Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1. Биологические и патофизиологические подходы к оценке радиочувствительности 12
1.1.1 Основные подходы к оценке чувствительности организма при радиационных воздействиях 12
1.1.2 Явление радиоадаптивного ответа как критерий для оценки индивидуальной радиочувствительности 14
1.1.3 Вариабельность генетического материала как основа индивидуальной радиочувствительности 18
1.1.4 Полисистемная оценка индивидуальной радиочувствительности 25
1.2. Патофизиологическая оценка влияния факторов космического полета 29
1.2.1 Микрогравитация как фактор космического полета 31
1.2.2 Радиационное воздействие как фактор космического полета 34
1.2.3 Комбинированное действие факторов космического полета 36
1.3. Моделирование факторов космического полета 37
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 40
2.1. Комплексное исследование радиочувствительности мышей при действии гамма излучения в сублетальной дозе 42
2.1.1 Оценка субфракционных изменений в сыворотке крови методом лазерной корреляционной спектроскопии у лабораторных мышей 43
2.1.2 Оценка изменений при действии гамма-изучения на клеточном уровне 44
2.1.3 Оценка изменений при действии гамма-изучения на органном уровне 46
2.1.4 Оценка изменений, происходящих при действии гамма-излучения на организменном уровне с помощью подсчета прироста массы тела мышей и поведенческого теста «Открытое поле» 49
2.2. Моделирование эффектов космического полета 50
2.2.1 Моделирование микрогравитации 50
2.2.2 Моделирование эффектов малых доз радиации 51
2.3. Исследование адаптационных реакций в ответ на действие факторов космического
полета в рамках космического эксперимента «Резистентность» программы «БИОН-М» №1 51
2.3.1 Схема исследования индуцированного радиоадаптивного ответа
2.3.2 Оценка уровня апоптоза в клетках костного мозга мышей после экспозиции на субмагнитосферной орбите 53
ГЛАВА 3. Определение критериев радиочувствительности на разных структурно-функциональных уровнях организма 56
3.1. Исследование генетически обусловленной радиочувствительности на молекулярно клеточном уровне 63
3.1.1 Исследование субфракционного состава сыворотки крови мышей после гамма-облучения в сублетальной дозе 64
3.1.2 Изменения лейкоцитарной формулы крови мышей под действием облучения 68
3.1.3 Определение содержания субпопуляций лимфоцитов методом лазерной проточной цитометрии
3.2. Исследование эффектов облучения на органный структурно-функциональный уровень 75
3.3. Исследование изменений при действии гамма-излучения на уровне организма (вес и поведение)
3.3.1 Изменения прироста веса 82
3.3.2 Оценка изменения поведенческой реакции после облучения в тесте «Открытое поле» 83
ГЛАВА 4. Оценка субфракционных изменений в плазме крови мышей в наземном эксперименте 87
ГЛАВА 5. Определение критериев чувствительности к основным факторам полета на основе данных космического эксперимента «Резистентность» на биоспутнике «Бион-М» №1 90
5.1. Оценка субфракционных изменений в плазме крови мышей в рамках космического эксперимента «Резистентность» на биоспутнике «БИОН-М» №1 90
5.2. Постановка схемы индуцированного радиоадаптивного ответа в клетках костного мозга мышей после экспозиции на субмагнитосферной орбите («БИОН-М» №1) 94
Заключение 99
Выводы 106
Список литературы 108
- Явление радиоадаптивного ответа как критерий для оценки индивидуальной радиочувствительности
- Оценка субфракционных изменений в сыворотке крови методом лазерной корреляционной спектроскопии у лабораторных мышей
- Исследование субфракционного состава сыворотки крови мышей после гамма-облучения в сублетальной дозе
- Постановка схемы индуцированного радиоадаптивного ответа в клетках костного мозга мышей после экспозиции на субмагнитосферной орбите («БИОН-М» №1)
Явление радиоадаптивного ответа как критерий для оценки индивидуальной радиочувствительности
Малые дозы ионизирующей радиации могут индуцировать в организме радиоадаптивный ответ, характеризующийся устойчивостью целого организма или клеток к последующему облучению. При индукции РАО происходит снижение уровня цитогенетических нарушений, повышение выживаемости клеток, понижение уровня образования опухолей, повышение устойчивости к инфекциям [Засухина Г.Д., 2007]. Степень выраженности РАО полифакториальна и зависит от типа клеток, мощности дозы, времени между облучениями в малой (адаптирующей) и высокой (повреждающей) дозах, от фазы клеточного цикла, времени оценки эффекта, от индивидуальной чувствительности клеток, органов и всего организма, от экологических условий, в которых находится организм и др. [Пелевина И.И. и др., 2015].
Проявление радиоадаптивного ответа напрямую зависит от генетических особенностей биообъекта и индивидуальной чувствительности организма к облучению [Roberts S.A.et al., 1999]. Для оценки радиоадаптивного ответа, как и для оценки влияния малых доз ионизирующего излучения, часто используют молекулярные и цитогенетические методы [Гончарова И.А. и др., 2003; Севанько А.В.,и др., 2003; Цыб А.Ф. и др., 2005]: выявляют хромосомные аберрации [Серебряный А.М. и др., 2008; Федоренко Б.С. и др., 2008; Алчинова И.Б., 2015], поражения различных клеточных структур [Бурлакова Ц.Б., 2010], оценивают мутационные события в локусах различных генов [Корзенева И.Б. и др., 2008а; Минина В.И., 2012 ], определяют повреждения ДНК (одно- и двунитевые разрывы (ОНР, ДНР), перекрестные сшивки) [Воронков Ю.И. и др., 2008; Осипов А.Н. и др., 2009; Turner H. C. et al., 2015], применяют микроядерный тест [Пелевина И.И. и др., 2005, 2010; Ахмадулина Ю.Р. и др., 2013; Turner H.С. et al., 2015], метод ДНК-комет [Мязин А.Е. и др., 2002], подсчет свободной плазменной ДНК [Васильева И.Н. и др., 2015; Glebova K. et al., 2016] или анализ митохондриальной ДНК [Абдулаев С.А. и др., 2010], образование КОЕ [Васильев С.А. и др., 2010], частоту клеточной гибели, характеризующие выживаемость клеток [Засухина Г.Д., 1999; Пелевина И.И., 2015 Vorobyeva N. et al., 2008], показатели оксидативного стресса [Пелевина И.И., 2010; Tseng B.P. et al., 2013] и др.
При исследовании развития радиоиндуцированного адаптивного ответа была выявлена следующая закономерность: чем ниже резистентность биообъекта, тем выше частота проявления РАО [Пелевина И.И. и др., 2015]. Данная закономерность просматривается в некоторых исследованиях. Например, анализ сравнения индукции РАО между естественными популяциями полевых мышей и обыкновенных слепушонок, для которых характерна более высокая радиочувствительность по сравнению с мышами, показал более высокую частоту проявления РАО у слепушонок по снижению количества микроядер в полихроматофильных эритроцитах. Однако авторы связывают успешную радиоадаптацию данного вида популяции не только со сравнительно низкой радиорезистентностью организма, но и с постоянным проживанием слепушонок в зоне хронического воздействия 90Sr в малых дозах в отличие от диких мигрирующих мышей [Григоркина Е.Б. и др., 2013]. В другом исследовании индукцию РАО анализировали по уровню аберраций хромосом у двух линий мышей с различной радиочувствительностью - C3H/Sn и 101/HY. При воздействии на организм сначала адаптирующей (АД), а потом повреждающей дозами (ПД) у линии C3H/Sn наблюдали кумулятивный эффект. У линии 101/HY наблюдали уменьшение числа аберраций хромосом, что могло быть вызвано активацией радиоадаптивного ответа. Однако данный результат может означать, что уменьшение количества повреждений связано с усилением клеточной гибели вследствие повышенного количества аберраций на клетку [Алчинова И.Б. и др., 2010]. Тем более что относительно высокая выживаемость мышей линии 101/HY, при том, что у них наблюдают дефекты в системе эксцизионной репарации, связывают как раз с повышенной элиминацией клеток с радиоиндуцированными повреждениями ДНК [Малашенко А.М. и др., 2003]. Возможно, различия в индукции РАО могут быть связаны не столько с повышенной чувствительностью организма к радиации, сколько с индивидуальными проявлениями механизмов клеточного ответа на воздействие ИИ. Тем не менее, на данный момент механизм индукции РАО и вариабельность в частоте его проявлений изучены недостаточно [Rithidech K.N. et al., 2012].
После космического полета в качестве стандартной процедуры для оценки истощения функциональных ресурсов и здоровья экипажа используют нагрузочные физиологические пробы, в связи с тем, что регуляторные механизмы, поддерживающие гомеостаз во время космического полета (КП) и во время реадаптации, могут быть достаточными в покое, но не при напряженной деятельности [Влияние динамических факторов космического полета на организм животных, 1979]. Оценку радиационного воздействия проводят ретроспективно и результаты этих исследований отражают изменения генетического материала, произошедшие за время полета, однако, оценить явление генетической нестабильности не представляется возможным.
Исследовать индивидуальную радиочувствительность и адаптацию организма возможно при дополнительной радиационной нагрузке in vitro – при моделировании РАО в культуре клеток, выделенных из организма, экспонированного ИИ. В проведенных исследованиях показано, что реакция клеток при индукции РАО весьма вариабельна. В лимфоцитах пилотов и космонавтов наблюдали как уменьшение, так и увеличение радиочувствительности, характеризующейся повышением уровня аберраций хромосом, после воздействия на выделенные лимфоциты дополнительной повреждающей дозы, что подчеркивает необходимость применения индивидуального подхода для оценки реакции на условия полета, радиации и других экстремальных факторов [Воронков Ю.И. и др., 2008].
Для большего понимания механизмов индукции РАО были проведены исследования на лимфоцитах человека с применением протеомного анализа для определения состава синтезируемых белков. Было показано, что существуют 17 специфических генов, которые экспрессиру-ются при воздействии повреждающей дозы только после воздействия предварительной адаптирующей дозы на клетки. Из них: семь белков-активаторов антиоксидантной защиты, пять белков контроля клеточного цикла, три белка иммунной системы, один белок репарации ДНК и один белок цитоскелета (миозин) [Rithidech K.N. et al., 2012]. Также показана определяющая роль в индукции РАО генов, играющих ключевую роль в индивидуальной резистентности организма к облучению, таких как ATM, TP53, BRCA1, PRKCD, APEX1 и др.
Работа с клетками костного мозга мышей, которые были экспонированы на субмагнито-сферной орбите на биоспутнике «БИОН-М» №1 в рамках космического эксперимента «Резистентность», позволила нам использовать явление радиоадаптивного ответа в клетках костного мозга (ККМ) в качестве нагрузочного теста для оценки адаптивных возможностей клеток к факторам космического полета. В данном эксперименте было нивелировано большинство факторов, влияющих на развитие РАО за счет выбора линейных мышей C57BL/6 с низкой частотой спонтанных мутаций и постановкой синхронных контролей. В качестве маркера развития РАО был выбран метод анализа клеточной гибели по пути апоптоза. Апоптоз считают одним из основных механизмов поддержания тканевого гомеостаза [Шмаров Д.А. и др., 2013]. Апоптоти-ческую гибель клеток относят к компенсаторно-приспособительному механизму, направленному на поддержание определенного количества здоровых клеток в популяциях [Бережков Н.В., 2008]. Его индукцию рассматривают как один из вариантов клеточной реакции на облучение [Matsumoto H., 2004]. Главная роль апоптоза при воздействии радиации на организм состоит в удалении генетически дефектных клеток. Генерализация внутриклеточных сигналов к развитию апоптоза в первую очередь связана с белком p53, экспрессия которого повышается при наличии повреждений хромосом, накоплении нерепарированных разрывов ДНК и других радиоиндуци-рованных генетических нарушениях [Ярилин А.А. и др., 2000]. При увеличении поглощенной дозы увеличивается и апоптотическая гибель клеток [Turner H.C. et al., 2015]. Роль апоптоза заключена в активации гибели не только облученных клеток, но и в элиминации потомков облученных клеток, в которых также регистрируют патологические митозы и нарушение митотиче-ского аппарата деления клеток. В эксперименте по облучению эндотелиоцитов человека гамма-излучением 169Yb в малых дозах 0,21-20 сГр показано, что нарушения перехода из метафазы в анафазу сохранялось на протяжении 120 исследуемых генераций после облучения [Гильяно Н.Я. и др., 2015].
Как показывают исследования, при индукции РАО происходит активация более медленной и качественной репарации повреждений ДНК по пути гомологичной рекомбинации, активация процессов, предотвращающих образование радиоиндуцированных двунитевых разрывов ДНК путем детоксикации свободных радикалов, что приводит к уменьшению частоты мутаций, иммуностимуляция [Пелевина И.И. и др.,1999]. За счет данных процессов происходит уменьшение запрограммированной гибели клеток путем апоптоза. Доказано, что выраженность апоптотической гибели клеток обратно пропорциональна степени индукции РАО [Пелевина И.И. и др., 2015]. Поэтому оценка частоты гибели клеток может быть одним из маркеров индивидуальной радиочувствительности, выражающейся в способности клеток к радиоиндуциро-ванному адаптивному ответу [Vorobyeva N. et al., 2008]. Применительно к космической деятельности, понимание механизмов индукции радиационно-индуцированного адаптивного ответа, характеризующего индивидуальную радиочувствительность, взаимодействия его с «эффектом свидетеля», вероятно, позволит повысить качество профессионального отбора [Matsumoto H. et al., 2004].
Оценка субфракционных изменений в сыворотке крови методом лазерной корреляционной спектроскопии у лабораторных мышей
В периферической крови мышей при подсчете лейкоцитарной формулы крови определяли относительное содержание лимфоцитов, нейтрофилов (палочко- и сегментоядерных), эозино-филов, базофилов и моноцитов. В дальнейшем рассчитывали индекс сдвига лейкоцитов крови. Субпопуляционый состав лимфоцитов и общее содержание лейкоцитов определяли на лазерном проточном цитометре EPICS XL 4 color (Beckman Coulter, США).
Лейкоцитарная формула и индекс сдвига лейкоцитарной крови. Определение количества клеток крови происходило путем подсчета лейкоцитарной формулы, который проводили при иммерсионной микроскопии окрашенных мазков через 1, 3 и 6 недель после облучения. Забор крови через 1 неделю осуществляли из малой подкожной вены голени [Степанова О.И., 2006]. Через 3 и 6 недель забор крови проводили при эвтаназии животных путем декапитации. Мазки крови готовили по стандартной методике [Васильев А.В., 1956]. Каплю крови наносили на предметное стекло («Healthaw», China) пипеткой, далее каплю равномерно распределяли с помощью шпателя для растяжки мазков («ГЕМ-СТРИП», Россия).
Для окрашивания приготовленных мазков использовали комбинированную окраску по Паппенгейму. При данном способе окрашивания последовательно применяли красители Мая Грюнвальда и Романовского-Гимзе. Рабочий раствор Романовского-Гимзе готовили из концен трата красителя («ПанЭко», Россия) по стандартной методике производителя [http://www.paneco-ltd.ru/]. Сухие нефиксированные мазки помещали в кювету с раствором Мая Грюнвальда («МиниМед», Россия) на 3-5 минут. После этого мазки ополаскивали дистиллиро ванной водой и помещали в кювету с разведенным раствором Романовского-Гимзы на 20-30 минут. Затем мазки промывали проточной водой и высушивали в течение нескольких часов [Егоров П. И. и др., 1956]. Данный способ считается наилучшим для окраски мазков перифери ческой крови и костномозговых пунктатов [Любина А.Я. и др., 1984]. Для подсчета лейкоцитов использовали метод Шиллинга - в четырех полях мазка по линии меандра. В каждом из четырех мест подсчитывали по 50 лейкоцитов. Далее рассчитывали индекс сдвига лейкоцитарной крови (ИСЛК) по формуле (1). (Эоз% + Баз% + Нейт%) ислк = (1) (Мон% + Лимф%) Где: Эоз % - относительное содержание эозинофилов в мазке крови, Баз… %… -… от..н(1о)сительное содержание базофилов в мазке крови, Нейт % - относительное содержание нейтрофилов в мазке крови, Мон % - относительное содержание моноцитов в мазке крови, Лимф % - относительное содержание лимфоцитов в мазке крови. Индекс сдвига лейкоцитарной крови – наиболее часто используемый интегральный гематологический индекс. Он характеризует наличие воспаления и реактивность организма в целом [Гирин С.В. и др., 2010].
Проточная цитометрия1. Т- и В-лимфоциты считают наиболее радиочувствительными клетками крови, даже при действии малых доз ИИ [Радзивил Т.Т. и др., 2016]. Для оценки суб популяционного состава лимфоцитов и общего содержания лейкоцитов крови мышей исполь зовали метод трехцветного цитометрического анализа на проточном лазерном цитометре EPICS XL 4 color (Beckman Coulter, США). В основе метода лежат взаимодействия моноклональных антител, меченых флуоресцентной меткой, с поверхностными антигенами лимфоцитов и после дующий анализ образцов на проточном лазерном цитометре. Использовали антитела с конъ югированными флуоресцентными метками: флуоресцеин-5-изотиоцианат (FITC) – антитела к CD19, фикоэритрин (PE) – антитела к CD3 и тандем цианин 5/фикоэритрин (PE/Cy5) – антитела к CD45. Окрашивание клеточной суспензии проводили по протоколу фирмы-производителя ан тител BendrMedSystems. К 100 мкл гепаринизированной цельной крови добавляли расчётное количество моноклональных антител к молекулам CD45-PeCy5/CD3-PE/СD19-FITC (eBioScience, Австрия). Через 30 минут после инкубирования в темноте при +4Со добавляли ли-зирующий-фиксирующий реагент Optilyse C в объеме 1 мл. Далее встряхивали на Vortex и инкубировали около 15 мин в темноте, при комнатной температуре. После этого осаждали лимфоциты центрифугированием 300-400xG при 4оС в течение 10 минут. Супернатант сливали и отмывали лимфоциты 1 мл физиологического раствора. Осадок ресуспендировали в 500 мкл
Оценку субпопуляционного состава лимфоцитов и общего содержания лейкоцитов крови мышей проводили совместно с н.с. Таллеровой А.В. лаборатории лекарственной токсикологии ФГБУ «Научно-исследовательского института фармакологии им. В.В. Закусова». физиологического раствора. Учет результатов цитометрии осуществляли на основании анализа 5000 - 10000 событий. Результаты обрабатывали в программе WinMDI 2,7 и выражали в процентах клеток, несущих данный маркер [Таллерова А.А. и др., 2012].
Исследование субфракционного состава сыворотки крови мышей после гамма-облучения в сублетальной дозе
При оценке радиочувствительности целого организма существует ряд трудностей. Наиболее показательным критерием является выживаемость биообъектов. Однако проведение таких исследований затратно, ограничивается этическими нормами и не применимо к человеку. Оценка только такого параметра как выживаемость биообъекта не может дать ответ на вопрос о пострадиционных изменениях в организме, приводящих к отсроченным последствиям. Также при высокой смертности биообъекта дальнейшее исследование проводят на более резистентных особях популяции [Мязин А.Е. и др., 2002]. Попытки найти достоверные маркеры, позволяющие разделить популяции на радиорезистентных и радиочувствительных особей, пока не увенчались успехом. Это связано с обширностью самого понятия “радиации”, под которым понимают разнообразие волн и частиц, используемых в различных дозах и с различной мощностью. Только для значительных доз (например, свыше 0,5 Гр гамма-излучения) получены кривые зависимости “доза-эффект” для определенных физиологических процессов (выход аберраций хромосом, уровни АФК и др.). Кроме того, исследователи обычно оценивают реакции на облучение по одному - двум тестам на одном физиологическом уровне. Однако гибель клеток или повреждения молекул ДНК не обязательно ведут к гибели организма. [Крыжановский Г.Н., 2009].
Для оценки индивидуальной радиочувствительности следует применять комплексный подход и использовать данные, полученные разными методами на нескольких структурно-функциональных уровнях, каждый из которых может модифицировать предел адаптационных и компенсаторных реакций.
На Подготовительном этапе происходила разработка и верификация батареи тестов для комплексной оценки действия ионизирующего излучения на организмы с генетически детерминированной радиочувствительностью. Была выбрана доза 7,5 Гр для того, чтобы исследовать изменения, вызванные гамма-излучением в сублетальной дозе, на разных структурно-функциональных уровнях организма. Одним из существенных преимуществ комплексного подхода является возможность уделить внимание не только процессу восстановления пораженного органа, но и восстановлению нормальной жизнедеятельности организма в целом, учитывая индивидуальную реактивность организма. Дизайн эксперимента был построен таким образом, что в нем использовали 3 линии мышей, отличающихся чувствительностью к ИИ: C3H/SnY, C57BL/6JY и 101/HY. В литературе мыши линии 101/HY описаны как одна из экспериментально-биологических моделей заболеваний человека, связанных с хромосомной нестабильностью и дефектами репарации ДНК [Лильп И.Г. и др., 1992; Мазурик В.К. и др., 2004]. Снижение эффективности репарационной системы и повышение спонтанного мутирования данной линии связывают с рецессивной мутацией гена mut-1 [Малашенко А.М. и др., 1980; Корогодина Ю.В. и др., 1981; Маг-коева Ф.З. и др., 2007]. Дефекты эксцизионной репарации обуславливают повышенную чувствительность к радиомиметикам (алкилирующие мутагены), поэтому мыши данной линии характеризуются генетической радиочувствительностью [Малашенко А.М. и др., 2003; Боярши-нова О.С. и др., 2009]. Мышей линий C3H/Sn и C57BL/6J считают радиорезистентными линиями, при этом линия С57BL/6J более восприимчива к облучению [Mikhalilov V.F. et al., 2005; Takabatake T. et al., 2008].
В нашей работе генетические особенности мышей линий С3H/Sn и С57BL/6J выявлены с помощью баз данных International Mouse Genome Informatics (MGI) (полиморфные варианты) [http://www.informatics.jax.org/], Mouse Phenome Database (MPD) (изменения в экспрессии) [http://phenome.jax.org/]. Данные по генетическим полиморфизмам и экспрессии генов мышей линии 101/Н отсутствуют. По результатам анализа получили, что радиорезистентные линии С3H/Sn и С57BL/6J отличны друг от друга по 39 полиморфным локусами кандидатных генов, отвечающих за резистентность к облучению. Также у данных линий выявлены многочисленные полиморфизмы по генам, возможно, участвующих в индукции радиоадаптивного ответа [Rithidech K.N. et al., 2012]. Однако данные полиморфизмы не являются клинически значимыми и, скорее всего, не влияют на вариации ответной реакций мышей на облучение. В условиях без дополнительных нагрузок у мышей линии С3H/Sn выявлено повышенная экспрессия 257 генов по сравнению с С57BL/6J (207 генов). Экспрессия генов в генетической базе данных MPD нормализована по Z-стандартизации, разницу в экспрессии учитывали при Z 1,5. На основе генетических баз Online Mendelian Inheritance in Man [http://www.omim.org], UniProt [http://www.uniprot.org/] и Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes [http://www.genome.jp/kegg/] выяснены функции генов с отличающейся экспрессией и отобраны те, которые могли участвовать в модуляции ответных реакций организма на гамма-излучение.
К механизмам проявления адаптационно-приспособительных реакций относят такие изменения, которые предотвращают или уменьшают генетические эффекты после облучения [Пелевина И.И. и др., 1999]. К генам, регулирующим приспособительные реакции в ответ на облучение, относят гены репарации радиационно-индуцированных повреждений ДНК, контроля клеточного цикла, индукции элиминации клеток, механизмов оксидативной защиты, иммунного ответа и др. [Рубанович А.В., 2007; Kim S.T. et al., 2002]. В главе «Обзор литературы», в разделе «Индивидуальная радиочувствительность» рассмотрена группа генов, играющих ключевую роль в развитии приспособительных механизмов. У мышей линии С3H/Sn исходно более высокая экспрессия 6 из 37 (Табл. 1, глава Обзор литературы) генов, ответственных за резистентность организма к облучению по сравнению с мышами линии С57BL/6J (Табл. 3).
Постановка схемы индуцированного радиоадаптивного ответа в клетках костного мозга мышей после экспозиции на субмагнитосферной орбите («БИОН-М» №1)
Изменения в картине периферической крови – одними из главных критериев оценки действия облучения на организм [Шибкова Д.З. и др., 2006]. Гибель лимфоцитов после радиационного воздействия продолжается около 3х суток. Разрушение клеток после облучения происходит и в лимфоидных органах (тимус, лимфатические узлы, селезенка, лимфоидные образования в кишечнике), в периферической крови и лимфе. Глубина снижения уровня лимфоцитов и скорость их гибели, так же, как и других клеток периферической крови, прямо зависит от дозы облучения и индивидуальной реактивности организма [Кузьменко Е.В., 2011].
Зрелые клеточные элементы крови, такие как сегментоядерные нейтрофилы, достаточно резистентны к действию ионизирующего излучения (D0 более 15 Гр). Изменение их содержания в крови после облучения главным образом связано с естественным процессом их убыли после завершения жизненного цикла и отсутствием поступления в периферическую кровь новых зрелых клеток. Для изменения числа нейтрофилов после облучения характерна фаза раннего нейтрофилеза, величина и время которой зависит от дозы облучения и реактивности организма, и обычно протекает от нескольких часов до суток после облучения [Valente M. et al., 2015]. Причины выброса в кровь в это время значительного числа зрелых нейтрофильных клеток связывают с влиянием на костный мозг экстрамедуллярных факторов, в частности, с возрастанием в крови на ранних сроках облучения содержания катехоламинов и других биологически активных веществ. Прохождение нейтрофильных гранулоцитов через отдел созревания составляет 5-6 суток, их содержание в периферической крови начинает снижаться именно с этого времени [Кузьменко Е.В., 2011]. Примерно через 2 недели после облучения в периферической крови развивается абортивный подъем содержания гранулоцитов. Скорость протекания данного процесса связана с компенсаторным усилением пролиферативных процессов в костном мозге. К третьей неделе развивается вторичное опустошение с максимальной нейтропенией. Далее возможна фаза восстановления содержания нейтрофилов в крови. Эта фаза связана с сохраненной долей клеток созревающего и пролиферативного отдела кроветворной системы, а также с восстановлением численности данных клеток [Шафиркин А.В. и др., 2009].
В настоящей работе сравнение количества различных форменных элементов в крови мышей разных линий через одну, три и шесть недель после облучения выявило наибольшие различия в количестве палочкоядерных (п/я) и сегментоядерных (с/я) нейтрофилов и лимфоцитов (Рис. 6). Содержание общего числа лейкоцитов, моноцитов и эозинофилов в периферической крови мышей статистически не изменялось.
В изменении картины крови у мышей линии C3H/SnY наблюдали лимфопению с развитием абортивного подъема через 1 неделю после облучения с последующим вторичным опустошением к третьей неделе и неполным восстановлением к концу эксперимента, а также стойкий нейтрофилез. Причем детектировали повышенное содержание палочкоядерных нейтрофилов в течение всего эксперимента и тенденцию к уменьшению количества сегментоядерных нейтрофилов к 6й неделе. Тенденция к снижению содержания с/я нейтрофилов у облученных мышей через 6 недель может означать, что не произошло достаточного обновления клеток после радиационного поражения. У мышей линии 101/HY значимого изменения в содержании клеток крови не обнаружили. У линии мышей C57BL/6JY наблюдали увеличение содержания палочко-ядерных нейтрофилов через 3 недели после облучения. При этом количество зрелых сегменто-ядерных нейтрофилов в опытных группах было постоянным и выше, чем в контроле. И, как у линии мышей С3Н/SnY, наблюдали глубокое снижение количества лимфоцитов с тенденцией к восстановлению численности данных клеток к 6й неделе после облучения.
Лейкоцитарная формула крови мышей трех линий. По оси абсцисс – недели после облучения. По оси ординат – содержание клеток крови, %. - PU 0,05 с контрольной группой, ! - PU 0,05 с линией мышей С3Н/SnY, + - PU 0,05 с линией мышей С57BL/6JY, -PТ 0,05 с 1й неделей, # - PТ 0,05 с 6й неделей. Верхняя и нижняя квартили указаны в квадратных скобках.
В исследованиях in vivo немишенных эффектов облучения, к которым относят «эффект свидетеля» и радиоиндуцированное поражение цитоплазмы и клеточных мембран [Литтл Д.Б., 2007], было показано, что после действия ИИ проявляются последствия клеточных взаимодействий, которые представляют собой баланс между образованием токсических факторов и ответом клетки на эти факторы. Механизмы, лежащие в основе данных клеточных реакций, включают в себя процесс окислительного стресса, и развивающийся на его основе типовой патологический процесс - воспаление [Mukherjee D. et al., 2014]. Нейтрофилы рассматривают как основные фагоцитирующие клетки, способные быстро мобилизоваться в очаг воспаления из крови. Большая по сравнению с лимфоцитами радиорезистентность и способность в короткое время активировать метаболизм для уничтожения продуктов деструкции делает их максимально приспособленными для осуществления ранних проявлений иммунной защиты [Ярилин А.А., 2010]. Наблюдаемое увеличение выхода в кровь п/я нейтрофилов может возникать за счет недостаточной работы созревающего отдела. Значительное увеличение содержание нейтрофилов у облученных мышей по сравнению с контролем могло быть следствием развития воспалительных реакций, нередко сопровождающих эффекты радиационного воздействия на организм. Такой сдвиг в лейкоцитарной формуле может быть связан с уменьшением полувыведения зрелых клеток из кровотока и снижением времени пребывания в костном мозге, а также в результате усиленной работы пролиферативного отдела [Шафиркин А.В. и др., 2009].
Для оценки тяжести заболеваний и эффективности методов проводимой терапии в клинической практике часто используют интегральные показатели крови на основе лейкограммы [Щербинская И.П. и др., 2006; Коваленко Л.А. и др., 2013].
В нашей работе был использован индекс сдвига лейкоцитарной крови как дополнительный интегральный метод оценки эффектов облучения (Рис. 7). Повышение ИСЛК характеризует наличие воспалительной реакции и нарушение иммунологической реактивности организма. Воспалительные реакции, являющиеся следствием радиационного поражения, привносят существенный вклад в развитие немишенных и отсроченных эффектов радиации [Mukherjee D. et al., 2014]. Увеличение ИСЛК обычно происходит за счет повышения относительного содержания нейтрофилов [Гирин С.В. и др., 2010], что и было зафиксировано в лейкоцитарной формуле опытных групп мышей исследуемых линий.
Рисунок 7. Индекс сдвига лейкоцитарной крови мышей линий C3H/SnY, 101/HY и С57BL/6JY. - PU 0,05 с контрольной группой, ! - PU 0,05 с линией мышей С3Н/SnY. Верхняя и нижняя квартили указаны в квадратных скобках. У мышей линий C3H/SnY и C57BL/6JY было зафиксировано достоверное повышение ИСЛК, что характерно для извращения иммунной реактивности. У линии 101/HY выявлена тенденция к такому изменению. При этом у линии мышей С57BL/6JY наблюдали тенденцию к снижению данного показателя с течением времени.
Воздействие радиации на кроветворную и лимфоидную ткань приводит не только к гибели лимфоцитов, но и вызывает значительные изменения их функциональной активности. Это может приводить к извращению иммунного ответа как в ближайшие сроки, так и в отдаленном периоде после лучевого воздействия. Для того чтобы отследить изменения, произошедшие в субпопуляциях лимфоцитов, была проведена лазерная проточная цитометрия периферической крови (Рис. 8).
Рисунок 8. Содержание Т- и В- лимфоцитов в крови мышей разных линий. По оси абсцисс – недели после облучения, по оси ординат – относительное количество лимфоцитов, %. -PU 0,05 с контрольной группой, ! - PU 0,05 с линией мышей С3Н/SnY, + - PU 0,05 с линией мышей С57BL/6JY, # - PТ 0,05 с 6й неделей. Верхняя и нижняя квартили указаны в квадратных скобках.
Было показано снижение содержания лимфоцитов у мышей трех линий в разные сроки после облучения. У мышей линии C3H/SnY в опытной группе к 6й неделе наблюдали сильное уменьшение содержания обеих субпопуляций лимфоцитов по сравнению с третьей неделей и с контролем. У мышей линии 101/HY снижение количества лимфоцитов также происходило через 6 недель после облучения, но только в субпопуляции В-клеток. У мышей линии C57BL/6JY в опытной группе отмечали резкое снижение количества лимфоцитов на 3й неделе после облучения с последующей тенденцией к восстановлению числа лимфоцитов обеих популяций к 6й неделе. Причину таких вариаций в клеточном ответе позволяют объяснить данные генетической базы MPD [http://phenome.jax.org/]. Количество генов с повышенной экспрессией, ответственных за пролиферацию, дифференциацию и активность лимфоцитов выше у мышей линии C57BL/6J по сравнению с линией мышей C3H/Sn (Табл. 10). Возможно, восстановление численности Т-лимфоцитов крови мышей линии С57BL/6JY, наблюдаемое в нашей работе, связано не столько с активацией тимопоэза, сколько с гомеостатической пролиферацией периферических Т-лимфоцитов [Митин А.Н. и др., 2013], что можно считать компенсаторно-приспособительной реакцией в ответ на действие ИИ.