Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Обзор литературы 14
1.1 Анемия и беременность. Актуальность проблемы 14
1.2 Железодефицитная анемия, осложняющая беременность 15
1.2.1 Биологическая роль железа в организме и основные этапы его обмена 18
1.2.2 Этиопатогенез железодефицитной анемии, осложняющей беременность 22
1.2.3 Особенности течения беременности, осложненной анемией 28
1.2.4 Современные подходы к лечению железодефицитной анемии, осложняющей беременность 29
1.3 Препараты на основе релиз-активных форм антител к
эндогенным регуляторам функций 35
1.3.1 Применение препарата релиз-активных форм антител к эритропоэтину в качестве стимулятора эритропоэза в эксперименте 37
1.3.2 Применение препарата релиз-активных форм антител к эритропоэтину в качестве стимулятора эритропоэза в клинической практике 39
ГЛАВА 2 Материал и методы исследования 43
2.1 Характеристика экспериментального материала 43
2.2 Характеристика клинической группы 44
2.2.1 Методы фармакотерапии железодефицитной анемии, осложняющей беременность 46
2.3 Методы исследования 48
2.3.1 Определение показателей периферической крови 48
2.3.2 Выделение костного мозга, изучение его клеточного состава 48
2.3.3 Фракционирование костного мозга мозга
Разделение клеток костного мозга по фенотипу
Способ получения кондиционной среды клеток костного
Метод клонирования in vitro клеток-предшественников эритропоэза 50
Определение интенсивности созревания эритроидных клеток-предшественников 51
Определение пролиферативной активности эритроидных клеток-предшественников 51
Метод определения эритропоэтической активности кондиционных сред клеток костного мозга и в сыворотке периферической крови 52
Определение уровня эритропоэтина 52
Определение феррокинетических показателей сыворотки периферической крови 53
Определение содержания сульфгидридных групп и липопротеинового комплекса в эритроцитах 53
Методы математической обработки результатов исследования 54
Результаты собственных исследований 55
Реакции системы крови и механизмы их развития при экспериментальной железодефицитной анемии и на фоне ее фармакологической коррекции у беременных мышей-самок 55
Картина периферической крови 55
Картина костномозгового кроветворения 59
Состояние пула кроветворных клеток-предшественников 62
Уровень эритропоэтической активности в кондиционных средах клеток костного мозга 64
Уровень эритропоэтина в кондиционных средах клеток костного мозга и в сыворотке крови 66 3.2 Морфофункциональное состояние эритрона у женщин с железодефицитной анемией, осложняющей беременность 68
3.2.1 Количественные показатели периферического звена эритрона 68
3.2.1.1 Количественные показатели периферического звена эритрона у беременных женщин без признаков анемии (контрольная группа) 68
3.2.1.2 Количественные показатели периферического звена эритрона при железодефицитной анемии умеренной степени тяжести 70
3.2.1.3 Количественные показатели периферического звена эритрона при железодефицитной анемии умеренной степени тяжести на фоне антианемической терапии 70
3.2.1.4 Количественные показатели периферического звена эритрона при железодефицитной анемии тяжелой степени 73
3.2.1.5 Количественные показатели периферического звена эритрона при железодефицитной анемии тяжелой степени на фоне антианемической терапии 75
3.2.2 Характеристика феррокинетических показателей при железодефицитной анемии, осложняющей беременность 77
3.2.2.1 Характеристика феррокинетических показателей у беременных женщин без признаков анемии (контрольная группа) 77
3.2.2.2 Характеристика феррокинетических показателей при железодефицитной анемии умеренной степени тяжести 77
3.2.2.3 Характеристика феррокинетических показателей при железодефицитной анемии умеренной степени тяжести на фоне антианемической терапии 79
3.2.2.4 Характеристика феррокинетических показателей при железодефицитной анемии тяжелой степени 80
3.2.2.5 Характеристика феррокинетических показателей при железодефицитной анемии тяжелой степени на фоне антианемической терапии 80
3.2.3 Содержание сульфгидрильных групп и липопротеинового комплекса в эритроцитах периферической крови при железодефицитной анемии, осложняющей беременность 83
3.2.3.1 Содержание сульфгидрильных групп и липопротеинового комплекса в эритроцитах периферической крови у беременных женщин без признаков анемии (контрольная группа) 83
3.2.3.2 Содержание сульфгидрильных групп и липопротеинового комплекса в эритроцитах периферической крови при железодефицитной анемии умеренной степени тяжести 83
3.2.3.3 Содержание сульфгидрильных групп и липопротеинового комплекса в эритроцитах периферической крови при железодефицитной анемии умеренной степени тяжести на фоне антианемической терапии 85
3.2.3.4 Содержание сульфгидрильных групп и липопротеинового комплекса в эритроцитах периферической крови при железодефицитной анемии тяжелой степени 86
3.2.3.5 Содержание сульфгидрильных групп и липопротеинового комплекса в эритроцитах периферической крови при железодефицитной анемии тяжелой степени на фоне антианемической терапии 86
3.2.4 Уровень эритропоэтина в сыворотке периферической крови при железодефицитной анемии 87
ГЛАВА 4 Обсуждение полученных результатов
Выводы 119
Список сокращений и условных обозначений 121
Список литературы
- Биологическая роль железа в организме и основные этапы его обмена
- Методы фармакотерапии железодефицитной анемии, осложняющей беременность
- Картина костномозгового кроветворения
- Содержание сульфгидрильных групп и липопротеинового комплекса в эритроцитах периферической крови при железодефицитной анемии умеренной степени тяжести
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Анемия занимает одно из ведущих мест в структуре экстрагенитальной заболеваемости у беременных женщин (Радзинский В.Е. и др., Ордиянц И.М. и др., 2015; Barroso F. et al., 2011). По статистике ВОЗ частота анемии у беременных в мире колеблется от 18 до 75 %. Изменения при анемии, приводящие к обменным, волемическим и трофическим нарушениям, способствуют развитию акушерских осложнений, как со стороны матери, так и со стороны плода и новорожденного, при этом частота осложнений находится в прямой зависимости от степени тяжести анемии (Johnson-Wimbley T.D. et al., 2016). По данным Управления по охране материнства и детства Минздрава РФ каждый третий ребенок в нашей стране и 42 % беременных страдают анемией разной степени тяжести, а в последнее десятилетие в России частота заболевания возросла в 6,3 раза (Коноводова Е.Н. и др., 2012; Протопопова Т.А., 2012).
Среди причин возникновения анемии беременных в качестве основной выделяют недостаточное удовлетворение повышенной потребности организма матери и плода в веществах, необходимых для кроветворения. Действительно, около 90 % всех анемий у беременных приходится на долю железодефицитной анемии (ЖДА). Дефицит других веществ, таких как фолиевая кислота, витамин В12 отмечается намного реже. Поэтому главным методом лечения данной патологии на протяжении многих лет оставалась терапия препаратами железа (Логутова Л.С., 2016; М.М. et al., 2017; G.A. et al., 2017). Однако длительная ферротерапия может приводить к побочным эффектам, а часто наблюдаемая резистентность к лечению препаратами железа свидетельствует о существовании других патофизиологических механизмов развития анемии во время беременности (Радзинский В.Е. и др., 2015).
Степень разработанности. Установлено, что при анемии, осложняющей
беременность, происходит усиленная продукция провоспалительных
цитокинов. Указанные вещества нарушают обмен железа, подавляют процесс
дифференцировки клеток-предшественников эритроидного ряда и негативно
влияют на выработку эритропоэтина – ключевого гормона эритропоэза. При
этом отмечается неадекватно низкая степени анемии продукция гемопоэтина
(Демихов В.Г., 2003; Коноводова Е.Н. и др., 2011). Таким образом, оптимизация
антианемического лечения дополнением стандартных схем терапии
эритропоэтином – пример патогенетического лечения, восполняющего дефицит эндогенного гематогормона. В частности, широко известен вариант совместного применения ферропрепаратов и рекомбинантного человеческого эритропоэтина (Айламазян Э.К. и др., 2004; 2012; Демихов В.Г. и др., 2016; Krafft A. et al., 2011). Недостатком данного метода является чрезмерно выраженное активирующее действие, оказываемое рекормоном на эритроидный росток кроветворения, что часто приводит к осложнениям терапии и значительно ограничивает возможность использования данного класса препаратов в акушерской практике (Миненко С.В. и др., 2005; Breymann C. et al., 2010).
В последние годы в России и за рубежом ведутся активные поиски новых
лекарственных препаратов и эффективных способов лечения анемии с
минимальной выраженностью побочных эффектов. Так, на сегодняшний день
большого внимания заслуживает изучение эффективности применения релиз-
активных форм антител в качестве эндогенных модификаторов биологических
реакций. Препараты релиз-активных форм антител имеют свойства,
определяющие их преимущества. Это щадящий характер воздействия,
безопасность, отсутствие зависимости и привыкания, специфичность, но при
этом быстродействие, а также то, что по эффективности они не уступают
современным синтетическим средствам при отсутствии побочных эффектов
(Эпштейн О.И., 2008; 2012; 2013). В проведенных экспериментальных и
клинических исследованиях препарата релиз-активных форм антител к
эритропоэтину (РАФ АТ к ЭП) было доказано, что он не блокирует активность
антигена, а модифицирует ее. За счет стимуляции образования эритроидных
клеток в костном мозге он повышает уровень содержания эритроцитов и
ретикулоцитов в периферической крови, как в условиях равновесного
кроветворения, так и при его угнетении (Эпштейн О.И. и др., 2004; Удут Е.В.,
2008; Эпштейн О.И., 2013). Учитывая тот факт, что даже длительное
применение не сопровождается развитием побочных эффектов (Боровская Т.Г.
и др., 2002; Сотникова Л.С., 2008), весьма перспективным представляется
использование препарата в комплексном лечении анемии беременных. Тем не
менее, учитывая, что во время беременности функциональное состояние систем
обеспечения жизнедеятельности организма характеризуется высокой
лабильностью и непредсказуемо меняет уровень и соотношение регуляторов кроветворения, возможность усиления терапевтического эффекта препаратов железа дополнительным назначением релиз-активных форм антител к эритропоэтину на данном этапе изученности еще не известна.
Цель исследования. Вскрыть механизмы, лежащие в основе
гемостимулирующего действия релиз-активных форм антител к эритропоэтину на модели анемии в эксперименте и оценить эффективность применения препарата в комплексной терапии анемии, осложняющей беременность, в клинике.
Задачи исследования:
-
В эксперименте вскрыть механизмы, лежащие в основе нарушений эритрона при железодефицитной анемии в гестационном периоде.
-
Изучить возможность коррекции нарушений, возникающих в системе крови при экспериментальной железодефицитной анемии в гестационном периоде, с использованием препарата релиз-активных форм антител к эритропоэтину и вскрыть механизмы его влияния на эритропоэз.
-
Выявить клинические эффекты при применении препарата релиз-активных форм антител к эритропоэтину в комплексной терапии анемии, осложняющей беременность, изучить механизмы их формирования.
-
Оценить эффективность противоанемической терапии в зависимости от степени тяжести заболевания.
Научная новизна. В работе впервые изучены особенности патогенеза экспериментальной анемии в период гестации. Показано, что в условиях дефицита железа, ведущего к снижению уровня гемоглобина, эритроцитов,
ретикулоцитов и падению гематокрита происходит нарушение функциональной активности прекурсоров эритропоэза, уменьшение секреции эритропоэтически активных гуморальных факторов клетками костного мозга и снижение содержания эритропоэтина в кондиционных средах от лимфоцитов, моноцитов и в сыворотке крови.
Установлены механизмы влияния релиз-активных форм антител к
эритропоэтину, используемых совместно с препаратом железа, на функции
эритроидного ростка кроветворения у животных с экспериментальной
железодефицитной анемией в гестационном периоде. Впервые выявленные
позитивные эффекты комплексной ферротерапии железодефицитного
состояния с использованием релиз-активных форм антител к эритропоэтину показали ведущее значение нарушения синтеза эндогенного эритропоэтина в патогенезе экспериментальной железодефицитной анемии.
Впервые проведена оценка клинической эффективности включения в схему лечения анемии, осложняющей беременность, препарата релиз-активных форм антител к эритропоэтину. Установлено, что комбинированная схема терапии оказывает более выраженное гемостимулирующее действие, приводя к статистически значимым, в сравнении с традиционным лечением, изменениям количественных показателей периферического звена эритрона, увеличивает число ретикулоцитов, благоприятно воздействует на обмен железа, восстанавливает структурно-метаболическую характеристику эритроцитов и нормализует уровень эритропоэтина в сыворотке крови.
Доказана зависимость клинической эффективности изучаемой схемы комплексной противоанемической терапии от степени тяжести заболевания.
Теоретическая и практическая значимость работы.
Экспериментальная модель железодефицитной анемии, разработанная в диссертационной работе, позволяет изучать механизмы развития и способы коррекции анемического синдрома во время гестации. Наблюдаемая в ходе исследования позитивная динамика показателей, отражающих основные патогенетические составляющие железодефицитной анемии, свидетельствует о целесообразности включения релиз-активных форм антител к эритропоэтину в состав комплексной противоанемической терапии. Полученные результаты могут быть положены в основу разработки нового, патогенетически обоснованного и безопасного способа коррекции нарушений со стороны системы эритрона при анемии, осложняющей беременность.
Методология и методы исследования. Диссертационное исследование состоит из экспериментального и клинического раздела.
В эксперименте разработана модель железодефицитной анемии в
гестациионном периоде. Детально изучены показатели эритропоэза
экспериментальных животных на фоне введения железосвязывающего препарата, исследованы механизмы угнетения эритроидного ростка костного мозга. Оценена возможность применения препарата релиз-активных форм антител к эритропоэтину для коррекци эритропоэза при лечении анемии в гестационном периоде, вскрыты механизмы его гемостимулирующего действия.
Клинический раздел содержит исследование эффективности применения препарата релиз-активных форм антител к эритропоэтину в качестве средства лечения железодефицитной анемии, осложняющей беременность, в составе комплексной терапии.
Основные методы исследования – методы исследования периферического
звена эритрона, изучение феррокинетических показателей, количественная
оценка сульфгидрильных групп и липопротеинового комплекса в эритроцитах
периферической крови методом цитофотометрии, морфологическое
исследование костного мозга, культуральные методы исследования,
определение содержания эритропоэтина в сыворотке периферической крови и
супернатантах клеток костного мозга с использованием метода
иммуноферментного анализа.
Положения, выносимые на защиту:
-
В основе формирования нарушений, возникающих в гемопоэтической ткани при дефиците железа в период гестации, лежит нарушение функциональной активности прекурсоров эритропоэза, уменьшение секреции эритропоэтически активных гуморальных факторов клетками костного мозга и снижение содержания эритропоэтина в кондиционных средах от лимфоцитов, моноцитов и в сыворотке крови.
-
Дополнение противоанемической терапии препаратом релиз-активных форм антител к эритропоэтину обеспечивает более выраженное, в сравнении с традиционным лечением железодефицитной анемии эритропоэзстимулирующее действие, приводя к статистически значимым изменениям уровня гематокрита, содержания эритроцитов и гемоглобина в периферической крови, увеличению количества эритрокариоцитов и эритроидных предшественников в гемопоэтической ткани, благоприятно воздействует на обмен железа в организме, восстанавливает структурно-метаболическую характеристику эритроцитов и нормализует уровень эритропоэтина в сыворотке крови.
Степень достоверности и апробация результатов работы. Степень
достоверности результатов проведенного исследования определяется
значительным и репрезентативным объемом выборки экспериментальных животных (n=196) и обследованных пациенток (n=195) с использованием современного объективного метода исследования, а также обработкой полученных данных современными методами математической статистики.
Основные положения диссертационной работы докладывались,
обсуждались и представлялись на межрегиональной научно-практической конференции «Диагностика и лечение анемий в ХХI веке» (Рязань, 2011), на VIII Региональном научном форуме «Мать и дитя» (Сочи, 2015), на Дискуссионном клубе молодых ученых в рамках XVIII межрегиональной научно-практической конференции «Амбулаторно-поликлиническая помощь в акушерстве и гинекологии» (Томск, 2015).
По материалам диссертации опубликовано 6 работ, из них 4 статьи в журналах, рекомендованных перечнем ВАК. Получено 2 патента (RU).
Диссертация изложена на 137 страницах машинописного текста и состоит
из введения, четырех глав, выводов, списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 14 рисунками и 12 таблицами. Библиографический указатель включает 156 источников, из них 97 отечественных и 59 иностранных.
Биологическая роль железа в организме и основные этапы его обмена
Железодефицитная анемия (ЖДА) является важнейшей общенациональной проблемой систем здравоохранения. Частота встречаемости железодефицитных состояний в группах женщин детородного возраста, беременных и детей достигает 50 и даже 70-80 % в зависимости от региона [Ломова Н.А., Дубровина Н.В., Докуева Р.С., Тютюнник В.Л., 2016].
Во время беременности неуклонно растет потребность во многих веществах и микроэлементах, в том числе, и в элементарном железе [Баркова Э.Н., 2012; Golub M.S., 2010]. У небеременных женщин такая потребность составляет 1,5 мг в сутки. Во время I триместра беременности она возрастает на 1 мг в сутки, во II триместре – на 2 мг в сутки и в III триместре – на 3-5 мг в сутки. При этом потеря микроэлемента в течение беременности увеличивается и составляет в среднем 0,8 мг в сутки. Наиболее существенна потеря железа в 16-20 недель гестации, что совпадает с периодом начала костномозгового кроветворения у плода и увеличением массы крови у самой беременной женщины [Gambling L., Lang C., McArdle H.J., 2011]. Существенный вклад в снижение запасов железа вносят роды. В третьем периоде родов при физиологической кровопотере теряется от 200 до 700 мг железа. При оперативном родоразрешении, а так же при патологической кровопотере закономерно происходит еще более значительная потеря железа. В дальнейшем, в период лактации, расходуется еще около 200 мг микроэлемента. Таким образом, из материнского депо в период беременности теряется около 800-950 мг железа [Шевелева Т.В., Скворцова М.Ю., 2012; Bothwell, T.H., 2000; Balesaria S., Hanif R., Salama M. еt al., 2012; Hubbard A.C., Bandyopadhyay S., Wojczyk B.S. et al., 2013].
На состояние периферической крови матери, безусловно, оказывает влияние и кроветворение плода, которое начинается с 19 дня внутриутробной жизни и проходит три стадии: I – в желточном мешке, II – в печени плода, III – в костном мозге. Для образования гемоглобина плод использует железо материнского организма, в последние 3 месяца своего развития плод утилизирует до 250-400 мг железа. Из материнской крови железо поступает в плаценту, превращается в ферритин и переходит к плоду. 2/3 ферритина отводится на образование плодового гемоглобина, остальная часть запасается в печени плода [Сидорова И.С., Кулаков В.И., Макаров И.О., 2006; Геворкян М.А., Кузнецова Е.М., 2011; Siddappa A.M., Rao R., Long J.D. et al., 2007].
Таким образом, суммарная потребность в железе в течение беременности – 1300 мг (300 мг – плоду). При недостаточном поступлении железа в организм или неполном его усвоении у беременной развивается железодефицитная анемия [Umbreit, J., 2005].
Различают три стадии дефицита железа: предлатентный, латентный и манифестный. Предлатентный дефицит железа характеризуется снижением запасов микроэлемента, но без уменьшения его расходования на эритропоэз. Вследствие снижения запасов железа снижается уровень ферритина в крови, однако анемия отсутствует, так как гемоглобиновый фонд ещё сохранен. Сидеропенический синдром не выявляется, уровень сывороточного железа в норме, а так же сохранен транспортный фонд. Следующая стадия дефицита железа – латентный дефицит – полное истощение запасов микроэлемента в депо, однако признаков развития анемии еще нет. Появляются клинические признаки сидеропенического синдрома. При лабораторном обследовании можно обнаружить снижение уровня сывороточного железа, закономерное увеличение общей железосвязывающей способности сыворотки (ОЖСС), эритроциты могут быть микроцитарными и гипохромными [Mireku M.O., Davidson L.L., Boivin M.J. et al., 2016]. Манифестный дефицит железа, или железодефицитная анемия возникает при снижении гемоглобинового фонда железа и проявляется симптомами как гипосидероза, так и анемии [Коноводова Е.Н., Докуева Р.С-Э., Якунина Н.А., 2011; Бабанов С.А., Агаркова И.А., 2012; Жилякова О.В., Захарова И.В., Удут В.В., Агаркова Л.А. и др., 2013; Ломова Н.А., Дубровина Н.В., Докуева Р.С., Тютюнник В.Л., 2016;].
Принято различать анемию, осложняющую беременность, то есть анемические состояния, возникающие непосредственно во время беременности, осложняющие ее течение, и, обычно прекращающиеся после родов, и сочетание беременности и анемии. В последнем случае анемия имеет место еще до наступления беременности, а, следовательно, оплодотворение, имплантация и дальнейшее ее развитие происходит на неблагоприятном фоне. Истинная анемия, осложняющая беременность, развивается после 20 недель беременности [Шехтман М.М., 2005; Геворкян М.А., Кузнецова Е.М., 2011; Daniilidis A., Giannoulis C., Pantelis A. et al., 2011].
Степень тяжести анемии определяют по данным лабораторного исследования – величине показателей количества эритроцитов, гемоглобина и гематокрита. Различают анемию беременных умеренной, тяжелой и очень тяжелой степени. Анемия беременных умеренной степени тяжести характеризуется уровнем гемоглобина от 109 до 70 г/л, количеством эритроцитов 3,9-2,51012/л, гематокритом 37-24 %.
Анемию беременных тяжелой степени диагностируют при уровне гемоглобина от 69 до 40 г/л, количестве эритроцитов 2,5-1,51012/л, гематокрита 23-13 %.
При анемии беременных очень тяжелой степени уровень гемоглобина составляет 40 г/л; количество эритроцитов менее 1,51012/л, а гематокрит 13 % [Сидорова И.С., Кулаков В.И., Макаров И.О., 2006; Протопопова Т.А. 2012; Ломова Н.А., Дубровина Н.В., Докуева Р.С., Тютюнник В.Л., 2016].
Характерной особенностью железодефицитной анемии является абсолютное уменьшение количества эритроцитов или функциональная недостаточность красных кровяных клеток в силу пониженного содержания гемоглобина в каждом отдельном эритроците. Железодефицитная анемия всегда носит гипохромный характер [Геворкян М.А., Кузнецова Е.М., 2011; Волкова С.А., Боровков Н.Н., 2013; Савченко Т.Н., Агаева М.И., Дергачева И.А., 2014].
Методы фармакотерапии железодефицитной анемии, осложняющей беременность
Продолжительность участия испытуемых в исследовании составила 8 недель для каждой группы пациенток.
В качестве препарата железа в исследовании использовался Феррум Лек, («Лек д.д.», Любляна, Словения), содержащий в одной жевательной таблетке 400 мг железа (III) гидроксид полимальтозата, что в пересчете на железо составляет 100 мг. Препарат принимался по 1 жевательной таблетке 2 раза в день в одно и то же время суток [Шевелева Т.В., Скворцова М.Ю., 2012; Логутова Л.С., 2016; Toblli J.E., Cao G., Oliveri L., Angerosa M., 2013].
Препарат релиз-активных форм антител к эритропоэтину – «Поэтам» («Поэтам», ООО «НПФИ Материа Медика Холдинг», Россия, г. Москва) принимался по 1 таблетке 3 раза в день под язык независимо от приема пищи.
В течение исследования пациентки всех групп наносили врачу 6 плановых визитов – до начала исследования и через 1, 2, 3, 4, 6 и 8 недель после начала терапии. Критериями эффективности терапии являлись показатели морфофункционального состояния эритрона и обмена железа.
В анализ эффективности проведенных вариантов лечения вошли все пациентки, закончившие исследование.
Из 180 беременных женщин, страдающих анемией, у 120 пациенток выявлена анемия умеренной степени тяжести, у 60 – тяжелой степени. В зависимости от тяжести анемии и проводимого лечения были выделены следующие клинические группы: группа женщин с анемией умеренной степени тяжести, получавшие монотерапию препаратом железа Феррум Лекпо 1 жевательной таблетке 2 раза в день на протяжении 8 недель (n=60); группа женщин с анемией умеренной степени тяжести, получавшие препарат железа Феррум Лекпо 1 жевательной таблетке 2 раза в день на протяжении 8 недель совместно с препаратом «Поэтам» по 1 таблетке под язык 3 раза в день (n=60); группы женщин с тяжелой степенью анемии, получавших монотерапию препаратом железа (n=30), и комбинированное лечение по аналогичным схемам (n=30); контрольная группа (n=15) включала соматически здоровых беременных женщин без анемии, сопоставимых с основной группой по возрасту и сроку беременности. 2.3 Методы исследования
Измерения при выполнении экспериментальной части работы проводились на 11, 15 и 18 дни опыта. Состояние изучаемых параметров у пациенток в клинической части исследования оценивалось до лечения и на 1, 2, 3, 4, 6 и 8 недель после начала терапии.
Количество ретикулоцитов (Rt) и общее количество лейкоцитов (ОКЛ) определяли стандартными гематологическими методами. Для подсчета гемограмм мазки фиксировали в метаноле (5 мин) и после высушивания окрашивали азур II-эозином (35-40 мин) [Блиндарь В.Н., Зубрихина Г.Н., Матвеева И.И. 2013; Рукавицын О.А., 2015].
Количество эритроцитов (RBC), средний объём эритроцита (MCV), ширину распределения эритроцитов по объёму – степень анизоцитоза (RDW), уровень гемоглобина (HGB), гематокрит (HCT), среднее содержание гемоглобина в эритроците (MCH), среднюю корпускулярную концентрацию гемоглобина в эритроците (MCHC) определяли на гематологическом автоматическом анализаторе Mythic 18 («Cormay», Франция, 2012).
Для изучения костного мозга выделяли бедренную кость мыши, очищали ее от мягких тканей и промывали канал 1 мл 3 % уксусной кислоты. Костный мозг ресуспендировали шприцом через иглы уменьшающегося диаметра. Общее количество миелокариоцитов (ОКК) подсчитывали в камере Горяева. Для приготовления мазков костного мозга содержимое бедренной кости разводили изологичной сывороткой и делали мазок с помощью шлифовального стекла. Высохшие мазки фиксировали в метаноле (3-5 мин) и окрашивали азур II 49 эозином. Миелограмму подсчитывали на 400 клеток, после чего рассчитывали абсолютное содержание клеточных элементов отдельных ростков гемопоэза [Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Шахов В.П., 1992; Дыгай А.М., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др., 2013].
Костный мозг выделяли из бедренной кости мыши 0,5 мл среды без цитокинов (M3231, MethoCultтм Stemsell Technologies), содержащей компоненты, отобранные для оптимального роста мышиных кроветворных клеток, суспендировали и подсчитывали общее количество миелокариоцитов, определяя их жизнеспособность. Для этого смешивали равные объемы суспензии исследуемых клеток и 0,5 % раствора трипанового синего («Serva», Германия), переносили в камеру Горяева и подсчитывали число жизнеспособных (неокрашенных) и «мертвых» (окрашенных) миелокариоцитов на 100 клеток.
Для выделения адгезирующей фракции миелокариоцитов взвесь клеток (106 кл/мл) инкубировали в CO2 инкубаторе («Sanyo MCO-15AC», Япония) при 370 С, 5 % CO2 и 100 % влажности в течение часа в пластиковых чашках Петри. Затем осторожно удаляли среду из чашки и дважды отмывали не прилипшие при инкубации клетки. В случае высокого содержания эритроцитов в неадгезирующей фракции, последнюю разделяли на градиенте плотности с использованием коммерческого препарата Ficoll-Paque («Pharmacia AB», Швеция). Образующийся при центрифугировании (3000 об/мин, 20 мин) интерфазный слой собирали, отмывали и использовали в дальнейшей работе.
Картина костномозгового кроветворения
Анализ динамики показателей обмена железа на фоне лечения в группе беременных женщин с умеренной степенью анемии показал, что при применении схемы терапии, включающей только препарат железа, уровень СЖ статистически значимо возрастал к концу второй недели наблюдения и составил 13,42±0,35 мкмоль/л (таблица 9).
На 8 неделе лечения данный показатель достиг уровня 16,92±0,48 мкмоль/л, что статистически значимо не отличалось от контрольных величин (Таблица 9).
Темпы снижения общей железосвязывающей способности сыворотки были менее значительными. Так, уровень ОЖСС в группе женщин, получавших только препарат железа, лишь к концу третьей недели терапии достиг уровня, статистически значимо отличающегося от исходной величины до лечения (75,95±1,20 мкмоль/л), но оставался значительно более высоким, чем в группе контроля до конца периода наблюдения.
Уровень СФ в группе женщин, получавших монотерапию, лишь к концу 4 недели лечения достиг уровня, статистически значимо отличающегося от исходного уровня до лечения и составил 11,02±0,53 мкг/л.
При добавлении в схему терапии препарата релиз-активных антител к эритропоэтину, динамика изменения феррокинетических показателей имела иную тенденцию. Так, на фоне более быстрого снижения ОЖСС (76,23±1,07 мкмоль/л на 2 неделе и 67,03±1,24 мкмоль/л на 8 неделе лечения), уровень СЖ уже на 3 неделе терапии достоверно не отличался от контрольных величин (17,38±0,49 мкмоль/л), а с 4 недели даже превысил таковые, не выходя за пределы нормальных величин (таблица 9).
Уровень СФ в группе женщин, получавших комбинированное лечение, так же имел тенденцию к более быстрому и значительному росту. Так, уже в конце второй недели наблюдения данный показатель достиг уровня 10,78±0,57 мкг/л, что достоверно отличалось от исходных величин, а с третьей недели лечения и до конца периода наблюдения был статистически значимо выше, чем в группе монотерапии.
Показатель концентрации ТФ значимо не изменялся на всем протяжении лечения независимо от схемы терапии (таблица 9).
Наиболее выраженные изменения в показателях обмена железа были выявлены при обследовании беременных женщин с тяжёлой степенью ЖДА. Так, при сравнении изучаемых показателей у женщин с физиологическим и осложненным анемией тяжелой степени течением беременности, установлено, что до начала лечения на фоне статистически значимо возросшей ОЖСС до 82,87±0,69 мкмоль/л, уровень СЖ составил в среднем 8,22±0,27 мкмоль/л, что было значительно ниже контрольного уровня. Концентрация СФ у женщин с тяжелой степенью анемии составила в среднем 5,60±0,18 мкг/л. Уровень трансферрина составил 2,57±0,03 г/л, что статистически значимо не отличалось от уровня данного показателя в контрольной группе (таблица 10).
Примечания1 -статистически значимые отличия от показателей беременных женщин без признаков анемии (контрольная группа);2 # - статистически значимые отличия от показателей женщин с анемией, осложняющей беременность, до лечения (группа до лечения);- статистически значимые различия между группами женщин с анемией, осложняющей беременность, получавших препарат железа (группа 1) и препарат железа совместно с РАФ AT к ЭП (группа 2), (р 0,05) терапии, было установлено, что в группе женщин, принимавших только препарат железа, уровень СЖ уже с конца первой недели лечения статистически значимо превысил исходную величину и составил 10,00±0,63 мкмоль/л.
С четвертой недели приема препарата данный показатель достиг уровня контрольных величин, и до конца периода наблюдения достоверно не отличался от показателей в группе женщин с физиологическим течением беременности (таблица 10).
ОЖСС в группе монотерапии препаратом железа так же уже с первой недели лечения была статистически значимо ниже исходных величин (79,53±1,48 мкмоль/л), однако оставалась значительно выше аналогичного показателя в контрольной группе до конца всего периода наблюдения (таблица 10).
Уровень СФ в группе женщин, получавших классическую антианемическую терапию, статистически значимо превысил исходные величины, начиная со второй недели лечения (7,57±0,21 мкг/л), а к концу 8 недели составил 17,33±1,23 мкг/л,что все же было значительно ниже его среднего уровня в группе беременных женщин без анемии (таблица 10).
В группе женщин с тяжелой степенью анемии, принимавших РАФ АТ к ЭП дополнительно к препарату железа, уровень СЖ уже с первой недели был значительно выше уровня, чем в группе монотерапии (таблица 10), а на 6 и 8 неделе (17,17±0,93 мкмоль/л и 20,73±0,77 мкмоль/л соответственно) даже превысил соответствующие показатели в группе здоровых беременных женщин, не выходя при этом за пределы нормальных значений (таблица 10).
ОЖСС в группе комбинированной терапии уже в конце первой недели снизилась до величины, достоверно отличающейся от исходной, и составила 76,03±1,52 мкмоль/л. Со второй недели лечения данный показатель был достоверно ниже, чем в группе монотерапии (73,13±1,05 мкмоль/л), а с 6 недели достоверно не отличался от контрольных величин.Концентрация СФ в группе женщин, принимавших РАФ АТ к ЭП дополнительно к препарату железа, уже в конце первой недели терапии была значительно выше по сравнению с группой монотерапии и составила 8,37±0,46 мкг/л. Данное соотношение показателей в терапевтических группах сохранялось до конца всего периода наблюдения. Уровень трансферрина значимо не изменялся на всем протяжении лечения не зависимо от схемы терапии (таблица 10).
Содержание сульфгидрильных групп и липопротеинового комплекса в эритроцитах периферической крови при железодефицитной анемии умеренной степени тяжести
Кроме того, было выявлено, что общее количество миелокариоцитов в гемопоэтической ткани у животных, получавших монотерапию, на 15 и 18 сутки наблюдения было достоверно ниже соответствующего уровня в группе контроля. При этом на 15 сутки эксперимента имело место уменьшение числа как незрелых, так и зрелых, а на 18 сутки – только зрелых форм нейтрофильных гранулоцитов, относительно их исходного уровня до лечения. Количество лимфоидных клеток в данной группе на всем протяжении периода наблюдения было статистически значимо ниже интактного уровня в группе небеременных самок (таблица 3). Описанные сдвиги сопровождались снижением ОКЛ по сравнению с контрольной группой беременных животных на 11 и 18 сутки эксперимента. При этом наблюдался моноцитоз и лимфоцитоз на 11 сутки наблюдения и статистически значимое снижение числа сегментоядерных нейтрофилов, моноцитов и лимфоцтов на 18 сутки (таблица 2).
При добавлении в схему лечения препарата релиз-активных форм антител к эритропоэтину уровень зрелых нейтрофильных гранулоцитов в костном мозге на 11 сутки терапии был значительно ниже такового в группе монотерапии, однако к 15 суткам наблюдения превысил аналогичный показатель. Уровень незрелых нейтрофильных гранулоцитов был статистически значимо ниже такового в группе мышей, получавших только препарат железа, на 18 сутки наблюдения (таблица 3). При этом снижение общего числа лейкоцитов в периферической крови наблюдалось только на ранних сроках гестации, и было связано со снижением количества моноцитов и лимфоцитов. К 18 суткам значение ОКЛ значительно превысило таковое в группе монотерапии в основном за счет сегментоядерных нейтрофилов, моноцитов и лимфоцитов и статистически значимо не отличалось от контрольных величин (таблица 2).
Что касается динамики изменения показателей костномозгового эритропоэза, то она в целом соответствовала картине периферичекой крови. Так, прирост числа эритрокариоцитов в гемопоэтической ткани у леченых животных отмечен с 11 суток опыта, не зависимо от схемы терапии, а на 18 сутки разница между величинами показателей в экспериментальных группах достигла статистической значимости (рисунок 2).
При приеме препарата железа на 18 сутки регистрировалось статистически значимое снижение темпов пролиферации КОЕ-Э. На фоне комбинированной терапии на 11 и 18 сутки эксперимента наблюдался интенсивный прирост выхода эритроидных колоний. Добавление в схему лечения релиз-активного препарата предотвращало замедление темпа пролиферации прекурсоров и ускоряло их дифференцировку на 15 и 18 сутки опыта (рисунок 3).
Усиление колониеобразования и дифференцировки гемопоэтических клеток в группе комбинированного лечения происходило на фоне стимуляции выработки веществ, составляющих эритропоэтическую активность, адгезирующими кариоцитами костного мозга на 15 и 18 сутки наблюдения. Причем разница с группой монотерапии также являлась статистически значимой. Тенденция к росту уровней эритропоэтической активности, секретируемой неадгезирующими миелокариоцитами, наблюдалась на протяжении всего периода исследования в обеих группах, однако статистическая разница с нелечеными животными зарегистрирована лишь на 18 сутки у мышей, получавших релиз-активный препарат (рисунок 4).
Таким образом, добавление РАФ АТ к ЭП в дополнение к препарату железа приводило к более существенной, по многим показателям, стимуляции эритропоэза. Это выражалось в регистрации более высоких числовых значений содержания эритроцитов и гемоглобина в периферической крови, эритрокариоцитов в костном мозге. В свою очередь установлено, что повышение функциональной активности эритроидного ростка происходило во многом благодаря стимуляции препаратом секреции гемопоэтически активных субстанций адгезирующими элементами кроветворного микроокружения.
По данным литературы, одним из патогенетических механизмов развития анемии у беременных, а так же механизмом резистентности к проводимой терапии во время гестации, является неадекватно низкая продукция эритропоэтина в ответ на анемию, связанная с избыточной продукцией провоспалительных цитокинов [Жилякова О.В., Захарова И.В., Удут В.В., Агаркова Л.А. и др., 2013; Ломова Н.А., Дубровина Н.В., Докуева Р.С., Тютюнник В.Л., 2016]. Цитокины провоцируют изменения в гомеостазе железа, процессе пролиферации эритроидных клеток-предшественников, продукции эритропоэтина и продолжительности жизни эритроцитов [Torti F.M., Torti S.V., 2002]. Недостаточная эффективность противоанемической терапии, несмотря на достаточное поступление железа в составе антианемических препаратов, связана с глубокими нарушениями в системе эритрона в гестационном периоде, причиной возникновения или усугублением которых является дефицит железа.
Повышение эффективности противоанемической терапии препаратом РАФ АТ к ЭП, выявленное в настоящем исследовании, возможно связано с его модулирующим влиянием на пролиферативную активность и дифференцировку эритроидных предшественников.
С целью выявления роли дистантных механизмов регуляции эритропоэза при экспериментальной анемии у беременных самок мышей и на фоне ее лечения, нас интересовал показатель уровня эритропоэтина в кондиционных средах клеток костного мозга и в сыворотке крови. Известно, что с прогрессированием беременности имеет место повышение выработки данного цитокина, стимулирующего продукцию эритроцитов костным мозгом [Hye-Ryeon H., Li Ch., Borim A., 2015]. Так и в нашем исследовании, в группе контрольных беременных животных уровень гемопоэтина в сыворотке крови повышался в течение всей гестации, достигая максимума к 18 суткам опыта. В кондиционных средах от моноцитов его содержание было значимо выше на 18 сутки, оставаясь при этом неизменным в кондиционных средах от лимфоцитов (рисунок 5).