Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Патогенетические подходы к регенеративной терапии поврежденний мягких тканей при компрессионной травме (обзор литературы) 13
1.1. Патогенез местных нарушений при компрессионной травме 14
1.2. Механизмы системных нарушений при компрессионной травме мягких тканей 16
1.3. Посттравматическая регенерация скелетных мышц при механической компрессии 19
1.4. Современные подходы к лечению компрессионной травмы мягких тканей 22
1.5. Основные принципы регионарной коррекции посттравматических повреждений мягких тканей. Возможности применения биомедицинских полимерных комплексов и продуктов клеточных технологий 26
Глава 2. Материалы и методы исследования 34
2.1. Материалы исследования 34
2.1.1 Дизайн исследования 34
2.1.2. Общая характеристика экспериментального материала 36
2.1.3. Моделирование компрессионной травмы тяжелой степени 36
2.1.4. Распределение животных по группам исследования 37
2.1.5. Характеристика препарата гиалуроновой кислоты 39
2.1.6. Биомедицинский клеточный продукт на основе культивированных ММСК человека 39
2.1.7. Обоснование дозы и способ регионарного введения применяемых средств 41
2.2. Методы исследования 42
2.2.1. Оценка тяжести компрессионной травмы 42
2.2.2. Инструментальные методы исследования 42
2.2.3. Морфологические методы исследования 47
2.3. Методы статистического анализа результатов исследования 49
Глава 3. Структурно-функциональные изменения скелетных мышц на модели тяжелой компрессионной травмы в условиях регионарного введения ММСК человека в геле гиалуроновой кислоты (результаты собственных исследований) 51
3.1. Моделирование тяжелой компрессионной травмы мягких тканей конечности 51
3.2. Макроскопическое описание скелетных мышц области компрессионной травмы при регионарном введении ММСК человека в геле гиалуроновой кислоты 54
3.3. Сократимость скелетных мышц при компрессионной травме мягких тканей в условиях регионарного применения культивированных ММСК человека в геле гиалуроновой кислоты 58
3.3.1. Сила одиночного мышечного сокращения 58
3.3.2. Сила мышечного сокращения в режиме тетанус 61
3.4. Состояние микроциркуляции в области повреждения мягких тканей при компрессионной травме после регионарного введения культивированных ММСК человека в геле гиалуроновой кислоты. 63
3.4.1. Перфузионная функция микроциркуляции скелетных мышц области механической компрессии мягких тканей 63
3.4.2. Кислородный статус крови в микроциркуляторном русле области поврежденных тканей 67
3.4.3. Окислительно-восстановительный статус скелетных мышц области компрессионного повреждения 70
3.5. Морфологические изменения скелетных мышц при компрессионной травме после введения в поврежденные ткани ММСК человека в геле гиалуроновой кислоты 74
3.5.1. Светомикроскопическая характеристика скелетной мышечной ткани в области компрессионной травмы 74
3.5.2. Морфометрическая характеристика мягких тканей области компрессии 81
3.5.3. Ультраструктурная характеристика скелетных мышц области компрессионной травмы 87
3.5.4. Иммуногистохимические показатели ангиогенеза и пролиферации поврежденных скелетных мышц в посткомпрессионном периоде 95
Выводы 102
Заключение 103
Перспективы дальнейшей разработки темы исследования 128
Список сокращений и условных обозначений 129
Список литературы 130
- Основные принципы регионарной коррекции посттравматических повреждений мягких тканей. Возможности применения биомедицинских полимерных комплексов и продуктов клеточных технологий
- Перфузионная функция микроциркуляции скелетных мышц области механической компрессии мягких тканей
- Морфометрическая характеристика мягких тканей области компрессии
- Иммуногистохимические показатели ангиогенеза и пролиферации поврежденных скелетных мышц в посткомпрессионном периоде
Введение к работе
Актуальность исследования. Синдром длительного сдавления остается опасным для жизни осложнением компрессионной травмы [Gonzalez D., 2005]. В условиях чрезвычайных ситуаций, производственных аварий и природных стихийных бедствий вероятность развития компрессионного синдрома у пострадавших с тяжелыми травмами превышает 40% [Reis N.D. et al. 2005]. Частота летальных исходов при этом может достигать 80-90%, что обусловливает необходимость дальнейшего изучения данной патологии [Кричевский А.Л., 1995; Гаркави А.В., 2000]. При длительном сдавлении большой массы мягких тканей развиваются опасные для жизни постишемические патологические изменения, в основе которых лежит, обусловленный реперфузией, цитолиз, мембраногенный отёк, выброс в кровоток токсических продуктов [Кипиани В.А., 2003; Шугаева К.Я. и со-авт., 2012]. Оказание медицинской помощи пациентам с компрессионными повреждениями мягких тканей основывается на проведении комплекса мероприятий, направленных на детоксикацию организма, устранение метаболических расстройств и восстановление трофики тканей [Самохвалов И.М. и соавт., 2004; Godi-er A. et al., 2013]. Тем не менее, высокая частота осложнений, неудовлетворительных анатомических и особенно функциональных результатов ставит в центр внимания вопросы кардинального совершенствования способов раннего лечения поврежденных механическим сдавлением мягких тканей [Рудаев В.И. и соавт., 1999]. Для снижения тяжести реперфузионных последствий компрессионной травмы предложены различные патогенетические подходы, улучшающие кровообращение, нормализующие микроциркуляцию и метаболизм поврежденных тканей [Баянов В.В., 1999; Шевцов А.Р., 2008; Османова А.А., 2010]. Перспективным направлением саногенеза компрессионных травм представляется регионарная активация клеточных систем репарации, позволяющих снизить степень постишемического разрушения мягких тканей, обеспечить ускоренное восстановление кровотока в зоне компрессии, а также функции скелетных мышц [Гаин Ю.М. и соавт., 2010]. Одним из вариантов решения проблемы реконструкции поврежденной ткани может оказаться пересадка в места анатомических дефектов биомедицинских препаратов на основе клеточных технологий, компенсаторно опосредующих восстановительные процессы [Winkler T. et al., 2012; Roth P. et al., 2012].
Степень разработанности темы исследования. Исследования последних лет показывают, что перспективными кандидатами на роль клеток с высоким регенеративным потенциалом являются мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (ММСК) [Liang X. et al., 2014]. Трафик ММСК в место повреждения может значительно усилить участие эндогенного пула стволовых клеток, обеспечить широкие дифференцировочные потенции, а также регенеративное микроокружение за счет паракринной секреции биоактивных факторов [Домарацкая Е.И. и соавт., 2015]. Современные биомедицинские технологии позволяют выделить ММСК из различных тканей, в том числе жировой [Gronthos S. et. al., 2001; Zuk P.A. et. al.,
2002; Kern S. et al., 2006]. Для регенерации поврежденных скелетных мышц апробированы суспензии культивированных ММСК в изотоническом солевом растворе [Nakabayashi A. et al., 2013]. Однако прогресс тканеинженерного направления биотехнологий связан с применением клеточных культур в составе носителей на основе биополимерных гелей [Шишацкая Е.И. и соавт., 2013; Калмыкова Н.В. и со-авт., 2014]. Большинству требований, предъявляемых к клеточным носителям, соответствуют препараты низкомолекулярной гиалуроновой кислоты (ГК), широко используемой в эстетической медицине в качестве биоревитализанта [Камелина Л.И. и соавт., 2010; Хабаров В.Н., 2012]. Имеются ряд доказательств положительного регенеративного эффекта при локальном применении гидрогеля ГК, в том числе совместно с культивированными ММСК [Хлусов И.А. и соавт., 2013; Jang C.H. et al., 2008]. В тоже время закономерности формирования структурно-клеточных преобразований в области обширной компрессии мягких тканей с позиций приспособительных механизмов компенсации в условиях регионарного введения геля низкомолекулярной ГК и ММСК в геле ГК остаются недостаточно изученными, что не позволяет оценить перспективы применения этого вида регенеративной терапии в практике обширных посттравматических повреждений мягких тканей.
Цель исследования – оценить патогенетические механизмы повреждений скелетных мышц при экспериментальной компрессионной травме мягких тканей и обосновать возможность их коррекции регионарным применением в область сдав-ления культивированных мультипотентных мезенхимных стромальных клеток человека в геле низкомолекулярной гиалуроновой кислоты.
Задачи исследования
-
Провести моделирование тяжелой компрессионной травмы мягких тканей на экспериментальных животных (крысы) и выявить основные проявления и механизмы формирования морфо-функциональных и структурно-метаболических нарушений в области компрессии.
-
Оценить сократимость скелетных мышц поврежденной конечности у крыс после введения в область сдавления геля гиалуроновой кислоты и препарата на ее основе с мультипотентными мезенхимными стромальными клетками человека.
-
Определить состояние микроциркуляции, утилизации кислорода и метаболического статуса скелетных мышц области компрессии после регионарного введения геля гиалуроновой кислоты и препарата на ее основе с мультипотентны-ми мезенхимными стромальными клетками человека.
-
Изучить морфологические изменения, регенераторную активность и ан-гиогенез скелетных мышц области сдавления после регионарного введения геля гиалуроновой кислоты и препарата на ее основе с мультипотентными мезенхим-ными стромальными клетками человека.
-
Выявить особенности влияния локальной внутримышечной пересадки геля гиалуроновой кислоты и мультипотентных мезенхимных стромальных клеток
человека в область компрессионного повреждения на миогенез и посттравматическую регенерацию мягких тканей.
Научная новизна исследования. Впервые в результате комплексных патофизиологических исследований обосновано регионарное применение геля ГК и ММСК человека в геле ГК для коррекции постишемических повреждений скелетных мышц в ранний период тяжелой компрессионной травмы в рамках компенсаторного усиления восстановительных процессов при тяжелой компрессионной травме мягких тканей. Установлено, что регионарная внутримышечная пересадка в ранний посткомпрессионный период геля ГК и препарата на ее основе с ММСК человека уменьшает выраженность морфо-функциональных и деструктивно-воспалительных изменений травмированных тканей, предупреждает развитие вторичного некроза мягких тканей, вызванного компрессионной ишемией, стимулирует восстановление микроциркуляции и регенеративный миогенез за счет проли-феративной активности Ki-67-экспрессирующих клеток и продукции ангиогенных трофических факторов, повышает метаболическую активность в области регенерации. Выявлено, что указанные механизмы влияния ГК и ММСК лежат в основе восстановления полноценной мышечной ткани и ее сократительной функции. Впервые доказано, что низкомолекулярная ГК, используемая в биомедицинском препарате в качестве клеточного носителя, при самостоятельном применении обладает регенеративным потенциалом, реализующимся по механизму активации ангиогенеза, пролиферации и метаболических процессов в области компрессионного повреждения, что обусловливает сохранность миоцитов.
Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты исследования расширяют знания о саногенезе при тяжелой компрессионной травме мягких тканей в результате регионарного применения геля низкомолекулярной ГК и культивированных ММСК в геле ГК в раннем периоде тяжелой компрессионной травмы мягких тканей с учетом стадийности посттравматического регенераторного процесса мышечной ткани. Данные об эффективности геля ГК и препарата на ее основе с культивированными ММСК человека позволяют оптимизировать методические подходы к разработке схем применения продуктов клеточных биотехнологий в рамках прикладных аспектов применения современных программ по оказанию специализированной медицинской помощи пострадавшим с компрессионной травмой.
Методология и методы исследования. Методический подход, применяемый в настоящей работе, базируется на представлениях об особенностях патогенеза ишемического повреждения мышечной ткани при тяжелой экспериментальной компрессионной травме, механизмах регенерации мышечной ткани, современных знаниях о механизмах действия продуктов клеточных технологий и включает: анализ данных научной литературы, построение научной гипотезы, разработку целевой установки и подбор методов исследования для решения поставленных задач,
сравнительно-сопоставительный анализ данных, полученных в ходе эксперимента для формирования репрезентативных результатов и формулирования выводов, положений, выносимых на защиту, практических рекомендаций.
В работе использованы диагностические алгоритмы прижизненной и ауто-псийной лабораторной и инструментальной диагностики. Материалом исследования служили данные, полученные в результате применения геля ГК и биомедицинского клеточного продукта на основе культивированных мультипотентных ме-зенхимных стромальных клеток в геле ГК для регенеративной терапии экспериментальных животных с компрессионной травмой тяжелой степени.
В работе соблюдены принципы доказательной медицины и использованы современные высокотехнологичные методы исследования и обработки данных.
Основные научные положения диссертации, выносимые на защиту:
-
При тяжелой компрессионной травме мягких тканей конечности регионарное введение в область сдавления геля гиалуроновой кислоты и препарата на ее основе с культивированными ММСК человека снижает выраженность посттравматических изменений скелетных мышц;
-
Регионарная внутримышечная имплантация в область компрессии культивированных мезенхимных мультипотентных стромальных клеток человека в геле гиалуроновой кислоты при тяжелой экспериментальной компрессионной травме мягких тканей способствует ускоренному восстановлению сократительной активности скелетных мышц, формированию мышечно-соединительнотканного регенерата с высоким содержанием миогенных элементов;
-
В основе саногенеза тяжелого компрессионного повреждения мягких тканей при раннем регионарном введении в область сдавления культивированных ме-зенхимных мультипотентных стромальных клеток человека в геле гиалуроновой кислоты лежит усиление пролиферативной активности клеточных компонентов мышечной ткани, стимуляция ангиогенеза, нарастающее улучшение перфузион-ных и метаболических характеристик микроциркуляции, стабилизация структурного состояния миосимпласта;
-
Гиалуроновая кислота в условиях внутримышечной пересадки в область посткомпрессионного повреждения мягких тканей включается в систему репарации поврежденных скелетных мышц, проявляя синергизм с регенераторными эффектами имплантированных культивированных мезенхимных мультипотентных стромальных клеток.
Степень достоверности и апробация результатов исследования. Достоверность и обоснованность результатов исследования обеспечены достаточным количеством экспериментальных животных (n=464) и проведенных исследований с использованием актуальных показателей лабораторных, инструментальных и гисто-морфологических методов исследования. Результаты исследования подтверждены методами статистического анализа.
Основные результаты диссертационного исследования доложены на научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицинского обеспечения войск (сил)» (Санкт-Петербург, 2014), Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 60-летию кафедры военно-полевой терапии (Санкт-Петербург, 2015), Юбилейной Всеармейской научно-практической конференции «Актуальные проблемы развития технических средств медицинской службы» (Санкт-Петербург, 2015), III Международном медицинском форуме «Медицина будущего – Арктике» (Архангельск, 2016), Юбилейной научно-практической конференции «Современные проблемы охраны здоровья военнослужащих» (Санкт-Петербург, 2016), Всероссийской конференции с международным участием «StemCellBio-2016: фундаментальная наука как основа клеточных технологий» (Санкт-Петербург, 2016), IХ Архангельской международной медицинской научной конференции (Архангельск, 2016), III Национальном Конгрессе по регенеративной медицине (Москва, 2017).
По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, из них 4 – в журналах, включенных в перечень рецензируемых научных изданий, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией (ВАК РФ) для опубликования основных результатов диссертационных исследований на соискание ученой степени кандидата наук.
Личный вклад автора в исследование. Автором лично проведено обоснование актуальности темы, планирование исследования, проведение экспериментов, получение данных с использованием инструментального и лабораторного оборудования. Автор лично осуществлял учет, систематизацию и оценку полученных данных, их статистическую обработку, анализ и обобщение.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 160 листах машинописного текста и состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Библиографический указатель включает 260 источников литературы, в том числе 111 отечественных и 149 зарубежных авторов. В диссертации представлено 14 таблиц, 16 рисунков.
Основные принципы регионарной коррекции посттравматических повреждений мягких тканей. Возможности применения биомедицинских полимерных комплексов и продуктов клеточных технологий
Данные о регионарном использовании биомедицинских полимерных комплексов и клеточных продуктов при лечении повреждений мягких тканей немногочисленны. Имеются сведения об эффективном применении фибробластов в фибриновом геле в лечении повреждений мышц [Зорин В.П. и соавт., 2009]. Локальное введение стволовых клеток жировой ткани в мышцы животных на модели острой ишемии конечности показало отсутствие некроза стопы и достоверное улучшение кровотока за счет увеличение числа капилляров [Rehman J. et al., 2004; Cao Y. et al., 2005]. Хороших функциональных результатов удавалось добиться при имплантации в зону дефекта мышечной ткани мезенхимных стромальных клеток [Winkler T. et al., 2008]. Локальное применение ММСК в сочетании с коллагеном, гиалуроновой кислотой, кератан - и дерматансульфатом при повреждении мышечной ткани способствовало снижению численности соединительнотканных клеток, экспрессирующих профиброгенные цитокины, что приводило к полноценному фагоцитозу и ингибированию формирования обширного рубца [Лебедева А.И., 2014]. По современным представлениям, регенерация поврежденных тканей осуществляется двумя способами: замещением стволовыми клетками клеточных структур, погибших вследствие повреждения, и/или паракринным действием, за счет синтеза различных биологически активных молекул, влияющих на трофику и рост окружающих клеток [Ziegelhoeffer T. et al., 2004; Rookmaaker M.B. et al., 2005]. Биологическое действие стволовых клеток определяется их способностью к миграции, пролиферации и тканеспецифичной дифференцировке, а также к синтезу различных биологически активных молекул, влияющих на трофику и рост окружающих клеток [Liang X. et al., 2014]. Способность стволовых клеток встраиваться в структуру поврежденных тканей не получила достаточного экспериментального подтверждения [Ткачук В.А. и соавт., 2009; Шевелева О.Н. и соавт., 2015; Panetta N.J. et al., 2010]. В то же время, как гипотеза о трофическом (паракринном) воздействии стволовых клеток на поврежденную (ишемизированную) ткань обоснована и подтверждена многочисленными экспериментами [Urbich C. et al., 2003; Heil M. et al., 2004]. Стволовые клетки мигрируют в очаг повреждения (хоуминг), где активно пролиферируют с выделением в окружающее межклеточное пространство трофических (ростовых) факторов, представляющих собой хемо-и цитокины [Jones B.J. et al., 2008; Block G.J. et al., 2009; Murphy M. B. et al., 2013; Stagg J. et al., 2013]. Эти вещества оказывают цитопротективное и антиапоптическое действие, активируют ангио- и нейрогенез, стимулируют тканеспецифические стволовые клетки и способствуют их включению в репаративный процесс, а также оказывают иммуносупрессивное и противовоспалительное действие на микроокружение [Majumdar M.K. et al., 2003; Aggarwal S. et al., 2005] . Стволовые клетки способны влиять на баланс про- и противовоспалительных цитокинов в поврежденной ткани [Григорьева О.А. и соавт., 2011].
В зависимости от способа введения мезенхимные стволовые клетки по-разному распределяются в органах и тканях [Konoplyannikov A.G. et al., 2008]. При внутриартериальном и внутривенном введении 92% мезенхимных стволовых клеток задерживается в прекапиллярной части микроциркуляции, что может привести к снижению кровотока [Toma C. et al., 2009]. При сравнении путей введения было выявлено, что непосредственная имплантация стволовых клеток в мышцу способствует более длительному их нахождению в ней, в отличие от инфузии в артерии и вены [Пальцев М.А. и соавт., 2009; Li S.H. et al., 2009]. При этом в скелетных мышцах, имплантированные стволовые клетки сохраняются значительно дольше, чем в сердечной мышце. Так, сохранность мезенхимных стволовых клеток к концу первых суток составляет в среднем 60%, а к исходу недели – около 7,5% [Ткачук В.А. и соавт., 2009]. Существенных различий в сохранности стволовых клеток, введенных в нормальную и ишемизированную мышцу, не выявлено.
ММСК представляют собой стволовые клетки стромы различных тканей. Источником ММСК является костный мозг [Tgel F. et al., 2007; Tolar J. et al., 2010], пуповина [Sarugaser R. et al., 2005; Reinisch A. et al., 2009], пуповинная кровь [Bieback K. et al., 2004; Kgler G. et al., 2004; Reinisch A. et al., 2007], скелетные мышцы [Williams J.T. et al., 1999], белая жировая ткань[Gronthos S. et. al., 2001; Kern S. et al., 2006], плацента [Miao Z. et. al. 2006; Park S.B. et al. 2011; Roubelakis M.G. et al., 2013; Pirjali T. et al. 2013] пульпа зуба [Gronthos S. et al., 2011] и другие ткани.
ММСК способны вырабатывать несколько основных пулов биологически активных факторов: антиапоптические факторы (фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF), фактор роста гепатоцитов (HGF), инсулиноподобный фактор роста (IGF-1) и др.); проангиогенные факторы (VEGF, IGF-1, фактор роста тромбоцитов (PDGF) интерлейкин (ИЛ-6) и др.); иммуномодуляторные (монооксид азота (NO), простагландин Е2 (PGE2), ИЛ-10 и др.); факторы, стимулирующие пролиферацию тканевых стволовых и прогениторных клеток (фактор роста стволовых клеток (SCF), LIF, макрофагальный фактор роста и др.); факторы, ингибирующие фиброз и образование рубцов при ишемии (HGF, bFGF); хемоаттрактанты (15 хемокинов, опосредующих миграцию лейкоцитов в поврежденные ткани); [Meirelles da Silva L. et al., 2009]. ММСК способны продуцировать факторы, способствующие росту нейронов – нейротрофический фактор мозга (BDNF) [Neuhuber B. et al., 2005; Yang S.H. et al., 2009], морфогенезу тканей [Granero-Molto F. et al., 2009].
К перспективным технологиям восстановления мышечной ткани относят трансплантацию ММСК человека, полученных из жировой ткани [Пальцев М.А. и соавт., 2009; Zuk P.A. et al., 2002; Krampera M. et al., 2006]. ММСК из жировой ткани локализованы в стенках капилляров и артериол и имеют фибробластоподобную морфологию [Lin G. et al., 2008]. Они способны вырабатывать те же антигены, что ММСК костного мозга и могут дифференцироваться как в кардиомиоциты, гепатоциты и эндотелиальные клетки, так и в клетки мезодермального ряда (адипоциты, миоциты, остеоциты, хондроциты) [Lee R.H. et al., 2004; Gimbl J.M. et al., 2007; Vriter S. et al., 2015]. ММСК способны стимулировать рост сосудов и нервов в ишемизированных тканях [Ткачук В.А. и соавт., 2009].
Развитие тканевой гипоксии при повреждении мышц вызывает активацию в эндотелии микрососудов фактора гипоксии (HIF) [Hirsch A.T. et al., 2006; Hirota K. et al., 2006] и усиление синтеза проангиогенных факторов (VEGF, ангиопоэтин, оксид азота, HGF, FGF и др.) и ингибиторов ангиогенеза (ингибитор активатора плазминогена, эндостатин и др.) [Макаревич П.И. и соавт., 2011; Voskuil M. et al., 2001; Banas A. et al. 2007; Peroni D. et al., 2008].
По мнению ряда исследователей, именно тканевая гипоксия является тем важнейшим фактором, который способствует проявлению основных свойств ММСК в тканях [Буравкова Л.Б. и соавт., 2012; Das R. et al., 2010; Mohyeldin A et al., 2010]. В гипоксических условиях наблюдается изменение энергетического метаболизма ММСК в направлении преобладания аэробного гликолиза, что способствует повышению их пролиферативной активности и мультилинейной дифференцировке [Буравкова Л.Б. и соавт., 2011; Dos Santos F. et al., 2010]. ММСК способны трансдифференцироваться в клетки с характеристиками эндотелиальных клеток-предшественников [Asahara T. et al., 1997; Rookmaaker M.B. et al., 2005] и участвовать в процессах васкуляризации с помощью паракринных эффектов [Ishikawa T. et al., 2010; Katsuda T. et al., 2014]. ММСК способствуют образованию и росту капилляров [Moon M.H. et al., 2006; Rohban R. et al. 2013].
В экспериментах с моделированием острой ишемии введение ММСК непосредственно в мышцу вызывает усиление реваскуляризации конечности [Yoshida M. et al., 2003; Miranville A. et al., 2004; Miyahara Y. et al., 2006].
ММСК оказывают влияние на иммунную систему: способствуют пролиферации и дифференцировке Т-лимфоцитов, снижают активность естественных киллеров и активируют Т-регуляторные клетки [Zhao S. et al., 2010; Gebler A., et al., 2012]. ММСК способны уменьшать секрецию Т-клетками провоспалительных цитокинов и увеличивать секрецию противовоспалительного цитокина [Puissant B. et al., 2005; Caplan A.I. et al., 2015]. ММСК обладают иммуносупрессивными свойствами, поэтому они весьма перспективны для имплантации [Prockop D., 2009; Salem H., 2010; Bunnell B. et al., 2010; Singer N. et al., 2011].
Перфузионная функция микроциркуляции скелетных мышц области механической компрессии мягких тканей
Состояние скелетных мышц в ранний посткомпрессионный период характеризовалось существенным угнетением микроциркуляции области сдавления во всех исследуемых группах (Таблица 6). Спустя 7 сут после прекращения компрессии конечности показатель ПМ в поврежденных тканях животных, которым регионарно вводили 0,9% раствор натрия хлорида был снижен на 55% (р 0,05) по отношению к интактным животным, свидетельствуя о развитии перфузионных нарушений. Степень снижения показателя ПМ в микроциркуляторном русле травмированных животных, которым в зону сдавления вводили гель гиалуроновой кислоты без клеток, а также гель гиалуроновой кислоты с суспензией ММСК была менее выраженной и составляла 43–44% (р 0,05) от исходного уровня, на 11–12% (р 0,05) превышая показатель перфузии по сравнению с контрольной группой. Через 14 сут посткомпрессионного периода во всех исследуемых группах наблюдался прирост показателя ПМ. Тем не менее, его среднее значение оставалось достоверно сниженным по сравнению с исходным периодом на 29-42% (р 0,05). Различий показателя перфузии между группами животных, которым вводили гель гиалуроновой кислоты без клеточного компонента и с суспензией ММСК не отмечалось.
Такие различия регистрировались в поздний посткомпрессионный период. К исходу 28 сут наблюдения средние значения ПМ в поврежденной мышечной ткани животных, которым вводили регионарно суспензию ММСК в составе геля гиалуроновой кислоты, на 27–34% (р 0,05) был выше, чем в контрольной и основной группе II и приближался к исходному показателю микроциркуляции у здоровых животных.
Аналогичная динамика установлена при оценке переменной составляющей перфузии (). СКО амплитуды колебаний кровотока через 7 сут после декомпрессии конечности животных контрольной группы было существенно сниженным (на 49%, р 0,05) по сравнению с показателем «флакса» мышечного кровотока у животных интактной группы, отражая резкое угнетение механизмов активного контроля микроциркуляции. Показатель в зоне компрессионного повреждения мягких тканей голени крыс, которым регионарно вводили гель гиалуроновой кислоты без клеток на 37% (р 0,05) превышал значения контрольной группы, оставаясь на 30% (р 0,05) ниже показателя здоровых животных. Использование на данном сроке исследования суспензии ММСК в составе геля гиалуроновой кислоты после устранения компрессии конечности не вносило изменений в уровень «флакса», установленный при введении одного клеточного носителя.
Через 14 сут посткомпрессионного периода показатель во всех группах проявлял тенденцию к росту, однако различий между группами животных, которым в поврежденную область вводили гель гиалуроновой кислоты с ММСК и без них не наблюдалось.
Прирост показателя в микроциркуляторном русле травмированных животных, которым вводили суспензию ММСК в область повреждения, был существенно выше по сравнению с основной группой II и контрольной группой в поздний посткомпрессионный период. К исходу 28 сут применение ММСК в составе клеточного носителя гиалуроновой кислоты обеспечивало относительно группы животных, которым вводили гель гиалуроновой кислоты, не содержащий клеточный компонент, значимое повышение состояния сосудистого тонуса и активацию механизмов регуляции кровотока в микроциркуляторном русле (на 24%, р 0,05), практически достигая значений , отмеченного у животных интактной группы. Различий в показателе переменной составляющей перфузии у животных основной группы II и контрольной не наблюдалось.
Перфузионные характеристики микроциркуляции коррелировали с динамикой относительного объема фракции эритроцитов (Vr), оцениваемого по процентному содержанию гемоглобина в тестируемом объеме биоткани. Во все исследуемые сроки посткомпрессионного периода показатель фракционного объемного кровенаполнения русла в области компрессионного повреждения мягких тканей у животных контрольной группы, которым вводили 0,9% раствор натрия хлорида, достигал 28–33,8%, существенно (на 11–17%, р 0,05) превышая значения, установленные у интактных животных. Через 7 сут после воздействия показатель относительного объема фракции эритроцитов относительно контроля в основных группах I и II не изменялся. Спустя 14 сут после компрессионной травмы в группе животных, которым регионарно вводили гель гиалуроновой кислоты, отмечалось определенное снижение относительного объема фракции эритроцитов с 33,8% до 29,9% (р 0,05). Регионарное введение в поврежденные мягкие ткани суспензии ММСК на гелевом носителе (основная группа I) к исходу 14 сут после прекращения компрессии тканей позволяло более выраженно (с 29,9% до 24,7%, р 0,05) снизить показатель Vr по сравнению с показателем в основной группе II животных, получавших гель гиалуроновой кислоты без клеток.
Через 28 сут после прекращения компрессии показатель относительного объема фракции эритроцитов в основной группе II составлял 27,4% не отличался от значений Vr у животных контрольной группы. В этот срок наблюдения показатель относительного объема фракции эритроцитов в основной группе I снижался по сравнению с показателем Vr в группе животных, получавших регионарно гель гиалуроновой кислоты, до 21,6% (р 0,05), свидетельствуя о достоверном вкладе ММСК в восстановление микроциркуляции поврежденных мягких тканей в позднем посткомпрессионном периоде.
Морфометрическая характеристика мягких тканей области компрессии
До нанесения компрессионной травмы мягких тканей голени крыс мышечные волокна расположены компактно и при морфометрическом исследовании полей зрения занимают площадь около 90-92% (Таблица 9). Продолжительное сдавление мягких тканей вызывало грубые структурные изменения скелетных мышц в зоне воздействия. Спустя 7 сут после компрессии мягких тканей голени у крыс контрольной группы, которым в зону повреждения локально вводили 0,9% раствор натрия хлорида, наблюдалось выраженное снижение относительной площади мышечных волокон с 92,1% до 39,5% (на 52,6%, р 0,05). В последующие сроки после воздействия (через 14 сут) у животных этой группы отмечалось несущественное (на 7,9%) повышение площади мышечных волокон. К исходу наблюдения (через 28 сут) суммарная относительная площадь мышечных волокон составляла 50%, оставаясь на 42% (р 0,05) ниже, чем у животных интактной группы.
Введение в зону повреждения геля гиалуроновой кислоты обеспечивало определенную сохранность мышечной ткани травмированных животных. Через 7 сут после введения препарата у животных данной группы относительная площадь мышечных волокон была на 12,3% (р 0,05) выше, чем у животных, которым регионарно вводили 0,9% раствор натрия хлорида и составляла 51,8%.
8 остальные сроки исследования (14-28 сут) различия между основной группой II и контрольной группой составляли 17-18,4% (р 0,05). Тем не менее, при использовании геля гиалуроновой кислоты относительная площадь мышечных волокон в эти сроки наблюдения составляла 64,5-68,4%, оставаясь на 23,7-40% (р 0,05) ниже, чем у интактных животных.
Наиболее выраженное восстановление мышечных волокон отмечалось у травмированных животных после регионарного применения суспензии ММСК человека в гелевом носителе гиалуроновой кислоты. Уже к исходу первой недели после сдавления относительная площадь мышечных волокон составляла 62,4%, на 10,6% (р 0,05) значимо превышая показатель у животных, которым вводили гель гиалуроной кислоты без клеточной суспензии.
В последующие сроки наблюдения (14 сут и 28 сут) эти различия были еще более существенными и составляли соответственно 14% (р 0,05) и 17,2% (р 0,05). Относительная площадь мышечных волокон при регионарном применении клеточного препарата в эти сроки наблюдения достигала 78,9% и 85,6% и несущественно отличалась (на 6,5% и 13,2%) от значений у интактных животных.
Процессу посттравматической регенерации мышечных волокон сопутствовала положительная динамика сокращения зон межмышечных интерстициальных пространств под влиянием клеточного препарата в составе геля гиалуроновой кислоты (Таблица 10). Спустя 7 сут после травмы у животных контрольной группы, которым локально вводили 0,9% раствор натрия хлорида, определялось значительное увеличение относительной площади межмышечных интерстициальных пространств по сравнению с площадью у интактных животных с 7,9% до 58,5% (р 0,05). В последующие сроки наблюдения (14-28 сут) площадь интерстициальных пространств умеренно сокращалась (на 7,9-11,5%), оставаясь значительно выше исходного периода до нанесения травмы (соответственно 50,6% и 47% от общей площади, при р 0,05).
Локальное введение в область компрессионного повреждения мягких тканей геля гиалуроновой кислоты позволило уже в ранний посттравматический период снизить объем межмышечных интерстициальных пространств. Через 7 сут после применения препарата площадь межмышечных пространств составляла 46,1%, что на 12,4% (р 0,05) ниже, чем у травмированных животных контрольной группы, которым локально вводили 0,9% раствор натрия хлорида. К исходу 14 сут и 28 сут эти различия достигали соответственно 17,1% (р 0,05) и 16,4% (р 0,05). В тоже время относительный объем межмышечного интерстициального пространства в области механической компрессии скелетных мышц при введении геля гиалуроновой кислоты сохранялся значительным и составлял соответственно 33,5% и 30,6%, что на 23,1% и 25,6% (р 0,05) выше объема у животных интактной группы.
Наиболее значимое уменьшение относительного объема межмышечного интерстициального пространства в зоне посткомпрессионных повреждений регистрировалось у животных с регионарным введением препарата ММСК в геле ГК. Через 7 сут после травмирующего воздействия объем интерстициального пространства у животных этой группы составлял 36,3%, что на 9,8% (р 0,05) ниже, чем у животных основной группы II, получавших гель гиалуроновой кислоты без клеточного компонента. Спустя 14 сут после введения препарата показатель межмышечного интерстициального пространства снижался на 15,4% (р 0,05) по отношению к контролю и составлял 18%, отличаясь на 10% (р 0,05) от значений у интактных животных. К исходу 28 сут после компрессионной травмы инфильтрация области повреждения суспензией ММСК в составе геля гиалуроновой кислоты приводила к наиболее выраженному снижению относительной площади интерстициального пространства (на 17%, р 0,05) по отношению к животным, получавшим гель гиалуроновой кислоты без ММСК. Исследуемый показатель площади интерстициального пространства не превышал 13,7%, недостоверно отличаясь (на 5,8%, р 0,05) от значений, установленных у нетравмированных животных.
Выраженность компонента соединительной ткани в формировании мышечно-соединительнотканного регенерата в поврежденной скелетной мышце рассчитывалась с помощью индекса стромально-мышечных отношений (Таблица 11). Нанесение животным контрольной группы компрессионной травмы характеризовалось существенным изменением стромально-мышечного соотношения. Через 7 сут после воздействия соотношение площади межмышечных интерстициальных пространств и площади мышечных волокон возрастало с 9% до 148%, в 16 раз (р 0,05) превышая данный показатель у нетравмированных животных.
В последующие сроки наблюдения (14-28 сут) индекс стромально мышечных отношений имел тенденцию к снижению, однако оставался высоким (94-106%), в 10-12 раз (р 0,05) превышая значения чем в группе интактных животных, что свидетельствует о существенном превалировании соединительнотканного компонента в составе мышечно соединительнотканного регенерата.
Инфильтрация поврежденных скелетных мышц гелем гиалуроновой кислоты приводила к снижению выраженности стромального компонента. Через 7 сут после травмы доля межмышечных интерстициальных пространств по отношению к мышечному компоненту была в 1,6 раза ниже (р 0,05), чем у травмированных контрольных животных, которым вводили 0,9% раствор натрия хлорида, и составляла 89%. Спустя 14 сут и 28 сут после введения препарата индекс стромально-мышечных отношений не превышал соответственно 52% и 45%, что более чем в 2 раза ниже (р 0,05), чем у травмированных животных контрольной группы.
Наиболее значимая инверсия стромально-мышечных отношений отмечалась при введении ММСК в составе геля гиалуроновой кислоты. К исходу первой недели после компрессионной травмы индекс выраженности соединительной ткани составлял 58%, что в 1,5 раза (р 0,05) ниже по сравнению с показателем в группе травмированных животных, которым вводили клеточный носитель без ММСК. Спустя 14 сут после компрессионного воздействия доля соединительнотканного компонента в группе животных ММСК по отношению к животным основной группы II, у которых использовался гель гиалуроновой кислоты, снижалась в 2,2 раза (р 0,05) и составляла 23%. Через 28 сут посткомпрессионного периода показатель стромально-мышечных отношений был ниже контрольных значений в 2,8 раза (р 0,05) и составлял 16%, несущественно превышая значения у животных интактной группы.
Таким образом, морфометрический анализ посткомпрессионных нарушений в скелетной мышце позволил выявить структурные перестройки, свидетельствующие о массивной посттравматической дегенерации мышечной ткани с существенным увеличением доли межмышечных интерстициальных пространств и их замещением соединительной тканью. Локальная инфильтрация поврежденных скелетных мышц гелем гиалуроновой кислоты и суспензией ММСК в геле гиалуроновой кислоты приводит к существенному увеличению доли мышечного компонента мышечно-соединительнотканного регенерата и значительному снижению выраженности формирования фиброза. Наиболее выраженные сдвиги установлены в условиях пересадки в геле гиалуроновой кислоты культивированных ММСК.
Иммуногистохимические показатели ангиогенеза и пролиферации поврежденных скелетных мышц в посткомпрессионном периоде
До нанесения травмы наблюдалась единичная экспрессия VEGF-позитивных структур в скелетной мышце крыс (Рисунок 14А). В срезах мышц только двух из девяти интактных животных отмечались незначительные (в пределах 1 балла) зоны VEGF-положительных клеток. Средняя плотность специфического окрашивания не превышала 0,22±0,13 балла (Таблица 12).
Ранний посткомпрессионный период характеризовался увеличением числа VEGF-позитивных клеток в зонах повреждения скелетных мышц голени во всех исследуемых группах. К исходу первых 7 суток после компрессии у животных контрольной группы, которым вводили 0,9% раствор натрия хлорида, плотность VEGF-позитивных клеток составляла 1,25±0,15 баллов. Введение в область компрессионной травмы геля гиалуроновой кислоты выявило умеренное усиление экспрессии VEGF-позитивных клеток по сравнению с аналогичным показателем иммуногистохимической плотности в контрольной группе (1,6±0,2 балла, р 0,05). Достоверно значимые различия в экспрессии VEGF среди исследуемых групп установлены в скелетных мышцах травмированных животных с введением в область повреждения суспензии ММСК, заключенной в гель гиалуроновой кислоты. У трех из семи животных наблюдался высокий (четырехбальный) уровень плотности VEGF-позитивных клеток, чего не отмечалось ни в одной из групп. При использовании ММСК в геле гиалуроновой кислоты средняя численность VEGF-положительных структур в этот срок исследования достигала 2,85±0,4 баллов, значимо (р 0,05) превышая значения в контроле и основной группе II.
Наиболее выраженные сдвиги в активации ангиогенеза под влиянием ММСК в геле гиалуроновой кислоты установлены в промежуточный посттравматический период. Спустя 14 сут после механической компрессии мягких тканей уровень экспрессии VEGF-позитивных клеток в срезах скелетных мышц животных с введением в область повреждения гелевой формы клеточного препарата расценивался как высокий (4 балла) и очень высокий (6 баллов), составляя в среднем 4,8±0,5 баллов (Рисунок 14Б). Регионарное применение геля гиалуроновой кислоты без ММСК индуцировало более низкие значения плотности VEGF-положительных структур (3,2±0,5 баллов, р 0,05) (Рисунок 14В). У животных контрольной группы, которым вводили изотонический солевой раствор, несмотря на динамическое повышение численности в поврежденных скелетных мышцах VEGF-позитивных клеток, уровень экспрессии не превышал 1,8±0,2 баллов, что значимо (р 0,05) ниже по сравнению с исследуемыми группами (Рисунок 14Г).
В поздний посткомпрессионный период экспрессия молекулярного маркера, контролирующего ангиогенез, в поврежденной скелетной мышце снижалась, однако сохраняла положительную направленность. В травмированных мышцах животных контрольной группы, которым в область компрессии вводили изотонический раствор натрия хлорида, плотность VEGF 98 положительных клеток спустя 28 сут после введения препарата характеризовалась как низкая и умеренная (1,6±0,25 баллов). При локальной инфильтрации поврежденных мышц гелем гиалуроновой кислоты уровень экспрессии клеточного VEGF-маркера несущественно снижался по сравнению с предыдущим этапом наблюдения с 3,2±0,5 баллов до 2,4±0,4 баллов и расценивался как преимущественно умеренный. Регионарное введение животным в область компрессионного повреждения мягких тканей клеточного препарата в гелевой среде сохраняла к исходу 28 сут преимущественно высокую плотность VEGF-позитивных клеток (4,0±0,4 баллов), достоверно (р 0,05) отличаясь от показателей к контрольной группе. Таким образом, локальная пересадка в зону компрессионного повреждения мягких тканей ММСК в составе геля гиалуроновой кислоты уже в ранние сроки после травмы позволяет достигать высокой и продолжительной экспрессии VEGF –позитивных клеток. Гиалуроновой кислота, используемая в качестве клеточного носителя, обладает умеренным проангиогенным действием и способна участвовать в регуляции неоангиогенеза. Наблюдаемое под действием ММСК и геля гиалуроновой кислоты аддитивное увеличение активности VEGF в клеточных структурах поврежденных скелетных мышц может приводить к усилению экспрессии ангиогенных факторов, стимулируя процессы репаративной регенерации по ауто- и паракринному механизму.
Аналогичные закономерности установлены при иммуногистохимической оценке маркера пролиферации (Таблица 13). До нанесения компрессионной травмы в скелетных мышцах голени крыс отмечалась единичная экспрессия маркера Ki-67, не превышающая 6,8% (Рисунок 15А).
В ранний посткомпрессионный период (через 7 сут после травмы) в поврежденных скелетных мышцах животных, которым локально вводили 0,9% раствор натрия хлорида, содержание Ki-67 – пролиферирующих клеток увеличивалось до 13,6%, оставаясь в пределах диапазона низких значений. К исходу 14 сут после травмирующего воздействия наблюдался незначительный прирост индекса пролиферации до 19,2% (р 0,05) с последующим несущественным снижением до 16,1% (р 0,05) к исходу 28 сут после прекращения компрессии относительно показателя у интактных животных (Рисунок 15Б). Данные изменения также не превышали 20% и находились в пределах низких значений уровня пролиферации.
Локальная инфильтрация скелетных мышц голени в зонах компрессионного повреждения гелем гиалуроновой кислоты создавала условия для более активной пролиферации клеточных структур. В ранний посткомпрессионный период индекс пролиферации в срезах скелетных мышц в 1,8 раза (р 0,05) превышал значения, установленные в контрольной группе и составлял 25,3±3,4%, что соответствует умеренной степени экспрессии иммунопозитивных клеток. Через 14 сут после травмы в этой группе животных наблюдалось нарастание численности Ki-67 – позитивных ядер до 31,4±4,5% с последующим (к исходу 28 сут) несущественным снижением до 27,2±3,8% (Рисунок 15В). Следовательно, во все сроки наблюдения после нанесения компрессионной травмы отмечался умеренный уровень экспрессии Ki-67 – пролиферирующих клеток.
Наибольшая численность Ki-67-позитивных клеток выявлена в поврежденных скелетных мышцах животных, которым выполнялось регионарное введение клеточного препарата на основе ММСК. Уже в ранний посткомпрессионный период (к исходу 7 сут после травмы) индекс пролиферации Ki-67 – иммунопозитивных клеток достигал 43,5±5,6%, в 1,75 раза (р 0,05) превышая данный показатель у животных основной группы II с инфильтрацией области повреждения гелем гиалуроновой кислоты без клеточного компонента и соответствовал переходной границе умеренной к высокой иммуногистохимической плотности Ki-67-маркера.
В последующие сроки наблюдения (через 14 сут и 28 сут посткомпрессионного периода) отмечалось дальнейшее увеличение содержания Ki-67-экспрессирующих клеток в поврежденных скелетных мышцах соответственно до 58,4-69,6%, что в 2,1-2,2 раза (р 0,05) выше значений в контрольной группе (рис. 15 Г). Такое содержание исследуемого иммуногистохимического маркера соответствует высоким значениям плотности пролиферирующих клеток.
Таким образом, показатели индекса выраженности Ki-67 - позитивных клеток в скелетных мышцах свидетельствуют о пролиферативной активности поврежденной мышечной ткани. Процесс посттравматической регенерации скелетных мышц при тяжелой компрессионной травме протекает в условиях сниженной интенсивности процессов пролиферации и ангиогенеза. Наиболее ранними событиями в процессах посттравматической регенерации мышечной ткани является нарушение механизмов пролиферации миобластов и ангиогенеза скелетных мышц. Топическая пересадка в зону компрессионного повреждения мягких тканей культивированных ММСК в составе геля гиалуроновой кислоты вызывает повышение плотности Ki-67 – экспрессирующих ядер клеток, а также нарастание числа VEGF – позитивных клеточных структур скелетных мышц.