Содержание к диссертации
Введение
Общая характеристика работы 6
1. Обзор литературы 13
1.1 Болезнь Паркинсона, общая информация 13
1.1.1 История изучения БП 13
1.2 Альфа-синуклеин 21
1.2.1 Альфа-синуклеин в дофаминовой нейротрансмиссии 24
1.2.2 Альфа-синуклеинопатии 31
1.2.3 Болезнь Паркинсона – форма альфа-синуклеинопатии. 32
1.2.4 Деменция с рассеянными тельцами Леви 37
1.2.5 Мультисистемная атрофия. 39
1.2.6 Болезнь Галевронда-Шпатца
1.3 Моделирование альфа-синуклеинопатий в генетически модифицированных животных 43
1.4 Формирование популяций дофаминергических нейронов 50
2. Материалы и методы исследования 56
2.1 Экспериментальные животные 56
2.2 Генотипирование животных.
2.2.1 Конвенционная полимеразная цепная реакция 58
2.2.2 Электрофорез ДНК в агарозном геле. 61
2.2.3 ПЦР в реальном времени 61
2.2.4 Анализ уровня экспрессии РНК. 63
2.2.5 Анализ белков. Приготовление образцов для анализа тотального белка. 64
2.2.6 Денатурирующии гель-электрофорез. 65
2.2.7 Иммуноблоттинг 65
2.2.8 Антитела 66
2.3 Исследование пролиферативной активности. 67
2.3.1 Введение 5-бром-2 -дезоксиуридина 67
2.3.2 Идентификация BrdU-положительных клеток. 67
2.4 Приготовление гистологических препаратов 67
2.4.1 Фиксация эмбрионов мыши. 67
2.4.2 Фиксация тканей мозга мышей раннего постнатального возраста. 68
2.4.3 Фиксация тканей мозга взрослых мышей. 68
2.5 Имммуногистохимическое окрашивание. 69
2.6 Морфометрический анализ дофаминергических нейронов в ядрах среднего мозга. 71
2.7 Статистическая обработка данных. 73
3. Результаты исследования и их обсуждение 74
3.1 Морфометрический анализ дофаминергических нейронов у мышей с конститутивной инактивацией гена альфа-синуклеина
3.1.1 Анализ развивающихся дофаминергических нейронов Чёрной субстанции (ЧС) и Вентральной области покрышки (ВОП) в эмбриогенезе. 76
3.1.2 Анализ дофаминергических нейронов чурной субстанции и вентральной области покрышки в раннем постнатальном периоде. 85
3.2 Разработка линии мышей для регулируемого тканеспецифичного нокаута гена альфа-синуклеина . 87
3.2.1 Характеристика исходной линии [SNCAflox/flox neoFRT/+].90
3.2.1.1 Анализ уровня альфа-синуклеина в тканях мышей линии [SNCAflox/flox neoFRT/+] 90
3.2.1.2 Удаление гена neo из генома [SNCAflox/flox neoFRT/+ ] мышей с помощью FRT рекомбинации. 92
3.2.1.3 Новый генетический нокаут. Конститутивное удаление
второго экзона гена альфа-синуклеина из генома
SNCAflox neo/flox пео мышей с помощью Cre-рекомбинации 96
3.3 Анализ формирования популяций дофаминергических нейронов у мышей новой линии SNCADflox/=flox 100
3.3.1 Морфометрический анализ дофаминергических нейронов у SNCADflox/Dflox мышей в эмбриогенезе 100
3.3.2 Морфометрический анализ дофаминергических нейронов у SNCADflox/Dflox мышей в раннем постнатальном развитии 104
3.3.3 Морфометрический анализ дофаминергических нейронов у взрослых SNCADflox/=flox мышей 104
3.4 Анализ уровня экспрессии гена мультимерина-1, располагающегося в промоторной области альфа-синуклеинаЮб
Практические рекомендации 113
Список использованной литературы 117
- Альфа-синуклеин
- Конвенционная полимеразная цепная реакция
- Разработка линии мышей для регулируемого тканеспецифичного нокаута гена альфа-синуклеина
- Морфометрический анализ дофаминергических нейронов у взрослых SNCADflox/=flox мышей
Введение к работе
Актуальность исследования. Болезнь Паркинсона (БП) - вторoe по
распространенности после болезни Альцгеймера нейродегенеративнoe
заболеваниe, частота встречаемости которого в развитых странax составляет 0,5
- 1 % в возрастной группе от 60 до 65 лет и от 2 до 4% - в возрастной группе
старше 80 лет. Основной патогенетической составляющей БП является потеря
функции и гибель дофаминергических (ДА) нейронов черной субстанции (ЧС).
Молекулярные механизмы специфичности поражения определенных
популяций нейронов нигростриарной системы остаются неизвестными, что
затрудняет разработку патогенетической терапии, поэтому их изучение
является актуальной задачей биомедицинской науки. После того, как было
установлено, что основным компонентом патогистологических включений,
выявляемых в аутопсийном материале больных с БП – телец Леви, является
агрегированный белок а-синуклеин, исключительную актуальность приобрели
исследования роли этого белка в инициации и прогрессии патологических
каскадов, заканчивающихся гибелью ДА нейронов. Мало изученной остается
роль а-синуклеина в формировании различных популяций ДА нейронов на
ранних этапах развития нервной системы. Исследования в данном направлении
затруднены из-за отсутствия адекватных животных моделей нарушения
функции этого белка, поэтому их создание рассматривается в настоящее время,
как одна из важных задач в изучении молекулярных основ патогенеза БП, и
разработка в рамках данного диссертационного исследования новых линий
генетически-модифицированных мышей делает его еще более актуальным.
Цель и основные задачи исследования. Основной целью работы являлось
выявление роли а-синуклеина в формировании различных популяций ДА
нейронов на примере двух анатомических структур, дифференциально
поражающихся при БП. Для достижения этой цели были поставлены
следующие задачи:
1. Исследовать эффект а-синуклеина на формирование популяций ДА
нейронов в ЧС и вентральной области покрышки (ВОП) головного мозга
мышей с конститутивной инактивацией гена а-синуклеина для выявления возможной роли кодируемого им белка в патогенетических механизмах БП.
-
Получить новую независимую модель конститутивного нокаута гена а-синуклеина с минимальными модификациями генома.
-
Провести сравнительное морфометрическое исследование популяций ДА нейронов в ЧС и ВОП на двух независимых линиях мышей с конститутивной инактивацией гена а-синуклеина.
4. Исследовать уровень экспрессии гена мультимерина-1 (Mmnr-1),
регуляторные элементы которого расположены в локусе, затронутом
генетической модификацией, использованной для конститутивной
инактивации гена а-синуклеина.
Научная новизна исследования. Многолетние исследования
патофизиологических аспектов БП показали, что основной анатомической
структурой, подвергающейся нейродегенерации при БП, является ЧС, где у
больных отмечается массированная потеря ДА нейронов, приводящая к
патологии всей нигростриарной системы. В другой анатомической структуре
среднего мозга, содержащей ДА нейроны - ВОП, дегенеративные процессы
при БП выражены в гораздо меньшей степени. Механизм дифференциального
поражения популяций ДА нейронов при БП остается неизвестным. В данном
диссертационном исследовании был использован новый подход для
выявления роли а-синуклеина в процессах дифференциальной гибели ДА
нейронов в ЧС и ВОП: использование линий генетически модифицированных
мышей с конститутивной инактивацией гена а-синуклеина. Результатом
такого исследования явились впервые полученные данные о различном
участии а-синуклеина в процессах раннего формирования популяций ДА
нейронов ЧС и ВОП. С целью характеристики трансгенных животных
моделей, ранее применявшихся для изучения патогенеза БП, впервые был
проведен анализ экспрессии гена Mmnr-1, регуляторные элементы которого
оказались затронутыми генетическими модификациями локуса а-синуклеина.
Результаты, выявившие существенное повышение уровня его экспрессии в
нервной системе, послужили научным обоснованием необходимости создания
новой линии мышей с минимальными модификациями локуса а-синуклеина,
обеспечивающими конститутивную инактивацию этого гена и не
изменяющими активность экспрессии гена Mmnr-1. Такая линия мышей была получена в рамках данной диссертационной работы. Использование созданной линии позволило провести первое репрезентативное сравнительное морфометрическое исследование формирования популяций ДА нейронов в ЧС и ВОП на двух независимых модельных животных системах. Определение роли а-синуклеина в развитии популяций ДА нейронов, дифференциально поражающихся у больных с БП, позволило существенно расширить наши знания о его участии в патогенетических механизмах заболевания. Tеоретическая и практическая значимость работы. Исследованию выраженных патологических изменений, характерных для развитых стадий БП, посвящено гораздо больше работ, чем изучению досимптоматических стадий заболевания, что объясняется крайней ограниченностью адекватных моделей, созданию которых в последнее время придается большое значение. Поэтому созданная в ходе диссертационной работы новая линия мышей с конститутивным нокаутом а-синуклеина, выполненная с минимальными на сегодняшний день модификациями генома, представляет особый научно-практический интерес. Линия может быть использована для изучения механизмов специфического нейродегенеративного процесса при нарушении функции а-синуклеина и выявления потенциальных молекулярных мишеней для разработки патогенетической терапии БП и других а-синуклеинопатий. Благодаря использованию в диссертационном исследовании комбинации оригинальных животных моделей, воспроизводящих ранние события, обусловленные нарушением функции а-синуклеина, удалось получить экспериментальные доказательства различной роли этого белка в формировании популяций ДА нейронов, дифференциально поражаемых при БП, что позволяет рассматривать а-синуклеин в качестве мишени для
разработки методов ранней патогенетической терапии БП.
Положения, выносимые на защиту.
-
Показана модулирующая роль а-синуклеина в формировании популяций ДА нейронов ЧС у генетически модифицированных мышей.
-
Нарушение функции а-синуклеина не влияет на процессы формирования популяции ДА нейронов ВОП - анатомической структуры среднего мозга, в гораздо меньшей степени, чем ЧС, поражаемой при БП.
-
Создана новая линия мышей с конститутивным нокаутом а-синуклеина, имеющая минимальные модификации в локусе этого гена, и позволяющая изучать молекулярные механизмы патогенеза БП.
-
Показано, что генетическая инактивация а-синуклеина у мышей ведет к статистически значимой потере части популяции ДА нейронов ЧС с последующей компенсацией у взрослых животных.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были
представлены на: VII Международной Пироговской научной медицинской
конференции студентов и молодых учёных (Москва, 2012), III Eвропейской
конференции по медицинским и биологическим наукам (Вена, Австрия, 2014),
II Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы
современной медицины» (Екатеринбург 2015), X Юбилейной
Международной научно-практической конференции молодых учёных-медиков (Курск, 2016), Всероссийской конференции молодых учёных, с международным участием «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2016).
Публикации и личный вклад автора. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 6 статеи (из них 4 в списке ВАК) и 5 публикации в сборниках докладов научных конференции. Личное участие автора состоит в выработке научного плана исследований и выполнении экспериментальных работ, вошедших в совместные публикации. Все основные экспериментальные данные диссертационного исследования получены автором лично.
Структура и объём работы. Диссертация содержит: введение, обзор
литературы, материалы и методы, результаты исследований и их обсуждение, выводы и библиографический указатель печатных работ на русском (14) и иностранных языках (163). Диссертация изложена на 142 страницах машинописного текста, содержит 1 таблицу и 31 рисунок.
Альфа-синуклеин
В истории исследования БП можно выделить несколько четко выраженных этапов, которые качественно развивали наши знания об этиологии и патогенезе этого заболевания. Джеймс Паркинсон первым описал клинические симптомы БП в 1817 году. Он выделил четыре группы патологических изменений: тремор покоя, брадикинезию, ригидность и постуральную неустойчивость как основные симптоматические признаки данной нозологической формы [Lees A.J., 2007]. По мере прогрессирования заболевания к моторной дисфункции часто присоединяются и немоторные нарушения нервной системы, включающие депрессию, тревожное состояние и когнитивную дисфункцию вплоть до деменции [Гусев Е.И. et al., 2004]; [Яхно Н.Н. et al., 2006]. Вторым событием, ознаменовавшим новый этап в изучении патогенеза БП, явились работы Фрица Генриха Леви, который в лаборатории Алоиса Альцгеймера проводил гистологические исследования аутопсийного материала больных, умерших от дрожательного паралича [Goedert M. et al., 2013]. В третьем томе справочника по неврологии за 1912 год им были опубликованы первые результаты патогистологического анализа головного мозга 25 пациентов с БП, в которых Леви описывал обнаруженные им новые патогистологические структуры. [Goedert M. et al., 2013]. Леви обнаружил специфические внутриклеточные тельца в стволе мозга у больных с БП – большие эозинофильные структуры, состоящие из плотно уложенных белковых филаментов, находящихся в цитоплазме. Позже Леви были модифицированы методики приготовления и анализа гистологических срезов и существенно увеличен размер выборки. В ходе дальнейших исследований им были описаны характерные включения (тельца) в различных анатомических структурах мозга: в клетках двигательных ядер блуждающего нерва, базального ядра Мейнерта, бледного шара, бокового и перивентрикулярного ядер таламуса. Действительно, обнаружение телец Леви было подтверждено современными методами у больных с БП в этих и других структурах, например, в голубом пятне (locus coeruleus) и дорзальном ядре блуждающего нерва [Wakabayashi K. et al., 1999a] и в коре мозжечка [Ikeda K. et al., 1978] . В 1923 году Леви опубликовал объемную монографию на 673 страницы, посвященную исследованиям дрожательного паралича. Однако и при анализе экспериментального материала, и в сделанных выводах он не придавал принципиально важного значения описанным им включениям и не нашел им соответствующего места в патогенезе дрожательного паралича. И что особенно следует подчеркнуть – Леви практически не исследовал область черной субстанции. Это сделал русский невропатолог Константин Николаевич Третьяков.
Исследования К.Н. Третьякова ознаменовали третий, наиболее значимый этап в изучении патогенеза БП. К.Н. Третьяков вплоть до 1923 года возглавлял лабораторию мозга знаменитой кафедры Шарко на медицинском факультете Сорбонны в Париже, где он изучал патофизиологические аспекты паркинсонального тремора. Однако объектом его исследований был постэнцефалитический паркинсонизм. К.Н. Третьяков изучал препараты мозга больных, погибших от летаргического энцефалита Экономо, эпидемия которого распространилась по Европе в период Первой мировой войны [Lees A.J., 2007; Lees A.J. et al., 2008; Tselis A.C. et al., 2014]. Сравнительный патологоанатомический и патогистологический анализ головного мозга пациентов, имевших в анамнезе болезни симптоматику паркинсонизма, характерную для летаргического энцефалита Экономо, и мозга больных, в анамнезе которых отсутствовал данный диагноз, позволил выявить связь развития симптомов паркинсонизма с дегенеративными процессами в очень ограниченной анатомической зоне – в черной субстанции (substancia nigra) [Юдина В.В. et al., 2009]. К.Н.Третьяков доказал, что именно деструктивные изменения и потеря клеточных элементов исключительно в черной субстанции приводят к ригидности и тремору. Далее он провел патологоанатомическое исследование мозга уже больных с болезнью Паркинсона (БП) и подтвердил у них ожидаемые дегенеративные изменения в черной субстанции. Эти данные хорошо согласовывались с наблюдениями Г. Маринеско, также работавшим в то время на кафедре Шарко. Г.Маринеско установил, что новообразования в черной субстанции могут вызывать паркинсональный тремор [Goedert M. et al., 2013]. Эти данные, указывающие на то, что различные заболевания с характерными общими расстройствами движений, тремором и ригидностью, характеризуются общей анатомической локализацией патологического процесса в черной субстанции, позволили К.Н.Третьякову в 1919 году сформулировать нигерную теорию паркинсонизма, которая обеспечила стремительный прогресс в исследованиях патогенеза БП [Юдина В.В. et al., 2009]. В последующих работах К.Н.Третьяковым был выполнен направленный анализ аутопсийного материала мозга больных с БП, результатом которого явилось выявление в черной субстанции внутриклеточных патогистологических включений, ранее описанных Ф.Г. Леви. К.Н.Третьяков подробно охарактеризовал эти патогистологические включения и предложил называть их тельцами Леви [Braak H. et al., 2006]. Позже, в 1938 году Рольф Хасслер подтвердил выводы К.Н.Третьякова о том, что именно дегенеративный процесс в черной субстанции является причиной паркинсонизма. Он также продемонстрировал фокусное распределение патологии и выявил наиболее выраженную потерю нервных клеток в каудальных и вентролатеральных отделах (pars ventrolateralis) черной субстанции, существенно развив, таким образом, знания о патогенезе БП [Goedert M. et al., 2013]. Выявление телец Леви в компактной области черной субстанции у пациентов с БП при post mortum анализе является основным патогистологическим признаком данного заболевания и сопровождается выраженной гибелью значительного числа катехоламинергических нейронов, а потеря дофаминергических (ДА) нейронов в черной субстанции у больных с БП может достигать более 85%. При этом в значительной части все еще функционирующих ДА нейронов наблюдаются признаки нейродегенеративного процесса. В телах таких нейронов часто выявляются тельца Леви, а в их отростках – различного рода патологические структуры, такие как, например, Леви нейриты. Поскольку в вентролатеральной части компактного вещества черной субстанции располагаются нейроны, проецирующие отростки в основном в дорзальную скорлупу полосатого тела (стриатума), то именно там и детектируется наиболее выраженный дефицит дофамина у больных с БП. Черная субстанция не является единственной анатомической структурой, поражающейся при БП.
Конвенционная полимеразная цепная реакция
Увеличение числа копий альфа-синуклеина (SNCA) и миссенс-мутаций (указаны черными прямоугольниками) в гене альфа-синуклеина вызывают преимущественно наследственные формы БП и Деменции с тельцами Леви. Шесть миссенс-мутаций обозначены с указанием в аминокислотных замен. Таким образом определенные мутации в гене альфа-синуклеина могут быть причиной агрегации этого белка и формирования фибрилл амилоидного типа.
Кроме того, был обнаружен полиморфизм в промоторной области гена альфа-синуклеина, который ассоциирован с возрастанием риска развития БП, особенно гаплотипа 15.3 кB [Pals P. et al., 2004]. Этот гаплотип встречается у пациентов с БП гораздо чаще, чем все другие гаплотипы. Целый ряд данных, полученных вследствие значительно активизировавшихся медико-генетических исследований БП, позволил подробно описать в европейской и азиатской популяциях эти и ряд других генетических ассоциаций с риском развития БП [Pankratz N. et al., 2009]; [Satake W. et al., 2009]; [Simon-Sanchez J. et al., 2009]. При этом далеко не для всех семейных форм БП удалось идентифицировать генетические ассоциации. И точечные мутации, и мультипликации в локусе альфа-синуклеина могут быть не только причиной БП, но и других альфа-синуклеинопатий.
Второй наиболее распространенной формой альфа синуклеинопатии, которая также характеризуется присутствием классических телец Леви, является деменция с рассеянными тельцами Леви (ДТЛ) [Яхно Н.Н., 2005]. Это заболевание, как и БП, относится к социально значимым, поскольку среди деменций в статистике многих центров оно уже опережает по числу случаев сосудистую деменцию и выходит на второе место после болезни Альцгеймера по частоте встречаемости [Crystal H.A. et al., 1990]; [McKeith I.G. et al., 1995]; [Dodel R. et al., 2008].
В патогенезе ДТЛ на первый план выступают прогрессирующие когнитивные расстройства, которые диагностируются на самых первых стадиях заболевания и доминируют в клинической картине, а моторные расстройства либо отсутсутвуют, либо слабо выражены [Lippa C.F. et al., 2007], [McKeith I.G. et al., 2005], поскольку анатомическая локализация патологического процесса отличается от таковой при БП. Многочисленные включения наблюдаются в кортикальных и субкортикальных нейронах и там же локализован нейродегенеративный процесс [Aarsland D. et al., 2003], [Aarsland D. et al., 2005]. В этом заключается принципиальное различие в патофизиологии БП и ДТЛ при том, что патология на молекуярном уровне при этих заболевания абсолютно идентична. Поскольку при БП у большинства пациентов развивается деменция [Irwin D.J. et al., 2013], существуют разногласия относительно классификации этих типов деменций. На сегодняшний момент происходит деление на «болезнь Паркинсона с деменцией» – если моторные симптомы преобладают на протяжении многих лет и деменция наступает относительно поздно; и на «деменцию с тельцами Леви» – если когнитивные нарушения наступают рано и доминируют в клинической картине [Love S., 2005] и [Fujishiro H. et al., 2008]. Неясным остается вопрос, идет ли речь о двух разных заболеваниях или же одно из них является формой развития другого [Uchikado H. et al., 2006]. Исследования осложняются тем, что у многих пациентов с БП при патогистилогическом анализе в аутопсийном материале тельца Леви обнаруживаются помимо области черной субстанции еще и в коре головного мозга, а количество таких случаев может доходить до 50% [Gearing M. et al., 1999]; [Kotzbauer P.T. et al., 2001]; [Irwin D.J. et al., 2012].
Третья по распространенности альфа-синуклеинопатия – мультисистемная атрофия (МСА), отличается от двух других описанных выше альфа-синуклеинопатий и по патоморфологическим характеристикам и по клиническим проявлениям [Jellinger K.A., 2007]. В клинической картине МСА могут присутствовать и симптоматика паркинсонизма, и церебеллярная атаксия, и симптомы поражения кортико-спинального тракта [Пономарев В.В., 2005], [Gilman S. et al., 2008]. В зависимости от того, поражение каких анатомических структур превалирует, выделяется три основных типа МСА: нигростриатная дегенерация (с доминирующей симптоматикой паркинсонизма); вегетативная дисфункция, называемая в более ранних работах синдромом Шая-Дрейджера (Shy-Drager), и атаксия, при которой наблюдается нарушение координации движений или неуверенная походка [Kaufmann H., 1996]; [Sikorska B. et al., 2007]. При этом вне зависимости от анатомической локализации патогистологического процесса на молекулярном уровне общим является единый механизм агрегации альфа-синуклеина без формирования телец Леви. Образование же специфических цитоплазматических включений происходит не в нейронах, а в клетках олигодендраглии [Papp M.I. et al., 1989]. Морфология образуемых альфа-синуклеином филаментов при МСА существенно отличается от таковых в тельцах Леви. Глиальные цитоплазматические включения (GCI или Папп-Лантос включения) имеют гораздо меньшие размеры и являются аргирофильными. В ряде случаев их удается выявить не только в цитоплазме, но и в ядре отдельных олигодендроцитов. Кроме того, при некоторых формах МСА нерастворимые белковые депозиты альфа-синуклеина, подобные GCI, были описаны в редких случаях, как включения в цитоплазме нейронов [Lin W.L. et al., 2004]. Хотя очевидно, что в молекулярном патогенезе МСА важная роль принадлежит дисфункции альфа-синуклеина, мутаций этого гена у больных с МСА выявлено не было [Hara K. et al., 2007]; [Ozawa T. et al., 1999]; [Vanacore N. et al., 2005].
Разработка линии мышей для регулируемого тканеспецифичного нокаута гена альфа-синуклеина
Альфа-синуклеин, являясь преимущественно нейроспецифическим белком, имеет важное значение в функционировании нейронов. Его экспрессия в эмбриогенезе начинается в нервной системе одновременно с началом дифференцировки нейрональных клеток-предшественников и активным ростом аксональных отростков в направлении подлежащих иннервирвации клеток-мишеней [Нинкина Н.Н. et al., 2000b]. С другой стороны, в этот период отмечается исключительно высокая пластичность развивающегося мозга, которая обеспечивает компенсацию многих возможных нарушений [Угрюмов М.В., 2008], в том числе и для развивающихся дофаминергических нейронов черной субстанции, обладающих исключительно высокой, по сравнению со многими другими типами нейронов, чувствительностью к нарушению функции синуклеинов [Abeliovich A. et al., 2007]. По-видимому, в нигростриатной системе ваработались определенные онтогенетические механизмы, которые позволяют нейронам преодолевать критические периоды развития и, более того, в ряде случаев даже приобретать повышенную устойчивость к целому ряду токсических воздействий [Al-Wandi A. et al., 2010].
Однако с возрастом развивается декомпенсация, приводящая к синаптической дисфункции в нейронах черной субстанции, что показано на модельных системах в стареющих альфа-синуклеин нокаутных мышах [Anwar S. et al., 2011]. У таких мышей выявлено существенноe снижениe уровня дофамина без значимой потери самих нейронов [Al-Wandi A. et al., 2010]. Важно отметить, что при болезни Паркинсона патологическая агрегация альфа-синуклеина в цитоплазме нейронов черной субстанции приводит к прогрессирующему с возрастом нарушению транспорта этого белка в пресинаптические терминалии.
Если учесть, что именно в пресинаптических терминалиях в нормe локализована большая часть альфа-синуклеина, где он выполняет важную функцию регулятора нейротрансмиссии [Burre J. et al., 2010], логично предположить, что дефицит функционально-активного пресинаптического белка альфа-синуклеина и нарушениe его нормальной функции в процессах нейротрансмиссии, будет вносить значимый вклад в развитие нейродегенеративного процесса, характерного для болезни Паркинсона. Косвенным подтверждением этого механизма является тот факт, что недостаточность альфа-синуклеина у пациентов с развивающейся болезнью Паркинсона именно в процессе старения становится фактором, способствующим прогрессии ряда патологических процессов, характерных для данного заболевания.
Нарушению нормальной функции альфа-синуклеина отводится важная роль в патогенезе наследственных и идиопатических форм БП [Spillantini M.G. et al., 1997]. В многочисленных работах подробно исследована нарастающая по мере прогрессии заболевания гибель дофаминергических нейронов, которая наиболее ярко выражена в чёрной субстанции. При этом менее детально изучена роль альфа-синуклеина в развитии дофаминергических нейронов и совсем мало известно об отдаленных последствиях нарушения функции этого белка в раннем развитии на судьбу дофаминергических нейронов в стареющем мозге.
Одной из задач настоящего исследования являлось изучение влияния нарушения функции альфа-синуклеина на процесс формирования дофаминергических нейронов. Важными животными моделями для изучения последствий дефицита альфа-синуклеина являются линии мышей с генетической инактивацией кодиружщего этот белок гена. Для моделирования конститутивного дефицита альфа-75 синуклеина в эмбриональном и постнатальном развитии был выбран подход с использованием линии нокаутных мышей, наиболее часто исползуемой на тот период времени различными лабораториями. 3.1 Морфометрический анализ дофаминергических нейронов у мышей с конститутивной инактивацией гена альфа-синуклеина В качестве экспериментальной модели была использована линия, полученная первоначально из лаборатории А.Розенталь [Abeliovich A. et al., 2000], а затем собственного разведения [Ab-а_synКО] [Garcia Reitboeck P. et al., 2013]. Контрольные животные с немодифицированным геномом (wt) были получены из тех же пометов, что и нокаутные, в серии перекрестных скрещиваний гетерозиготных производителей на том же C57Bl6J генетическом фоне. На животных экспериментальной и контрольной групп был выполнен подробный морфометрический анализ дофаминергических нейронов в двух анатомических структурах среднего мозга: чёрной субстанции (ЧС) и вентральной области покрышки (ВОП), которые дифференциально поражаются у больных с БП.
Морфометрический анализ дофаминергических нейронов у взрослых SNCADflox/=flox мышей
Морфометрический анализ дофаминергических нейронов в ЧС у SNCAMox/Aflox мышей в раннем постнатальном периоде на 7-й день после рождения показал, что у нокаутных животных их число статистически достоверно выше, чем у контрольных животных дикого типа (Рис.27). Такая картина качественно отличается от того, что было нами показано ранее для животных линии [Ab-а_synКО], у которых на стадии р7 статистически достоверных различий в данной анатомической области выявлено не было (Рис. 14 и 27). При анализе числа дофаминергических нейронов в области ВОП также не было выявлено статистически достоверных отличий у нокаутных животных, и показатели не отличались от показателей контрольных животных дикого типа (Рис. 28).
Для того, чтобы проверить будет ли нормализовано количество дофаминергических нейронов у SNCAAflox/Aflox мышей, как это происходило у линии [Ab-а_synКО] во время постнатального периода, нами был произведён подсчёт дофаминергических нейронов у взрослых молодых животных в возрасте 6 месяцев. В результате проведенного анализа было установлено, что к шести месяцам у нокаутных животных происходит нормализация количества дофаминергических нейронов и статистически достоверной разницы в количестве ТГ-позитивных клеток не было обнаружено ни в области чёрной субстанции, ни в вентральной области покрышки ( Рис. 27 и 28). дофаминергических нейронов в вентральной области покрышки новой нокаутной линии [a-syn_neo-free_KO] и контрольных мышей дикого типа (wt) на 11.5, 13.5 дни эмбриогенеза, в постнатальном периоде на 7-й день после рождения (р7) и у взрослых животных в возрасте 6 месяцев. n = 5 для каждой группы, – p 0.01 по критерию U Вилкоксона– Манна–Уитни.
Поскольку единственным различием в линиях [Ab-а_synКО] и SNCAMox/Aflox был объем генетической модификации локуса альфа-синуклеина нами был проведён анализ данного локуса и особое внимание уделено выявлению других возможных генов или их регуляторных элементов, которые могли быть параллельно модифициронанны. В геноме использованной нами на первом этапе работы линии мышей [АЬ-а_synКО] генетическая модификация, проведенная при конструировании этого нокаута, затрагивала регуляторную область вблизи промотора гена мультимерина-1, существовала вероятность изменения активности и регуляции этого гена. Важным свойством полученого нами нового конститутивного нокаута альфа-синуклеина являлось то, что проведенными модификациями в геноме не были затронуты регуляторные участки гена мультимерина-1, который расположен в интронной области вблизи промотора гена альфа-синуклеина. Интересно, что и в геноме мыши, и в геноме человека оба эти гена находятся в непосредственной близости друг от друга. Так, в геноме человека ген, кодирующий альфа-синуклеин, расположен на 4-й хромосоме и там же расположен ген, кодирующий мультимерин-1 (Рис. 29). В геноме мыши он расположен на 6-й хромосоме и очень сходно структурно относительно альфа-синуклеина располагается ген мультимерина-1 (Рис. 29).
Несмотря на то, что нокаутная линия [АЬ-а_synКО] широко используется в лабораториях мира и предполагается, что генетические модификации локуса альфа-синуклеина теоретически не должны влиять на другие гены, поскольку их кодирующие части не затронуты, 106 аккуратный анализ уровня экспрессии мультимерина-1 ранее выполнен не был. Рисунок 29. Взаимное расположение генов альфа-синуклеина (SNCA) и мультимерина-1 (MMRN1) в геноме человека и мыши Поэтому одной из задач данного диссертационного исследования являлось проведение сравнительного анализа уровней экспрессии мультимерина-1 в тканях нервной системы мышей линии [Аb-а_synКО] и новой полученной нами линии [SNCAMox/Mox]. Рисунок 30. Кривые амплификации транскриптов мультимерина-1 в реакции ПЦР в реальном времени. Разница в количестве циклов амплификации для нокаутных линий относительно уровня ГАФД (обозначен синим) составляет 7 циклов. 108 Из тканей коры головного мозга мышей данных линий выделяли тотальную РНК и после синтеза первой цепи с помощью реакции обратной транскрипции анализировали уровни экспрессии мультимерина-1 методом ПЦР в реальном времени (Рис.30).
Уже в первых установочных экспериментах стало очевидно, что уровень экспрессии мультимерина-1 в линии [АЬ-а_synКО] настолько сильно изменен, что разница между ACt для этой линии животных по сравнению с тремя другими исследованными составила порядка 7 циклов и свидетельствовала о существенно повышенном содержании РНК мультимерина-1 в иследованных образцах. Уровени экспресии гена мультимерина-1 в двух нокаутных линиях могли различаться в таком случае на два порядка. Действительно, в различных отделах головного и спинного мозга мышей линии [АЬ-а_synКО] уровень РНК мультимерина-1 был существенно повышен. На рисунке 31 приведены данные анализа экспрессии мультимерина-1 в препаратах тотальной РНК из коры головного мозга мышей методом RT-PCR, из которых следует, что у [АЬ-а_synКО] мышей содержание РНК мультимерина-1 по сравнению с нормой (WT) увеличено в 67 раз. При этом уровень экспрессии мультимерина-1 в новом конвенционном нокауте [SNCAMox/Mox] был такой же, как и у контрольных мышей дикого типа (WT).
Кроме того, нами был так же исследован уровень экспрессии мультимерина-1 в имеющемся у нас другом конвенционном нокауте гена альфа-синуклеина [Та-synKO]. Эта линия нокаутных мышей, полученная из лаборатории Т. Sudhof, гораздо реже используется в работах по изучению функции альфа-синуклеина. И хотя генетическая модификация, проведенная в локусе альфа-синуклеина у мышей линии [Та-synKO], довольно обширна, это не влияет на уровень экспрессии мультимерина-1 (Рис. 31). Возможно, расположенный в обратной ориентации ген neo, оказывает гораздо менее драмматичный эффект на регуляторные элементы гена альфа-синуклеина. Каким образом практически 70-кратное превышение содержания мультимерина-1 в нейронах может сказываться на фенотипе нокаутных животных неизвестно.