Содержание к диссертации
Введение
1. Применение S.pyogenes для лечения онкологических заболеваний (обзор литературы) .11
1.1 Основные подходы к лечению онкологических заболеваний с помощью ,актерий .11
1.2 Историческое и современное обоснование лечения рака S.pyogenes 16
1.3 S. pyogenes - возбудитель заболеваний человека. Основные факторы патогенности 20
1.3.1 Общая характеристика S. pyogenes 20
1.3.2 Поверхностный М-белок S. pyogenes .22
1.3.3 Основные токсины и ферменты, вырабатываемые S. pyogenes 27
1.4 Возможные механизмы воздействия S. pyogenes на опухолевые клетки .32
1.4.1 Прямое цитотоксическое воздействие S.pyogenes на опухолевые клетки 32
1.4.2 Активация плазминогена 33
1.4.3 Активация иммунной системы .34
1.4.4 Воздействие высокой температуры 36
1.4.5 Ингибирующее действие аргининдеиминазы 37
1.5 Обобщение материала, изложенного в литературном обзоре 38
2. Материалы и методы исследования .41
3. Выбор штамма S.pyogenes для проведения экспериментов и разработка способа введения бактерий животным .51
4. Создание штамма S.pyogenes «Гуров» с блокированной продукцией М-белка и изучение его противоопухолевого действия .72
4.1 Получение штамма S.pyogenes «Гуров» с блокированной продукцией М белка .72
4.1.1 Анализ нуклеотидной последовательности в области гена М-белка .72 4.1.2.Электротрансформация emm гена S. pyogenes штамма «Гуров» методом электропорации .76
4.1.3 Анализ полученных мутантных клонов по характеру локализации ДНК вставки в геноме и по стабильности инсерции в область генома .79
4.1.4 Секвенирование ДНК штамма «Гуров» после трансформации .80
4.2 Результаты полногеномного секвенирования Streptococcus pyogenes штамм «Гуров» и его мутанта по М-белку «Гуров» emm 83
4.3 Сравнение эффективности терапии мышиных перевиваемых опухолей с использованием S. pyogenes штамма «Гуров» и его мутантного штамма, лишенного М-белка в экспериментах in vivo 87
4.4 Изучение жизнеспособности S.pyogenes штаммов «Гуров» и «Гуров» emm– после введение внутрь опухоли 90
4.5 Взаимодействие S. pyogenes штамма «Гуров» и его мутанта по М-белку с клетками гепатомы 22а in vitro
4.5.1 Оценка цитотоксического воздействия штаммов «Гуров» и «Гуров» emm– в отношении гепатомы 22а 93
4.5.2 Оценка адгезии штаммов «Гуров» и «Гуров» emm– в отношении гепатомы 22а .94
4.6 Взаимодействие штамма «Гуров» S. pyogenes и его мутанта по М-белку с перитонеальными макрофагами интактных мышей in vitro .98 4.6.1 Фагоцитарная активность макрофагов в отношении штамма S. pyogenes «Гуров» и его мутанта по М-белку 100
4.6.2 Влияние штамма «Гуров» и его мутанта по М-белку на способность макрофагов продуцировать нитроксидные радикалы in vitro 101
4.6.3 Влияние штамма S.pyogenes «Гуров» и его мутанта по М-белку на способность макрофагов к продукции супероксид анионов in vitro 103
4.6.4 Влияние штамма S.pyogenes «Гуров» и его мутанта по М-белку на способность макрофагов к продукции цитокинов in vitro .105
5. Изучение противоопухолевого действия штамма S.pyogenes М49-16 и его мутанта с инактивированным геном аргининдеиминазы М49-16delAD .109
5.1 Исследование цитотоксического действия штамма S.pyogenes M49-16 и его мутанта по гену аргининдеиминазы M49-16delAD в отношении клеток гепатомы 22а in vitro .110
5.2 Исследование противоопухолевой активности штамма S. pyogenes M49-16 и его мутанта по гену аргининдеиминазы на модели лабораторных животных с саркомой S37 112
Заключение .116
Выводы .126
Список условных сокращений .128
Список литературы .130
- Поверхностный М-белок S. pyogenes
- Выбор штамма S.pyogenes для проведения экспериментов и разработка способа введения бактерий животным
- Результаты полногеномного секвенирования Streptococcus pyogenes штамм «Гуров» и его мутанта по М-белку «Гуров» emm
- Влияние штамма S.pyogenes «Гуров» и его мутанта по М-белку на способность макрофагов к продукции цитокинов in vitro
Введение к работе
Актуальность исследования. Несмотря на то, что за последнее время достигнут существенный прогресс в области терапии онкологических заболеваний, они продолжают оставаться одной из наиболее распространенных причин смерти в развитых странах. Общепринятые методы, такие как лучевая и химиотерапия, не дают полного излечения, что обуславливает необходимость поиска новых альтернативных методов, одним из которых является лечение опухолей с применением микроорганизмов.
Патогенетические особенности опухолей позволяют им «ускользать» от действия макрофагов и других клеток системы врождённого иммунитета, поэтому одной из магистральных линий поиска способов терапии опухолей является изучение возможностей стимуляции воспалительного процесса и активации клеток его реализующих для лечения злокачественных образований. Для этой цели используют живые, аттенуированные или генетически модифицированные бактерии, которые обладают прямым цитотоксическим эффектом и оказывают воздействие на клетки иммунной системы [Jessy, 2011]. Изучение способов и механизмов реализации эффектов действия клеток и веществ с противоопухолевой активностью является важнейшей задачей современной патофизиологии.
Особый интерес вызывает применение для этих целей бактерий Streptococcus pyogenes и продуктов их жизнедеятельности [Hoption Cann, 2003]. Эти бактерии являются хорошо изученными патогенными микроорганизмами, выделяемыми исключительно из образцов биологического материала человека. Известно, что S. pyogenes могут проявлять как прямые, так и опосредованные цитолитические воздействия на эукариотические клетки, обусловленные наличием различных ферментов и токсинов [Forbes, 2006]. Существенным преимуществом использования S. pyogenes является высокая чувствительность стрептококков к пенициллину, которая позволяет легко уничтожить их после терапевтического применения. При этом S. pyogenes могут длительное время существовать в тканях, плохо снабжаемых кислородом, в том числе в злокачественных новообразованиях [Forbes, 2006]. Необходимо отметить, что S. pyogenes относятся к микроорганизмам, которые возможно подвергнуть генно-инженерной модификации, что позволяет инактивировать отдельные гены для изучения их свойств. Таким образом, S.pyogenes являются перспективными
микроорганизмами для создания на их основе новых подходов к противоопухолевой терапии.
Степень разработанности темы. S. pyogenes стал впервые использоваться в клинической практике для терапии злокачественных опухолей в конце 19 века американским хирургом W.Coley [Nauts, 1953]. Coley отмечал, что наилучшего результата ему удавалось достигнуть, когда в ходе терапии у пациента развивался мощный воспалительный процесс. Для клинического применения был разработан и активно применялся так называемый “токсин Коли”, который представлял собой фильтрат термически обработанных S. pyogenes, не содержащий живых бактерий. В 50-60-ых годах XX века было опубликовано несколько статей по применению фильтратов S. pyogenes (“токсина Коли”) для лечения экспериментальных опухолей, в которых было показано, что саркома S37 у мышей является опухолью, чувствительной к данному методу терапии [Havas, 1958]. В начале XXI века была опубликована монография, обобщившая успешный многолетний опыт применения S. pyogenes штамма «Гуров» в клинической практике для терапии онкологических заболеваний на базе Пермского государственного медицинского университета [Черешнев В.А. 2006]. Позднее была продемонстрирована успешная возможность лечения опухоли поджелудочной железы у мышей после однократного введения живой культуры S. pyogenes M49 серотипа штамм №591 внутрь опухоли [Maletzki, 2008]. Предполагают, что этот эффект обусловлен ответом организма на патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (PAMP), присутствующие на микроорганизмах, что может усиливать противоопухолевую защиту организма. Однако, механизмы противоопухолевого действия S. pyogenes до сих пор недостаточно ясны.
При этом также было показано, что живые бактерии оказались более эффективными, чем убитые S. pyogenes [Maletzki, 2008]. Эти данные доказывают необходимость сохранять жизнеспособность S. pyogenes. Синтез микроорганизмами широкого набора биологически активных веществ, включающих токсины и разнообразные ферменты, в физиологически активном состоянии обуславливает более выраженное противоопухолевое действие живых бактерий. В частности, показано, что стрептококковый фермент – аргининдеиминаза способен в существенной степени замедлять развитие большой группы опухолевых клеток [Feidler, 2015]. Однако существенным
недостатком такого рода терапии является высокая токсичность S. pyogenes. С
целью снижения потенциальной опасности живых стрептококков для
организма нами была поставлена задача сконструировать штамм S. pyogenes,
лишенный М-белка – одного из главных факторов патогенности стрептококков.
Цель исследования. Изучить противоопухолевое действие модифицированных
штаммов S. pyogenes на экспериментальных моделях in vivo и in vitro и
обосновать новые подходы к терапии опухолей с использованием модифицированных бактерий.
Задачи исследования:
1. Для снижения вирулентности живых S. pyogenes штамма «Гуров»,
используемых при лечении опухолей в эксперименте, получить и
охарактеризовать новый мутантный штамм с инактивированным геном М-
белка (emm).
2. Провести сравнительный анализ генетических различий между штаммами
Гуров» и «Гуров» emm (GURSA1) с помощью полногеномного
секвенирования.
-
Оценить динамику опухолевого роста и выживаемость у мышей с перевиваемыми опухолями - гепатомой 22а и саркомой S37 при введении штаммов S. pyogenes «Гуров» и «Гуров» emm (GURSA1).
-
Сравнить прямое цитотоксическое воздействие исходного штамма S. pyogenes «Гуров» и его мутанта «Гуров» emm (GURSA1) на клетки гепатомы 22а in vitro.
-
Исследовать функциональную активность перитонеальных макрофагов интактных мышей в системе in vitro в ответ на воздействие штаммов S. pyogenes «Гуров» и «Гуров» emm (GURSA1).
6. Изучить рост клеток гепатомы 22а в условиях in vitro и выживаемость мышей
с саркомой S37 при воздействии штамма S. pyogenes М49-16 с
инактивированным геном аргининдеиминазы.
Научная новизна исследования. Впервые получен и охарактеризован новый штамм S. pyogenes с инактивированным геном М-белка, обладающий противоопухолевой активностью в отношении перевиваемых опухолей мышей in vivo и in vitro. В результате полногеномного секвенирования штамма S. pyogenes «Гуров» установлено, что штамм «Гуров» относится к серотипу М111, а не к серотипу М39, как считалось ранее; получены ранее неизвестные данные
о строении Mga регулона М111 серотипа. Впервые показано, что инактивация
белка М-белка 111 серотипа приводит к повышению адгезивной способности S.
pyogenes в отношении клеток гепатомы 22а мышей. Также впервые показано,
что инактивация гена белка М111 приводит к снижению антифагоцитарных
свойств стрептококков в отношении резидентных перитонеальных макрофагов
интактных мышей. Кроме того, инактивация гена белка М111 влияет на
способность стрептококков индуцировать синтез цитокинов и усиливать
продукцию активных форм кислорода перитонеальными макрофагами
интактных мышей. Впервые показан противоопухолевый эффект
аргининдеиминазы, продуцируемой S. pyogenes М 49 серотипа, на модели перевиваемой саркомы S37 мышей in vivo.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Для проведения экспериментов по изучению противоопухолевой активности живых S. pyogenes получен и охарактеризован новый изогенный мутант штамма «Гуров» с инактивированным геном М-белка «Гуров» emm (GURSA1).
-
Наличие единичной вставки интегративной плазмиды в области кодирования гена emm, обнаруженной при сравнительном полногеномном секвенировании исходного штамма S. pyogenes «Гуров» и его мутанта «Гуров» emm (GURSA1), доказывает, что целостность генома мутантного штамма в других областях не нарушена.
3. На моделях перевиваемых опухолей у мышей продемонстрировано
подавление опухолевого роста при введении живых бактерии S. pyogenes
штамма «Гуров» emm (GURSA1) по сравнению с исходным штаммом «Гуров».
-
Бактерии штамма S.pyogenes «Гуров» emm (GURSA1) обладают более выраженным прямым цитотоксическим действием в отношении клеток гепатомы 22а in vitro по сравнению с исходным штаммом «Гуров».
-
Стимулирование продукции активных форм кислорода в резидентных перитонеальных макрофагах бактериями S. pyogenes штамма «Гуров» emm (GURSA1), в отличие от исходного штамма «Гуров» можно рассматривать как один из механизмов противоопухолевого действия этих бактерий.
Теоретическая и практическая значимость исследования. Представленная диссертационная работа является фундаментальным научным исследованием, результаты которого вносят вклад в изучение прямого и опосредованного цитотоксического воздействия S. pyogenes на злокачественные перевиваемые
опухоли у животных. Работа носит экспериментальный характер. Результаты исследования создают основу для дельнейшего изучения механизмов противоопухолевого действия живых S. pyogenes как потенциальных средств терапии опухолевых заболеваний человека. Заявка на изобретение № 2016152829 от 30.12.2015 принята и проходит экспертизу по существу. Штамм S. pyogenes «Гуров» emm был депонирован нами и находится в коллекции патогенных штаммов ФБУН ГНУ ПМБ (Оболенск).
Личное участие автора в получении результатов. Автором, совместно с научными руководителями, были спланированы и лично выполнены все экспериментальные исследования in vitro и in vivo, а также проведена статистическая обработка данных. В постановке и решении конкретных задач, организации и выполнении исследований, обработке и интерпретации полученных результатов автору принадлежит ведущая роль.
Публикации по материалам исследования. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 4 публикации в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК при Министерстве образования и науки Российской Федерации, 1 в зарубежном журнале. Принята заявка № 2016152829 от 30.12.2015 на изобретение, проходит экспертизу по существу. Штамм «Гуров» emm (GURSA1) депонирован в коллекции патогенных штаммов ФБУН ГНУ ПМБ (Оболенск).
Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность
результатов, полученных при проведении экспериментов, подтверждается достаточным и репрезентативным объёмом выборки выполненных наблюдений и контрольных исследований и подтверждена адекватными методами статистической обработанных. Методы математической обработки полученных результатов соответствуют поставленным задачам. Материалы диссертации доложены на XXI, XXII, XXIV, XXVI конгрессах европейского клинического микробиологического общества ECCMID (Милан, Италия, 2011 г.; Лондон, Великобритания, 2012 г., Барселона, Испания, 2014, Амстердам, Нидерланды. 2016), на конференции “Современная диагностика и лечение стрептококков группы А в клинической практике” (Рим, Италия 2013), XIX конгрессе им. Ленсфильд по стрептококкам и стрептококковым заболеваниям (Буэнос-Айрес, Аргентина, 2014), на X, XIV и XV Всероссийских научных форумах с международным участием им. акад. В.И. Иоффе “Дни иммунологии в Санкт-
Петербурге” (Санкт-Петербург, Россия 2011, 2015,), на конференции «Клеточные и молекулярные механизмы взаимоотношения опухоли и микроокружения» (Томск, Россия, 2015 г.), на II и III Петербургских международных онкологический форумах «Белые ночи 2016» и «Белые ночи 2017».
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 143 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов работы, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 154 источников, 10 отечественных и 144 зарубежных. Текст диссертации иллюстрирован 10 таблицами и 37 рисунками.
Поверхностный М-белок S. pyogenes
Традиционная система классификации Лансфилд, основанная на серотипировании, к настоящему времени была заменена emm типированием, которое основывается на секвенировании гена М-белка в области, кодирующей N-терминальную часть, характеризующуюся участками, уникальными для каждого серотипа [56]. К настоящему времени молекулярные эпидемиологи определяют более 200 различных emm типов S.pyogenes, что позволяет следить за формированием клинически актуальных штаммов [57].
М-белок является основным поверхностным антигеном S.pyogenes. Для понимания влияния этого белка на иммунную систему важно описать его молекулярную структуру. Молекула белка М укреплена в клеточной стенке и образует на ней нитевидные выросты, проходящие сквозь капсулу и структуру пептидогликана (Рис.2). Данные выросты образуются двумя переплетающимися двухнитевыми спиральными молекулами, заякоренными в пептидогликане клеточной стенки за счет консервативного участка в С-терминальном участке – LРxTGЕ – домене, и покрывают поверхность бактерий (Рис.2). Известно, что серологическая вариабельность белка обусловлена высоко гетерогенным участком в N-терминальной части молекулы, что и служит типоспецифическим антигеном. Важно учесть, что в отличие от дистальной (N-концевой) части молекулы, проксимальная часть молекулы М белка практически не подвержена изменениям.
Первый этап механизма инфекционного процесса, связанного с стрептококковой инфекцией, характеризуется адгезией микроорганизма к эпителию слизистых оболочек. Основными адгезивными веществами выступают липотейхоевые кислоты. Однако, не менее важную роль в прикреплении к субстратам играют поверхностные белки – адгезины, включая SfbI и М белок.
М-белок является основным антифагоцитарным фактором. Он ингибирует фагоцитарные реакции, непосредственно действуя на фагоциты или маскируя рецепторы для компонентов комплемента и опсонинов, адсорбируя на своей поверхности фибриноген, фибрин и продукты его деградации. Антитела к М-белку обеспечивают длительную невосприимчивость к повторному заражению, что значительно снижает эффективность гуморальных защитных реакций.
Белок в ряде штаммов стрептококков находится в несвязанной с клеточной стенкой форме, проявляя свойства суперантигена, вызывая поликлональную активацию лимфоцитов и образование антител с низким аффинитетом [58]. Подобные свойства играют существенную роль в нарушении толерантности к тканевым изоантигенам и развитии аутоиммунной патологии. M-белок в секретируемой форме является достаточно мощным иммуномодулятором и фактором, влияющим на уровень свертывания крови за счет выброса прокоагулянтных микровезикул из мононуклеаров периферической крови [59].
Важной функцией М-белка является его способность связывать фибриноген, препятствуя активации комплемента и опсонизации фрагментами комплемента бактериальных клеток, что приводит к снижению способности С3b конвертазы связываться с бактериями [60]. M-белок также ингибирует опсонизацию альтернативным путём комплемента за счет связывания с регуляторами комплемента хозяина. С М-белком стрептококков ассоциированы свойства связывания С4В [61], C3B [62]. C М-белком также связывают и активацию плазминогена, приводящую к нарушению депозиции опсонина С3b, что припятствует захвату стрептококков нейтрофилами [63]. М- белок также способен препятствовать слиянию фагосомы с азурофильными гранулами [64].
Стрептококковый М-белок взаимодействует с толл-подобными рецепторами TLR2 на моноцитах периферической крови человека. При данном воздействии моноциты экспрессируют цитокины IL-6, IL-1 и фактор некроза опухоли (TNF-). Данный иммунный ответ значительно возрастает в присутствии нейтрофильного гепаринсвязывающего белка (HBP), взаимодействуя с CD11/CD18. Анализ тканевой биопсии у пациентов с некротическим фасцитом, вызванным Streptococcus pyogenes, выявил приток нейтрофилов и моноцитов в область инфицированного участка в сочетании с высвобождением HBP. М-белок в синергизме с HBP вызывает воспалительную реакцию, которая может способствовать глубоким патофизиологическим последствиям при тяжелых стрептококковых инфекциях [65]. При этом наличие в молекуле М-белка участков последовательности, перекрестно реагирующих с тканями миокарда и эндокарда, делает М-белок триггером развития иммунопатологических заболеваний, таких как ревмокардит.
Высокая иммуногенность М-белка делает его «ахиллесовой пятой» патогена, так как антитела, продуцируемые иммунной системой против М-белка, связывают его и обуславливают поглощение бактерий фагоцитами.
Следует понимать, что столь многообразные эффекты, проявляемые М-белком, с одной стороны обусловлены его поверхностной локализацией и способностью напрямую взаимодействовать с иммунной системой, а с другой, связаны с тем, что М-белок в различных штаммах Streptococcus pyogenes может быть представлен множественными гомологичными между собой белками (Emm, Mrp, Enn, Sof и тд.), находящимися под контролем единой системы регуляции (Mga) [66]. При этом штаммы Streptococcus pyogenes имеют различную структуру и иммунологические особенности организации как самого М-белка, так и различную организацию Mga регулона ( Рис. 3).
Автономный Mga-регулятор Streptococcus pyogenes контролирует активность продукции М-белка в фазу экспоненциального роста, влияя на развитие острой инфекции. Используя слияния репортеров люциферазы, исследователи показали, что тимогидрохинон с комплексной бульонной питательной средой Todd-Hewitt уменьшает экспрессию Mga и идентифицирует альбумин как один компонент, ответственный за этот эффект [67]. Связывание Mga-мутантов с иммобилизованными белками матрикса человека (коллаген I типа, фибронектин, кератин, ламинин) и белками сыворотки (альбумин, фибриноген) уменьшалось, что отражало снижениие уровня экспрессии М-белка и других белков в Mga регулоне. Также в работе было установлено, что жизнеспособность организма-хозяина значительно снижалась после длительного воздействия Mga-мутантов.
Таким образом, Mga-регулятор Streptococcus pyogenes влияет на связывание белков матрикса человека и взаимодействие с эукариотическими клетками [67].
В другом исследовании было показано, что вирулентный штамм Streptococcus pyogenes М1 серотипа имел мутацию в регуляторной системе CovRS, которая повысила степень патогенности штамма [68]. Интересно, что нейтрофилы способны распознавать спонтанные гипервирулентные мутанты M1T1 СГА CovRS. Сообщается, что ДНКаза Sda1 имеет решающее значение для обеспечения устойчивости штамма 5448 M1T1 к элиминации из человеческой крови и обеспечивает отбор in vivo мутаций CovRS. Ученые пересмотрели роль Sda1 в отборе мутаций CovRS и реакциях врожденного иммунитета на S. pyogenes. Удаление sda1 или всех генов ДНКазы в штамме MG12221 M1T1 не изменяло появление мутаций CovRS. Полученные данные способствуют пониманию прогрессирования инвазивных инфекций M1T1 S. pyogenes [68, 69].
Streptococcus pyogenes серотипа M1 обычно ассоциируется с крупными вспышками инвазивных стрептококковых инфекций и развитием стрептококкового синдрома токсического шока (Toxic shock syndrome – STSS). Предполагается, что патогенез связан с бактериальными суперантигенами, которые индуцируют сильные воспалительные реакции, но причина, по которой штаммы серотипа M1 чрезмерно представлены в STSS, до сих пор не понята.
Показано, что высокоочищенная растворимая форма белка M1 из S. pyogenes, которая не имеет участка, связывающегося с мембраной, является мощным индуктором пролиферации и высвобождения цитокинов Th1 типа. Пролиферация Т-клеток, индуцированная белком M1, была HLA- зависимой, не требовала внутриклеточной обработки и была ограничена V. Обширные исследования, проведенные методом масс-спектрометрии, показали, что в препарате не было других обнаруживаемых белков. Исследование подтвердило, что растворимый белок М1 является новым стрептококковым суперантигеном, который, вероятно, способствует чрезмерной активации Т-клеток и гипервоспалительному ответу, наблюдаемому при тяжелых инвазивных стрептококковых инфекциях [70].
Выбор штамма S.pyogenes для проведения экспериментов и разработка способа введения бактерий животным
Для изучения противоопухолевого действия S. pyogenes серотипов М-49 и М-39 на мышиных моделях мы провели ряд экспериментов по оценке цитотоксичности различных штаммов in vitro.
Исследования, проводимые при различных концентрациях стрептококков на мышиной гепатоме 22а, показали, что большинство штаммов начинали проявлять цитотоксическую активность при концентрации 106 КОЕ/мл и показали усиление ингибирования роста опухолевых клеток при дальнейшем увеличении концентрации.
Мы разделили все штаммы S.pyogenes на три группы, представленные в таблицах 4, 5 и 6, исходя из уровня ингибирования при максимальной концентрации бактерий. В таблице 4 приведены данные о штаммах №1, №8, №12, обладавших слабым ингибирущим эффектом (менее 40% при концентрации 108 КОЕ/мл) на рост клеток гепатомы, проявляющемся лишь при высоких концентрациях стрептококков. В таблице 5 представлены данные о штаммах, обладавших средней цитотоксической активностью (40-80% при концентрации 108 КОЕ/мл), некоторые из которых показывали достоверный ингибирующий эффект при концентрации 106 КОЕ/мл. Штаммы, обладавшие высокой цитотоксической активностью (более 80% при концентрации 108 КОЕ/мл), описаны в таблице 6.
Для экспериментов in vivo мы отобрали по одному или два штамма из каждой группы - а именно: №1, №13, №15, №16, № 22, а также штамм “Гуров”, который обладал средней питотоксической активностью. Влияние разных штаммов S. pyogenes на рост гепатомы 22а in vivo.
Выбранные нами для дальнейших исследований штаммы стрептококков, вводили мышам через 14 дней после инокуляции гепатомы 22а. Инъекцию бактерий осуществляли внутрь опухоли, чтобы максимизировать влияние на злокачественные клетки и снизить вероятность возникновения генерализованной инфекции.
В первом эксперименте самцов мышей С3НА в количестве 51 разделили на шесть групп; пять групп мышей получали однократно инъекцию 50 мкл суспензии стрептококков различных штаммов в концентрации 107 КОЕ/мл, а контрольная группа 50 мкл физиологического раствора. Далее наблюдали динамику роста опухоли. Поскольку начальный размер опухолей и их рост в каждой группе сильно варьировался, целесообразным было разделить их на опухоли с начальным диаметром более 15 мм и менее 15 мм, как представлено на рисунках 4 и 5.
При начальном размере опухоли более 15 мм наблюдался быстрый рост опухоли в присутствии всех штаммов. Динамика развития опухоли у мышей с начальным диаметром опухоли менее 15 мм, при введении стрептококков, практически не отличалась от контроля, однако в группах инфицированных штаммами №13, №16 и №22, наблюдалась заметная задержка роста опухоли продолжительностью более 2 недель (Рис.5). Полный регресс злокачественных образований был отмечен лишь у двух мышей, одна из которых относилась к группе инфицированной штаммом №16, а вторая штаммом №1.
Введение мышам S.pyogenes в концентрации 50 мкл 107 КОЕ/мл сопровождалось высокой смертностью, как показывает рисунок 6. В первые семь дней в группах животных, инфицированных штаммами №15 и №22, погибло более 50% мышей; штаммом № 1 более 40% мышей; штаммом № 16 более 20% мышей. В группе мышей, инфицированных штаммом №13, смертность в течение этого времени не наблюдалась.
Инъекцию стрептококков производили при достижении опухолями диаметра 5-10 мм, на 10 сутки после инокуляции гепатомы 22а. Восемнадцать самцов мышей линии С3НА разделили на две группы по 9 мышей, одна группа получила инъекцию 50 мкл суспензии штамма №16, а вторая - контрольная группа – 50 мкл физиологического раствора. Вторую и третью инъекцию в том же количестве производили на 4 и 11 сутки после первого введения стрептококков.
Регистрировавшаяся динамика развития опухолей представлена на рисунке в среднем по группам и в виде индивидуальных кривых роста для каждой мыши.
Как продемонстрировано на рисунке 6, по средним значениям опухолевый рост при введении стрептококков был значительно ниже, чем в контроле. Каждое последующее введение штамма №16 вызывало задержку роста или уменьшение опухоли у большинства мышей. У 4 мышей отмечали замедление роста опухоли до 7 суток после введения S.pyogenes , у 3 мышей – до 14.
Однако, повторное введение стрептококков обусловило большую смертность: более 40%, как продемонстрировано на рисунке 6.
По совокупности имеющихся данных штаммы №13 и №16 были выбраны для дальнейшего изучения, поскольку вызывали задержку роста опухоли, не обладали такой токсичностью, как штаммы №15 и №22, и в случае штамма №16 наблюдался случай регресса опухоли. А также был выбран штамм №1, поскольку, несмотря на слабую активность в эксперименте in vitro и отсутствие задержки роста опухоли in vivo, одна из мышей в группе этого штамма выздоровела.
Во втором эксперименте in vivo для внутриопухолевого введения использовали дозу 106 КОЕ/мл стрептококков, чтобы уменьшить токсичность воздействия. Поскольку в первом опыте задержка роста и регресс наблюдался лишь у мышей с небольшими опухолями, во втором эксперименте инъекцию стрептококков производили при достижении опухолями диаметра 5-10 мм, то есть на 11 день после инокуляции гепатомы. Пятьдесят самцов мышей линии С3НА разделили на пять групп по 10 мышей, 4 группы мышей получили однократно инъекцию 50 мкл суспензии стрептококков (штаммы №1, №13, №16, штамм «Гуров»), контрольная группа – 50 мкл физиологического раствора. Регистрировавшаяся далее динамика развития опухолей представлена на рисунке 8 в среднем по штаммам и на рисунке 9 в виде индивидуальных кривых роста для каждой мыши.
Как продемонстрировано на рисунке 8, по средним значениям показатели опухолевого роста при введении всех штаммов стрептококков не отличались от контроля.
Результаты полногеномного секвенирования Streptococcus pyogenes штамм «Гуров» и его мутанта по М-белку «Гуров» emm
Как было показано в главе 4.2, мутантный штамм неожиданным образом проявил более выраженный противоопухолевый эффект in vivo, механизм которого пока трудно объясним. Можно предположить, что в результате конструирования рекомбинантного штамма стрептококков, интеграция плазмидной ДНК в область гена emm привела не только к нарушению синтеза М-белка, но и к существенным нарушениям экспрессии других генов, ассоциированных с геном emm в регулоне вирулентности Mga [42, 67, 69]. Не исключены также и так называемые полярные эффекты, связанные с изменением экспрессии бактериальных генов в других участках генома после интеграции плазмиды. Чтобы исключить эти эффекты, нами был проведен полногеномный анализ исходно штамма «Гуров» и его emm мутанта.
По результатам полногеномного секвенирования нам удалось установить, что размер генома штамма «Гуров» составляет 1 890 357 bp. Он содержит 6 рибосомальных оперонов РНК и 67 генов Т-РНК. В структуру генома включены 5 полноценных бактериофагов (определенных при помощи программы PHASTER). Все обнаруженные бактериофаги являются умеренными стрептококковыми фагами № 315.4 (1), 315.3(2), 315.4(3), 315.1(4), 315.6(5).
Близкие по структуре бактериофаги были ранее выявлены путем полногеномного секвенирования у штамма S.pyogenes MGAS315 М3 серотипа[124]. Помимо этого, нам удалось выявить 4 однонуклеотидных замены. 3 однонуклеатидных замены находятся внутри одного бактериофага, Streptococcus pyogenes phage 315.3 (№5). Все они не изменяют характер кодирования аминокислот и находятся в области длинной 2000 нуклеотидов. Четвертая замена приводит к изменению кодирования аминокислот в гене HPr киназы/фосфорилазы. В данном гене произошла замена аланина на валин. В геноме обнаружен целый комплекс генов токсинов обычно ассоциированных с умеренными бактериофагами: SpeK, SpeI, SpeH, а также гены токсинов SpeJ [125], SmeZ и SpeG. Ген SpeK обнаружен в бактериофаге №3, а гены SpeI, SpeH в бактериофаге №5.
Сравнение результатов секвенирования исходного штамма «Гуров» и «Гуров» emm– , как и ожидалось, показало наличие встроенной плазмиды в область emm гена. Однако самым неожиданным результатом, полученным в результате полногеномного секвенирования штамма «Гуров», оказалось, что данный штамм исходно имел повреждения в области М регулона (Рис.21).
Секвенирование показало, что по организации М регулона, в штамма «Гуров» его можно отнести к Г или Д типу, то есть в структуре после позитивного регулятора mga в геноме последовательно располагаются гены, гомологичные генам М подобных белков mrp, emm и enn других штаммов СГА (Рис.20).
Однако, ген mrp имеет стоп кодон в структурной части, что делает его нефункциональным или, как минимум, абортированным (Рис.21). Поэтому в штамме Гуров позитивный регулятор может лишь стимулировать экспрессию гена emm. Инактивация гена emm «Гуров» emm– за счет встройки плазмиды привела к неспособности синтезировать полноразмерный ген М-белка и практически исключила способность стимулировать экспрессию гена emm.
Данный ген Мga регулона редко обнаруживают в штаммах СГА, он гомологичен другим генам emm стрептококков групп С и G. Третий ген Мga регулона в штамме «Гуров»- enn оказался неизмененным. Но в результате интеграции плазмиды, она структурно отделила данный ген от транскрипционного регулятора. Ген enn имеет высокую степень гомологии с с аналогичным геном М 49 серотипа и обычно кодирует М-подобный белок со способностью связывать IgA. Данные секвенирования во многом объясняют результаты повышенной чувствительности штамма «Гуров» emm– к фагоцитозу макрофагами и, опосредованно, более низкую вирулентность штамма.
Влияние штамма S.pyogenes «Гуров» и его мутанта по М-белку на способность макрофагов к продукции цитокинов in vitro
Для изучения влияния мутантного штамма на продукцию цитокинов нами были выбраны два провоспалительных - IL-6 и IL-17 и один противовоспалительный - IL-10. В настоящее время все три цитокина рассматриваются в качестве протуморогенных факторов, синтез которых в организме является нежелательным. Соответственно действия, направленные на подавление этих цитокинов будут играть положительную роль в организме опухоленосителей.
Провоспалительный цитокин IL-6 - типичный протуморогенный фактор, который рассматривается в настоящее время в качестве мишени для иммунотерапии (в клинике применяют антитела к IL-6, которые блокируют действие этого цитокина) [137]. Он обладает не только туморогенным эффектом на ранних этапах новообразования, но также обладает ангиогенным действием, чем способствует дальнейшей опухолевой прогрессии [137]. Кроме того, показано, что IL-6 играет негативную роль, способствуя привлечению в опухоль незрелых миелоидных супрессорных клеток [1], а также является фактором дифференцировки Th17 клеток, обладающих ангиогенным потенциалом [138].
IL-17 относится к провоспалительным цитокинам и выделяется различными клетками, в том числе и макрофагами. Этот цитокин оказывает проангиогенное действие и способствует метастазированию и прогрессии опухолей [139-142]. Из данных литературы известно, что IL-17 способствует привлечению в опухолевый узел нейтрофилов, продуцирующих ангиогенные факторы, которые способствуют росту новообразования [139, 141].
IL-10 является противовоспалительным цитокином. Он обладает иммуносупрессивным действием в отношении антиген-презентирующих клеток, чем может способствовать снижению развития Т-клеточного противоопухолевого ответа и ускользанию опухолей от иммунного надзора [137]. Повышение уровня содержания IL-10 является плохим прогностическим признаком при росте ряда опухолей человека [137] . Кроме того, IL-10 в присутствии другого противовоспалительного цитокина, TGF, способствует дифференцировке Т-регуляторных клеток, увеличение числа которых при раке считается весьма неблагоприятным признаком.
Из данных литературы известно, что изолированные М1, М3, М5 и М49 белки S.pyogenes способны вызывать воспалительный ответ в моноцитах крови человека и, в частности, индуцировать в них продукцию IL-6 in vitro [65], а М5 белок напрямую взаимодействует с Т-лимфоцитами крови человека и вызывает в них синтез IL-10 [143].
Как показано на рис. а, мы не обнаружили разницы между влиянием исходного штамма «Гуров» и его изогенного мутанта на продукцию IL-6, однако выявили выраженные различия в продукции двух других цитокинов.
Так, исходный штамм «Гуров» активировал продукцию IL-10 в значительно большей степени, чем штамм «Гуров» emm–, что позволяет связать наличие белка М111 со способностью индуцировать продукцию этого противовоспалительного цитокина макрофагами (Рис.34). По данным литературы IL-10 проявляет в основном негативные эффекты в отношении противоопухолевой защиты. С этой точки зрения, ослабление способности индуцировать синтез этого цитокина макрофагами путем удаления М111 белка может служить благоприятным фактором для развития противоопухолевой защиты и задержки опухолевого роста.
Что касается продукции IL-17, то оба исследованных нами штамма оказались способными подавлять продукцию этого цитокина (Рис.34), однако мутантный штамм «Гуров» emm– был способен подавлять продукцию IL-17 в значительно большей степени, чем исходный штамм «Гуров». Способность мутантного штамма в сильнее подавлять синтез IL-17 макрофагами можно также рассматривать как позитивный эффект в отношении противоопухолевой защиты, поскольку снижается продукция проангиогенного и протуморогенного цитокина.
Таким образом, удаление М-белка в штамме S. pyogenes «Гуров» emm– привело к следующим иммуномодулирующим эффектам в отношении макрофагов: усилению продукции супероксид анионов и снижению продукции IL-10 и IL-17. Все три эффекта можно рассматривать как позитивные с точки зрения противоопухолевой защиты. Усиление продукции супероксид анионов может способствовать цитотоксическому действию макрофагов в отношении опухолевых клеток; подавление продукции ангиогенного цитокина IL-17 может сдерживать рост опухолевого узла, а снижение (по сравнению с исходным штаммом) продукции IL-10 уменьшит его иммунодепрессивное влияние. Можно предположить, что удаление М-белка привело также и к позитивному воздействию в организме мышей, а наблюдаемая нами при введении мутантного штамма задержка опухолевого роста может быть связана не только с его прямым воздействием на опухолевые клетки, но и с его иммуномодулирующим воздействием на макрофаги.