Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Низкомолекулярные аминотиолы плазмы крови и их роль в патогенезе ишемического повреждения мозга
1.1 Биохимия гомоцистеина и других аминотиолов
1.1.1 Содержание и фракционный состав гомоцистеина и других аминотиолов в плазме крови 10
1.1.2 Биосинтез и пути метаболизма аминотиолов .12
1.1.3 Химические свойства SH-групп тиолов .16
1.1.4 Аминотиолы и антиоксидантная защита организма 17
1.2 Механизмы повреждающего действия гомоцистеина
1.2.1 Внутриклеточные мишени повреждающего действия гомоцистеина 19
1.2.2 Гомоцистеинилирование белков плазмы крови
1.3 Нейротоксичность гомоцистеина .26
1.4 Глутатионилирование белков как механизм цитопротекции при ишемическом повреждении головного мозга 29
ГЛАВА 2. Аналитические платформы и технологии мониторинга уровня гомоцистеина и других аминотиолов в плазме крови
2.1 Общие замечания 33
2.2 Высокоэффективная жидкостная хроматография
2.2.1 ВЭЖХ-Фл 34
2.2.2 ВЭЖХ-УФ 36
2.2.3 ВЭЖХ-МС 39
2.2.4 ВЭЖХ c детектором сцинтилляции 40
2.2.5 Электрохимический детектор 40
2.3 Капиллярный электрофорез
2.3.1 КЭ-УФ .41
2.3.2 КЭ-ЛИФ 44 Раздел II. собственные исследования
ГЛАВА 3. Общая характеристика экспериментального материала и дизайн исследования
3.1 Реактивы 46
3.2 Материалы и Оборудование
3.2.1 ВЭЖХ 46
3.2.2 Масс-спектрометрия 47
3.2.3 Капиллярный электрофорез
3.3 Объекты исследования 47
3.4 Экспериментальные модели на животных
3.4.1 Моделирование фокальной ишемии головного мозга 47
3.4.2 Моделирование глобальной ишемии головного мозга 48
3.4.3 Моделирование гипергомоцистеинемии у крыс 48
3.4.4 Регистрация мозгового кровотока 49
3.5 Методы определения аминотиолов
3.5.1 Определение фракций Гцис в плазме крови по его NEM-производному с использованием ВЭЖХ-МС... 49
3.5.2 Определение фракций аминотиолов в плазме крови по их ТНБ-производным методом ВЭЖХ-УФ 51
3.5.3 Определение фракций аминотиолов в плазме крови по их mBrB-производным методом ВЭЖХ-Фл 52
3.5.4 Прямое определение общего гомоцистеина в плазме крови с использованием КЭ-МС.. 53
3.5.5 Метод КЭ-УФ для определения связанных аминотилов по их тиокарбонильным производным 55
ГЛАВА 4. Результаты и обсуждение
4.1 Прямое определение общего гомоцистеина плазмы крови методом капиллярного электрофореза и масс-спектрометрии 56
4.2 Определение связанных аминотиолов плазмы методом капиллярного электрофореза по их циклическим S,N-тиокарбонильным производным 59
4.3 Анализ плазменных фракций гомоцистеина по его N-этилсукцинимидному производному с использованием хроматомасс-спектрометрии 64
4.4 Определение общих и восстановленных аминотиолов плазмы крови человека методом жидкостной хроматографии по их тионитробензойным производным. 69
4.5 Сравнение хроматографических методик определения гомоцистеина, цистеина и глутатиона .74
4.6 Апробация метода жидкостной хроматографии для определения аминотиолов по их тионитробензойным производным
на экспериментальной модели гипергомоцистеинемии 82
4.7 Редокс-статус аминотиолов плазмы крови крыс при локальной
и глобальной ишемии головного мозга .87
Выводы 97
Заключение 99
Список литературы 100
Список сокращений и обозначений..
- Содержание и фракционный состав гомоцистеина и других аминотиолов в плазме крови
- ВЭЖХ c детектором сцинтилляции
- Капиллярный электрофорез
- Определение связанных аминотиолов плазмы методом капиллярного электрофореза по их циклическим S,N-тиокарбонильным производным
Содержание и фракционный состав гомоцистеина и других аминотиолов в плазме крови
К низкомолеклярным аминотиолам относят множество соединений, из которых наибольшую роль в организме играют гомоцистеин, цистеин и глутатион. Гомоцистеин (Гцис) - непротеогенная аминокислота, обладающая множеством молекулярных мишеней, обусловливающих многообразие патогенетических механизмов клеточного повреждения с его участием. Большое число факторов влияет на его содержание в плазме крови: возраст, пол, беременность, особенности питания, прием антагонистов витаминов группы В и др. [Broxson Е.Н. et al. 1989 , Ueland P.M. et al. 1993]. Под верхней границей нормального содержания общего Гцис (ТГцис) обычно приводят значения 10-15 мкМ [Amores-Sanchez М. and Medina М.А. 2000, Wiley V.C. et al. 1988; Ueland P.M. et al. 1993], но выделение границ нормы имеет несколько условный характер и служит только для общего ориентирования. Превышение этого порога называется гомоцистеинемией (ГГц). Для женщин характерны более низкие значения общего Гцис (примерно на 2 мкМ), но с возрастом разница пропадает и в среднем уровень ТГцис поднимается от младенчества до старости примерно в два раза [Refsum H. et al.2004]. Так у 30% пожилых людей наблюдается его уровень 14 мкМ [Selhub J. et al. 1995]. Потребление витаминов группы В оказывает существенное влияние на уровень Гцис и является основной причиной вариабельности референтных значений в популяциях. Индивидуальные же изменения общего Гцис составляют около 8 % для измерений, проводимых по единым правилам в течение 1 года [Refsum H. et al.2004], однако суточные колебания ТГцис (и, в особенности, его фракций) связаны с приемом пищи и могут быть значительно больше. С его ростом возрастают и его индивидуальные колебания, достигая 25% при ГГц выше 40 мкМ [Refsum H. et al.2004].
ГГц имеет три степени: умеренную, среднюю и тяжелую. Умеренная ГГц (TГцис 10-30мкМ) наиболее распространена, особенно у пожилых людей. Она может быть ассоциирована с почечной недостаточностью и умеренным дефицитом Вi2, В9 [Selhub J. et al. 1993], также при ряде мутаций цистатионин-р-синтазы и MTHFR [Klerk M. et al. 2002]. У большинства людей с Віг-дефицитом также повышен TГцис плазмы [Ueland P.M. et al. 1993], и имеется негативная корреляция между ними в области субнормальных значений кобаламина (130-300 пМ) [Ueland P.M. et al. 1993]. Отсюда анализ ТГцис имеет некоторые преимущества перед Bi2, т.к. Гцис отражает не столько дефицит фолата номинальный, сколько функциональный, т.е. дефицит внутриклеточного фолата или нарушение молекулярных фолат-зависимых реакций. Это позволяло бы его использовать в качестве маркера дефицита, однако диагностическая значимость Гцис как маркера дефицита Bi2 невелика вследствие его неспецифичности и уступает определению метилмалоновой кислоты [Ueland P.M. et al. 1993]. Показано, что чрезмерное употребление кофе, курение и алкоголизм сопровождаются развитием умеренной Ггц и большинство исследований, посвященных определению взаимосвязей уровня Гцис с различными заболеваниями, сталкиваются с данной группой ГГц.
Средняя ГГц (ТГцис 30-100 мкМ) наблюдается также, как правило, у людей с недостаточностью Bi2 и Вд, при почечной недостаточности. В последнем случае ГГц возникает из-за нарушения клиренса Гцис [Friedman A.N. et al. 2001]. В работе [Manssor М.А. et al. 1994] на небольшой выборке людей, имеющих ГГц и дефицит Вп, было показано существенное возрастание восстановленного Гцис ( 2 мкМ) по сравнению с контрольной группой (0,24 мкМ), притом не только в абсолютных значениях, но и относительно общего Гцис плазмы, поэтому характер зависимости восстановленный-общий Гцис имел не линейный, а экспоненциальный характер.
Наследственные нарушения метаболизма метионина могут приводить к тяжелой форме ГГц, при которой уровень ТГцис превышает 100 мкМ в плазме крови и моче. Среди людей с такими нарушениями (называемых вместе наследственной гомоцистинурией) высок процент ССЗ, инсультов, деформаций скелета, нарушение зрения [Mudd S.H. et al. 1985]. В большинстве случаев у них обнаруживается аутосомно-рецессивная форма дефектов цистатионин-р-синтазы.
Существуют наследственные заболевания, обозначаемые как гомоцистинурии, сопровождаемые очень высоким уровнем плазменного гомоцистеина. Само соединение было открыто в 30-х годах ХХ века [Butz L.W. and du Vigneaud V. 1932], но только спустя три десятилетия исследования гомоцистинурии привлекли интерес ученых к Гцис и положили начало его лабораторной диагностике [Gerritaen T. et al. 1962, Carson N.A.J. and Neil D.W. 1962].
Гцис-снижающая терапия (применение витаминов B6, Вп, бетаина, фолата, ограниченное потребление метионина) во многих случаях оказывает выраженный клинический эффект (но не снижают риск развития инсульта), хотя лишь частично снижает Гцис плазмы [Wilcken D.E.L. and Wilcken В. 1997, Lentz S.R. and Haynes W.G. 2002].
Свободный Гцис состоит из восстановленного (1% от общего Гцис) и окисленного пула (5-10% Гцис и столько же смешанного дисульфида Гцис-Цис). Остальная часть TГцис связана с белками дисульфидными связями [Wiley V.C. et al. 1988], другие дисульфидные формы Гцис (Гцис-ЦисГли и Гцис-Глн) присутствуют в незначительных количествах [Mudd S.H. et al. 2000]. Часть Гцис образует амидные связи с боковыми цепями лизина ( 3 мкМ [Jakubowski Н. 2006]), и тиолактоновая форма ( 30 нМ [Jakubowski H. 2006]) которые при анализе, как правило, не учитываются. Верхний предел нормальной концентрации Гцис принимается за 12-15 мкМ [Wiley V.C. et al. 1988; Ueland P.M. et al. 1993], у пациентов с гомоцистинурией Гцис может достигать 500мкМ, что превышает связывающую емкость плазменных белков ( 140мкМ [Wiley V.C. et al. 1988]). У детей Гцис ниже (4-8мкМ) [Refsum H. et al. 1991].
Данные о возможных суточных вариациях плазменного Гцис немногочисленны и неполные. Одни авторы не находят различий [Malinow M.R. et al. 1989], другие отмечают небольшой, но значимый подъем общего Гцис после приема пищи в течение 2-4 ч с возвращением к 8 часу на исходный уровень [Ubbink J.B. et al. 1992]. Для здоровых людей характерен постоянный уровень Гцис в течение многих лет [Ueland P.M. et al. 1993].
Общее содержание других низкомолекулярных аминотиолов в плазме крови и их фракционный состав приведен в таблице 1. Была показана линейная связь между соотношениями восст./общ. Гцис, Цис, Цис-Гли [Mansoor M.A. et al. 1993a, 1994], что является отражением гомеостаза окислительно-восстановительного состояния тиолового пула. Также выявлена обратная корреляция содержания белок-связанных форм этих тиолов [Mansoor M.A. et al. 1994], отражая их конкурентные отношения за места связывания с белками. Изменения равновесия между фракциями аминотиолов в плазме происходят очень короткое время (за минуты) [Mansoor M.A. et al. 1993b].
ВЭЖХ c детектором сцинтилляции
Сравнительно новый аналитический метод, который в последние два десятилетия получил бурное развитие в анализе разнообразных классов соединений – от металлов до ДНК и белков. Чрезвычайная гибкость в выборе подвижных фаз, покрытий, а также простота и экономичность позволяют в ряде случаев КЭ успешно конкурировать с ВЭЖХ. Выбор детекторов для КЭ не уступает ВЭЖХ, однако их чувствительность ограничена объемом инжекции и здесь КЭ существенно уступает.
Наибольшее распространение получили КЭ системы, оснащенные УФ-детекторами. Сама возможность использования КЭ-УФ в диагностике несет в себе большое преимущество перед другими методами разделительного анализа, т.к. он максимально приближен к клинико лабораторным требованиям простоты, эффективности и экономичности (дешевле оборудование, используется много меньше растворов и реактивов, сам анализ протекает быстрее). Прямой анализ аминотиолов в модельном растворе [Zinellu A. et al. 2010] позволяет достичь чувствительности 1 мкМ по Гцис, однако детекция при 190-200 нм в плазме крови встречает существенные затруднения. Без использования дериватизирующих агентов в режиме зонного КЭ возможно определение только сравнительно высоких (десятки мкМ и выше) концентраций тиолов в биологических жидкостях [Russell J. et al. 1996; Carru C. et al. 2002], но совершенно недостаточно для определения в плазме.
Описано несколько примеров применения КЭ для разделения производных аминотиолов, обладающих заметным поглощении в УФ диапазоне [Russel J. et al. 1996, Kubalczyk P. and Bald E. 2006] (за исключением ABD-F и mBrB-производных, но они здесь не рассматриваются т.к. обладают флуоресценцией). Это объясняет меньшее распространением самого КЭ, низкой чувствительностью детекторов по сравнения с ВЭЖХ, а также тем обстоятельством, что большинство модификаторов для анализа биомолекул разрабатывалось исходя из возможности их хроматографического разделения. Тем не менее, его гибкость и многообразие режимов позволяют использовать ТНБ-, ТКДИ- и CMQT- производные тиолов для КЭ-анализа. В последнем случае псевдоизотахофореза с добавлением в пробу ацетонитрила позволило измерять общий Гцис [Kubalczyk P. and Bald E. 2006] с помощью CMQT, однако чувствительность была 1 мкМ, что на порядок ниже в сравнении с ВЭЖХ [Chwatko G. and Bald E. 2002].
Также интерес представляет работа [Sevcokova P. et al. 2003], в которой представлена дериватизация (2,2-дитиопиридином) тиолов непосредственно в капилляре. Для этого в капилляр вводили зоны реагента в ацетонитриле и образец депротеинизированной ССК плазмы, восстановленный TCEP, разделенные электролитом с мицеллами SDS. Когда в процессе фореза аналиты достигали зоны реагента, происходила реакция дисульфидного обмена с формированием тионной формы тиопиридина, обладающей абсорбцией при 343 нм. По ней определяли содержание аминотиола в пробе. Чувствительность метода составляла 6 мкМ по Гцис, время анализа 9 мин. Данный подход можно рассматривать как аналог постколоночной дериватизации [Andersson A. et al. 1993], однако здесь имеется несколько ограничений. Во-первых, сама схема пробоподготовки может содержать трудности для определения восстановленных аминотиолов. Если при определении общего содержания или свободной формы все аналиты пробы восстанавливают, т.е. там нет дисульфидов, то пробах без восстановителя дисульфидные формы, встречаясь с тиопиридином, могут захватывать его, снижая сигнал. Во-вторых, чувствительность метода недостаточна для точного определения нормальных значений общего Гцис. В-третьих, сигнал от Цис на представленной в работе электрофореграмме явно ниже, чем ожидаемый исходя из его концентрации в плазме и стехиометрии реакции. Все это указывает на то, что данному подходу требуется дальнейшая оптимизация.
КЭ в отличие от ВЭЖХ является методом, который весьма чувствителен к солевому составу пробы. Это особенно актуально, если речь идет о большом объеме инжекции и концентрировании аналитов в капилляре. Плазма крови является весьма сложным объектом в этом отношении, а после кислотной депротеинизации возможности концентрирования практически не применимы из-за высокой ионной силы образцов. Поэтому методы очистки проб или т.н. “фишинга”, т.е. специфической адсорбции аналитов на условно неподвижной фазе особенно актуально для КЭ-УФ. Использование для этих целей золотых наночастиц с полимерным покрытием [Chang C.-W. and Tseng W.-L. 2010, Shen C.-C. Et al. 2009] позволило достичь чувствительности 10-65 нМ. Преимущества Au-наночастиц в их специфичности и эффективности сорбции, а главное в возможности концентрировать и очищать аналиты непосредственно в пробе. Авторы использовали кислый (рН 1) электролит, что в сочетании с относительно длинным (60 см) и широким (75 мкм) капилляром увеличило время анализа до 40 мин. Этот метод применим для определения общих, свободных и связанных тиолов, однако о возможностях его применения для восстановленной фракции пока нет данных. Восстановление образцов проводили используя TCEP, депротеинизацию ультрафильтрацией, десорбцию аналитов ДТТ. Учитывая современное развитие наночастиц, данный подход представляет большие перспективы.
Из списка коммерчески доступных реагентов для получения производных с поглощением в УФ-диапазоне представляет интерес ТКДИ. Реакция его с аминотиолами (Рис. 4.3) имеет особенности по сравнению с другими реагентами. Во-первых, это слабо ионизируемое соединение и в дальнейшем будет показано, что это важно для КЭ. Во-вторых, в отличие от большинства модификаторов ТКДИ не присоединяется к аминотиолу всей структурой, а отдает молекуле аналита всего два атома С=S (тиокарбонильную группу), при этом высвобождается две молекулы имидазола. Обобщенно реакция показана на рисунке 7, где под -R- подразумевается углеродный скелет аминотиола. Так образуются циклические 5-членные тиоксотиазолидиновые (из Цис, Цисгли, пенициламина (ПА)) и 6-членные тиоксотетрагидротриазиновые (из Гцис) карбоксильные кислоты. Таким образом, ТКДИ можно охарактеризовать как неспецифический бифунциональный сшивающий агент. У глутатиона, ввиду удаленности его -NH2 и -SH групп, затруднено образование циклического производного. Возможность S,N-тиокарбонилирования у-глутамилцистеина ещё не исследована.
Так большой интерес представляет возможность электрокинетического инжекции (ЭИ) образов когда аналиты под действием электрополя из пробы перемещаются в капилляр и одновременно концентрируются в узкой зоне. При этом предел обнаружения при этом может снижаться (по сравнению с гидродинамической инжекцией) от мМ до мкМ и ниже, т.е. на несколько порядков. При этом разрешающая способность при ЭИ может быть выше за счет узкой зоны концентрирования аналита. У ЭИ существуют 2 особенности: вводятся только заряженные молекулы одного знака и эффективность ввода определяется проводимостью растворами в пробе и капилляре. Как известно, скорость движения заряженной частицы в электрическом поле зависит от напряженности (первой производной по координатам напряжения). В однородном растворе напряженность имеет постоянное значение во всех участках капилляра (за исключением пристеночных эффектов), но если появляются участки с различной проводимостью, то однородность поля нарушается. В участках, где проводимость ниже, напряженность растет и подвижность ионов увеличивается. Поэтому для эффективного ЭИ раствор пробы должен иметь низкую проводимость (т.е. высокое сопротивление). Это достигается обессоливанием пробы, т.к. иные способы снижения проводимости (введение органических растворителей) неэффективны, т.к. влияют на ионизацию самих аналитов. Необходимо отметить, что решающее значение имеет не разность, а соотношение проводимостей растворов. Для наглядности можно рассмотреть следующий пример. Пусть в капилляре будут две зоны - с низкой (С1) и высокой (С2) проводимостью (Рис. 2.4). На этих участках напряженность поля постоянна и ей соответствует падение напряжения U1 и U2. Т.к. сила тока (I) для обоих участков постоянна, то I= U1 C1=U2 C2
Капиллярный электрофорез
Таким образом, несмотря на то, что масс-спектрометрия с электрораспылительным источником ионизации позволяет производить прямой анализ низкомолекулярных аминотиолов, для определения их восстановленных форм требуется химическая дериватизация по трем причинам. Во-первых, ввиду низкого содержания аналитов для увеличения ионизационной способности. Во-вторых, для увеличения времени удерживания аналитов и отделения их от соединений, проявляющих ионную супрессию. И, в-третьих, для собственно стабилизации восстановленных форм (предотвращения их окисления). Последние две проблемы можно решить альтернативными путями за счет выбора неподвижных фаз, введения ТФЭ и кислотной преципитации образцов, но первая остается основной проблемой МС. Имеющиеся публикации, как было показано выше, продемонстрировали, что чувствительность даже современных приборов недостаточна для определения концентрации Гцис на уровне 100 нМ и ниже. Поэтому применение модификатора являлось необходимым шагом на пути решения этой задачи. Оно позволило поднять чувствительность ВЭЖХ-МС на уровень методик ВЭЖХ-Фл, но, в отличие от последних, не требует применения дорогостоящих модификаторов, многие из которых дают нестабильные и интерферирующие аддукты. Кроме того, объем данных, который может быть получен с помощью МС, позволяет проводить исследования метаболомного характера. При этом также сохраняется возможность использования NEM ввиду специфического характера проводимой им модификации.
Определение общих и восстановленных аминотиолов плазмы крови человека методом жидкостной хроматографии по их тионитробензойным производным Среди множества методов определения низкомолекулярных тиолов в биологических средах организма распространение получили методики основанные на ВЭЖХ-Фл, КЭ-ЛИФ, ВЭЖХ-МС [Melnikov I.O. et al. 2006, Mansoor M.A. et al. 1992, Pfeiffer 1999, Causse E. et al. 1999, Kang S.H. et al. 2000, Li S. et al. 2008]. Для всех вышеперечисленных подходов для достижения высокой чувствительности характерно использование дорогостоящего оборудования и/или модифицирующих агентов. Применение дериватизирующих агентов, дающих возможность использовать УФ-диапазон для детектирования в этом плане является доступной альтернативой, т.к. УФ детекторы широко распространены и реагенты отличаются низкой стоимостью. Ранее применённые реагенты, такие как дитиопиридин [Andersson A. et al. 1993], 2-хлоро-1-метилхинолинтетрафлуороборат [Chwatko G. and Bald E. 2002], тиокарбонилдиимидазол [Amarnath K. et al. 2003], и др., позволяют достичь хороших результатов для определения Гцис и некоторых других аминотиолов. Одним из хорошо известных и давно применяемых в биохимии тиол-специфичных реактивов является 5,5 -дитиобис-(2-нитробензойная) кислота (ДТНБ) или реагент Эллмана. Он, как правило, применяется для определения концентрации тиольных групп, т.к. при взаимодействии ДТНБ с тиолом образуется тионитробензоатдианион [Riddles P.W. et al. 1979], обладающий интенсивным поглощением при 412 нм. Высокочувствительное определение аналитов по данному неспецифическому продукту возможно при постколоночной дериватизации, но это требует специального оборудования. Вместе с этим, в ходе реакции образуется смешанный дисульфид из оставшейся части ДТНБ и тиола, который имеет максимум поглощения при 330 нм, что и было использовано для ВЭЖХ-анализа тиолов [Дутов А.А. и др. 2010, Katrusiak A.E. et al. 2001, Komuro C. et al. 1985, Zhloba A.A. and Blashko E.L. 2004], притом не только их общего содержания, но и восстановленной фракции.
В настоящей работе провели оптимизацию условий восстановления и ВЭЖХ с использованием ДТНБ для определения общего Цис, Гцис, Глн и Цисгли в плазме крови человека, используя в качестве ВС пеницилламин (ПА). Для оптимизации проводилось изучение влияние температуры восстановления тиолов плазмы при различных концентрациях ДТТ (0, 5, 10 и 25 мМ в реакционной смеси) и температуре (24оС, 37оС, 60оС). При концентрации ДТТ 5 мМ оптимальная температура восстановления 37оС, а при увеличении содержания восстановителя температурный оптимум снижается до 24оС. Для Цис, Гцис, Цисгли максимальный сигнал наблюдался при 5 мМ ДТТ/37оС, в то время как для Глн оптимум был при 25мМ ДТТ/60оС. Также для Цис, Гцис и Цисгли наблюдалось снижение выхода продукта с ростом концентрации ДТТ при 37оС и 60оС, в то время как выход продукта Глн, напротив, возрастал при 24оС. Таким образом, температура инкубации и концентрация восстановителя оказывают на аналиты различные эффекты и выбор оптимального режима восстановления тут неочевиден. Введение ВС может в некоторой мере скомпенсировать эти эффекты. Так как наибольшая стабильность отношений сигналов аналит/ПА наблюдалась при восстановлении при 37оС и концентрации ДТТ 5 мМ, то нами были взяты эти условия для дальнейших экспериментов. Также необходимо отметить, что температура и концентрация ДТТ на этапе восстановления сильно влияет не только на выход продуктов в плазме, но также и в модельной системе. Восстановление при 10 мМ ДТТ/60оС характеризуется для Цис и ЦисГли не только заметным падением соотношением площадей пиков аналит/ПА, но и потерей линейной зависимости от концентрации аналита, в отличие от восстановления при 5 мМ ДТТ/37оС. В случае с Гцис и Глн данные режимы восстановления приводят к практически идентичным результатам.
При добавлении ДТНБ в различных концентрациях (1,7; 17 и 50 мМ в реакционной смеси) оптимальными было 17 мМ, т.к. при 1,7 мМ наблюдаемые сигналы были значительно ниже, а при 50 мМ побочные продукты реакции мешали определению целевых пиков. Исследовалось также влияние рН добавляемого буфера на выход ТНБ-производных (200 мМ Na-фосфатный с рН 6,0 и 7,4, а также 300мМ Na-карбонатный с рН 9,5). Значительного влияния эти добавки не оказывают, однако при использовании буфера с рН 6,0 интенсивности сигналов были ниже, а при рН 9,5 наблюдалось искажение пика Цис.
На рисунке 4.12 приведены хроматограммы плазмы крови после обработки ДТНБ. Время выхода производного Цис составляло 8,1 мин, Глн – 11,5 мин, Цисгли – 12,5 мин, Гцис – 13,8 мин, ПА – 16,4 мин. Вариабельность времени удерживания находилась в пределах 2,5 %.
На рисунке 4.13 приведены калибровочные графики, полученные путем добавления к смеси плазмы крови растворов аминотиолов с различным содержанием. Как видно из рисунка ТНБ-производные аналитов имеют близкие наклоны, а коэффициент корреляции полученных прямых не менее 0,99. Это позволяет считать сигнал линейным в исследованном диапазоне (10-500 мкМ для Цис и 1-70 мкМ для остальных тиолов). В таблице 4.3 приведены концентрации общих тиолов плазмы, полученные в образцах плазмы крови здоровых женщин на первом триместре беременности.
При оптимизации условий восстановления мы исходили из методики [Zhloba A.A. and Blashko E.L. 2004], которая в свою очередь была основана на протоколе [Katrusiak A.E. et al. 2001]. Если сравнить данные последней работы, полученные на контрольной группе, то сразу обращает на себя внимание то, что среднее содержание Цис, Цисгли и других тиолов понижено в 1,5-2 раза относительно других литературных данных, что наиболее вероятно можно объяснить процедурой пробоподготовки, чем условиями ВЭЖХ или особенностями выбора контрольной группы доноров.
Определение связанных аминотиолов плазмы методом капиллярного электрофореза по их циклическим S,N-тиокарбонильным производным
В генерации АФК немалдоважную роль играет нарушение активности глутатион-S-трансферазы ц-типа, т.к. у гипертензивных крыс, подверженных инсульту наблюдается снижение экспрессии этого фермента [McBride M.W. et al. 2005].
По данным работы [Martinez-Revellez S. Et al. 2008] 90-минутная окклюзия среднемозговой артерии с последующей реперфузией приводила к значительному увеличению активности циклооксигеназы-2. Активность eNOS, iNOS и супероксиддисмутаз при этом существенно не менялась, что может свидетельствовать об NO-независимом характере эндотелиальной дисфункции. Вовлеченность симпатико-адреналовой системы в процессы периферического сосудистого ответа была показана на моделях ишемии ГМ [Boselli С. et al. 2002, Martinez-Revelles S. et al. 2008, Coucha M. et al. 2013] и сердца [Zhao M. et al. 2012]. При этом, однако, автору последней работы не удалось выявить на фоне ишемического повреждения мозга различий в ответе брыжеечных артерий на стимуляцию агонистов od-адренэргических рецепторов. Это наводит на мысль о существований других рецепторов, способных опосредовать передачу сигнала, обуславливающего системный ответ на повреждение мозга. К ним, в первую очередь, можно отнести 3-адренэргические рецепторы 3-го типа (J33R). Их действие проявляется в условиях гиперстимуляции симпатической системы и носит антагонистический характер по отношению к эффектам, опосредованных р-адренэргическими рецепторами первых двух типов [Moens A.L. et al. 2010]. Несмотря на то, что все три типа этих рецепторов относятся к суперсемейству G-связанных белков, p3R имеет существенные особенности регуляции своей активности, выражающися в том, что он может связывать Gi и Gs независимо друг от друга и не нуждается в фосфорилировании [Liggett S.B. et al. 1993, Soeder K.J. et al. 1999]. P3R активируются при значительно больших концентрациях катехоламинов, чем plR и p2R [Emorine L.J. et al. 1989, Nahmias С et al. 1991, Balligand J.L. 2013]. Как было указано выше, локальная ишемия головного мозга сопровождается массированным выбросом катехоламинов в кровоток, т.е. создаются условия для стимуляции P3R. Отсутствие сайтов фосфорелирования в структуре этого рецептора влечет за собой временной характер их стимуляции, отличный от P1R и P2R. Если последние подвергаются десенсетизации при продолжительной стимуляции, то для p3R это не характерно [Nantel F. et al. 1993, Moens A.L. et al. 2010]. Возможность альтернативного сплайсинга мРНК p3R обуславливает существование его нескольких изоформ с различными фармакологическими свойствами [Hutchinson D.S. et al. 2002].
Активация P3R приводит к увеличению синтеза оксида азота, но пока ещё нет полной ясности, какая из изоформ NO-синтаз при этом играет ведущую роль и через какие пути внутриклеточного сигналинга опосредуется увеличение экспрессии или ферментативной активации NOS [Moens A.L. et al. 2010]. Так показано, что активность nNOS ассоциирована с белком теплового шока Hsp90 [Damy Т. et al. 2003, Ghosh D. К. Et al. 2012], а iNOS - с выбросом цитокинов (ФНОа, Ил-1, Ил-6) [Drexler Н. et al. 2005] и нитрозилированием белка Ras [Drexler Н. et al. 1998, Lee M. and Choy J. С 2013]. Активация p3R носит органоспецифический характер. По данным [Gauthier С. 1998] показано, что она ассоциирована с активностью eNOS, но её механизмы в отделах сердца различаются. В правом желудочке усиление активности синтазы происходит за счет диссоциации её комплекса с кавеолином, но в левом желудочке за счет фосфорилирования eNOS [Brixius K. et al. 2004].
Оксид азота, являясь в физиологических концентрациях вазодилататором, при массированном выбросе за счет активации iNOS может оказывать противоположный эффект. Было установлено, что S-нитрозоглутатион обладает нейропротективным действием за счет снижения экспрессии iNOS [Khan M. et al. 2005]. Поэтому реактивный выброс NO периферическими тканями может быть дополнительным фактором повреждения ГМ [Baradaran A. et al. 2014].
Показанные в данной работе результаты имеют отличия от изменений общего уровня плазменных аминотиолов, наблюдаемых при ишемии почек. Так при моделировании ишемии одной почки было найдено повышение общего Гцис на 36% [Кузьменко Н.В. и др. 2011], в то время как окклюзия среднемозговой артерии не приводила к изменению его уровня в течение 7-ми дней эксперимента. С другой стороны, характер изменений восстановленного Гцис при фокальной ишемии ГМ и ишемии почки, по всей видимости, носят однонаправленный характер, т.к. в последнем случае также наблюдалось снижение тиогрупп в плазме крови животных [Александрова Л.А. 2010]. Авторы этой работы также находят в этой модели активацию супероксиддисмутазы и повышение уровня малонового диальдегида. Это свидетельствует, о том, что, несмотря на различную роль ГМ и почек в метаболизме Гцис, при ишемии этих органов могут быть задействованы общие механизмы, влияющие на его редокс-статус.
Интересно также отметить, что при плавательном стрессе у крыс наблюдается резкое повышение ТГцис примерно в 2 раза [Алисиевич С.В. и др. 2006]. Однако этот эффект пропадает, если животное находится в условиях умеренной ГГц (дефицита B9). Исследование агрегации тромбоцитов при плавательном стрессе в условиях ГГц показало, что интенсивность её прироста была менее выражена, чем в контрольной группе (без ГГц). Аналогичная динамика зарегистрирована со стороны АТФ, выброс которой, уменьшался по сравнению с контролем [Алисиевич С.В. и др. 2006]. Авторы связали полученные результаты с различными механизмами (прямое действие адреналина, ингибирование экто-АДФазы Гцис, индукция синтеза тромбоксана А2 Гцис, опустошение гранул тромбоцитов при их хронической активации Гцис). Полученные в настоящей работе результаты свидетельствуют, что резкое снижение редокс-статуса Гцис и др. тиолов может играть определенную роль в активации тромбоцитов. Известно, что Гцис оказывает потенцирующие влияние на агрегацию в присутствии некоторых активаторов [Роткина А.С. и др. 2012], однако пока не ясно какой его формой обусловлено это влияние. Тот факт, что преинкубация тромбоцитов с NEM устраняет эффекты Гцис свидетельствует о том, что именно его восстановленная форма может иметь первостепенное значение. Если в результате стресса происходит резкое снижение редокс-статуса Гцис, то его восстановленная форма будет существенно снижена, несмотря на его повышенный общий уровень при ГГц. В норме же стресс сопровождается выбросом Гцис из клеток, в которых он находится преимущественно в восстановленной форме и этот выброс может минимизировать последствия стресса, что выражается в усилении агрегации тромбоцитов по сравнению с контролем.
Таким образом, полученные в данной работе результаты согласуются с концепциями стресса и системной реактивной эндотелиальной дисфункции. Выявленные изменения редокс-статуса аминотиолов указывают на то, что этот показатель может иметь диагностическую роль в острую стадию ишемии ГМ (в первые часы – дни), когда изменения общих аминотиолов ещё не выражены. Кроме того, эти результаты обуславливают актуальность исследования новых аспектов эндотелиальной дисфункции.