Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности.
Современные условия жизни человека и связанные с этим антропогенные факторы негативно влияют на иммунную систему и часто ведут к срыву нормальных адаптивных реакций (Ветров В.А., 2015; Winans B. et al., 2011; Kunisawa J. et al, 2010; Bjrksten B., 2009). Наряду с этим под воздействием широкого спектра химических загрязнителей и антимикробных препаратов изменяется качественный и количественный состав микробиоценозов естественно открытых полостей тела человека, в результате чего симбионтные взаимоотношения в системе микробиота-хозяин трансформируются в отношения взаимной агрессии. При этом деструктивная реакция со стороны микробиоты проявляется усиленной продукцией и высвобождением различных факторов вирулентности, которые могут стать причиной развития серьезных патологических процессов в организме хозяина (Choi J. et al, 2018; Serino M., 2018; Everard A. et al, 2013). Одним из непосредственных проявлений этих негативных тенденций является значительный рост числа заболеваний, которые обусловлены условно-патогенными грамотрицательными бактериями, входящими в семейство Enterobactenaceae и относящимися к облигатным или транзиторным представителям кишечной микрофлоры человека (Wright Н. et al, 2017; Bassetti М. et al, 2011; Pallett A. et al, 2010).
Ключевым фактором патогенности грамотрицательных бактерий является липополисахарид (ЛПС, или эндотоксин) - один из основных компонентов внешней мембраны клеточной стенки этих микроорганизмов. ЛПС обладает очень высокой и разнонаправленной биологической активностью, непосредственно ассоциированной с липидом А. Взаимодействие липида А со специализированными мембранными рецепторами определенных типов клеток ведет к их активации и синтезу широкого спектра медиаторов воспаления (Rhee S.H., 2014; Bishop R.E., 2005). Возникающий при этом “медиаторный хаос” считается ведущей причиной таких тяжелых и все еще достаточно часто встречающихся патологий, как полиорганная недостаточность и септический шок (Chousterman B.G. et al., 2017; Marshall J.C. et al, 2010; Opal S.M. et al., 2010).
Вместе с тем становится все более очевидным, что ЛПС играет существенную роль в патогенезе многих других заболеваний, формирование и развитие которых не имеет непосредственной связи с острыми и/или хроническими инфекционными процессами, обусловленными грамотрицательными бактериями (Clementi A. et al, 2017; Аниховская И.А. и др., 2016; Аниховская И.А. и др., 2015; Окороков П.Л. и др., 2012; Doreswamy V. et al, 2011; Kats S. et al, 2011). Дело в том, что ЛПС принадлежит к числу облигатных антигенов нормальной среды обитания человека (Farokhi A. et al, 2018). Кроме того, в дистальных отделах желудочно-кишечного тракта человека находится огромное количество симбионтной микрофлоры, значительную часть которой составляют представители семейства Enterobactenaceae (Sansonetti P.J., 2008). Таким образом, постоянный контакт с ЛПС происходит на протяжении всего жизненного цикла каждого индивидуума.
Интегральный вектор воздействия ЛПС на организм во многом зависит от функционального состояния гуморальных и клеточных систем, участвующих в его распознавании, нейтрализации биологической активности и элиминации (Cross A.S., 2014; Mller-Loennies S. et al, 2007). Существенную роль в этих сложных и взаимосвязанных процессах играют иммунные механизмы, которые реализуются при непосредственном участии эффекторов врожденного и адаптивного иммунитета (Cross A.S., 2014; Mller-Loennies S. et al., 2007). Для того, чтобы подчеркнуть особое значение антиэндотоксиновых иммунных механизмов в неинфекционной патологии, проф. М.Ю. Яковлевым в научную семантику был введен термин “антиэндотоксиновий иммунитет”, который стал широко использоваться в отечественной и иностранной литературе (Яковлев М.Ю., 2015). Считается, что антиэндотоксиновый иммунитет является одним из важнейших функциональных компонентов интегральной системы адаптационно-компенсаторных механизмов, принимающих участие в поддержании гомеостаза микробных молекул в организме. Поступление ЛПС в организм в количествах, которые превышают адаптивные возможности этой системы или происходящее на фоне ее функциональной недостаточности, классифицируется как “эндотоксиновая агрессия”, разнообразные манифестации которой могут оказывать значительное влияние на клиническое течение и исход основного заболевания (Яковлев М.Ю., 2013; Okorokov P.L. et al., 2011; Вышегуров Я.Х. и др., 2007).
Имеющиеся на сегодняшний день клинико-экспериментальные данные о характере нарушений различных звеньев антиэндотоксиновой иммунной защиты при неинфекционных заболеваниях, ассоциированных с риском развития эндотоксиновой агрессии, достаточно ограничены и зачастую противоречивы. Остается невыясненными вопросы о взаимных связях между такими нарушениями и хроническим вялотекущим воспалением. Между тем ЛПС-зависимая продукция провоспалительных медиаторов может быть важным фактором поддержания хронических низкоинтенсивных воспалительных процессов, которые ведут к атеросклеротическим изменениям сосудов и повышают риск сердечнососудистых осложнений (Clementi A. et al., 2017; Аниховская И.А. и др., 2015; Ю.В. Конев и др., 2011; K. Reifenberg et al., 2009); формируют микроокружение, благоприятное для метастазирования и опухолевого неоангиогенеза (Voronov E. et al., 2014); способствуют развитию метаболической иммуносупрессии (Patel H.J. et al., 2017) и т.д.
Цель исследования – установить патогенетическое значение нарушений антиэндотоксиновых иммунных механизмов при неинфекционных заболеваниях, ассоциированных с повышенным риском развития эндотоксиновой агрессии.
Задачи исследования:
1. Оценить патогенетическое значение нарушений иммунных
антиэндотоксиновых механизмов при аутоиммунных заболеваниях
(акантолитическая пузырчатка, системная красная волчанка, ревматоидный
артрит).
-
Установить патогенетическую роль нарушений антиэндотоксиновых иммунных механизмов при сахарном диабете 1 и 2 типа;
-
Изучить патогенетическое значение нарушений антиэндотоксиновых иммунных механизмов при онкологической патологии (лейкемия и миелодиспластический синдром; опухоли различной локализации).
-
Охарактеризовать состояние разных звеньев антиэндотоксиновой иммунной защиты при локальных воспалительных заболеваниях челюстно-лицевой области (хронический генерализованный пародонтит, верхушечный периодонтит, гнойные процессы мягких тканей лица и шеи);
-
Выявить взаимные связи между нарушениями антиэндотоксиновых иммунных механизмов, активностью аутоиммунных процессов и хроническим низкоинтенсивным воспалением при акантолитической пузырчатке; системной красной волчанке; ревматоидном артрите; сахарном диабете 1 и 2 типа с использованием кластерного анализа.
-
Охарактеризовать физиологические параметры различных звеньев антиэндотоксиновой иммунной защиты с учетом анализа матрицы корреляционных связей между показателями различных звеньев антиэндотоксиновой иммунной защиты, концентрацией общих иммуноглобулинов разных классов в крови и общего секреторного IgA в слюне.
-
Обосновать выбор и усовершенствовать лабораторные методики для развернутой оценки состояния различных звеньев антиэндотоксиновых иммунных механизмов в норме и при патологии.
Научная новизна исследования. В работе впервые охарактеризованы нарушения механизмов антиэндотоксиновой иммунной защиты при аутоиммунных заболеваниях (акантолитическая пузырчатка, системная красная волчанка, ревматоидный артрит), воспалительных заболеваниях челюстно-лицевой области (хронический генерализованный пародонтит, верхушечный периодонтит, гнойные процессы мягких тканей лица и шеи), нарушениях углеводного обмена (сахарный диабет 1 и 2 типа) и неопластических процессах (лейкемия и миелодиспластический синдром, опухоли различной локализации).
Впервые продемонстрирована тесная связь между дефицитом сывороточных анти-ЛПС-антител класса M и активностью аутоиммунных процессов у больных акантолитической пузырчаткой и системной красной волчанкой.
Впервые показано, что у больных ревматоидным артритом и сахарным диабетом 1 и 2 типа развитие низкоинтенсивного воспаления тесно ассоциировано с угнетением гуморального звена антиэндотоксиновой иммунной защиты, наиболее типичным проявлением которого является дефицит сывороточных анти-ЛПС-антител класса M.
Впервые установлено, что у больных гнойно-воспалительными заболеваниями лица и шеи развитие гнойного процесса сопровождается снижением ЛПС-связывающего потенциала гранулоцитов, что может быть использовано в качестве прогностического критерия.
Впервые показано, что при ряде неопластических процессов нарушения антиэндотоксиновых иммунных механизмов проявляются в виде дефицита сывороточных анти-ЛПС-антител класса M, что благоприятствует эндотоксиновой агрессии и развитию инфекционных осложнений, причинным фактором которых является грамотрицательная микрофлора.
Впервые показано, что у здоровых людей индивидуальные уровни анти-ЛПС-антител разных классов и различной специфичности зависят от пола, возраста, группы крови (система AB0), а также подвержены сезонным колебаниям.
Впервые показано, что у здоровых людей повышение базовой концентрации С-реактивного белка в крови до уровня, рассматриваемого как предиктор повышенного кардиоваскулярного риска, ассоциировано со снижением уровней сывороточных анти-ЛПС-антител разных классов и падением ЛПС-связывающего потенциала моноцитов и гранулоцитов периферической крови.
Впервые установлено, что антимикробная активность полимиксина B в присутствии ЛПС энтеробактерий снижается прямо пропорционально концентрации ЛПС, что делает возможным количественное определение ЛПС энтеробактерий биолюминесцентным методом.
Впервые показано, что мягкое окисление ЛПС перйодатом натрия с
последующим присоединением активированного производного биотина
(биотинамидокапроилгидразида) по альдегидным группам позволяет повысить чувствительность определения ЛПС энтеробактерий в твердофазном конкурентном анализе.
Впервые показано, что неспецифическое взаимодействие конъюгата ЛПС с флуоресцеинизотиоцианатом (ЛПС-FITC) с лейкоцитами периферической крови эффективно блокируется сывороточным альбумином, что определяет возможность использования такого конъюгата в качестве флуоресцентного зонда при определении ЛПС-связывающего потенциала моноцитов и гранулоцитов.
Впервые установлено, что присоединение к рецептору CD14 специфичных к нему моноклональных антител клона RMO52 (анти-CD14 МКА) не препятствует связыванию с этими же рецепторами конъюгата ЛПС-FITC. Это позволяет определять функционально активные ЛПС-связывающие рецепторы на моноцитах и гранулоцитах путем одновременного окрашивания указанных клеток конъюгатом ЛПС-FITC и конъюгатом анти-CD14 МКА с фикоэритрином.
Теоретическая значимость работы. Результаты проведенных исследований
значительно расширяют представления о роли нарушений иммунных механизмов
нейтрализации и элиминации ЛПС энтеробактерий при неинфекционной патологии
человека. Дефицит сывороточных анти-ЛПС-антител класса М, обладающих
наибольшей способностью к связыванию и нейтрализации биологической
активности ЛПС, создает благоприятные условия для эндотоксиновой агрессии,
которая может протекать в острой или хронической форме, либо в смешанном
варианте. В зависимости от основной патологии, это во многом предопределяет
патогенетическую значимость нарушений антиэндотоксиновых иммунных
механизмов: ЛПС-зависимое низкоинтенсивное воспаление и связанные с этим
ангиопатии, атеросклероз сосудов; аутоиммунные расстройства;
инсулинорезистентность; метаболические нарушения и эндогенная интоксикация; формирование микроокружения, благоприятного для местатазирования, опухолевый неоангиогенез и прогрессии опухолевого роста; риск развития инфекционных осложнений; метаболическая иммуносупрессия. При этом направленность изменений уровней сывороточных анти-ЛПС-антител разных классов чаще всего не совпадает с направленностью изменений концентрации в крови общих иммуноглобулинов этих же классов, что свидетельствует об отсутствии непосредственных связей между иммунным ответом на ЛПС энтеробактерий и состоянием В-клеточного звена иммунитета в целом. Полученные данные свидетельствуют о перспективности поиска средств и лечебных процедур снижения концентрации ЛПС кишечного происхождения в общей гемоциркуляции и обоснования показаний к их применению у больных с верифицированными нарушениями антиэндотоксиновых иммунных механизмов.
Практическая значимость работы. Предложены новые методики анализа
содержания ЛПС энтеробактерий в водно-солевых растворах, которые
характеризуются высокой чувствительностью и широким диапазоном определяемых
концентраций ЛПС. Разработаны высокоэффективные способы иммобилизации S- и
R-формы молекул ЛПС энтеробактерий на внутренней поверхности
полистироловых планшетов при проведении иммуноферментного анализа (ИФА),
что обеспечивает низкий уровень неспецифических взаимодействий и существенное
увеличение соотношения [полезный сигнал/фон], тем самым повышая
чувствительность и воспроизводимость анализа. Предложены универсальные протоколы проведения ИФА для определения анти-ЛПС-антител разных классов и различной специфичности. Предложены новые методики определения ЛПС-связывающего потенциала моноцитов и гранулоцитов периферической крови с помощью проточной лазерной цитофлуориметрии. Показано, что анализ динамики изменений ЛПС-связывающего потенциала гранулоцитов при одонтогенных гнойно-воспалительных заболеваниях лица и шеи может быть использован для оценки тяжести гнойного процесса и прогнозирования развития осложнений, сопровождающихся системным воспалительным процессом.
Методология и методы исследования. Методологией диссертационного
исследования стал системный подход к оценке патогенетической значимости нарушений
антиэндотоксиновых иммунных механизмов, основанный на использовании комплекса
современных иммунологических, биохимических и статистических методов. Объектом
исследований являлись больные, страдающие аутоиммунной патологией
(акантолитическая пузырчатка, системная красная волчанка, ревматоидный артрит);
воспалительными заболеваниями челюстно-лицевой области (хронический
генерализованный пародонтит, верхушечный периодонтит, гнойные процессы мягких тканей лица и шеи); нарушениями углеводного обмена (сахарный диабет 1 и 2 типа); неопластическими процессами (лейкемия и миелодиспластический синдром, опухоли различной локализации). Контрольную группу составили практически здоровые люди, которые по полу и возрасту соответствовали указанным выше группам больных, и на момент проведения обследования не имели клинических признаков острой инфекционной патологии, а также хронических заболеваний в анамнезе. Обследование и взятие биоматериала осуществлялось медицинским персоналом Медицинской академии имени
С.И. Георгиевского после подписания всеми участниками информированного согласия на проведение исследования. Материалом для проведения лабораторных исследований служили образцы периферической крови и слюны, взятые по общепринятым методикам. Все использованные средства измерений и оборудование медицинского назначения были метрологически обеспечены на протяжении выполнения исследований и позволяют получать достоверные данные, а их номенклатура соответствует поставленной цели и задачам диссертационной работы.
Основные научные положения, выносимые на защиту
-
При ряде аутоиммунных заболеваний (акантолитическая пузырчатка, системная красная волчанка, ревматоидный артрит) выявлено снижение уровней сывороточных анти-ЛПС-антител класса M. У больных акантолитической пузырчаткой и системной красной волчанкой дефицит сывороточных анти-ЛПС-антител класса M сопряжен с активацией аутоиммунных процессов, а у больных ревматоидным артритом - с повышением концентрации С-реактивного белка в крови.
-
У больных сахарным диабетом 1 типа повышение концентрации С-реактивного белка в крови ассоциировано с достоверным снижением уровней сывороточных анти-ЛПС-антител всех классов, тогда как у больных сахарным диабетом 2 типа увеличение концентрации С-реактивного белка в крови сопровождается достоверным повышением уровней анти-ЛПС-антител классов A и G на фоне дефицита анти-ЛПС-антител класса M.
-
При ряде неопластических процессов (опухоли различной локализации; лейкемия и миелодиспластический синдром) выявлен дефицит сывороточных анти-ЛПС-антител класса M на фоне возрастания уровней сывороточных анти-ЛПС-антител классов A и G. Проведение лучевой терапии у пациентов со злокачественными опухолями различной локализации усугубляет нарушения антиэндотоксиновых иммунных механизмов.
-
У здоровых людей повышение базовой концентрации С-реактивного белка в крови до уровня, считающегося предиктором повышенного кардиоваскулярного риска, сопровождается достоверным снижением уровней сывороточных анти-ЛПС-антител разных классов и падением ЛПС-связывающего потенциала моноцитов и гранулоцитов периферической крови.
-
Дефицит сывороточных анти-ЛПС-антител класса M, проявляющих наибольший протективный эффект по отношению к ЛПС энтеробактерий, может быть обусловлен их повышенным потреблением в антителозависимых реакциях нейтрализации и элиминации ЛПС. Это благоприятствует эндотоксиновой агрессии, манифестация которой будет предопределять патогенетическую значимость нарушений антиэндотоксиновых иммунных механизмов в зависимости от основной патологии.
Степень достоверности и апробация результатов. О достоверности полученных результатов и обоснованности выводов свидетельствует достаточное количество обследованных лиц (192 практически здоровых человека и 697
больных); большой объем лабораторных исследований, выполненных с применением современных методик; адекватный статистический анализ численных данных.
Диссертационная работа выполнена в рамках научно-исследовательских работ
«Разработка и внедрение методов диагностики состояния клеточного и
гуморального антиэндотоксинового иммунитета в физиологии и патологии
человека» (№ госрегистрации 0105U002205, 2005-2008 гг.); «Роль нарушений
гуморального и клеточно-опосредованного антиэндотоксинового иммунитета в
патогенезе наиболее распространенных мультифакториальных заболеваний,
ассоциированных с риском развития эндотоксиновой агрессии» (№ госрегистрации
0109U008096, 2009-2011 гг.); «Клинические, иммуногенетические, молекулярные,
биохимические аспекты стратификации прогноза течения, осложнений и
эффективности лекарственной терапии ревматических, эндокринных,
нефрологических, сердечно-сосудистых и пульмонологических заболеваний» (№ госрегистрации 0113U001556, 2013-2017 гг.); «Патогенетические механизмы формирования органопатологии при системных и локальных патологических процессах» (№ госрегистрации 115052150075, 2014-2016 гг.; проект выполнялся при поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках базовой части госзадания по проекту №3884).
Апробация работы состоялась 15 ноября 2017 г. на совместном заседании
сотрудников кафедр общей и клинической патофизиологии и внутренней медицины
№2 Медицинской академии имени С.И. Георгиевского (структурное подразделение)
ФГАОУ ВО «КФУ им. В.И. Вернадского». Основные положения диссертационной
работы докладывались на: IV съезде гематологов и трансфузиологов Украини (Киев,
2001); Annual meeting of American College of Allergy, Asthma and Immunology
(Orlando, 2001); Annual meeteng of American College of Allergy, Asthma and
Immunology (San Antinio, 2002); I открытой научно-практической конференции
“Актуальные проблемы современной медицины” (Симферополь, 2002); XXIII
Congress of the European Academy of Allergy and Clinical Immunology (Amsterdam,
2004); международной научно-практической конференции “Эпидемиология
основных стоматологических заболеваний” (Ивано-Франковск, 2004); научно-
практической конференции “Достижения современной медицины, посвященная
памяти С.И. Георгиевского” (Симферополь, 2004); научно-практической
конференции с международным участием “Фундаментальные вопросы
экспериментальной и клинической эндокринологии” (Харьков, 2005); Annual
meeteng of American Academy of Allergy, Asthma and Immunology (San Antonio,
2005); II межнародном симпозиуме “Гемостаз - проблемы и перспективы” (Киев,
2006); Annual meeteng of American Academy of Allergy, Asthma and Immunology (San
Diego, 2007); IX Украинской научно-практической конференции по актуальным
вопросам клинической и лабораторной иммунологии, аллергологии и
иммунореабилитации (Киев, 2007); VІІ съезде эндокринологов Украины (Киев, 2007); X Украинской научно-практической конференции по актуальным вопросам клинической и лабораторной аллергологии и иммунологии (Киев, 2008); международной научно-практической конференции “Фундаментальная медицина – практике здравоохранения” (Киев, 2008); Украинской научно-практической
конференции с международным участием “Современные теория и практика
клинической иммунологии и аллергологии” (Киев, 2010); I открытой научно-
практической конференции “Клиническая эндотоксинология: итоги 10-летних
исследований и дальнейшие перспективы” (Симферополь, 2010); международной
научно-практической конференции “Юбилейные Пироговские чтения”
(Севастополь, 2010); Всероссийской научно-практической конференции
“Клиническая лабораторная диагностика в гематологии и службе крови” (С.Петербург, 2011); ХХХ Congress of the European Academy of Allergy and Clinical Immunology (Istanbul, 2011); симпозиуме с международным участием “Интеграция лабораторной информации в диагностике, лечении и профилактике” (Киев, 2011); VI конгрессе патофизиологов Украины (Мисхор, 2012); международной научно-практической конференции “Наука. Инновации. Практическая медицина” (Симферополь, 2012); The 12th World Congress on Inflammation (Boston, 2015); Всероссийском конгрессе эндокринологов “Достижения персонализованной медицины сегодня – результаты практического здравоохранения завтра” (Москва, 2016); The 13th World Congress on Inflammation (London, 2017).
Внедрение результатов в практику. Результаты работы внедрены в научный процесс лаборатории цитологии и иммунологии ГУ «Институт гематологии и трансфузиологии НАМН Украины»; в педагогический процесс на кафедре внутренней медицины №2 Медицинской академии имени С.И. Георгиевского; в педагогический процесс на кафедре общей и клинической патофизиологии Медицинской академии имени С.И. Георгиевского; в практическую деятельность Клинического медицинского многопрофильного центра Святителя Луки (г. Симферополь); в практическую деятельность ГБУЗ РК (Бахчисарайская ЦРБ) Куйбышевской участковой больницы (Бахчисарайский р-н, Республика Крым).
Публикация результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 68 научных работ на русском и английском языках, в том числе 39 статей в журналах, соответствующих критериям и перечню рецензируемых научных изданий, рекомендованных ВАК. Получено 3 декларационных патента Украины и 1 патент на полезную модель Российской Федерации.
Личный вклад автора в исследование. Диссертант непосредственно участвовал в планировании работы, проведении всех лабораторных исследований, анализе полученных результатов, формулировке научных положений и выводов, подготовке публикаций и представлении результатов работы на научно-практических конференциях. Личный вклад автора в написание научных работ по теме диссертации составляет 85 %. Все соавторы указаны в публикациях.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 325
страницах машинописного текста; содержит 65 таблиц, 65 рисунков. Диссертация
состоит из следующих разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материал и
методы исследования», «Результаты исследований», «Заключение», «Выводы»,
«Практические рекомендации», «Список литературы». Библиографический
указатель содержит 601 источник, из них 153 – на русском языке, 448 – на иностранных языках.