Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Природа, физико-химические свойства и клиническое значение монч (обзор литературы) 10
1.1 Природа МОНЧ 10
1.2 МОНЧ как физико-химический феномен
1.2.1 Определение 12
1.2.2 Получение 12
1.2.3 Физико-химические свойства 13
1.2.4 Цитопатические эффекты 14
1.3 Роль МОНЧ в заболеваниях, связанных с эктопической кальцификацией 17
1.3.1 Заболевания почек 17
1.3.2 Холелитиаз 18
1.3.3 Хронический простатит/синдром хронической тазовой боли (ХП/СХТБ), тестикулярный микролитиаз (ТМ) и интерстициальный цистит/синдром болезненного мочевого пузыря (ИЦ/СБМП) 19
1.3.4 Кальцификация плаценты 20
1.3.5 Атеросклероз и ККС
1.4 Атеросклероз и ККС: природа сердечно-сосудистой кальцификации 24
1.5 Механизмы ингибирования кальцификации в биологических жидкостях 26
ГЛАВА 2 Материалы и методы исследования 29
2.1 Выделение МОНЧ из кальцифицированных атеросклеротических бляшек 29
2.2 Искусственный синтез МОНЧ 30
2.3 Декальцификация МОНЧ 30
2.4 Визуализация МОНЧ 31
2.5 Определение минерального состава и распределения размерности МОНЧ 31
2.6 Определение белкового состава МОНЧ 32
2.7 Определение липидного состава МОНЧ 34
2.8 Определение нуклеинового состава МОНЧ 34
2.9 Анализ факторов формирования МОНЧ 2.10 Анализ деления МОНЧ 36
2.11 Анализ интернализации КФБ 36
2.12 Определение токсичности КФБ in vitro 37
2.13 Определение прямой кальцификации тканей in vitro 39
2.14 Определение токсичности КФБ и прямой кальцификации тканей in vivo 39
2.15 Определение способности КФБ изменять конформацию антикальцифицирующих белков 42
2.16 Статистический анализ 44
ГЛАВА 3 Сравнение естественных и искусственных монч 45
Глава 4 Механизмы патогенности кфб 58
Заключение 69
Выводы 73
Практические рекомендации 74
Список используемых сокращений 75
Список литературы
- Цитопатические эффекты
- Хронический простатит/синдром хронической тазовой боли (ХП/СХТБ), тестикулярный микролитиаз (ТМ) и интерстициальный цистит/синдром болезненного мочевого пузыря (ИЦ/СБМП)
- Определение белкового состава МОНЧ
- Определение токсичности КФБ и прямой кальцификации тканей in vivo
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Феномен минерало-органических наночастиц (МОНЧ), образующихся в
организме человека, был открыт еще более 25 лет назад, однако эти результаты
были опубликованы несколькими годами позже (Kajander E. O. с соавт., 1998).
Дискуссии об их природе и условиях, способствующих их образованию, велись
на протяжении всей следующей декады (Cisar J. O. с соавт., 2000; Price P. A. с
соавт., 2002; Heiss A. с соавт., 2003; Raoult D. с соавт., 2008). В ряде
исследований группе из Тайваня удалось синтезировать из различных солей и
фосфатов семейство МОНЧ, названное ими бионами (Martel J. c соавт., 2008;
Young J. D. с соавт., 2009; Wu C. Y. с соавт., 2013). Согласно оригинальной
гипотезе, бионы представляют собой физиологический механизм,
регулирующий функцию, транспорт и выведение элементов и минералов в организме человека (Martel J. с соавт., 2014). Кальций-фосфатные бионы (КФБ) могут накапливаться в организме при перенасыщении биологических жидкостей ионами кальция и фосфора или при нарушении механизмов, препятствующих их формированию или выведению из организма (Martel J. с соавт., 2014).
Предположение, что МОНЧ могут быть причиной или маркером
связанных с эктопической кальцификацией заболеваний, к которым относятся
атеросклероз и кальцификация клапанов сердца (ККС), было впервые
высказано еще в пионерской работе (Kajander E. O. с соавт., 1998). Кроме того,
потенциальная роль МОНЧ в этиологии и/или патогенезе атеросклероза может
иметь особую значимость вследствие его чрезвычайно высокой
распространенности, а также связанной с ним инвалидизации и смертности (Nowbar A. N. с соавт., 2014). В ряде исследований МОНЧ были обнаружены в кальцифицированных артериях и клапанах сердца (Miller V. M. с соавт., 2004; Puskas L. G. с соавт., 2005; Delogne C. с соавт., 2007; Bertazzo S. с соавт., 2013). В других работах было показано, что МОНЧ могут быть маркером атеросклероза и ККС (Price P. A. с соавт., 2004; Bratos-Perez M. A. с соавт., 2008; Candemir B. с соавт., 2010; Tulunay Kaya C. с соавт., 2011).
Степень разработанности темы исследования
Ранее были проведены исследования морфологии, минерального (Kajander E. O. с соавт., 1998; Raoult D. с соавт., 2008; Young J. D. et al., 2009) и органического (Raoult D. с соавт., 2008; Young J. D. с соавт., 2009; Martel J. с
соавт., 2011; Wu C. Y. с соавт., 2013) состава МОНЧ, а также были подробно
рассмотрены факторы, способствующие формированию МОНЧ в
биологических жидкостях (Heiss A. с соавт., 2003; Price P. A. с соавт., 2003; Young J. D. с соавт., 2009). Кроме того, было показано, что МОНЧ присутствуют в кальцифицированных артериях и клапанах сердца (Miller V. M. с соавт., 2004; Puskas L. G. с соавт., 2005; Delogne C. с соавт., 2007; Bertazzo S. с соавт., 2013), а также могут быть маркером атеросклероза и ККС (Price P. A. с соавт., 2004; Bratos-Perez M. A. с соавт., 2008; Candemir B. с соавт., 2010; Tulunay Kaya C. с соавт., 2011).
В то же время неясно, являются ли МОНЧ, выделенные из
кальцифицированных тканей (естественные), и искусственно синтезированные
МОНЧ (искусственные) одинаковыми или имеют какие-либо различия. Не
было показано в эксперименте, являются ли МОНЧ причиной сердечно
сосудистой кальцификации, безвредным продуктом фосфорнокальциевого
гомеостаза или продуктом фосфорнокальциевого гомеостаза с определенными
патогенными эффектами. Теоретически можно предположить как минимум три
возможных механизма патогенности МОНЧ: 1) токсичность для
эндотелиальных клеток; 2) прямая кальцификация тканей; 3) конформационные изменения антикальцифирующих белков.
Соответственно, есть потребность в исследовании, которое: 1) показало бы сходство или различия между естественными и искусственными МОНЧ; 2) выявило бы патогенные эффекты МОНЧ, которые могут определять развитие сердечно-сосудистой кальцификации.
Цель исследования - определить роль минерало-органических наночастиц в патогенезе атеросклероза.
Задачи исследования:
-
Изучить факторы формирования, морфологию и химический состав естественных и искусственных минерало-органических наночастиц;
-
Оценить эндотелиотоксичность минерало-органических наночастиц;
-
Оценить способность минерало-органических наночастиц вызывать прямую кальцификацию тканей сердечно-сосудистой системы и изменять конформацию антикальцифицирующих белков.
Научная новизна исследования
Доказано, что как естественные, так и искусственные МОНЧ представляют собой сферические частицы губчатой структуры диаметром 100-500 нм, состоящие из гидроксиапатита и определенных белков, адсорбирующие
двуспиральную ДНК из окружающей среды и образующиеся при перенасыщении биологических жидкостей ионами кальция и фосфора. Таким образом, показана идентичность естественных и искусственных МОНЧ, которые должны рассматриваться как кальций-фосфатные бионы (КФБ).
Установлено, что КФБ вызывают апоптоз и снижают жизнеспособность эндотелиальных клеток, способствуют синтезу проатеросклеротических цитокинов интерлейкина-6 и интерлейкина-8 и индуцируют гиперплазию интимы брюшной аорты крыс. Показано, что данные эффекты могут быть обусловлены интернализацией КФБ эндотелиальными клетками и определяют роль КФБ в патогенезе атеросклероза.
Продемонстрировано, что КФБ не кальцифицируют ткани сердечнососудистой системы напрямую, а представляют собой механизм защиты от гиперкальциемии/гиперфосфатемии, приводящей к прямой кальцификации тканей.
Показано, что КФБ не изменяют конформацию как бычьего сывороточного альбумина (БСА), так и человеческого сывороточного фетуина-А (ЧСФ), представляющих собой два различных механизма противодействия кальцификации.
Теоретическая и практическая значимость работы
Доказана идентичность факторов формирования, а также
морфологического и химического состава естественных и искусственных МОНЧ. На основании этого установлено, что оба типа МОНЧ должны рассматриваться как КФБ.
Показано, что КФБ являются механизмом защиты от
гиперкальциемии/гиперфосфатемии, а их патогенные эффекты ограничены токсичностью для эндотелиальных клеток, что определяет роль КФБ в развитии атеросклероза.
Полученные результаты позволяют обосновать участие КФБ в фосфорнокальциевом гомеостазе и патогенетическую роль в развитии атеросклероза.
Методология и методы исследования
Для достижения цели исследования было проведено выделение МОНЧ из атеросклеротических бляшек и искусственный синтез МОНЧ, а также изучена возможность существования предполагаемых декальцифицированных МОНЧ. Для визуализации МОНЧ использовалась сканирующая электронная микроскопия (СЭМ), просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) и
атомно-силовая микроскопия (АСМ). Распределение МОНЧ в растворе
изучалось методом динамического рассеяния света (ДРС). Оценка
минерального состава МОНЧ проводилась методами энергодисперсионной
рентгеновской спектроскопии (ЭДРС), рентгеновской дифрактометрии (РД) и
инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье (Фурье-ИКС).
Органический состав МОНЧ исследовался при помощи электрофореза в
полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ) с
последующим окрашиванием нитратом серебра, иммуноблоттинга (ИБ),
окраски Hoechst 33342, спектрофотометрической оценкой ДНК и газовой
хроматографией-масс-спектрометрией (ГХ-МС). Для анализа факторов
формирования МОНЧ проводилась спектрофотометрическая оценка
оптической плотности (ОП) растворов, инкубированных при различном
содержании солей кальция, фосфора, и сыворотки. Токсичность МОНЧ для
эндотелиальных клеток in vitro оценивалась посредством фазово-контрастной
микроскопии, ПЭМ, проточной цитометрии (ПЦ), MTT (3-(4,5-диметилтиазол-
2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид)-теста и иммуноферментного анализа
(ИФА). Для оценки вызываемой МОНЧ эндотелиотоксичности in vivo
использовалась модель ангиопластики аорты крысы с применением баллона
для коронарной ангиопластики с дальнейшей окраской эксплантированных
брюшных аорт гематоксилин-эозином и по ван Гизону и оценкой толщины
интимы и медии. С целью оценки способности МОНЧ вызывать прямую
кальцификацию тканей использовалась модель кальцификации
бычьего/свиного перикарда in vitro и проведена окраска по Коссу и
ализариновым красным эксплантированных брюшных аорт с той же животной
модели, что использовалась для оценки эндотелиотоксичности. Наконец, для
оценки конформационных изменений антикальцифицирующих белков были
искусственно синтезированы МОНЧ, содержащие лишь один
антикальцифицирующий белок, и использованы спектроскопия кругового дихроизма, анализ антикальцифицирующей функции и анализ преципитации. Для количественного анализа результатов экспериментов применялись классические методы статистической обработки.
Анализ литературы по теме диссертации, выделение естественных МОНЧ
из атеросклеротических бляшек, искусственный синтез МОНЧ,
декальцификация МОНЧ, эксперименты по анализу факторов формирования МОНЧ, эксперименты на клеточных культурах, гистологический анализ, эксперименты по анализу конформационных изменений антикальцифирующих
белков, оценка результатов и статистическая обработка данных, а также написание статей и диссертации выполнены лично автором.
Эксперименты по оценке морфологии, минерального и органического состава МОНЧ были проведены совместно с сотрудниками Научно-аналитического центра исследования химического состава и структуры углеродистых веществ ФГБУН Институт углехимии и химического материаловедения СО РАН (г. Кемерово): канд. хим. наук. О. С. Ефимовой и канд. хим. наук А. Н. Поповой. Эксперименты на лабораторных животных и эксперименты на модели кальцификации перикарда in vitro были проведены совместно с сотрудниками ФГБНУ «НИИ комплексных проблем сердечнососудистых заболеваний» (г. Кемерово): канд. биол. наук Е. А. Великановой, канд. биол. наук Т. В. Глушковой и канд. мед. наук Д. Е. Филипьевым.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Естественные и искусственные минерало-органические наночастицы морфологически и химически идентичны и должны рассматриваться как кальций-фосфатные бионы.
-
Роль кальций-фосфатных бионов в развитии атеросклероза двояка: с одной стороны, они обладают токсичностью для эндотелиальных клеток, способствуя апоптозу и снижая жизнеспособность эндотелиальных клеток, индуцируя синтез проатеросклеротических цитокинов интерлейкина-6 и интерлейкина-8 и вызывая гиперплазию интимы брюшной аорты крыс, с другой - являются механизмом защиты от гиперкальциемии/гиперфосфатемии, приводящей к прямой кальцификации тканей.
Степень достоверности результатов
О достоверности результатов диссертационного исследования
свидетельствуют достаточный объем экспериментального материала, широкий спектр проведенных лабораторных исследований, неоднократно повторенные испытания in vitro, использование современных методов исследования и статистической обработки полученных результатов.
Апробация материалов диссертации
Результаты настоящего исследования доложены и обсуждены на V Ежегодной научной сессии молодых ученых Кузбасса «Наука-практике» (10-11 июня 2015, г. Кемерово), VIII Европейской конференции по биологическим и медицинским наукам (5 декабря 2015, г. Вена), L Международной научно-практической конференции «Современная медицина: актуальные вопросы» (7 декабря 2015, г. Новосибирск), XLV Международной научно-практической
конференции «Научная дискуссия: вопросы медицины» (12 января 2015, г. Москва).
Цитопатические эффекты
Классический путь получения МОНЧ был разработан Kajander с соавт. [80, 103] и в дальнейшем оптимизирован Cisar с соавт. [6]. Для индукции формирования МОНЧ необходимо инкубировать предварительно отфильтрованный (фильтры с порами 0,22 мкм) раствор, перенасыщенный ионами кальция и фосфора, в течение 4-8 недель в среде DMEM или RPMI-1640 с 10% фетальной бычьей сывороткой (ФБС, опционально -облученная) или любой другой биологической жидкостью в условиях клеточного культивирования (37C; 5–10% CO2/90–95% воздуха в асептических условиях) [6, 80, 103]. Существует два пути получения перенасыщенного ионами кальция и фосфора раствора: 1) гомогенизация кальцифицированной ткани [80, 103]; 2) добавление солей кальция и фосфора в большой концентрации [6, 33, 60, 117]. Кроме того, возможно получать МОНЧ в бессывороточных условиях [11, 80, 90, 98, 101-103, 141]. Альтернативный вариант синтеза МОНЧ основан на добавлении фосфатидилинозитола (до 200 мкг/мл), растворенного в хлороформе или воде, в DMEM/RPMI-1640 с или без 10% ФБС/-облученной ФБС [6]. Стоит отметить, что пенициллин и стрептомицин, обычно добавляемые к культуральной среде для профилактики бактериальной контаминации, не ингибируют формирование МОНЧ [75, 124]. Существует две основных детерминанты формирования МОНЧ: повышение концентрации сыворотки, альбумина и фетуина-А ингибирует этот процесс, в то время как повышение концентрации кальция и фосфора ускоряет его [23, 33, 60, 117]. После 4-8 недель инкубации на дне культурального флакона можно наблюдать белый преципитат [6, 80, 103]. Кроме того, возможна дальнейшая инкубация полученных МОНЧ в свежей культуральной среде [6, 80, 103]. Однако, чтобы убедиться в осаждении МОНЧ всех размеров, необходимо центрифугирование при 60 000 x g.
МОНЧ могут быть визуализированы посредством СЭМ, ПЭМ или АСМ как сферические частицы диаметром 500 нм, формирующие характерные скопления и состоящие из углерода, азота, кислорода, кальция и фосфора в соответствии с данными ЭДРС [33, 60, 79, 80, 103, 108, 117]. Форма и структура МОНЧ в некоторой степени зависит от биологической жидкости, в которой они были инкубированы [23, 117], но также зависит и от ее концентрации [112]. Кривая распределения размерности МОНЧ в растворе, определенная методом ДРС, имеет пик в диапазоне от 160 до 300 нм [5, 27, 112, 143], но этот параметр зависит от времени инкубации, биологической жидкости и ее концентрации [23, 112]. Стоит отметить, что МОНЧ, выделенные из ФБС [33, 60, 80, 103, 117], сыворотки здоровых субъектов [33, 60, 117] и искусственно синтезированные МОНЧ [33, 60, 117] обладают сходной морфологией, элементным и минеральным составом. При помощи РД, Фурье-ИКС и микро-Рамановской спектроскопии (МРС) было показано, что вышеуказанные МОНЧ имеют формулу Ca10(PO4)6(OH)2, что соответствует гидроксиапатиту [33, 60, 117].
Белковый состав МОНЧ обычно исследуется ДСН-ПААГ с последующим специфическим окрашиванием [5, 6, 23, 27, 33, 49, 57, 59, 60, 82, 88, 98, 101, 112, 116, 117], времяпролетной матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией-масс-спектрометрией (МАЛДИ-ВП-МС) [33, 101, 116, 117] или жидкостной хроматографией-тандемной масс-спектрометрией (ЖХ МС/МС) [5, 23, 37, 112]. Электрофоретический паттерн МОНЧ свидетельствует о наличии в них компонентов из биологической жидкости, которые адсорбируются на их поверхности [6, 117]. Молекулярные массы полипептидов, идентифицируемые на геле, варьируют от 18 до 96 кДа [5, 6, 23, 27, 33, 49, 57, 59, 60, 82, 88, 98, 101, 112, 116, 117]. Данные ДСН-ПААГ со специфическим окрашиванием, МАЛДИ-ВП-МС и ЖХ-МС/МС показывают, что тремя основными белками МОНЧ являются альбумин, фетуин-А и аполипопротеин А1 [5, 23, 33, 37, 88, 101, 112, 117]. Это было подтверждено ИБ [45, 59, 101, 117] и иммуноэлектронной микроскопией (ИЭМ) [45, 101]. Более того, фетуин-А обладает большей авидностью к МОНЧ в сравнении с альбумином [60]. Как и в случае с минеральным составом, МОНЧ, выделенные из ФБС [33, 60, 80, 103, 117], сыворотки здоровых субъектов [33, 60, 112, 117] и искусственно синтезированные МОНЧ [33, 60, 112, 117] обладают сходным белковым составом по данным ДСН-ПААГ со специфическим окрашиванием [117], МАЛДИ-ВП-МС [33] и ЖХ-МС/МС [112]. Адсорбция белков к МОНЧ не зависит от их размера и кривизны [112], однако растворение и повторная преципитация изменяют способность МОНЧ связывать белки [5]. В целом, белковый состав МОНЧ отражает белковый состав окружающих биологических жидкостей [37, 117]. Липидный состав МОНЧ по-прежнему остается неясным, хотя были предприняты попытки его определения колориметрическим ферментативным тестом [117]. В то же время при помощи ИЭМ удалось обнаружить, что МОНЧ могут содержать окисленные липиды [51]. Все основные свойства МОНЧ представлены в табл. 1.
Существовало множество споров на предмет геномного состава МОНЧ [32, 80, 98, 103]. Хотя МОНЧ, инкубируемые в сыворотке и бессывороточных условиях, делятся в течение как минимум первых 5 дней инкубации [90], никому не удалось выделить из них какой-либо специфичной последовательности нуклеотидов [59, 110]. Поэтому дискуссии о МОНЧ как о живых организмах (нанобактериях) были прекращены. Однако было показано [151], что взаимодействия некоторых вирусов с минералами также могут формировать наноструктуры фосфата кальция.
Фибробласты линии 3T6, инкубированные вместе с МОНЧ в течение 48 часов, интернализировали данные частицы, что вызывало образование больших вакуолей; окраска по Коссу также выявила очаги внутриклеточной кальцификации [80]. Кроме того, МОНЧ ингибировали пролиферацию и вызывали апоптоз этой линии фибробластов [55]. Было показано, что МОНЧ токсичны для амеб, макрофагов линии THP-1 и клеток раковой линии HeLa [101]. В одном из исследований МОНЧ вызывали вакуолизацию, набухание митохондрий и растворение ядерной мембраны в клетках эпителия почечных канальцев линии HK-2 [53]. Помимо этого, экспозиция МОНЧ приводила к повышению уровня пероксида водорода и малонового диальдегида, а также снижению активности Na+/K+ и Ca2+/Mg2+ АТФаз в клетках данной линии [53]. Известно, что крысиные макрофаги линии RAW264.7 и человеческие макрофаги линии THP-1 интернализируют МОНЧ независимо от их размера, причем МОНЧ могут вызывать разрыв фагосом и таким образом попадать в цитоплазму [112]. МОНЧ вызывают апоптоз крысиных макрофагов линии RAW 264.7 через активацию каспазы-3, а также ингибируют их пролиферацию [61]. Кроме того, в данных клетках МОНЧ индуцируют экспрессию и выделение фактора некроза опухоли-, интерлейкина-1, индуцибельной нитрооксидсинтазы и внутриклеточного 8-изо-простагландина F2, которые являются провоспалительными маркерами либо маркерами окислительного стресса [61]. МОНЧ диаметром 1 мкм вызывают синтез значительного количества активных форм кислорода, активируют каспазу-1 и повышают уровень выделяемого интерлейкина-1 в человеческих макрофагах линии THP-1; в то же время частицы диаметром 300 нм не вызывают таких эффектов [112]. Наконец, МОНЧ интернализируются и вызывают вакуолизацию, набухание митохондрий, конденсацию хроматина, фрагментацию ядерной мембраны, растворение ядра, аутофагию и цитолиз клеток раковых линий MDA-MB-231 и JAR. Кроме того, экспозиция МОНЧ способствовала апоптозу путем повышения экспрессии белков Bax и Fas [42, 43] и замедляла пролиферацию данных клеток [42]. Основные свойства МОНЧ представлены в таблице
Хронический простатит/синдром хронической тазовой боли (ХП/СХТБ), тестикулярный микролитиаз (ТМ) и интерстициальный цистит/синдром болезненного мочевого пузыря (ИЦ/СБМП)
Спустя пять недель после операции все животные умерщвлялись передозировкой углекислого газа. Сегменты брюшной аорты крыс ( 2,5 см) вырезались, фиксировались в 10% забуференном формалине (Electron Microscopy Sciences), заключались в парафин (Electron Microscopy Sciences), и на микротоме выполнялись срезы (3 мкм), которые помещались на предметные стекла с поли-L-лизиновым покрытием (Thermo Scientific). Для окраски ализариновым красным проводилась нарезка предварительно замороженных тканей на криотоме (Microm HM 525, Thermo Scientific). После окраски гематоксилин-эозином, по ван Гизону, по Коссу и ализариновым красным срезы с каждой аорты оценивались световой микроскопией (Axioscop 40 Lab Microscope, Carl Zeiss) для оценки гиперплазии интимы, вычисления отношения интимы к медии и оценки наличия отложений солей кальция. Толщина интимы и медии оценивалась с использованием программы ImageJ (National Institutes of Health). На каждую окраску оценивалось по три среза с каждой крысы с вычислением средних значений для последующего анализа.
Для депарафинизации заключенные в парафин срезы нагревались в термостате до 60C в течение 20 мин и трижды обрабатывались ксилолом (Electron Microscopy Sciences) в течение 10 мин. Далее проводилась обработка 100%, 95%, 70%, 50% и 30% этанолом (1 мин каждый раз), 0,9% NaCl в течение 2 мин, ФСБ в течение 2 мин, и образцы промывались проточной водой. Окраска гематоксилин-эозином проводилась следующим образом: депарафинизированные образцы обрабатывались раствором гематоксилина Харриса (Electron Microscopy Sciences) в течение 1 мин, промывались проточной водой, обрабатывались 1% водным раствором эозина Y (Electron Microscopy Sciences) в течение 1 мин, промывались проточной водой, обезвоживались в батарее спиртов возрастающей концентрации (50%, 70%, 80%, дважды 95% и дважды 100%) и дважды промывались ксилолом. Для хранения образцов и световой микроскопии срезы заключались в среду Permount (Electron Microscopy Sciences).
Для окраски по ван Гизону депарафинизированные срезы обрабатывались рабочим раствором гематоксилина Вейгерта (Electron Microscopy Sciences) в течение 10 мин, промывались проточной водой, обрабатывались в красителе ван Гизона (Electron Microscopy Sciences) в течение 3 мин, промывались дистиллированной водой и обезвоживались в батарее спиртов возрастающей концентрации (дважды 95% и дважды 100% этанол), дважды обрабатывались ксилолом и заключались в среду Permount.
Для окраски по Коссу депарафинизированные срезы обрабатывались 5% раствором нитрата серебра (Electron Microscopy Sciences) в течение 60 мин перед 100 Вт лампой с зеркалом для отражения света. Далее они трижды промывались дистиллированной водой, обрабатывались 5% раствором тиосульфата натрия (Electron Microscopy Sciences) в течение 5 мин, промывались один раз проточной и дважды – дистиллированной водой, обрабатывались 5% раствором Nuclear Fast Red (Electron Microscopy Sciences) в течение 5 мин, промывались один раз проточной и дважды – дистиллированной водой, обезвоживались (трижды 100% этанол), дважды обрабатывались ксилолом и заключались в среду Permount.
Для пробоподготовки образцов к спектроскопии кругового дихроизма и анализу антикальцифицирующей функции БСА (45 мл, 50 мг/мл в стерильной бидистиллированной воде) инкубировался с 5 мл раствора БСА-КФБ (2 МкФ) или стерильной бидистиллированной воды. Смесь помещалась в пробирки Falcon при 37C, 5% CO2 и высокой влажности (MCO-18AIC, Sanyo) на 1 неделю. ЧСФ (9 мкл, 1 мкг/мкл в стерильной бидистиллированной воде) инкубировался с 1 мкл раствора ЧСФ-КФБ (2 МкФ) или стерильной бидистиллированной воды. Смесь помещалась в 1,66 мл пробирки при 37C, 5% CO2 и высокой влажности (MCO-18AIC, Sanyo) на 1 неделю. Затем все растворы замораживались при -40C в течение суток и далее лиофилизировались в течение суток (FreeZone Plus 2.5 Liter Cascade Benchtop Freeze Dry System, Labconco). После лиофилизации приблизительно половина порошка подвергалась декальцификации 0,5M дигидратом динатриевой соли ЭДТА в течение 6 ч при КТ, снова замораживалась в течение суток при -40C и далее лиофилизировалась в течение суток. Все образцы готовились в дублях.
Спектры записывались при 20C на спектрометре кругового дихроизма Jasco J-600 (Jasco) с использованием кварцевых кювет толщиной 1 мм. Спектры БСА измерялись на длине волны между 185 и 270 нм со скоростью сканирования 50 нм/мин, разрешении и ширине полосы пропускания 1 нм и чувствительности 50 миллиградусов. Спектры ЧСФ измерялись при тех же самых настройках, исключая чувствительность, которая составила 5 миллиградусов. Каждый спектр представлял собой среднее 3 или 5 последовательных сканирований для БСА и ЧСФ соответственно. Концентрации БСА и ЧСФ составили 0,01 мкг/мкл и 0,055 мкг/мкл соответственно.
С целью анализа антикальцифицирующей функции лиофилизированный БСА, инкубированный с раствором БСА-КФБ (2 МкФ) или со стерильной бидистиллированной водой с или без последующей декальцификации растворялся в среде DMEM до концентрации 500 мкг/мл, и базовые стерильные растворы CaCl2 и Na2HPO4 12H2O затем разбавлялись в этом растворе до равных концентраций в 0,1, 0,2, 0,5, 1 и 2 мМ. Аналогичная процедура проводилась с лиофилизированным ЧСФ (10 мкг/мл). Спустя 48 ч инкубации при 4C измерялась ОП на длине волны 650 нм для оценки антикальцифицирующей способности опытного и контрольного БСА и ЧСФ. Все измерения проводились в дублях с использованием средних значений для последующего анализа.
Для анализа преципитации белка из раствора нативный БСА (45 мл, 50 мг/мл в стерильном 0,9% NaCl) инкубировался с 5 мл раствора БСА-КФБ (2 МкФ) или стерильного 0,9% NaCl. Смесь помещалась в пробирки Falcon при 37C, 5% CO2 и высокой влажности (MCO-18AIC, Sanyo) на 1 неделю. Концентрация растворимого белка оценивалась сразу же после раскапывания, на 1, 3, 5 и 7 день по методу Брэдфорда. Для приготовления реагента Брэдфорда 100 мг красителя Кумасси бриллиантового синего G-250 (Sigma-Aldrich) растворялись в 50 мл 95% этанола и далее смешивались со 100 мл 85% ортофосфорной кислоты (Sigma-Aldrich). Реагент Брэдфорда разбавлялся бидистиллированной водой до 1 л после полного растворения красителя. Для количественной оценки белка 200 мкл 0,9% NaCl или образца (предварительно разведенного в 0,9% NaCl в соотношении 1:100) смешивались с 2,5 мл реагента Брэдфорда и инкубировались при КТ в течение 5 мин. Измерение результата проводилось на длине волны 595 нм (GENESYS 6 UV-Vis, Thermo Scientific). Калибровочная кривая рассчитывалась для БСА в концентрации 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125, 0,0625 и 0,03125 мг/мл. Все измерения проводились в дублях с использованием средних значений для последующего анализа.
Статистический анализ проводился при помощи программы GraphPad Prism (GraphPad Software). Оценка нормальности распределения оценивалась по критериям д Агостино-Пирсона и Колмогорова-Смирнова. Данные были представлены с помощью среднего и размаха. Две независимые группы сравнивались по двустороннему t-критерию Стьюдента. Поправка на множественные сравнения проводилась вычислением средней доли ложных отклонений гипотез (false discovery rate). P-значения или q-значения в случае вычисления средней доли ложных отклонений гипотез (q-значения – это P-значения после поправки с использованием этого метода) 0,05 признавались статистически значимыми.
Определение белкового состава МОНЧ
Таким образом, было показано, что КФБ обладают эндотелиотоксичностью. Они способствуют апоптозу и снижают жизнеспособность эндотелиальных клеток, индуцируют синтез интерлейкина-6 и интерлейкина-8, являющихся проатеросклеротическими цитокинами [69, 76], а также вызывают гиперплазию интимы in vivo. Эти эффекты могут быть обусловлены интернализацией данных частиц эндотелиальными клетками.
В то же время представленные эксперименты имеют ряд ограничений. Во первых, клеточная линия EA.hy 926 является гибридомой, которая была получена путем слияния эндотелиальных клеток пупочной вены человека с клетками аденокарциномы легкого линии A549 [52]. Хотя она сохраняет основные морфологические и функциональные особенности венозных эндотелиальных клеток человека [52], это все же: 1) венозные, а не артериальные эндотелиальные клетки; 2) они потеряли способность синтезировать некоторые молекулы клеточной адгезии, что затрудняет оценку их секреторного профиля. В то же время, у гибридомы есть как минимум одно преимущество: она значительно более устойчива к цитотоксическим агентам. Поэтому, можно сделать вывод, что КФБ действительно обладают цитотоксическим действием. Во-вторых, возможно, что эндотелиотоксичность КФБ обусловлена обыкновенным физическим повреждением клеточных мембран или органелл, которое может быть вызвано также и другими бионами. Хотя в теории это и возможно, не существует доказательств того, что атеросклероз может быть ассоциирован с перенасыщением элементами, отличными от кальция и фосфора. Поэтому включать другие бионы в дизайн данного исследования было нерелевантно.
Все проведенные эксперименты подтверждают гипотезу о том, что КФБ оказывают токсические эффекты на эндотелиальные клетки, что, в свою очередь, определяет их патогенность, поскольку это одно из главных звеньев в развитии атеросклероза [54, 147]. Полученные данные согласуются с результатами предыдущих исследований [42, 43, 53, 55, 61, 80, 101, 112], которые обнаружили выраженную цитотоксичность КФБ для других клеточных линий. Кроме того, помимо прямой цитотоксичности, КФБ также способствуют выработке интерлейкина-6 и интерлейкина-8, которые известны как проатеросклеротические цитокины [69, 76]. Поэтому КФБ могут быть начальным триггером атеросклероза и способствовать развитию местного воспаления путем индукции синтеза проатеросклеротических цитокинов.
Для оценки способности КФБ вызывать кальцификацию напрямую были проведены эксперименты на модели кальцификации перикарда in vitro. Не удалось обнаружить кальцификации как бычьего, так и свиного перикарда, экспонированного КФБ; в то же время экспозиция CaCl2 и Na2HPO4 12H2O в равных концентрациях 1 или 10 мМ вызывала образование отложений солей кальция (Рисунок 24).
Данные результаты позволили сделать вывод, что именно гиперкальциемия и гиперфосфатемия, а не КФБ вызывают прямую кальцификацию тканей. Более того, именно КФБ нейтрализовывали в эксперименте вредоносные эффекты перенасыщения солями кальция и фосфора. Это подтверждает гипотезу Wu, Young и их соавторов [23, 33, 60, 117], которые предположили, что КФБ, образующиеся в биологических жидкостях в результате перенасыщения ионами кальция и фосфора, могут быть физиологическим механизмом, регулирующим функции, транспорт и выведение этих элементов в организме человека. Также можно предположить, что кальций-фосфатные частицы, которые были обнаружены в тканях органов сердечно-сосудистой системы рядом научных групп [1, 8, 34, 49, 57, 83, 99, 109, 149], формируются там как результат гиперкальциемии и гиперфосфатемии и поэтому должны рассматриваться как предшественники, а не как индукторы кальцификации.
Наконец, было исследовано, способны ли КФБ изменять конформацию антикальцифицирующих белков, из которых были выбраны БСА и ЧСФ, поскольку они представляют два различных механизма связывания кальция [144]. Антикальцифицирующее действие ЧСФ обусловлено отрицательными зарядами -слоя домена D1, которые занимают места фосфатных группировок в кристаллах гидроксиапатита, что приводит к высокоаффинному связыванию кальция [144]. В то же время БСА связывает ионизированный кальций посредством множественных отрицательно заряженных аминокислот на своей поверхности [144]. Таким образом, ЧСФ связывает фосфат кальция с высокой аффинностью, в то время как БСА связывает свободный кальций с низкой аффинностью [144].
Для исключения влияния каких-либо других белков на результат был проведен ряд экспериментов с КФБ, содержащих только БСА или ЧСФ. СЭМ показала, что морфология БСА-КФБ и ЧСФ-КФБ сходна с морфологией обычных КФБ (Рисунок 26).
Для определения конформации были измерены спектры кругового дихроизма БСА и ЧСФ, инкубированных с раствором БСА-КФБ, ЧСФ-КФБ или стерильной бидистиллированной водой с или без последующей декальцификации. Не было выявлено значимых различий между спектрами (Рисунок 27). Рисунок 27 – Спектроскопия кругового дихроизма БСА и ЧСФ, инкубированных с раствором БСА-КФБ, ЧСФ-КФБ или стерильной бидистиллированной водой с или без последующей декальцификации ЭДТА Далее была изучена антикальцифицирующая функция БСА и ЧСФ. Ее анализ также не показал какого-либо значимого различия между образцами (Рисунок 28).
Анализ антикальцифицирующей функции БСА и ЧСФ, инкубированных с раствором БСА-КФБ, ЧСФ-КФБ или стерильной бидистиллированной водой с или без последующей декальцификации ЭДТА Также было исследовано, способны ли КФБ индуцировать преципитацию БСА из раствора, однако каких-либо значимых различий между образцами обнаружить не удалось (Рисунок 29). Рисунок 29 – Анализ преципитации БСА из раствора при инкубации с БСА-КФБ Таким образом, не было выявлено никаких структурных или функциональных изменений в БСА или ЧСФ после экспозиции КФБ. Поэтому был сделан вывод, что КФБ не изменяют конформацию антикальцифицирующих белков. Резюме КФБ способствуют апоптозу и снижают жизнеспособность эндотелиальных клеток, индуцируют синтез проатеросклеротических цитокинов интерлейкина-6 и интерлейкина-8 и вызывают гиперплазию интимы брюшной аорты крыс. Эти эффекты могут быть обусловлены интернализацией данных частиц эндотелиальными клетками. В то же время КФБ не вызывают прямую кальцификацию бычьего/свиного перикарда и брюшной аорты крыс, а также не изменяют структуру или функцию антикальцифицирующих белков альбумина и фетуина-А. Оценивая полученные результаты, можно сделать вывод, что КФБ являются механизмом защиты от гиперкальциемии/гиперфосфатемии, а единственным выявленным на данный момент механизмом их патогенности является токсичность для эндотелиальных клеток. Это определяет значимость КФБ в развитии атеросклероза, поскольку эндотелиальная дисфункция является одним из важнейших звеньев данного процесса.
Определение токсичности КФБ и прямой кальцификации тканей in vivo
Настоящая работа была проведена с целью оценки структуры естественных и искусственных МОНЧ, изучения факторов формирования МОНЧ и исследования указанных потенциальных механизмов патогенности МОНЧ.
На начальном этапе было осуществлено выделение МОНЧ из атеросклеротических бляшек и искусственный синтез МОНЧ. СЭМ, ПЭМ и АСМ показали идентичность морфологии, а измерение размерности в растворе методом ДРС - идентичность распределения размерности обоих указанных типов МОНЧ. Дальнейшая оценка минерального и органического состава при помощи ЭДРС, РД, Фурье-ИКС, ДСН-ПААГ с последующим окрашиванием нитратом серебра, ИБ, окраски Hoechst 33342, спектрофотометрической оценки ДНК и ГХ-МС выявила лишь незначительные различия в их липидном составе с идентичностью всех остальных компонентов. Был сделан вывод, что оба типа МОНЧ идентичны друг другу и представляют собой сферические частицы губчатой структуры диаметром 100-500 нм, состоящие из гидроксиапатита и белков (в основном антикальцифицирующих белков альбумина и фетуина-А) и адсорбирующие двуспиральную ДНК из окружающей среды. Стоит также отметить, что не удалось обнаружить никаких специфических структур при попытке выделения предполагаемых декальцифицированных МОНЧ.
Далее был проведен анализ факторов формирования МОНЧ. Было показано, что из шестнадцати атеросклеротических бляшек МОНЧ были выделены лишь в одиннадцати. Кроме того, не удалось выделить МОНЧ из экстрактов внутренней грудной артерии, которая была определена как отрицательный контроль вследствие того, что она практически никогда не поражается атеросклерозом [77, 152]. В то же время МОНЧ были успешно синтезированы искусственно в результате перенасыщения культуральной среды растворимыми солями кальция и фосфора во всех повторах этого эксперимента. Было продемонстрировано, что увеличение концентрации солей кальция и фосфора ускоряет формирование МОНЧ, а увеличение концентрации сыворотки, содержащей антикальцифицирующие белки – напротив, замедляет его. Таким образом, решающим фактором, определяющим формирование МОНЧ, является отношение концентрации солей кальция и фосфора к концентрации сыворотки.
Результаты всех данных экспериментов показали, что структура и факторы формирования естественных и искусственных МОНЧ идентичны и соответствуют таковым для КФБ. Кроме того, декальцификация МОНЧ приводит к их разрушению без получения каких-либо специфических структур. Поэтому был сделан вывод, что данные наночастицы являются не «кальцифицирующимися», как это было предположено раньше [81], а «кальций-фосфатными», или, для большей точности и ясности, КФБ. По этой причине данный термин был использован относительно всех последующих экспериментов.
Проведенная при помощи ФКМ, ПЦ, MTT-теста и ИФА серия экспериментов in vitro показала, что КФБ вызывают апоптоз, снижают жизнеспособность эндотелиальных клеток и способствуют синтезу ими интерлейкина-6 и интерлейкина-8, являющихся проатеросклеротическими цитокинами [69, 76]. Посредством ПЭМ было продемонстрировано, что морфологическим субстратом данных эффектов может быть интернализация КФБ эндотелиальными клетками. Кроме того, при окраске гематоксилин-эозином и по ван Гизону удалось обнаружить гиперплазию интимы брюшной аорты при введении КФБ в кровеносное русло подопытных крыс. Вследствие этого был сделан вывод, что КФБ обладают токсичностью для эндотелиальных клеток.
Для оценки способности КФБ вызывать прямую кальцификацию тканей использовалась модель кальцификации перикарда in vitro и использована та же животная модель, что и для оценки эндотелиотоксичности. При окраске по Коссу и ализариновым красным не удалось обнаружить кальцификации бычьего/свиного перикарда или брюшной аорты крыс, экспонированных КФБ; в то же время экспозиция бычьего/свиного перикарда растворам, перенасыщенным солями кальция и фосфора, вызывала образование отложений солей кальция. Данные результаты позволили сделать вывод, что именно гиперкальциемия и гиперфосфатемия, а не КФБ вызывают прямую кальцификацию тканей. Соответственно, КФБ, образующиеся в биологических жидкостях в результате перенасыщения ионами кальция и фосфора, могут быть защитным механизмом, регулирующим функции, транспорт и выведение этих элементов в организме человека. Также можно предположить, что кальций-фосфатные частицы, которые были обнаружены в тканях органов сердечно-сосудистой системы [1, 8, 34, 49, 57, 83, 99, 109, 149], формируются там как результат гиперкальциемии и гиперфосфатемии и поэтому должны рассматриваться как предшественники, а не как индукторы кальцификации.
Наконец, было исследовано, способны ли КФБ изменять конформацию антикальцифицирующих белков. Для исключения влияния каких-либо других белков на результат был проведен ряд экспериментов с искусственно синтезированными КФБ, содержащих только БСА или ЧСФ, которые представляют собой два различных антикальцифицирующих механизма. Спектроскопия кругового дихроизма, анализ антикальцифицирующей функции и анализ преципитации не выявили никаких структурных или функциональных изменений в БСА или ЧСФ после экспозиции КФБ независимо от процедуры декальцификации. Поэтому был сделан вывод, что КФБ не изменяют конформацию антикальцифицирующих белков.
Таким образом, результаты функциональных экспериментов позволяют сделать вывод, что МОНЧ (КФБ), являясь механизмом защиты от гиперкальциемии/гиперфосфатемии, тем не менее обладают эндотелиотоксичностью и могут быть начальным триггером атеросклероза, повреждая эндотелий и способствуя развитию местного воспаления путем индукции синтеза проатеросклеротических цитокинов.