако критерии IDF обладали меньшей информативностью в отношении развития ССЗ [Assmann G. et al., 2007].

В популяции потомков участников Фрамингемского исследования в 2007 году было проведено исследование, целью которого было определить, имеет ли МС прогностическую ценность без сопутствующей ИР [Meigs J.B. et al., 2007]. Среди 2803 лиц, принимавших участие в исследовании и наблюдавшихся 11 лет, было зарегистрировано 135 случаев СД 2 типа и 240 СС3. ИР была выявлена у 56 % пациентов с МС, определяемым по критериям NCEP-ATPIII, 52 % больных с применением IDF критериев и у 100% согласно критериям EGIR. Было установлено, что МС, определяемый любыми из перечисленных критериев, без ИР повышал риск СД 2 типа примерно в 3 раза. Риск ССЗ был повышен в 1,6 раз у больных с МС без ИР при использовании критериев IDF, чего не наблюдалось при применении критериев NCEP-ATPIII. Таким образом, было показано, что МС является фактором риска ССЗ и СД 2 типа независимо от наличия ИР, за исключением критериев NCEP-ATPIII. Сочетание МС и ИР существенно повышает степень риска развития данных осложнений.

Более высокий социально-экономический статус, сидячий образ жизни и повышенные значения ИМТ в большой степени ассоциированы с МС. Более того, Cameron et al. пришли к заключению, что различия в генетическом фоне, рационе питания, уровнях физической активности, курении, семейной истории СД 2 типа и образовании влияют на распространенность МС и его компонентов [Cameron A.J. et al., 2004]. Распространенность АО и избыточной массы тела настолько велика, что приобрела характер неинфекционной эпидемии. По данным ВОЗ, примерно 1,6 миллиарда человек на планете имеют избыточную массу тела и более 400 миллионов страдают ожирением. «Эпидемия ожирения», главным образом, обусловлена значительным увеличением потребления высококалорийной пищи и заметным снижением физической активности.

Распространенность ожирения в США, по данным одного из наиболее крупных по оценке эпидемиологии ожирения исследований, проведенного в 2000 году, составила 19,8%, СД – 7,3%, а их сочетания – 2,9%. В Европе среди мужчин распространенность ожирения составила в среднем 10-25%, среди женщин – 10-30% [Tsigos C. et al., 2008]. В странах Азии различия в распространенности ожирения и МС выражены больше, чем среди европейских стран. Результаты выборочных исследований, проведенных в России, позволяют предположить, что не менее 33-35% трудоспособного населения имеет избыточную массу тела и 25-27% – ожирение [Ройтберг Г.Е., 2007]. Рост числа больных с ожирением и избыточной массой тела усиливает вероятность перехода НГН и НТГ в рамках МС в СД 2 типа, ускоряющий возникновение и более агрессивное течение ассоциированных с ним осложнений.

Механизмы развития инсулинорезистентностии и эндотелиальной дисфункции

Определение концентрации лептина в плазме крови Количественное определение лептина в плазме оценивали методом проточной флуориметрии на двухлучевом лазерном автоматизированном анализаторе Bio-Plex Protein Assay System (Bio-Rad, USA) с использованием коммерческой тест-системы Bio-Plex Pro Human Diabetes 10-Plex Assay (Bio-Rad, США).

Принцип метода. Суть метода заключается в связывании исследуемых молекул со специфическими антителами, адсорбированными на поверхности микросфер (магнитных гранул), что позволяет определять до 100 аналитов в одной лунке.

Ход определения. В работе использовались 96-луночные планшеты формата Bio-Plex, в которые добавляли по 50 мкл микросфер, затем дважды промывали буферным раствором с помощью промывочной станции Bio-Plex Pro Wash Station (Bio-Rad, США). Далее, согласно протоколу, вносили по 50 мкл растворов стандартных и исследуемых образцов в соответствующие лунки планшета и инкубировали 30 мин в темноте при комнатной температуре и непрерывном встряхивании. После 3- кратной отмывки добавляли 25 мкл специфических антител. По окончании второй инкубации проводилась 3-кратная отмывка, после чего вносили 100 мкл стрептавидина–РЕ, который связывался с биотинилированными антителами. Инкубировали в темноте, при комнатной температуре 10 мин при 300 об/мин. После 3-х кратной отмывки, вносили в каждую лунку по 125 мкл буфера, затем после 30 сек встряхивания помещали планшет на микропланшетную платформу Bio-Plex.

Считывание результатов производилось с помощью автоматического микропланшетного фотометра Bio-Plex-200 System (Bio-Rad, США) и программного обеспечения Bio-Plex Manager (Bio-Rad, США). Концентрации лептина определяли по стандартной кривой (определяемый динамический диапазон 2-32 000 пг/мл) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя.

Референсные значения лептина в плазме крови: 3,7-11,1 нг/мл для женщин; 2-5,6 нг/мл для мужчин.

Определение концентрации С-реактивного белка в сыворотке крови Концентрацию C-РБ в сыворотке крови определяли на автоматическом биохимическом анализаторе СА-180 (Furuno Electric Co., Ltd, Япония) с помощью набора реагентов «СRP U-hs FS» (DiaSys Diagnostic Systems GmbH, Германия).

Принцип метода. Определение концентрации C-РБ по конечной точке путем фотометрического измерения реакции антиген-антитело между антителами к человеческому CРБ, иммобилизованными на полистироловых частицах, и присутствующем в образце CРБ. Референсные значения С-РБ в сыворотке крови: до 5 мг/л. Определение концентрации инсулина в плазме крови Концентрацию инсулина в сыворотке крови определяли твердофазным иммуноферментным "сэндвичевым" методом с помощью наборов «Insulin ELISA» (DRG Diagnostics GmbH, Германия) согласно протоколу производителя.

Принцип метода. В лунки микропланшета с адсорбированными на них моноклональными антителами против инсулина, вносили растворы стандартов, контролей и исследуемых образцов. Затем добавляли в ячейки ферментный конъюгат с последующей инкубацией (120 мин) при комнатной температуре. Во время второй инкубации комплекс пероксидазы хрена со стрептавидином связывался с комплексом биотин-анти-инсулин антителом. После добавления раствора субстрата, интенсивность окраски была прямо пропорциональна концентрации инсулина в образцах. Измерение оптической плотности проводили спектрофотометрически при длине волны 450 нм. Концентрацию инсулина в сыворотке крови рассчитывали по калибровочной кривой. Референсные значения инсулина в плазме крови: 2,6 - 24,9 мкЕд/мл.

Для выявления НТГ определяли индекс HOMA-IR (Homeostatic Model Assessment of Insulin Resistance), который рассчитывали по формуле: НОМА-IR = (Инс х Гл) /22,5, где Инс – инсулин плазмы натощак (мкЕд/мл), Гл – глюкоза плазмы натощак (ммоль/л). Пересчет концентрации инсулина с пг/мл на мкЕд/мл осуществляли, используя онлайн-калькулятор SI Unit Conversion Calculator(http://www.socbdr.org/rds/authors/unit_tables_conversions_and_genetic_diction aries/conversion_in_si_units/index_en.html).

Методы статистического анализа данных Статистическую обработку полученных результатов проводили в программе Statistica 10.0 (StatSoft, Tulsa, США). Для проверки нормальности распределения количественных показателей использовали критерий КолмогороваСмирнова. С помощью непараметрического критерия МаннаУитни оценивали различия между независимыми выборками при несоответствии изучаемых признаков нормальному распределению. Для оценки достоверности различий между группами в случае при соответствии нормальному закону распределения признака использовали t-критерий Стьюдента. Соответственно, результаты представлены в виде средних величин и стандартной ошибки средней величины (M±m) для нормально распределенных признаков, а также в виде медианы (Mе) и значений 25% и 75% квартилей (Me (Q1;Q3)) для ненормально распределенных количественных данных. Парную взаимосвязь между двумя и более признаками определяли методом корреляционного анализа Спирмена.

Проверку соответствия распределения частот генотипов равновесию ХардиВайнберга, а также сравнение частот аллелей и генотипов в выборках проводили с применением критерия 2. На основании данных о частотах генотипов в группах больных и здоровых доноров, рассчитывали отношение шансов (OR). Значения OR 1 указывало на положительную ассоциацию ("предрасположенность"). Доверительный интервал (CI) представляет собой интервал значений, в пределах которого с вероятностью 95% находится ожидаемое значение OR. Для оценки влияния генотипов на антропометрические и биохимические показатели применяли непараметрический дисперсионный анализ по КрускалуУоллису. Анализ неравновесного сцепления проводился с использованием программного обеспечения Haploview 4.2 (Broad Institute, Cambridge, США) с определением коэффициентов сцепления D (коэффициент Левонтина) и r2 (коэффициент корреляции Пирсона). Блочную структуру устанавливали с помощью алгоритма «Solid spine of LD» с заданным порогом D 0,7. Частоты гаплотипов сравнивались между выборками с использованием критерия 2 и точного критерия Фишера (при частоте гаплотипа менее 5%). OR и 95% CI были рассчитаны для гаплотипов с использованием статистического онлайн калькулятора VassarStats (http://vassarstats.net/). Все различия считали достоверными при уровне значимости р 0.05.

Аллель-специфическая полимеразная цепная реакция

Показано, что у больных МС в ответ на блокирование селективных антагонистов к рецепторам ЭТ-1 типа A кровоток предплечья увеличивается, т.е. данный тип рецепторов опосредуют вазоконстрикторные эффекты при МС [Rocha N.G. et al., 2014]. Показано, что ЭТ-1, воздействуя на этот же тип рецепторов, может ингибировать активность iNOS и продукцию NO, вызываемую провоспалительным IL-1. Активация эндотелиновыми рецепторами типа A с помощью ЭТ-1 может приводить к повышенному образованию супероксид-аниона и пероксинитрита в эндотелиальных клетках в смоделированных условиях АГ и снижению активности eNOS, что указывает на вероятное разобщение данной изоформы [Wedgwood S. et al., 2001]. Loomis et al. в своих экспериментах на животных подтвердили, что опосредованная ЭТ-1 повышенная вазоконстрикция, обеспечивается частично за счет супероксидных радикалов, образуемых как NADPH-оксидазой, так и разобщенной eNOS [Loomis E.D. et al., 2005]. Более того, в смоделированных с помощью различных медиаторов (эндотоксин, липополисахарид) условиях хронического стресса предварительная обработка эндотелиальных клеток ЭТ-1 действительно вызывала разобщение eNOS и ее переключение на синтез супероксида вместо NO, при этом продукция самой eNOS не изменялась [Gopalakrishna D. et al., 2016].

Согласно данным различных исследований, сывороточные уровни ЭТ-1 могут повышаться не только у пациентов с МС по сравнению с условно здоровыми лицами, но и у больных только с одним из компонентов МС, в частности, АГ, гипергликемиией или АО [Yu A.P. et al., 2015]. В нашем исследовании не было выявлено сильных и средних корреляций с другими изучаемыми параметрами при МС. Согласно другим работам, уровни ЭТ-1 коррелировали с объемом талии, систолическим АД, уровнями глюкозы и холестерина ЛПВПу пациентов с МС [Yu A.P. et al., 2015], а также с весом, соотношением «ОТ/ОБ», уровнями ТГ, инсулина и значениями гликозилированного гемоглобина при СД 2 типа. Ранее также было продемонстрировано, что сывороточные уровни ЭТ-1увеличены у пациентов с СД 2 типа, АГ, а также у животных в экспериментальных моделях ожирения и АГ [da Silva A.A. et al., 2004]. Harmelen et al. показали, что количество ЭТ-1, образующееся в жировой ткани in vivo у пациентов с ожирением примерно в 2,5 раза выше по сравнению с аналогичными значениями лиц с нормальным весом [van Harmelen V. et al., 2008]. Более того, ЭТ-1 снижал экспрессию инсулиновых рецепторов и IRS-1 и, наоборот, повышал экспрессию эндотелиновых рецепторов типа B в висцеральной жировой ткани, ослабляя антилиполитическое действие инсулина на адипоциты. ЭТ-1 может также ослаблять вазодилатирующие эффекты инсулина через PI3K/Akt сигнальный путь в ГМК сосудов, действуя на IRS-2 и активируя протеинкиназу C, ослабляющую активность eNOS [Tesauro M. et al., 2009]. Участие ЭТ-1 в развитии ИР было также подтверждено в экспериментах с нокаутными мышами, свидетельствующих о вовлечении гипоадипонектинемии в данный процесс [Iwasa N. et al., 2010].

Нами установлено, что у носителей генотипа TT полиморфного варианта G894T гена NOS3 при МС повышен уровень ЭТ-1 в сыворотке крови (примерно в 5 раз) по сравнению с носителями гетерозиготного генотипа. Учитывая тот факт, что аналогичная взаимосвязь была обнаружена у больных МС с генотипом TT полиморфизма C774T (с уровнем ЭТ-1), а также нахождение полиморфизмов G894T и C774T в сильном неравновесном сцеплении, мы предполагаем, что ассоциированный с риском развития МС гаплотип 894T/774T вносит вклад в вариабельность сывороточных концентраций ЭТ-1 при МС. В другом исследовании была показана ассоциация полиморфизма C774T гена NOS3 с повышенной поглотительной способностью нейтрофилов периферической крови у детей с СД 1 типа [Кондратьева Е.И. и соавт., 2007], что отражало вклад этого полиморфизма в формирование хронического воспаления.

Одним из молекулярных механизмов, лежащих в основе повышения ЭТ-1, служит повышенная стимуляция инсулином сигнального пути киназ ERK1/2 и MAP киназы [Eringa E.C. et al. 2004]. Помимо этого, гиперпродукция ЭТ-1 может индуцироваться повышенными концентрациями глюкозы за счет блокирования альтернативного сигнального пути киназы ERK5 [Wu Y. et al., 2010].Также существуют данные о том, что повышенная экспрессия ЭТ-1 в условиях гипергликемии опосредуется активацией транскрипционных факторов из семейства CCAAT/энхансер-связывающихся белков [Manea S.A. et al., 2013].Эксперименты с эндотелиальными клетками, проведенные in vitro, свидетельствуют о роли окислительного стресса в повышении промоторной активности гена препроэндотелина-1, мРНК гена эндотелина-1 и экспрессии большого ЭТ-1.

Было показано, что ЭТ-1 способен повышать экспрессию vCAM-1 при воспалении с помощью различных механизмов, включающих вовлечение рецепторных тирозинкиназ в ГМК и ETS-домен-содержащего белка (активатор транскрипции) [Lin C.C. et al., 2015], p38MAPK-зависимую активацию нейтральных сфингомиелиназ [Ohanian J. et al., 2012] или продукцию супероксидного аниона-радикала посредством сигнального пути с эндотелиновыми рецепторами типа A и NADPH-оксидазой [Li L. et al., 2003]. Кроме того, ЭТ-1 повышает экспрессию мРНК генов, задействованных в ремоделировании сосудистой стенки, ангиогенезе и воспалении, посредством активации в них цАМФ-отвечающих элементов, или специфических последовательностей ДНК, на которые действует транскрипционный фактор CREB [Deacon K., Knox A.J., 2010].

Адгезивные рецепторы суперсемейства иммуноглобулинов, к которым относятся iCAM-1 и vCAM-1, принимают участие в межклеточной адгезиии и играют важную роль в эмбриогенезе, регенерации и иммунном ответе. Повышение экспрессии данных молекул и, соответственно, их растворимых циркулирующих форм имеет большое значение в патогенезе ЭД при воспалении, атеросклерозе и других патологических процессах. vCAM-1 представлен на различных типах клеток (эндотелиоцитах, эпителиоцитах, фибробластах, некоторых гемопоэтических клетках) и опосредует адгезию лимфоцитов, моноцитов, эозинофилов и базофилов к сосудистому эндотелию, лигандом для vCAM-1 служит интегрин очень поздний антиген-4 (VLA-4), iCAM-1 может экспрессироваться эндотелиальными клетками, макрофагами и лимфоцитами и связываться с лейкоцитарными интегринами LFA-1 и Мас-1.

Исследование ассоциации полиморфных вариантов гена NOS3 с маркерами эндотелиальной дисфункции при метаболическом синдроме

Полученные в нашем исследовании результаты о повышенных сывороточных уровнях IL-8 при МС согласуются с данными других исследований, регистрируемое при ожирении [Bruun J.M. et al., 2003], МС [Jialal I. et al., 2012], СД 2 типа [Nomura S. et al., 2000; Herder C. et al., 2005] и ИБС [Tajfard M. et al., 2017]. Тогда как в других работах уровни IL-8 у пациентов с МС в сыворотке крови не изменялись в сравнении с условно здоровыми лицами [Ingelsson E. et al., 2008; Chedraui P. et al., 2014; Pahwa R. et al., 2017]. Доказана модуляция IL-8 систематическим выполнением физических упражнений [Trseid M. et al., 2004]. Было установлено, что наличие МС не влияет на сывороточное содержание IL-8 у больных СД 1 типа [Ferreira-Hermosillo A. et al., 2015], но повышает его уровни при сердечной недостаточности [Shin M.J. et al., 2009]. Ранее сообщалось, что не IL-8, а MCP-1 ассоциирован с ИР при МС [Kim S.H. et al., 2011]. Возможно, именно поэтому мы также не обнаружили значимого увеличения уровней IL-8 при III степени ожирения у больных МС. В экспериментах было показано, что инсулин опосредованно, через активацию транскрипционного фактора NF-B, индуцирует экспрессию IL-8 в макрофагах, а TNF- – в преадипоцитах [Manowsky J. et al., 2016]. Помимо перечисленных факторов, в качестве индуктора продукции IL-8 при МС может выступать висфатин.

В экспериментах in vitro было показано, что мононуклеарные клетки периферической крови здоровых людей, инкубированные в среде, содержащей плазму людей с ожирением, начинают продуцировать IL-8 и IL-1, который является также является индуктором IL-8 [Parisi M.M. et al., 2017]. В жировой ткани IL-8 секретируется адипоцитами, преадипоцитами и макрофагами для направленной миграции активированных макрофагов, имеющих провоспалительный фенотип М1. Данное хемоаттрактантное действие исследуемой молекулы способствует формированию хронического воспаления и ИР. Хотя в нашем исследовании не обнаружено влияния степени ожирения на продукцию IL-8 при МС, другими исследователями было выявлено повышение синтеза данного интерлейкина в висцеральной жировой ткани при III степени ожирения по сравнению с I степенью [Fain J.N. et al., 2004]. Количество IL-8, высвобождаемого подкожной жировой тканью пациентов с МС, было больше, чем лицами без ожирения и МС [Bremer A.A., Jialal I., 2013]. При этом, как и в нашем исследовании, уровни провоспалительного TNF- в данной ткани у больных МС повышены не были, однако содержание IL-6 было увеличенным. При сравнении секреции IL-8 разными типами жировой ткани у одних и тех же пациентов с МС было обнаружено повышение продукции данного хемокина в висцеральной жировой ткани по сравнению с подкожной [Bruun J.M. et al., 2004].

Нами было обнаружено, что у пациентов с МС, являющихся носителями генотипа TT полиморфизма G894T гена NOS3 повышено содержание IL-8 по сравнению с таковым у носителей гетерозиготного генотипа. Вероятно, функциональное значение генотипа TT, помимо роли в снижении синтеза eNOS, заключается в усилении хемотаксиса при хроническом воспалении, которое является одной из характеристик МС. Ранее было показано, что окисленный 1-пальмитоил-2-арахидоноил-sn-глицеро-3-фосфорилхолин, идентифицированный при хроническом воспалении и атеросклеротических поражениях, активирует eNOS с помощью механизма с участием киназ PI3K и Akt и одновременно приводит к генерации супероксида данной изоформой. Затем образуемый eNOS супероксидный радикал с помощью механизмов, включающих истощение внутриклеточного холестерина, активирует белок, связывающий стерол-регуляторные элементы. Данный белок, в свою очередь, транслоцируется в ядро, связывается со стерол-регуляторными элементами в промоторе гена IL-8 и увеличивает транскрипцию этого гена и, соответственно, количество самого IL-8 [Gharavi N.M. et al., 2006]. Более того, пероксинитрит, образующийся из супероксидного аниона и NO, посредством активации транскрипционных факторов NF-B и AP-1 способствует повышению продукции IL-8 [Zouki C. et al., 2001]. Избыточная продукция IL-8 у больных МС с генотипом TT полиморфного варианта G894T стимулирует секрецию ЭТ-1, но не оказывает влияние на образование NO, тем самым вызывая дисбаланс данных молекул [Cheng M. et al., 2008].

Лептин является негликозилированным пептидным гормоном, продуцируемым дифференцированными адипоцитами, который, в первую очередь, известен своей ролью гипоталамического модулятора потребления пищи, веса тела и откладывания жира. Рецепторы к лептину расположены, в основном, в гипоталамусе и стволе мозга, а сигналы через эти рецепторы контролируют насыщение, энергетические затраты и нейроэндокринную функцию. Как и в нашем исследовании, во множестве работ у людей с МС [Yun J.E. et al., 2010; Li W.C. et al., 2011], избыточным весом и ожирением [Morioka T. et al., 2014] отмечается повышенный уровень лептина, который не подавляет аппетит, или, другими словами, лептинорезистентность на уровне центральной нервной системы или пострецепторном уровне. Помимо влияния на аппетит и обмен веществ, лептин стимулирует симпатический отдел вегетативной нервной системы, что ведёт к повышению АД и частоты сердечных сокращений.

Гиперлептинемия является одним из факторов, который вносит вклад в повышенную продукцию eNOS на системном уровне у больных МС [Korda M. et al., 2008], что очевидно имеет место в нашем исследовании. Кроме этого, лептин может увеличивать фосфорилирование Akt киназы в участке Ser308 и, соответственно, фосфорилирование eNOS в позиции Ser1177 в эндотелиальных клетках аорты человека и крыс [Vecchione C. et al., 2002]. Было показано, что лептин активирует сигнальный путь PI3-K/Akt во многих тканях, индуцируя опосредованное киназой Jak2 фосфорилирование IRS-1 без участия инсулинового рецептора [Niswender K.D. et al., 2003], что указывает на возможное наличие общих сигнальных механизмов действия с инсулином. Procopio et al.продемонстрировали, что в эндотелиальных клетках аорты человека лептин в физиологических концентрациях стимулирует фосфорилирование протеинкиназы AMPK участвует в стимуляции eNOS, активируя Akt киназу или непосредственно фосфорилируя eNOS в позиции Ser1177 [Procopio C. et al., 2009]. При ожирении лептин также способен уменьшать внутриклеточный L-аргинин, приводя к разобщению eNOS и повышенному образованию цитотоксического пероксинитрита [Korda M. et al., 2008].

Известно, что лептин оказывает множественные провоспалительные эффекты на сосуды. При взаимодействии со своими рецепторами, экспрессируемыми на клетках сосудистой стенки, лептин вызывает реакции окислительного стресса, увеличивает экспрессию IL-8 [Tong K.M. et al., 2008], TNF-, и IL-6, потенцирует пролиферацию, а также экспрессию VEGF и молекул адгезии эндотелиальных клеток, включая iCAM-1 и vCAM-1, посредством активации транскрипционного фактора NF-B [Adya R. et al., 2015]. Кроме того, лептин стимулирует синтез CРБ гепатоцитами [Shamsuzzaman A.S. et al., 2004], обеспечивая, тем самым, потенциальную связь между лептином и патогенезом ЭД. Как следствие, это влечет к нарушенной функции ГМК, нарушению эндотелий-зависимой вазодилатации, способствует АГ и атеросклерозу. Результаты клинических исследований демонстрировали положительную корреляцию между циркулирующим лептином и уровнями VCAM-1 и vWF [Porreca E. et al., 2004], продукция которого в нашем исследовании была повышена у больных МС с морбидным ожирением.

У здоровых людей лептин повышает уровни активности ЭТ-1 и NO и, следовательно, сохраняет физиологический баланс между этими двумя медиаторами с противоположными эффектами. Было показано, что эти эффекты лептина отсутствуют у пациентов с MС, сопровождающимся гиперлептинемией [Schinzari F. et al., 2013]. Отсутствие сосудистого эффекта экзогенного лептина у пациентов с ожирением позволяет интерпретировать хроническую гиперлептинемию как биомаркер ЭД. Согласно данным разных исследований, лептин вносит вклад в развитие ЭД и АГ с помощью альдостерон-зависимых механизмов [Huby A.C. et al., 2016], активации симпатической нервной системы с вовлечением ангиотензина II и генерации АФК [Wang J. et al., 2013]. Ранее также сообщалось, что лептин способствует неоинтимальному росту у мышей и индуцирует генерацию супероксида митохондриями и MCP-1 в аортальных эндотелиальных клетках [Yamagishi S.I. et al., 2001].

ЭД является ранним маркером развития атеросклероза. В нашем исследовании у всех больных МС сывороточное содержание ЭТ-1 было повышено, а уровни двух других маркеров ЭД (vWF и vCAM-1) возрастали при морбидном ожирении, ассоциированном с ИР. Можно сделать вывод о том, МС сопровождается повышением активности вазоконстрикторных механизмов, а выраженное нарушение функционирования эндотелия происходит только при формировании тяжелой формы ожирения и ИР, что в наибольшей степени повышает риск развития атеросклероза. Полностью противоречивые данные об отсутствии или наличии ЭД у людей с ожирением или МС встречаются в опубликованных ранее исследованиях. Так, полученные нами данные согласуются с результатами другого исследования, в котором ЭД была выявлена только у людей, страдающих морбидным ожирением, ассоциированным с ИР [El Assar M. et al., 2013]. В другом исследовании, напротив, у людей с морбидным ожирением, но без ИР, было обнаружено парадоксальное сохранение сосудистой функции [Biasucci F. et al., 2010]. Также установлено, что ожирение, независимо от наличия МС, ассоциировано с сосудистыми повреждениями [Schinzari F. et al., 2015], причем нарушения микроциркуляции могут уже наблюдаться у людей с избыточным весом.