Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 11
1.1 Роль аденозина в физиологических и патологических процессах 11
1.1.1 Метаболизм аденозина 11
1.1.2 Нерецепторные эффекты аденозина 13
1.1.3 Эффекты стимуляции аденозиновых рецепторов 14
1.1.4 Роль аденозиновых рецепторов моноцитов при воспалении
1.2 Аденозиновые рецепторы - перспективные мишени для терапии заболеваний 21
1.3 Влияние аденозина на процессы регенерации 25
1.4 Современная терапия ожоговой раны
1.4.1 Эпидемиология ожогов 29
1.4.2 Современные стандарты терапии ожоговой раны 29
1.4.3 Подходы к клеточной терапии ожоговой раны 31
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 39
2.1 Дизайн и объект исследования 39
2.2 Материал исследования 42
2.3 Методы исследования 43
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение собственных исследований 56
3.1 Иммунофенотипическая характеристика аденозин-модифицированных моноцитов 56
3.2 Анализ экспрессии мРНК генов аденозиновых рецепторов аденозин-модифицированными моноцитами 73
3.3 Анализ экспрессии мРНК генов цитокинов аденозин-модифицированными моноцитами 79
3.4 Анализ концентрации цитокинов в кондиционной среде аденозин-модифицированных моноцитов
3.5 Регенеративные процессы in vivo при введении аденозин модифицированных моноцитов вокруг ожоговой раны 96
3.5.1 Планиметрический анализ области ожоговой раны у животных экспериментальных групп в разные периоды наблюдения 96
3.5.2 Гистологическая характеристика области ожоговой раны в разные периоды наблюдения 105
Заключение 122
Выводы 128
Практические рекомендации 129
Список сокращений 130
Список литературы
- Нерецепторные эффекты аденозина
- Материал исследования
- Анализ экспрессии мРНК генов аденозиновых рецепторов аденозин-модифицированными моноцитами
- Планиметрический анализ области ожоговой раны у животных экспериментальных групп в разные периоды наблюдения
Нерецепторные эффекты аденозина
Аденозин реализует свои эффекты с помощью нерецепторных механизмов и через взаимодействие со специфическими рецепторами. Нерецепторные механизмы действия аденозина изучены недостаточно и ограничиваются лишь небольшим количеством исследований, проводившихся в конце XX века [229]. Один из нерецепторных путей был открыт при изучении механизмов индукции апопотоза центральных и периферических нейронов птиц и млекопитающих под действием аденозина. В частности было обнаружено, что применение ингибиторов аденозинового транспортера практически полностью предотвращает токсический эффект аденозина [189]. Еще одним подтверждением токсичности при накоплении аденозина является исследование Т. D. Wakade и соавт. (1995). Они показали, что ингибирование аденозиндезаминазы (фермента, катализирующего расщепление аденозина до инозина и аммиака) ведет к значительному увеличению нейротоксичности [64].
Другой путь нерецепторных эффектов аденозина опосредуется при фосфорилировании с помощью аденозинкиназы. Исследования A. R. Wakade (1998) показали, что стимуляция аденозинкиназы ведет к усилению токсического эффекта аденозина [230]. Это связано с тем, что под действием аденозинкиназы образуются фосфорилированные продукты обмена аденозина, ингибирующие синтез ДНК, РНК и белковых продуктов [44].
Аденозин, несмотря на токсический эффект на нейроны, оказывает кардиопротекторное влияние при ишемии-реперфузии [192]. Причем авторы данного исследования предполагают, что положительный эффект, в противоположность экспериментам с нейронами, описанными выше, опосредуется за счет увеличения количества фосфорилированного аденозинкиназой АМФ.
Таким образом, существует несколько путей нерецепторного влияния аденозина, однако все они нуждаются в дополнительном изучении.
Несмотря на наличие внерецепторных механизмов действия аденозина, большинство своих эффектов он реализует через взаимодействие со специфическими рецепторами [78, 113, 137, 138, 158]. Аденозиновые рецепторы обнаружены практически во всех анализированных тканях и органах. Аденозиновые рецепторы относятся к семейству Р1 пуринергических рецепторов и представляют собой семь трансмембранных доменов в комплексе с внутриклеточным ГТФ-связывающим белком (G-белком). На настоящий момент секвенировано и клонировано 4 типа аденозиновых рецепторов: Al, А2А, А2В, A3 [138].
Активация рецепторов зависит от концентрации аденозина во внеклеточной среде. В норме концентрация аденозина не превышает 1мкМ, при этом эффекты аденозина реализуются через А1 (0,03 - 0,2 мкМ), A3 (0,03 - 0,2 мкМ) и А2А (0,7 мкМ) рецепторы. А2В рецепторы, являясь низко аффинными, реагируют лишь на повышенные концентрации аденозина (24 мкМ) при патологических состояниях [114].
Сигнальные пути подтипов аденозиновых рецепторов [140]. Примечание: CREB - белок, связывающий цАМФ зависимый элемент, DAG -диацилглицерол, IP3 - инозитол 1, 4, 5 - трифосфат, PI3K -фосфатидилинозитол 3 - киназа, PIP2 - фосфатидилинозитол - 4, 5 -бифосфат, РК - протеинкиназа, PLD - фосфолипаза D, PLC - фосфолипаза С.
Тем не менее, каждый аденозиновый рецептор обладает рядом индивидуальных свойств. A1 аденозиновый рецептор А1 рецептор более других распространен в центральной нервной системе (коре больших полушарий, мозжечке, таламусе, спинном мозге, гипофизе), кроме того он встречается в жировой ткани, желудке, кишечнике, сердце, аорте, печени, селезенке. Активация А1 рецепторов ведет к ингибированию аденилатциклазы через активацию коклюш-чувствительного G-белка [73] и, в результате, к повышению активности фосфолипазы С [181, 198]. В миокарде и нейронах А1 аденозиновые рецепторы способны активировать коклюш-чувствительные К+ каналы, а также ингибировать Q-, Р- и N-типы Са каналов [138].
Физиологическими эффектами от стимуляции А1 является подавление липолиза, повышение захвата глюкозы адипоцитами, снижение выброса нейротрансмиттеров, бронхоконстрикция, проведение боли [232]. Активация А1 аденозиновых рецепторов в почках ингибирует высвобождение ренина, повышает реабсорбцию натрия в проксимальных извитых канальцах, снижает скорость клубочковой фильтрации [159].
Для сердечно-сосудистой системы положительными эффектами активации А1 аденозиновых рецепторов является замедление ритма, отрицательный инотропный эффект в сердце, вазоконстрикция. Однако в условиях гипоперфузии, гипотонии, остановки сердца аденозин оказывает негативное влияние, предотвращая необходимое компенсаторное увеличение частоты сердечных сокращений и артериального давления. К эффектам активации А1 аденозиновых рецептов в патологических условиях можно отнести нейропротекторное действие при черепно-мозговых травмах и защиту от ишемии головного мозга [89]. A2A аденозиновый рецептор
А2А аденозиновый рецептор в центральной нервной системе представлен лишь в полосатом теле и обонятельных бугорках, но кроме этого имеет высокую экспрессию на лейкоцитах (особенно нейтрофилах) и тромбоцитах, в тимусе и селезенке [175]. На среднем уровне экспрессирован в легких, сердце, сосудах.
А2А реализует такие физиологические эффекты аденозина, как расширение сосудов, подавление агрегации тромбоцитов, усиление выброса нейротрансмиттеров [ИЗ]. А2А рецепторы опосредует противовоспалительные эффекты за счет повышения продукции цитокинов клетками [164]. Было показано, что агонисты А2А аденозиновых рецепторов приводят к увеличению концентрации противовоспалительного IL-10 в моделях in vitro и in vivo [67, 213]. Стимуляция А2А рецептора человеческих синовиоцитов ведет к снижению уровня TNFa, IL-6 и IL-8, подъему IL-10, что свидетельствует о снижении воспалительной реакции [101,213].
Противовоспалительные и ткане-протекторные эффекты, опосредованные А2А рецепторами, были продемонстрированы в ряде моделей различных воспалительных заболеваний, в частности на модели артрита у животных [20, 68, 162]. Было показано, что стимуляция А2А рецепторов уменьшает клинические проявления и улучшает гистологическую картину коллаген-индуцированного артрита у мышей 184]. Терапия агонистами А2А рецептора характеризовалась снижением экспрессии мРНК генов провоспалительных цитокинов, оксидативного и нитрозо-повреждения [76]. За счет эффективного противовоспалительного и ранозаживляющего действия агониты А2А аденозиновых рецепторов были одобрены для клинических испытаний [58, 108, 228].
Материал исследования
Периферическую венозную кровь здоровых доноров в объеме 30 мл собирали из локтевой вены утром натощак в стерильную вакуумную пробирку с гепарином (Green Vacube с Li-гепарином, 16 100 мм, «Green Cross», Корея). Кровь в течение часа доставляли в ЦНИЛ СибГМУ для последующего иммунологического исследования.
Кровь у лабораторных животных забирали методом кардиопункции. У усыпленных с помощью СОг - асфиксии животных выстригали шерсть в области предполагаемого укола и дезинфицировали кожу. Пальпаторно определяли место конечного толчка сердца. На 1 см краниальнее от установленной точки, отступив на 1—2 мм от левого края грудины, делали укол, держа иглу вертикально. Кровь забирали стерильным шприцом, смоченным гепарином (ОАО «Синтез», Россия), для предотвращения свертывания крови, после чего переливали в вакуумные пробирки с гепарином (Green Vacube с Li-гепарином, 16 100 мм, «Green Cross», Корея). Кровь в течение 30 минут доставляли в ЦНИЛ СибГМУ для последующего иммунологического исследования. 2.3 Методы исследования
Выделение фракции периферических мононуклеарных клеток (МНК) В стерильных центрифужных пробирках объемом 50 мл («Falcon», США) разбавляли венозную кровь 1:1 раствором Хэнкса («Sigma», США). Под 30 мл полученной смеси подслаивали 13 мл раствора фиколла (1,077 г/мл, «ПанЭко», Россия). Полученный градиент центрифугировали в течение 30 минут с ускорением 504g при температуре 20С. Далее собирали мононуклеарную фракцию на границе раздела фаз и переносли в новые стерильные центрифужные пробирки. Для отмывки полученных клеток от примесей фиколла объем клеточной суспензии доводили до 50 мл раствором Хэнкса и центрифугировали 20 минут с ускорением 165g при температуре 20С. С помощью аспиратора удаляли супернатант, осажденные клетки ресуспендировали в 1 мл раствора Хэнкса. Полученный объем смеси повторно доводили до 50 мл раствором Хэнкса и центрифугировали 20 минут с ускорением 165g при температуре 20С.
Выделение моноцитов из МНК венозной крови Выдление моноцитов из фракции мононуклеаров проводили методом центрифугирования в двойном градиенте плотности перколла (1,131г/смЗ, «Sigma»,CIIIA). Готовили 10-кратный забуференный фосфатный раствор: 25 г NaCl, 0,25 г Na2HPC 4, 4,2 г КН2РО4 доводили дистиллированной водой до 400 мл, рН=7,2-7,4. Далее готовили стандартный изотонический раствор перколла (с плотностью 1,123 г/мл): к 1 мл 10-кратного забуференного фосфатного раствора добавляли 9 мл перколла с плотностью 1,131 г/мл. После чего готовили раствор перколла с плотностью 1,064 г/мл (5226 мкл стандартного изотонического раствора перколла смешивали с 5776 мкл RPMI) и 1,032 г/мл (750 мкл стандартного изотонического раствора перколла смешивали с 4250 мкл RPMI).
Полученные после отмывки от фиколла мононуклеары ресуспендировали в 1 мл среды RPMI. Добавляли 1,5 мл стандартного изотонического раствора перколла. Полученную смесь переносили в новые 15 мл стерильные центрифужные пробирки. С помощью одноразового шприца наслаивали 5 мл раствора перколла с плотностью 1,064 г/мл, после чего сверху наслаивали 2 мл раствора перколла с плотностью 1,032 г/мл. Полученный градиент центрифугировали в течение 50 минут с ускорением 2058g при температуре 20С. Верхнее кольцо, содержащее фракцию моноцитов, собирали пастеровской пипеткой и переносили в чистую 50 мл пробирку. Объем клеточной суспензии доводили раствором Хэнкса до 30 мл. Центрифугировали в течение 15 минут с ускорением 659g при температуре 20С. После отмывки от перколла проводили подсчет количества клеток в камере Горяева.
Далее на основе адгезионной среды готовили клеточную суспензию с концентрацией 0,5 млн клеток/мл. Адгезионная среда состояла из 500 мл среды RPMI, 5 мл пирувата натрия (11 мг/мл), 146 мг глутамина, 10 мл эмбриональной телячьей сыворотки, 3 мкл Р-меркаптоэтанола, 5 мл ЮОх Antibiotic Antimycotic Solution («Sigma», США) (10,0 единиц пенициллина, 0,10 мг стрептомицина и 0,25 мкг амфотерецина В на мл 1х раствора). Клеточную суспензию помещали в 24-луночные пластиковые культуральные планшеты из расчета 1 мл на лунку, после чего инкубировали клетки в течение 2 часов в СОг - инкубаторе во влажной атмосфере 5% С02 при +37С. Стимуляция и культивирование моноцитов
По окончании инкубации содержимое лунок аспирировали несколько раз, удаляя неадгезированную фракцию клеток. Далее среду в лунках заменяли равным объемом (1 мл) полной питательной среды с цитокинами. Полная питательная среда состояла из 500 мл среды RPMI, 5 мл пирувата натрия (11 мг/мл), 146 мг глутамина, 50 мл эмбриональной телячьей сыворотки, 3 мкл (3-меркаптоэтанола, 5 мл 100х Antibiotic Antimycotic Solution (10,0 единиц пенициллина, 0,10 мг стрептомицина и 0,25 мкг амфотерецина В на мл 1х раствора), 20 нг/мл IL4 («ProSpec», США) и 20 нг/мл GM-CSF («ProSpec», США). Для стимуляции клеток добавляли негидролизуемый аналог аденозина - NEC A («Sigma», США) в концентрации ЗОмкМ или 100 мкМ и инкубировали в СОг - инкубаторе во влажной атмосфере 5% С02 при +37С 24 или 72 часа соответственно. Для определения исследуемых параметров в отсутствии стимуляции (в качестве контроля) к клеткам добавляли растворитель NECA - диметилсульфоксид (DMSO). По завершении культивирования осуществляли пробоподготовку клеток для проведения иммунофенотипирования, ПЦР, а также сбор кондиционной среды для последующего определения концентрации цитокинов.
Анализ экспрессии мРНК генов аденозиновых рецепторов аденозин-модифицированными моноцитами
Статистическую обработку полученных данных осуществляли с использованием пакета программ «GraphPad Prism5». Для оценки значимости количественных показателей в группах сравнения предварительно определяли соответствие полученных данных нормальному закону распределения с помощью критерия Шапиро-Вилка. Параметры, подчиняющиеся нормальному закону распределения, описывали с помощью среднего значения (М) и стандартного отклонения (т); не подчиняющиеся нормальному закону распределения - с помощью медианы (Me) и интерквантильного интервала (Q25-Q75). Сравнение количественных данных, подчиняющихся нормальному закону распределения, осуществляли при помощи Т-критерия Стьюдента. Сравнение количественных показателей, не подчиняющихся нормальному закону распределения, осуществляли при помощи критерия Манна-Уитни. Межгрупповые различия данных в трех независимых группах оценивали с помощью критерия Крускала-Уоллиса с учетом поправки на множественное сравнение. Критической величиной уровня значимости различий считали р 0,05.
Иммунофенотипическая характеристика аденозин модифицированных моноцитов
Дифференцировка моноцитов в дендритные клетки существенно зависит от микроокружения [223]. Известно, что наличие в среде аденозина, сопровождающееся стимуляцией аденозиновых рецепторов, искажает дифференцировку моноцитов [42, 60]. Вследствие этого появляется отдельная популяция клеток, характеризующаяся измененной функциональной активностью и экспрессией поверхностных маркеров. Для изучения изменения иммунофенотипа моноцитов под влиянием NECA проводили оценку экспрессии ряда поверхностных маркеров, таких как CD la, CD 14, CD209. Определение поверхностных кластеров дифференциации проводили через 24 или 72 часа от начала культивирования согласно выбранному режиму стимуляции. Для определения содержания популяции моноцитов определяли параметры бокового и переднего светорассеяния. Боковое светорассеяние (SSC) характеризует ганулярность клеток, а переднее светорассеяние (FSC) - размер клеток.
Через 24 часа после начала культивирования анализируемая популяция (имеющая средние показатели SSC/FSC, характерные для моноцитов) составляла 70,03% клеток (64,27 - 79,93) для нестимулированных культур и 70,09% клеток (61,45 - 83,89) после стимуляции 30 мкМ NECA (рисунок 4).
При культивировании в течение 72 часов по параметрам переднего и бокового светорассеяния анализируемые популяции составили 70,25% (68,67-79,50) и 71,18% (69,16-86,28) от общего количества событий для нестимулированной и стимулированной культур моноцитов соответственно (рисунок 5). По сравнению с 24 часовыми культурами анализируемые популяции выросли в размере и увеличили количество гранул, что соответствует процессу дифференцировки.
Маркер CD la является членом семейства липидных антигенпрезентирующих молекул. CD 1а - один из основных маркеров, характеризующих процесс дифференцировки моноцитов в дендритные клетки. Клетку, экспрессирующую CD 1а можно отнести к незрелым дендритным. Пример распределения популяций клеток по экспрессии CD 1а при различных режимах стимуляции NECA представлен на рисунке 6.
Через 24 часа моноциты, стимулированные 30 мкМ NEC А в течение 24 часов, несли на своей поверхности достоверно меньшее количество иммуннофенотипического маркера CDla - 18,07% (10,12-32,55), чем нестимулированная культура клеток - 29,55% (22,21-49,93) (р=0,0044).
Через 72 часа в нестимулированной культуре 44,74% клеток (36,74-58,85) несли на своей поверхности CDla. В то же время только 11,85% (7,28-51,17) моноцитов, стимулированных 100 мкМ NEC А, экспрессировали данный маркер. Различия между группами статистически достоверны на уровне значимости р 0,0001 (рисунок 7).
В процессе культивирования моноциты приобретают профиль незрелых дендритных клеток, что характеризуется повышением экспрессии маркера CDla. Для моноцитов, культивируемых с DMSO, характерно увеличение экспрессии данного маркера, что соответствует нормальному протеканию процесса дифференцировки. Снижение экспрессии CDla, наблюдающееся у аденозин-модифицированных клеток, может свидетельствовать о торможении или искажении процессов дифференцировки.
Планиметрический анализ области ожоговой раны у животных экспериментальных групп в разные периоды наблюдения
По данным литературы аденозин, его аналоги и агонисты аденозиновых рецепторов значительно влияют на секрецию цитокинов. Согласно данным S. Ryzhov и коллег (2008), стимуляция перитонеальных макрофагов мыши аналогом аденозина NECA приводит к увеличению уровня секреции IL-6 [94]. Данные, полученные в работе S. Ryzhov, полностью согласуются с результатами проведенного нами исследования. В работе Z.H. Nemeth и коллег (2005) показано, что стимуляция мышиных макрофагов RAW 624.7 аденозином и его агонистами вызывала повышение секреции IL-10 [46]. Это было подтверждено также в более позднем исследовани N.D. Khoa и коллег (2007), где показано повышение секреции IL-10 при стимуляции аденозином моноцитарной линии ТНР-1 [143]. В рамках проведенного нами исследования было установлено, что под влиянием аналога аденозина NECA имеет место тенденция к увеличению секреции IL-10, что коррелирует с результатами работ Z.H. Nemeth и N.D. Khoa.
Широкий спектр исследований указывают на увеличение продукции сосудисто-эндотелиального фактора роста стимулированными аденозином клетками. Так по данным A.R. ЕНа (2008) культивирование моноцитов в течение 96 часов с последующим 24-часовым культивированием в условиях гипоксии вызывает повышение уровня VEGF в 15 раз (40 пг/мл в условиях нормоксии и 600 пг/мл в условиях гипоксии) [126]. Повышение секреции клетками при культивировании в условиях гипоксии также изучалось S. Gessi и соавт. (2010) [53]. В 2009 году ими был проведен ряд экспериментов по исследованию влияния аденозина на уровни HIF-1, VEGF и ИЛ-8 на модели гипоксии ксантомных клеток (макрофагов, дифференцированных из моноцитов, за счет захвата, гидролиза и реэтерификации эфиров холестерина, присутствующих в липопротеинах низкой плотности). В условиях гипоксии добавление 100 мкМ аденозина к культуре ксантомных клеток через 24 часа инкубации вызывало увеличение секреции VEGF в 1,6 раза по сравнению с интактными клетками, IL-8 - в 1,5 раза. Изучение уровней секреции при использовании блокаторов Al (DPCPX) и А2А (SCH 58261) аденозиновых рецепторов позволило сделать вывод, что увеличение секреции VEGF и IL-8 опосредуется через А2В и A3 рецепторы. По результатам проведенных нами исследований секреция сосудисто-эндотелиального фактора роста через 24 часа после добавления 30 мкМ аналога аденозина NECA возрастала в 23 раза, а через 72 часа под действием 100 fiM NECA - в 37 раз, что значительно превышает показатели секреции VEGF в экспериментах с культивированием клеток в условиях гипоксии. Поэтому методика повышения секреции VEGF моноцитами с помощью NECA является более перспективной, чем применение для этой цели моделирования условий гипоксии.
К.В. Горемыкин и соавт. (2011) при изучении секреции цитокинов стимулированными аналогом аденозина моноцитами человека показали, что при добавлении 30 мкМ аналога аденозина и культивировании в течение 38 часов происходит увеличение секреции в 4,04 раза [16]. В рамках проведенного нами исследования установлено, что культивирование в течение 24 часов при аналогичном режиме стимуляции (30 мкМ NECA) приводит к увеличению секреции в 23 раза. Это свидетельствует о том, что выбранный нами режим культивирования эффективнее, поскольку обеспечивает продукцию сосудисто-эндотелиального фактора роста на более высоком уровне и сокращает время культивирования.
A.N. Clark и соавт. (2007) проводили эксперименты по изучению процессов ангиогенеза при активации аденозиновых рецепторов [21]. В качестве агониста аденозиновых рецепторов ими был использован N 94 циклопентиладенозин (СРА) - селективный агонист А1 аденозинового рецептора. На модели куриной хориоаллантоидной мембраны было установлено, что СРА не стимулировал ангиогенез путем прямого взаимодействия с сосудистыми клетками, вследствие чего возникла гипотеза о его опосредованном эффекте через стимуляцию высвобождения проангиогенных факторов из клеток крови, в частности, моноцитов. При культивировании моноцитов в течение 18 часов после добавления СРА наблюдалось повышение секреции VEGF в 1,7 раза, 5пМ СРА + 50 пМ ZM241385 (антагонист А2А-аденозиновых рецепторов) - в 1,6 раза. Это позволило сделать вывод, что активация А1 подтипа аденозиновых рецепторов приводит к повышению секреции сосудисто-эндотелиального фактора роста моноцитами и стимуляции процессов ангиогенеза. Таким образом, выбранный нами аналог аденозина NECA является более удачным стимулятором секреции сосудисто-эндотелиального фактора роста, чем N -циклопентиладенозин, поскольку приводит к наиболее выраженному увеличению уровня секреции сосудисто-эндотелиального фактора роста моноцитами.
Таким образом, в рамках проведенного нами исследования показано увеличение концентрации сосудисто-эндотелиального фактора роста и наличие тенденций к изменению уровней цитокинов различной функциональной активности при стимуляции моноцитов аналогом аденозина NECA.
При анализе литературных источников и результатов собственных исследований было установлено, что выбранный нами стимулятор модификации моноцитов аденозин (NECA) значительно влияет как на фенотипический профиль моноцитов, способствуя изменению пути дифференцировки, так и на цитокиновый профиль, приводя к увеличению экспрессии и секреции широкого спектра цитокинов и ростовых факторов.
Исходя из результатов проведенного исследования, наиболее оптимальной для аутологической трансплантации в область ожоговой раны с целью стимуляции регенеративных процессов была выбрана модификация моноцитов 100 мкМ NECA с последующим культивированием в течение 72 часов. Данный режим был выбран ввиду наибольшей концентрации VEGF в кондиционной среде клеточных культур, усиленного эффекта на уровень экспрессии мРНК генов целевых цитокинов, а также увеличенного количества модифицированных клеток по результатам цитофлуориметрического анализа.