Содержание к диссертации
Введение
I. Обзор литературы 15
1.1. Toll-like рецепторы: общая характеристика, строение, функции 15
1.1.1. Общая характеристика toll-like рецепторов 15
1.1.2. Физиологическая роль toll-like рецепторов 18
1.1.3. Строение и функции отдельных toll-like рецепторов 20
1.1.4. Участие toll-like рецепторов в патогенезе инфекционных и неинфекционных заболеваний 22
1.2. Генетический полиморфизм толл-подобных рецепторов 24
1.2.1. Генетический полиморфизм TLRs в патогенезе инфекционных заболеваний 24
1.2.2. Генетический полиморфизм TLR в патогенезе заболеваний неинфекционного происхождения 30
1.2.3. Толл-подобные рецепторы в патогенезе заболеваний головного мозга 34
1.3. Патогенетические механизмы ишемического инсульта 36
1.3.1. Роль воспаления в патогенезе ишемического инсульта 40
1.3.2. Участие toll-like рецепторов в патогенезе ишемического инсульта 44
1.3.3. Генетический полиморфизм толл-подобных рецепторов у больных ишемическим инсультом 45
1.4. Заключение 46
II. Материалы и методы исследования 47
2.1. Общая характеристика клинического материала 47
2.2. Развернутая характеристика групп исследования 48
2.2.1. Характеристика исследуемых контрольной группы 48
2.2.2. Характеристика исследуемых клинической группы 49
2.3. Методы исследования клинической и контрольной группы 51
2.3.1. Клинические методы исследования 51
2.3.2. Инструментальные методы исследования 51
2.3.3. Лабораторные методы исследования 52
2.3.3.1. Общий анализ крови 52
2.3.3.2. Определение лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии (ЛТА) 52
2.3.3.3. Определение агрегационной активности тромбоцитов 52
2.3.3.4. Определение концентрации цитокинов (IL–1, IL–6, IL– 10) 53
2.3.3.5. Исследование уровня экспрессии TLR2, TLR4 на моноцитах периферической крови 54
2.3.3.6. Молекулярно-генетические исследования 54
2.4. Статистическая обработка материала 55
III. Результаты собственных исследований 57
3.1. Сравнительная частота генетического полиморфизма toll-like рецепторов (TLR2 (Arg753Gln), TLR3 (Phe412Leu), TLR4 (Asp299Gly), TLR6 (Ser249Pro), TLR9 (T –1237C)) у больных ишемическим инсультом в Забайкальском крае 57
3.2. Экспрессия TLR2, TLR4 у больных ишемическим инсультом, в том числе с учетом носительства полиморфизма генов толл-подобных рецепторов 67
3.2.1. Уровень экспрессии TLR2, TLR4 на моноцитах периферической крови у больных ишемическим инсультом 67
3.2.2. Взаимосвязь уровня экспрессии TLR2, TLR4 и количества лейкоцитов (нейтрофилов и лимфоцитов) в периферической крови у больных ишемическим инсультом 69
3.2.3. Экспрессия TLR2, TLR4 у больных ишемическим инсультом в зависимости от носительства генетического полиморфизма и генетического индекса 72
3.3. Концентрация IL–1, IL–6, IL–10 у больных ишемическим инсультом–носителей полиморфизмов толл-подобных рецепторов 74
3.3.1. Содержание IL–1, IL–6, IL–10 в плазме крови больных ишемическим инсультом в динамике острого периода заболевания 74
3.3.2. Взаимосвязь концентрации IL–1, IL–6, уровня экспрессии TLR2, TLR4 у больных ишемическим инсультом 76
3.3.3. Концентрация IL–1, IL–6, IL–10 у больных ишемическим инсультом в динамике заболевания в зависимости от носительства генетического полиморфизма toll-like рецепторов и генетического индекса 77
3.4. Лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия и агрегация тромбоцитов у больных ишемическим инсультом, в том числе с учетом носительства полиморфизма генов толл-подобных рецепторов 81
3.4.1. Лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия у больных ишемическим инсультом 81
3.4.2. Взаимосвязь уровня экспрессии и лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии у больных ишемическим инсультом 83
3.4.3. Лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия у больных ишемическим инсультом, в том числе с учетом носительства полиморфизма генов толл-подобных рецепторов 85
3.4.4. Агрегационная активность тромбоцитов у больных ишемическим инсультом 88
3.4.5. Взаимосвязь экспрессии TLR2, TLR4 и агрегации тромбоцитов у больных ишемическим инсультом 89
3.4.6. Агрегационная активность тромбоцитов с учетом носительства генетического полиморфизма toll-like рецепторов и генетического индекса у больных ишемическим инсультом 99
IV. Обсуждение полученных результатов 116
V. Выводы 128
VI. Список литературы 130
- Генетический полиморфизм TLRs в патогенезе инфекционных заболеваний
- Сравнительная частота генетического полиморфизма toll-like рецепторов (TLR2 (Arg753Gln), TLR3 (Phe412Leu), TLR4 (Asp299Gly), TLR6 (Ser249Pro), TLR9 (T –1237C)) у больных ишемическим инсультом в Забайкальском крае
- Взаимосвязь экспрессии TLR2, TLR4 и агрегации тромбоцитов у больных ишемическим инсультом
- Агрегационная активность тромбоцитов с учетом носительства генетического полиморфизма toll-like рецепторов и генетического индекса у больных ишемическим инсультом
Введение к работе
Актуальность проблемы. По данным Всемирной федерации
неврологических обществ, ежегодно в мире регистрируется не менее 15 млн.
инсультов, в России свыше 450 тыс. эпизодов, при этом заболеваемость
составляет 2,5 4 на 1000 человек и является одной из самых высоких в мире
(Широков Е.А., 2011). В последние годы ишемический инсульт, имея
тенденцию к увеличению, занимает второе место в структуре общей
смертности и первое среди причин стойкой утраты работоспособности и
инвалидизации населения многих стран. Очень велики экономические и
социальные последствия заболевания (Шурдумова М.Х., 2011). Всё
сказанное свидетельствует об актуальности изучаемой проблемы, а
исследование этиопатогенетических механизмов возникновения инсульта можно с полным основанием определить как чрезвычайно важные.
В настоящее время исследователи стали уделять особое внимание роли
толл-подобных рецепторов в патогенезе как инфекционных, так и
неинфекционных заболеваний, поскольку, взаимодействуя с лигандами, toll
like рецепторы активируют синтез цитокинов, от которых зависит
интенсивность воспалительной реакции. Полиморфизм генов TLRs за счет
специфических аллелей вносят существенный вклад в персональные
особенности развития защитных реакций, а также предрасположенность к
целому ряду заболеваний (Симберцев А.С., 2005, Щебляков Д.В., 2010,
Хорева М.В., 2012, Малежик Л.П., 2012, Саха Сумита, 2013, Романова С.В.,
2013, Питиримова А.Л., 2014, Руденко К.А., 2014). Достаточно работ
посвящено изучению роли данных рецепторов и полиморфизма их генов при
аутоиммунных, онкологических заболеваниях, сепсисе, хроническом
гепатите С, артритах (M. A. Hofmann, 2008, Д.В. Щебляков, 2010, Sui Lung
Su, 2012, Бережная Н.М., 2013, Дубинская Г.М., 2014, Wang Haiyan, 2014,
Марковский А.В., 2015). Суперэкспрессия этих рецепторов также служит
важнейшим патогенетическим фактором воспалительных неинфекционных
заболеваний (Ю.А.Крохалева, А.В.Марковский, 2016). Имеются
исследования участия толл-белков в развитии гипертонической болезни, ишемической болезни сердца, ожирения, атеросклероза, являющихся факторами риска острого нарушения мозгового кровообращения (Сульская Ю.В., 2009, Скочко О.В., 2011, Хорева М.В., 2012, Луна Лю, 2012, Хуторная М.В., 2013, Alvaro Gonzlez, L.C., 2002, Lutz Hamann, 2013). Однако особый интерес вызывает изучение генетического полиморфизма toll-like рецепторов и влияние его на основные патогенетические звенья ишемического инсульта.
Степень разработанности темы исследования
В настоящее время проведено немало исследований, посвященных
участию толл-подобных рецепторов в патогенезе некоторых
невоспалительных заболеваний головного мозга и заболеваний,
сопровождающихся повреждением ЦНС. К ним относятся рассеянный склероз, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера и некоторые другие
(Nagai Y., 1996, Barbanti P., 2000, Linnea Stridh, 2011, Laure Aurelian, 2015, Zhong Zhangfeng, 2015). Доказано, что сигнальная система TLRs воздействует на тяжесть аутоиммунного воспаления в ЦНС (Andersson A., 2008, Miranda Hernandez S., 2011, Cohen S. J., 2010). Увеличение экспрессии некоторых TLRs на моноцитах при цереброваскулярной патологии ассоциировано с возникновением ишемического инсульта и тяжестью его течения (Шурдумова М.Х., 2011). По данным David Brea Lpez (2010) взаимодействие белков теплового шока с TLRs на клетках периферической крови увеличивает уровень экспрессии данных рецепторов. На основании приведенных данных высказано предположение, что размер инфаркта должен зависеть от степени экспрессии TLRs, а блокада лигандов и TLRs может быть эффективным методом для ослабления воспалительной реакции. Однако нам не встретились работы, посвященные роли генетического полиморфизма толл-подобных рецепторов в патогенезе ишемического инсульта, а также влияние SNP на экспрессию toll-like рецепторов при этой патологии.
Цель исследования:
Изучить прогностическую и патогенетическую роль аллельного полиморфизма генов некоторых толл-подобных рецепторов, а также уровень их экспрессии у больных ишемическим инсультом.
Задачи исследования:
-
Оценить частоту аллелей и генотипов генетического полиморфизма толл-подобных рецепторов (TLR2 (Arg753Gln), TLR3 (Phe412Leu), TLR4 (Asp299Gly), TLR6 (Ser249Pro), TLR9 (T–1237C)) у больных ишемическим инсультом в Забайкальском крае. Выявить генетические предикторы заболевания, тяжести ишемического инсульта и развития повторного сосудистого эпизода.
-
Исследовать уровень экспрессии TLR2, TLR4 на моноцитах периферической крови у больных ишемическим инсультом, в том числе с учетом носительства генетического полиморфизма TLR2(Arg753Gln), TLR4(Asp299Gly) и генетического индекса. Оценить клинико-прогностическое значение экспрессии TLR2 и TLR4.
-
Определить содержание IL–1, IL–6, IL–10 в плазме у больных ишемическим инсультом в динамике заболевания, в том числе в зависимости от носительства генетического полиморфизма TLR2(Arg753Gln), TLR3(Phe412Leu), TLR4(Asp299Gly), TLR6(Ser249Pro), TLR9(T –1237C) и генетического индекса.
-
Изучить феномен лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии (ЛТА) и агрегационную активность тромбоцитов (спонтанную и индуцированную) у больных ишемическим инсультом в динамике заболевания, в том числе с учетом носительства генетического
полиморфизма TLR2(Arg753Gln), TLR3(Phe412Leu), TLR4(Asp299Gly), TLR6(Ser249Pro), TLR9(T –1237C) и генетического индекса. 5. Провести анализ и определить причинно-следственные связи между выявленными маркерами заболевания у больных ишемическим инсультом.
Научная новизна. Впервые изучено и проанализировано носительство генетического полиморфизма TLR2 (Arg753Gln), TLR3 (Phe412Leu), TLR4 (Asp299Gly), TLR6 (Ser249Pro), TLR9 (T–1237C) у больных ишемическим инсультом в Забайкальском крае и обозначены предикторы заболевания: TLR2 –753Arg, TLR6 –249Pro, TLR9 –1237C и TLR4 –299Asp/Asp -генотип. Установлено, что наличие в геноме дикого аллеля TLR4 (Asp299Gly) ассоциировано с тяжелым течением болезни. Присутствие же в геноме большого количества предрасполагающих аллелей SNP TLRs увеличивает риск возникновения ишемического инсульта и ассоциируется с тяжелым его течением.
Впервые установлено, что общее количество моноцитов, количество активированных моноцитов, в том числе и экспрессирующих TLR2, TLR4 у больных ишемическим инсультом увеличивается. При тяжелом течении инсульта отмечалось снижение данных показателей, что может иметь клинико-прогностическое значение. При повторном ОНМК к моменту завершения формирования зоны инфаркта мозга индекс экспрессии возрастает. Кроме этого, среди больных инсультом в группе с высоким IGI по сравнению с низким обнаружено снижение количества моноцитов, в том числе и экспрессирующих TLR2 (p<0,05).
Впервые у пациентов с ишемическим инсультом при наличии –753Gln TLR2 в геноме обнаружено значительное увеличение концентрации IL –1, IL–6 в крови на всем протяжении острого периода ОНМК, а комплексное носительство предиктивных аллелей генов toll-like рецепторов как в норме, так и у больных инсультом, к концу острого периода заболевания вызывает цитокиновый дисбаланс с увеличением концентрации провоспалительных интерлейкинов.
Впервые показано, что в острейший период ОНМК чем больше предиктивных аллелей SNP TLRs в геноме, тем выраженнее лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия (ЛТА). При этом in vitro наблюдаются сравнительно низкие показатели степени и скорости индуцированной агрегации кровяных пластинок, при одновременном увеличении их среднего радиуса.
Положения, выносимые на защиту:
1. У больных ишемическим инсультом в геноме часто обнаруживаются TLR2 –753Arg, TLR6 –249Pro, TLR9 –1237C аллели и TLR4 –299Asp/Asp-генотип. Для развития заболевания имеет значение количество предиктивных аллеломорфов SNP TLRs в геноме. Носительство TLR4 –299Asp-аллеля ассоциировано с тяжелым течением заболевания.
2. У пациентов с ишемическим инсультом в крови увеличено число
активированных моноцитов, экспрессирующих TLR2, TLR4. Носительство
двух и более предиктивных аллелей полиморфизма генов toll-like рецепторов
сопровождается снижением количества активированных моноцитов,
экспрессирующих TLR2. Увеличение количества моноцитов,
экспрессирующих TLR4, ассоциировано со снижением концентрации IL-1.
3. Носительство –753Gln TLR2 увеличивает концентрацию IL-1, IL-6 в периферической крови на всем протяжении острого периода ОНМК. Комплексное носительство предиктивных аллелей полиморфизма генов tolllike рецепторов в динамике ишемического инсульта вызывает цитокиновый дисбаланс с увеличением концентрации провоспалительных интерлейкинов (IL-1, IL-6), усиление лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии и вторичную индуцированную гипоагрегацию тромбоцитов с увеличением радиуса агрегатов
Теоретическая и практическая значимость. Результаты исследования
позволяют уточнить некоторые иммунологические аспекты в патогенезе
ишемического инсульта, в том числе с учетом степени тяжести и
вторичности сосудистого эпизода, оценить влияние носительства
генетического полиморфизма toll-like рецепторов на выраженность иммунологических реакций и на степень экспрессии TLR2, TLR4 и, в связи с этим, прогнозировать развитие заболевания, а также характер осложнений. Полученные данные дадут возможность для более детального изучения рассматриваемых механизмов, что позволит в будущем улучшить диагностические мероприятия у этой категории больных.
Внедрение результатов исследования в практику. Результаты диссертационной работы внедрены в учебный процесс на кафедрах патологической физиологии, неврологии, нейрохирургии и медицинской генетики ФГБОУ ВО ЧГМА (г. Чита).
Методология и методы исследования. При обследовании людей соблюдались этические принципы согласно Хельсинкской Декларации Всемирной Медицинской ассоциации (WRRld Medical Association Declaration of Helsinki 1964, в редакции 2013 г., изменения внесены на 64-ой Генеральной Ассамблее ВМАЮ Форталеза, Бразилия, октябрь 2013).
Все участники исследования были разделены на 2 группы: клиническую и контрольную. В клиническую группу включены 115 больных ишемическим инсультом, госпитализированые в первые сутки от начала заболевания. Все больные ишемическим инсультом по степени тяжести заболевания (согласно шкале NIHDSS) были разделены на три группы: 1-я группа (34 человека) включала больных с легким течением заболевания - оценка степени тяжести инсульта до 5 баллов; 2-я (47 человек) – пациентов со средней степенью тяжести инсульта - средний балл от 5 до 9 баллов; 3-я группа (34 человека) -больных с тяжелой степенью инсульта с оценкой 10 баллов и более.
Контрольную группу составили 94 относительно здоровых респондента. Все наблюдаемые подписывали информированное согласие на участие в исследовании.
В работе использовались клинические, инструментальные,
лабораторные и статистические методы исследования.
Лабораторные методы исследования.
Молекулярно-генетические исследования. В качестве материала
использовали образцы ДНК, выделенные из лейкоцитов периферической
крови с помощью реагентов ДНК-Экспресс-кровь (НПФ «Литех», Москва).
Амплификация фрагментов генов проводилась в термоциклере «Бис–М112»
(ООО «Бис-Н», Новосибирск). В работе использовались стандартные наборы
реактивов TLR2(Arg753Gln), TLR3(Phe412Leu), TLR4(Asp299Gly),
TLR6(Ser249Pro), TLR9(T 1237 C) НПФ «Литех» (Москва). Визуализация
продуктов амплификации осуществлялась с помощью электрофореза в 3% агарозном геле с добавлением бромистого этидия, в проходящем в ультрафиолетовом свете. Полученные результаты анализировали согласно инструкции набора. Забор крови для данного исследования осуществлялся однократно в обеих группах наблюдения.
Определение цитокинов (IL 1, IL 6, IL 10) проводили в плазме крови с помощью твердофазного иммуноферментного анализа («сэндвич» метод) с использованием тест-систем фирмы «Вектор Бест» (Россия). Кровь у больных ишемическим инсультом исследовалась в 1-е, на 10-е и 21-е сутки, у индивидуумов контрольной группы единожды.
Исследование уровня экспрессии TLR2, TLR4 на моноцитах
периферической крови. Общее количество моноцитов (абс. и относит.)
периферической крови (CD14+), количество моноцитов, экспрессирующих
TLR2 (CD14+СD282+), TLR4 (CD14+СD284+), количество активированных
моноцитов (CD14+HLADR+) и количество активированных моноцитов,
экспрессирующих TLR2 (CD14+СD282+HLADR+) и TLR4
(CD14+СD284+HLADR+) изучали мультипараметрическим методом
иммунофлюоресцентного анализа с использованием панели моноклональных антител (Hycultbiotechnology, Голландия), (Вeckman Coulter, США). Пробоподготовку проводили путем удаления эритроцитов с применением лизирующего раствора «OptiLise C» (Immunotex, Франция) по прилагаемому протоколу. Образцы анализировали на проточном цитофлуориметре «Cytomics FC–500» (Beckman Coulter, США) по стандартному протоколу. Полученные данные трактовали с помощью программы «CXP Cytometer» (Beckman Coulter, США). Также оценивали уровень экспрессии исследуемых поверхностных рецепторов по средней интенсивности флюоресценции (MFI – mean fluorescence intensity).
Определение агрегационной активности тромбоцитов. Спонтанную и индуцированную агрегацию тромбоцитов изучали с использованием двухканального лазерного анализатора АЛАТ 2 в модификации 230 LA 2
(НПФ «БИОЛА», Россия) у больных ишемическим инсультом в 1-е, 10-е и
21-е сутки заболевания, у исследуемых контрольной группы однократно. В
качестве индукторов использовались: АДФ в конечной концентрации 5
мг/мл; АДФ (1,25 мг/мл); коллаген (1 мг/мл); адреналин (5 мг/мл);
ристомицин (15 мг/мл). Оценивали тип агрегатограммы и определяли степень агрегации - максимальный процент светопропускания плазмы и размер радиуса агрегатов (опт. ед.), скорость агрегации (опт. ед.).
Определение лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии (ЛТА)
Проводили на свежей цитратной крови обследуемых (метод Ю. А. Витковского и соавт. (1999)). Лимфоцитарно-тромбоцитарные коагрегаты подсчитывали на 100 клеток путем световой микроскопии в камере Горяева. Лимфоцитарно-тромбоцитарный индекс (ЛТИ) оценивали как среднее арифметическое количество тромбоцитов, присоединившихся к одному лимфоциту.
Общий анализ крови исследовали благодаря автоматическому гематологическому анализатору «Pentra –120» («HRRiba ABX», Франция) в момент госпитализации, на 10-14 сутки от начала заболевания и к окончанию острого периода инсульта (21 сутки). У здоровых респондентов забор крови осуществлялся однократно.
Статистическая обработка материала
Статистический анализ результатов исследования проводился с
помощью программ BIOSTAT, Microsoft Excel 2007, Statistica 6,0
(StatSoftInc.,USA). Предварительно до начала анализа вариационные ряды
проверялись на нормальность методом асимметрии и эксцессов. Медиану, 25
и 75 процентили вычисляли при помощи описательной статистики. Для
сравнения двух несвязанных групп использовали критерий Манна-Уитни.
Достоверными признавались различия при р<0,05. Взаимосвязь между
количественными признаками выявлялась с помощью корреляционного
анализа Спирмена, статистически значимым считался результат при rs>0,3,
р<0,05. Кроме этого, вычисляли индивидуальный генетический индекс (IGI)
являющийся ранжированной величиной, характеризующей совокупный
эффект носительства изучаемого генетического полиморфизма
(кумулятивная полимерия) у индивидуума с учетом, что нормальная гомозигота - это «1», гетерозигота - «2», мутантная гомозигота - «3» для TLR6 (Ser249Pro) и TLR9 (T1237-C), для TLR2 (Arg753Gln) и TLR4 (Asp299Gly) нормальная гомозигота принималась за «3», гетерозигота - за «2», мутантная гомозигота - за «1».
Формула расчета:
индивидуальный генетический индекс (IGI) у одного исследуемого:
IGI = Ahp TLR2(Arg753Gln) + Ahp TLR4 (Asp299Gly) + Ahp TLR6 (Ser249Pro) +Ahp TLR9 (t-1237c)
N
где, А числовое значение генотипа; HP выявленный генотип
полиморфизма определенного толл-подобного рецептора; N количество генотипов.
После унификации (когда качественные показатели переводятся в количественные, соизмеримые по значимости) и суммации баллов находили M (медиану) и сравнивали c подобными значениями здоровых пациентов с помощью критерия Мана-Уитни.
Степень достоверности и апробация результатов диссертации:
О достоверности результатов свидетельствует достаточно большой
материал исследования (115 больных ишемическим инсультом, 94
практически здоровых лиц, 272 результата исследования лимфоцитарно-
тромбоцитарной адгезии, 290 результатов исследования сосудисто-
тромбоцитарного гемостаза, 274 результата определения концентрации IL-
1, IL-6; 209 результатов молекулярно-генетического исследования, 60
результатов определения количества моноцитов, экспрессирующих TLR2,
TLR4)), использование современных методик исследования, в том числе
адекватного статистического анализа, публикации основных результатов
диссертационной работы в ведущих рецензируемых изданиях,
рекомендованных ВАК.
Результаты исследования представлены на Региональной межвузовской
научно-практической конференции молодых ученых «Медицина завтрашнего
дня» г. Чита, 2012 г., 2013г, 2015г; 70-й итоговой научной конференции
молодых ученых и студентов Дальневосточного государственного
медицинского университета с международным участием «Актуальные
вопросы современной медицины», г. Хабаровск, 2013 г.; Всероссийской
научно-практической конференции с международным участием,
посвященной 60-летию Читинской государственной медицинской академии, «Актуальные проблемы клинической и экспериментальной медицины», г. Чита, 2013 г.; VI Всероссийской конференции с международным участием «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии», г. Москва, 2013 г., 2016 г.; III Российском Международном Конгрессе «Цереброваскулярная патология и инсульт», г. Казань, 2014 г. ; 82-ой Всероссийской Байкальской научно –практической конференции молодых учёных и студентов с международным участием, посвященной 95-летию ИГМУ, «Актуальные вопросы современной медицины», г. Иркутск, 2015 г.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 работ, из них 5 в
рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Министерства
образования и науки РФ для публикации результатов диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук.
Объем и структура работы: Диссертация содержит 150 страниц машинописного текста и состоит из введения, четырёх глав, заключения, выводов и списка использованной литературы (105 отечественных и 80 зарубежных источников). Работа иллюстрирована 49 таблицами, 1 рисунком.
Генетический полиморфизм TLRs в патогенезе инфекционных заболеваний
Полиморфизм генов подразумевает копирование с одного и того же гена несколько вариантов одного и того же белка, которые отличаются друг от друга структурой. При этом часть копий либо не наделена активностью, либо может обладать противоположной функцией [20,85]. В частности, полиморфизм TLRs может проявляться нарушением распознавания микроорганизмов и как следствие дисбалансом функционирования системы врожденного иммунитета, что приводит к повышению чувствительности к инфекциям и развитию хронических воспалительных заболеваний [64,70,82,94,98,102]. Так, уменьшение активности толл-подобных рецепторов отражается на микробном биоценозе, при этом условно-патогенная микрофлора становится постоянной микрофлорой и в результате начинаются атипичные формы воспалительных процессов [27].
В настоящее время в литературе появилось достаточное количество данных, свидетельствующих о зависимости возникновения и характера протекания инфекционного заболевания от полиморфизма тех или иных tolllike рецепторов. Среди полиморфизмов, которые влияют на структуру и функции TLRs, имеют значение однонуклеотидные замены в областях, ответственных за формирование внешнего и внутреннего домена. Изменение структуры и функции доменов может способствовать изменению трансдукции сигнала от рецептора внутрь клетки.
Ген ТLR2 (CD 282, толл-подобный рецептор 2) кортирован на хромосоме 4q32 и кодирует белок, состоящий из 784 аминокислотных остатка.
Полиморфный вариант TLR2 Arg753Gln, расположенный в районе внутреннего домена толл-подобного рецептора, ассоциирован с возникновением инфекционных процессов. Именно Arg/Arg-генотип связан с развитием воспалительного ответа при некоторых заболеваниях [99]. У исследуемых, имеющих замену нуклеотида С на нуклеотид Т в позиции 2029 гена TLR2, приводящую к изменению функции этого рецептора, была отмечена высокая восприимчивость к возбудителю лепры с развитием лепроматозной формы заболевания [37]. В другом исследовании замечено, что полиморфизм TLR2R753Q связан с увеличением риска возникновения инфекционного эндокардита [179]. В литературе описаны случаи мутации гена TLR2 (Arg32Gln), связанные с рецидивирующими инфекциями респираторного тракта у детей, а полиморфный вариант TLR2 (Arg753Gln) ассоциирован со стафилококковым сепсисом [98]. J. Kim и соавт. В своих экспериментах in vitro [37] обнаружили активацию TLR2 на макрофагах кожи, спровоцированную P. Аcnes, которая сопровождалась повышением синтеза IL– 12, IL–8 и увеличением количества экспрессированного TLR2 на мембране макрофагов, локализованных вокруг волосяных фолликулов.
Ген TLR3 локализуется на хромосоме 4q35 [26]. Изучена генетическая предрасположенность к нарушению колонизационной резистентности слизистой оболочки толстого кишечника, обусловленная полиморфизмом TLR3 (Phe412Leu). По данным этого исследования, мутация TLR3 (Phe412Leu) встречалась у 38,8% больных, большая часть носителей оказалась гетерозиготной. Полная мутация TLR3 (Leu/Leu) выявлена только у 6,1 % пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника [26]. В 2007 г. был выявлен новый генетический дефект: аутосомно-доминантный дефицит TLR3. Эта мутация предрасполагала к появлению изолированного герпетического энцефалита, хотя клинически все пациенты с дефицитом TLR3 казались здоровыми без видимого иммунодефицита и без повышенной восприимчивости к другим инфекционным агентам [37]. Полиморфный маркер Phe412Leu TLR3 у детей с хроническим гепатитом В и С был ассоциирован со снижением адаптивного иммунитета, в точности уменьшением численности СDЗ-лимфоцитов, повышение продукции IL–1, IL–6, IgG и IgA и снижением уровня виремии HBV и HCV, что может првести к длительному торпидному течению заболевания и отсутствием выведения возбудителя и активацией аутоагрессивных реакций [76]. При молекулярно-генетическом анализе распределения полиморфизма Phe412Leu промоторной области TLR3 у пациенток с хроническим неспецифическим цервицитом значимых отличий в сравнении с контрольной группой обнаружено не было [55]. При изучении опухолей, ассоциированных с вирусом Эпштейн – Барра, который распознается TLR3, отмечена экспрессия этого рецептора при лимфоме Беркитта, карциноме желудка и носоглотки. Экспрессия TLR3 и ее значение для роста опухоли исследовалось при использовании различных клеток меланомы. Выявлено, что клетки многих линий первичных опухолей и нормальные меланоциты экспрессировали TLR3. Использование синтетического аналога dsRNA и лиганда TLR3 оказывало выраженное проапоптотическое действие. Отмечено также, что TLR3 является эффективным индуктором внутриклеточных антимикробных субстанций, которые могут проявлять себя как адъюванты, и поэтому TLR3 может быть охарактеризован как мультифункциональный адъювант, способный усиливать эффективность иммунотерапии [5].
Ген TLR4 расположен на хромосоме 9q32–33. Одним из наиболее изученных вариантов полиморфизма TLR4 является Asp299Gly, который тесно связан с развитием гематогенного остеомиелита и системного кандидоза [94]. Полиморфный вариант Asp299Gly гена TLR4 является результатом однонуклеотидной замены А G в положении +896 в экзоне 3, в результате которой аспарагиновая кислота заменяется на глицин в 299 положении полипептидной цепи экстрацеллюлярного домена рецептора. Изучено, что маркер –299Gly гена TLR4 связан с низким иммунным ответом на ЛПС бактерий как результат уменьшения экспрессии TLR4 на клетках с последующим прекращением взаимодействия TLR4 с ЛПС. В другом исследовании отметили, что данный полиморфизм несет ответственность за подавление прведения сигнала рецептором внутрь клетки и снижением воспалительной реакции на граммотрицательные бактерии [26]. SNPTLR4 Asp299Gly связана с восприимчивостью к сепсису и малярии [40].
При исследовании полиморфизма гена ТLR4 (Asp299Gly) среди пациентов с хроническим гепатитом С продемонстрирована взаимосвязь данного полиморфного варианта с более тяжелым течением ХГС, а также низкой эффективностью лечения ХГС в обеих группах пациентов [28]. Исследован феномен эндогенного ауторозеткообразования в крови при ОРВИ у детей – носителей полиморфизма Asp299Gly гена ТLR4. Оказалось, что у больных детей, отягощенных мутациями TLR4, клеточные ассоциации значительно выражены, нежели у больных детей, не имеющих точечные дефекты в гене рецептора [96]. Полиморфизм TLR4 (rs 11536889) ассоциирован с возникновением сепсиса в китайской популяции [110]. Asp299Gly TLR4 изучался у детей с хроническим пиелонефритом. По результатам этого исследования сделан вывод, что изучаемый полиморфизм является маркером высокого риска ранней манифестации хронического воспалительного процесса в интерстиции почек с длительным и рецидивирующим течением заболевания у детей [53].
Ген TLR6 кортирован на хромосоме 4р13, имеет один экзон и кодирует белок длиной в 796 аминокислот [19]. Полиморфизм гена TLR6 (Ser249Pro) был изучен у детей, больных острой респираторной вирусной инфекцией. В результате данного исследования было выявлено, что мутация в гене TLR6 способствует увеличению лимфоцитарно-тромбоцитарных агрегатов при всех полиморфных вариантах по сравнению с контрольной группой [96]. Найдена ассоциация полиморфизма TLR6 SNP rs5743827 с увеличением риска возникновения уреаплазменной инфекции дыхательной системы и бронхолегочной дисплазии [165]. Среди пациенток с хроническим неспецифическим цервицитом мутантные гомозиготы в позиции – 249 гена TLR6 встречались у каждой третьей больной женщины. Носительство данной гомозиготы TLR6 является предиктором данного заболевания, которое ассоциировано с рецидивированием и хронизацией воспаления в шейке матки [54].
Ген TLR9 локализован на коротком плече 3 хромосомы в области 21.3. Ген представлен четырьмя экзонами и кодирует белок, состоящий из 1032 аминокислот. Для полиморфизма T –127C TLR9 была найдена связь с повышенным риском возникновения малярии у бурундийских детей [129]. Данное исследование показало, что у больных детей – носителей C-аллеля TLR9 (T–127C) наблюдался более высокая концентрация сывороточного -интерферона. Однако при исследовании африканской популяции связь полиморфизма гена TLR9 с малярией не обнаружилась [118]. В некоторых работах аналогичный полиморфизм не был ассоциирован с заболеваниями. Так, например, в китайской популяции не выявлена связь полиморфного варианта TLR9 (T–1237C) с остеоартритом, в то время как SNPTLR9 (Т–1486C) существенно связано с остеоартритом коленного сустава [158]. На модели герпетического кератита установлено, что вирус-индуцированная экспрессия TLR9 связана с межлинейными различиями в строении гена TLR9 у мышей [145]. Найдена связь полиморфизмов генов TLR2(Arg753Gln), TLR9(2848G/A) с риском развития внутриутробного инфицирования плода, преждевременных и срочных родов [17]. На сегодняшний день известно, что полиморфный вариант TLR9 C2848T (rs352140) может влиять на клиническое течение ВИЧ– 1-инфекции [115,158]. Kikuchi и соавт. выявили, что генотип 2848 ТТTLR9 был ассоциирован с более высокой экспрессией TLR9 и увеличением концентрации IgM у больных первичным билиарным циррозом [134]. Более того, значение TLR9 было исследовано при лечении рака шейки матки у мышей с помощью вакцины. Hasimu и соавт. (2007) обнаружили, что уровень экспрессии TLR9 может увеличиваться при инфекционном заболевании шейки матки, вызванном ВПЧ16 [130,131,176]. Изучена роль полиморфизмов TLR9 –1486 Т/С (rs187084) и C2848T (rs352140) в возникновении рака шейки матки у польского населения. Данное исследование продемонстрировало, что полиморфизм TLR9 –1486Т/С (rs187084) повышает риск развития рака шейки матки [134].
Сравнительная частота генетического полиморфизма toll-like рецепторов (TLR2 (Arg753Gln), TLR3 (Phe412Leu), TLR4 (Asp299Gly), TLR6 (Ser249Pro), TLR9 (T –1237C)) у больных ишемическим инсультом в Забайкальском крае
По итогам молекулярно-генетического исследования выявлены все искомые аллели в гомо- и гетерозиготном состоянии. Распределение частот генотипов среди представителей контрольной группы соответствовало равновесию Харди-Вайнберга (Hardy-Weinberg Equilibrium). У представителей клинической группы отклонение от равновесия Харди-Вайнберга обнаружено для полиморфизма TLR4(Asp299Gly), TLR6(Ser249Pro) преимущественно за счет разницы наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности (табл.3.1.1)
При сравнении частот аллелей и генотипов изучаемых толл-рецепторов в клинической и контрольной группах отчетливые различия наблюдались по генотипу –753Arg/Arg TLR2 с большей частотой встречаемости последнего у больных ишемическим инсультом (р=0,02). Генотип –753Arg/Gln и аллель – 753Gln TLR2 чаще встречался у здоровых резидентов (р=0,02; р=0,01 соответственно) (табл. 3.1.2). Относительный риск развития церебрального инсульта у обладателей Arg/Arg-генотипа составил 2,41 [CI 95%: 1.33-4.36], для носителей генотипа Arg/Gln 0,44 [CI 95%: 0,24-0,81], для лиц, имеющих дикий аллель равен 2,21[CI 95%: 1,29-3,78], для резидентов, несущих Gln- аллель -0,45[CI 95%: 0,26-0,78].
При изучении полиморфизма TLR4 (Asp299Gly) в клинической и контрольной группах среди больных чаще встречались носители дикого аллеля TLR4 (Asp299Gly) – 0,783 против 0,707 у здоровых респондентов, причем зарегистрировано 1,6 кратное увеличение носительства в состоянии гомозиготы, гетерозиготное же состояние наблюдалось в 4,9 раза реже, чем у исследуемых контрольной группы (р 0,0001). Gly/Gly-генотип TLR4 выявлялся чаще у больных ишемическим инсультом. Риск развития данной патологии у носителей Asp/Asp-генотипа составил 2,82 [CI 95%: 1,59-5,02], у гетерозигот – 0,16 [CI 95%: 0,08-0,33], у мутантных гомозигот –2,72 [1,03-7,16]. Для обладателей Asp- аллеля RR составил 1,49 [CI 95%: 0,96-2,32], для носителей минорного аллеля – 0,67 [CI 95%: 0,43-1,05].
В группе больных носителей Pro/Pro-генотипа и Pro-аллеля TLR6 (р=0,0002) было больше, степень риска развития заболевания для них составила 3,2 [CI 95%: 1,81-5,67] и 2,14 [CI 95%: 1,43-3,21] соответственно. Гетерозигот оказалось меньше, чем в группе контроля (р=0,0002), для которых степень риска инсульта оказалась равной 0,38 [CI 95%: 0,21-0,69]. Обладатели дикого аллеля TLR6 (Ser249Pro) встречались чаще среди здоровых резидентов (р=0,0002), RR для развития ОНМК составил 0,47 [CI 95%: 0,31-0,7].
При сравнении частот по полиморфному варианту TLR9 (Т1237C) у лиц клинической группы отмечалось более частое носительство мутантного аллеля по отношению к обследуемым контрольной группы (р=0,03), относительный риск заболевания для больных с ОНМК оказался равным 1,93 [CI 95%: 1,06-3,5], причем данный показатель для обладателей аллеля –1237С в гомозиготном состоянии составил 3,35 [CI 95%: 0,37-30,51], (табл. 3.1.2)
Таким образом, в отличие от здоровых резидентов у больных ишемическим инсультом наблюдалось более частое носительство нормального аллеля TLR2 (Arg753Gln) и рискового аллеля TLR6 (Ser249Pro), TLR9 (T– 1237C).
Сравнивая полиморфизм TLR9 (T–1237C) у больных с впервые возникшим инфарктом мозга и у пациентов с повторным церебрососудистым эпизодом, мы выявили, что в группе последних носителей нормального аллеля оказалось больше, в то время как у пациентов с впервые диагностированным инсультом чаще встречался рисковый аллель (2=3,83; р=0,05). RR для аллеля –1237T был равен 2,61 [95%CI: 0,97–7,03], для –1237C- аллеля – 0,38 [95%CI: 0,14–1,03]. Носительство других полиморфных вариантов генов toll-like рецепторов, изучаемых нами, не различалось в данных группах наблюдения (табл.3.1.3.).
У пациентов с легкой степенью тяжести чаще встречался рисковый аллель TLR4 (Asp299Gly), в то время как в группе наблюдаемых с тяжелой степенью ОНМК – нормальный аллель TLR4(Asp299Gly) (2=6,76; р=0,009). Относительный риск составил 1,34 [95% CI:0,56 – 3,22] и 0,74 [95% CI:0,31 – 1,78] соответственно. При сравнении частот аллелей и генотипов других изучаемых нами полиморфных маркеров у пациентов с различной тяжестью заболевания отчетливых различий не выявлено (табл.3.1.4.).
Далее мы определили лиц с комплексным носительством полиморфизма из 4-х предикторных аллелей. Хотя по результатам статистически значимой разницы между сравниваемыми группами выявлено не было, тем не менее, среди больных носителей комбинации аллелей было больше – 25,2% против 17% (табл. 3.1.5.).
Следующим этапом исследования, проведенного нами, было вычисление индивидуального генетического индекса с целью оценки аддитивного влияния предиктивных аллелей. По результатам полученных данных мы отметили, что генетический индекс в пределах 2,2–2,4 (то есть наличие в геноме более двух рисковых аллелей изучаемого полиморфизма) чаще наблюдался у больных ишемическим инсультом по сравнению со здоровыми резидентами (2=9,5; р=0,02), в то время как индекс 1,4–1,6 встречался реже, чем в контрольной группе (2=8,9;р=0,03) (табл.3.1.6.).
Расчет генетического индекса у больных ишемическим инсультом разной степени тяжести показал, что среди больных с тяжелой степенью инсульта индекс 1,4–1,6 наблюдался у 2,9% исследуемых, индекс 1,8–2 у 26,5% против 14,9% и 48,9% у доноров контрольной группы (2=13,1; р=0,004 и 2=11,4; р=0,01 соответственно). IGI=2,2–2,4 в 2,2 раза встречался чаще у больных с тяжелой степенью заболевания в сравнении со здоровыми респондентами (2=17,7; р=0,0005) (табл.3.1.7.).
У больных с повторным церебрососудистым эпизодом индекс 1,4–1,6 наблюдался реже, а индекс 2,2–2,4 чаще, чем у пациентов с впервые диагностированным ишемическим инсультом и у здоровых резидентов (55,2%, 47,7% и 28,7% соответственно), (2=17,1; р=0,0007), (табл.3.1.8.).
Таким образом, чем больше количество аллельных вариантов, повышающих риск возникновения ишемического инсульта, тем выше риск развития ишемического инсульта, часто с тяжелым течением.
По итогам исследования генетического полиморфизма Тoll-рецепторов (TLR2(Arg753Gln), TLR3(Phe412Leu), TLR4(Asp299Gly), TLR6(Ser249Pro), TLR9(T–1237C)) у больных ишемическим инсультом в Забайкальском крае отмечалась высокая частота носительства аллелей –753 Arg TLR2, –299Asp TLR4, –249 Pro TLR6, –1237C TLR9 и генотипа –753Arg/Arg TLR2, –299 Asp/Asp TLR4, –299 Gln/Gln TLR4, –249 Pro/Pro TLR6. Выявлено, что аллель –299Asp TLR4 ассоциируется с тяжелым течением заболевания, а –1237C TLR9 – с повторным сосудистым эпизодом. Индивидуальный генетический индекс в пределах 2,2–2,4 чаще наблюдается у больных ОНМК, нежели у резидентов контрольной группы.
Взаимосвязь экспрессии TLR2, TLR4 и агрегации тромбоцитов у больных ишемическим инсультом
При расчете коэффициента корреляции Спирмена у здоровых участников исследования выявлены положительные связи разной силы между общим количеством моноцитов, количеством активированных моноцитов, в том числе с экспрессированными TLR2 и TLR4 и степенью и скоростью агрегации, индуцированной адреналином, и степенью агрегации при внесении АДФ 5 мкг/мл (табл.3.4.5.1., 3.4.5.2.).
В группе больных ишемическим инсультом обнаружены сильные связи прямые по направлению между общим количеством моноцитов, экспрессирующих TLR2, TLR4, количеством активированных моноцитов, экспрессирующих данные толл-рецепторы, и степенью агрегации, индуцированной АДФ 1,25 мкг/мл. Общее количество моноцитов, в том числе экспрессирующих TLR2, количество активированных моноцитов, в том числе с экспрессированным на мембране TLR2 и MFI, имеют сильную отрицательную связь со степенью агрегации при внесении адреналина (табл.3.4.5.1., 3.4.5.2.).
При сравнении концентрации интерлейкинов с агрегацией тромбоцитов среди больных ишемическим инсультом в острейший период заболевания и в период окончания формирования инфаркта мозга между концентрацией цитокинов и агрегацией тромбоцитов корреляционная зависимость не найдена. К концу острого периода заболевания обнаружена умеренной силы и обратная по направлению связь IL–6 с агрегацией, индуцированной коллагеном (R= –0,5; р=0,03), АДФ 5 мкг/мл (R= –0,4; р=0,04) и адреналином (R= –0,4; р=0,03). В группе здоровых исследуемых выявлена слабая прямая зависимость уровня этого же интерлейкина и спонтанной агрегации тромбоцитов (R= 0,3; р=0,02) (табл. 3.4.5.5., 3.4.5.6.).
Таким образом, при ОНМК увеличение MFI, общего количества моноцитов, количество активированных моноцитов, в том числе и экспрессирующих TLR2, сопровождается снижением агрегационной активности, индуцируемой адреналином, повышение количества моноцитов, количества активированных моноцитов, включая клетки с экспрессированными TLR2, TLR4, ассоциировано с увеличением степени агрегации, индуктором которой является АДФ 1,25 мкг/мл. Учитывая, что индуцированная гипоагрегация in vitro у больных инсультом говорит не о снижении агрегационной активности тромбоцитов, а, скорее, о тромбастении либо (и) их активном потреблении, то правильнее степень агрегационной активности кровяных пластинок ассоциировать с увеличением количества активированных моноцитов, экспрессирующих TLR2. При ишемическом инсульте уменьшение концентрации IL–6 коррелирует с увеличением агрегационной активности при внесении коллагена, АДФ 5 мкг/мл, адреналина, увеличение содержания IL–6 сопровождается снижением данной агрегации. В условиях нормы рост концентрации IL–6 ассоциируется с увеличением спонтанной агрегации тромбоцитов.
Агрегационная активность тромбоцитов с учетом носительства генетического полиморфизма toll-like рецепторов и генетического индекса у больных ишемическим инсультом
При сравнении результатов агрегации тромбоцитов в зависимости от носительства генетического полиморфизма TLR2(Arg753Gln) было выявлено, что больные – носители дикого аллеля данного рецептора – имели более низкие показатели степени агрегации при внесении АДФ 1,25 мкг/мл, степени и скорости агрегации при добавлении АДФ 5 мкг/мл и адреналина, чем таковые в контрольной группе (p 0,05; p 0,001). Отмечено, что степень спонтанной агрегации в период формирования инфаркта мозга была достоверно больше у больных–носителей минорного аллеля TLR2(Arg753Gln), нежели у больных– носителей нормального аллеля TLR2(Arg753Gln) (p 0,05). Анализ результатов в динамике заболевания показал, что у обладателей –753Arg – аллеля степень и скорость агрегации при внесении АДФ 5 мкг/мл увеличивалась к концу острого периода мозгового инсульта, у носителей –753Gln – аллеля отмечалась более высокая степень спонтанной агрегации тромбоцитов в период формирования инфаркта мозга по сравнению с острейшим периодом НМК (табл. 3.4.6.1., табл.3.4.6.2.).
Исследование агрегации кровяных пластинок с учетом носительства полиморфного варианта TLR3 (Phe412Leu) продемонстрировало, что у пациентов–носителей как нормального, так и рискового аллеля степень агрегации, индуцированной АДФ 1,25 мкг/мл, степень и скорость при внесении АДФ 5 мкг/мл и адреналином, а также скорость агрегации при добавлении коллагена была меньше, чем у здоровых респондентов (p 0,05; p 0,001). Следует отметить, что степень агрегации, индуцированной коллагеном, у обладателей –412Phe-аллеля TLR3(Phe412Leu) на 21 сутки инфаркта мозга превышала таковую у носителей аналогичного аллеля контрольной группы (p 0,05). Оценивая результаты изучаемых показателей в динамике ОНМК, мы выявили, что у носителей дикого аллеля TLR3 (Phe412Leu) степень агрегации при внесении АДФ 5 мкг/мл имела тенденцию к снижению, в то время как при добавлении адреналина отмечалось ее увеличение к концу острого периода (p 0,05; p 0,001). При индукции агрегации коллагеном и АДФ 1,25 мкг/мл было зарегистрировано повышение ее скорости на 10 сутки ишемического инсульта, что отличалось от значений, полученных в 1-е и 21-е сутки заболевания (p 0,05) (табл. 3.4.6.1., табл.3.4.6.2.).
Степень и скорость агрегации тромбоцитов, индуцированной АДФ 5 мкг/мл, АДФ 1,25 мкг/мл и адреналином, у пациентов–носителей –299Asp-аллеля и –299Gly-аллеля TLR4(Asp299Gly) определились в более низких значениях в сравнении с идентичными носителями контрольной группы (p 0,05; p 0,001). Обладатели как нормального, так и минорного аллеля TLR4(Asp299Gly), страдающие ишемическим инсультом, показали высокие значения степени агрегации при внесении коллагена по отношению к здоровым лицам (p 0,05; p 0,001). Однако при добавлении данного индуктора скорость агрегации у носителей дикого аллеля TLR4(Asp299Gly) снижалась в отличие от таковых контрольной группы (p 0,05; p 0,001). При сравнении среднего размера агрегатов у носителей разных аллелей клинической группы оказалось, что у больных, имеющих –299Gly-аллель TLR4(Asp299Gly), при внесении коллагена и адреналина этот показатель был больше, чем у больных–носителей нормального аллеля данного полиморфизма (p 0,05; p 0,001). В динамике заболевания статистически значимые отличия были найдены для носителей рискового аллеля TLR4 (Asp299Gly), у которых скорость агрегации, индуцированной АДФ 1,25 мкг/мл и адреналином, была максимальной к окончанию периода формирования инфаркта мозга и, соответственно, отличалось от значений, полученных в 1-е и 21-е сутки инсульта (p 0,05) (табл.3.4.6.1., табл.3.4.6.2.).
У больных–носителей –Ser-аллеля и –Pro-аллеля TLR6 (Ser249Pro) значения среднего радиуса тромбоцитов при внесении АДФ 5 мкг/мл, а также степень и скорость агрегации, индуцированной адреналином, были меньше в отличие от здоровых резидентов (p 0,05; p 0,001). Пациенты с ОНМК, обладающие минорным аллелем TLR6 (Ser249Pro), имели тенденцию к снижению степени и скорости агрегации тромбоцитов при добавлении АДФ 1,25 мкг/мл в сравнении с представителями контрольной группы (p 0,05; p 0,001). У этих же больных при индукции агрегации коллагеном отмечалось увеличение среднего радиуса кровяных пластинок, но снижение скорости образования агрегатов в сравнении со здоровыми людьми. У носителей нормального аллеля TLR6 (Ser249Pro) в клинической группе степень и скорость спонтанной агрегации оказалась выше, чем в контрольной группе и у больных– обладателей патологического аллеля TLR6 (Ser249Pro) (p 0,05; p 0,001). Наблюдение за результатами агрегации в течение всего острого периода инсульта в зависимости от полиморфизма TLR6 (Ser249Pro) показало, что носители –Ser- аллеля TLR6 имеют склонность к снижению скорости агрегации тромбоцитов от начала мозгового удара к окончанию острого периода при внесении коллагена (p 0,05). У обладателей –Pro-аллеля TLR6 замечена тенденция к увеличению скорости образования агрегатов от 1 к 21 суткам заболевания при добавлении АДФ 5 мкг/мл и адреналина (p 0,05) (табл. 3.4.6.1., табл.3.4.6.2.).
При исследовании агрегации у носителей полиморфизма TLR9(T -1237C) выявлено, что среди больных-обладателей дикого и минорного аллеля степень и скорость агрегации, индуцированной АДФ 1,25 мкг/мл и адреналином, была ниже, чем у респондентов контрольной группы (p 0,05). Среди пациентов клинической группы, имеющих –Т-аллель TLR9 (T-1237C), в отличие от здоровых участников исследования средний радиус агрегатов был меньше при добавлении АДФ 5 мкг/мл и больше при исследовании спонтанной агрегации (p 0,05). При сравнении изучаемых показателей у пациентов–носителей разных аллелей внутри групп наблюдения статистически значимые отличия были найдены только для здоровых резидентов, где обладатели –С-аллеля TLR9 (T-1237C) имели повышенную скорость агрегации тромбоцитов, чем носители нормального аллеля (p 0,05) (табл. 3.4.6.1., табл.3.4.6.2.).
Сравнительный анализ показателей агрегации в зависимости от генетического индекса в группе контроля не дал достоверных результатов, однако радиус агрегатов как при спонтанной, так и индуцированной различными активаторами агрегации у здоровых резидентов с IGI 2,0 и более был больше, чем у наблюдаемых с индексом менее 2,0. У больных с индексом 1,4–1,8 отмечалось увеличение степени и скорости спонтанной агрегации в 1-е и снижение скорости агрегации, индуцированной АДФ 5 мкг/мл, на 10 сутки в отличие от пациентов с IGI=2–2,2. В динамике заболевания обладатели индекса 1,4–1,8 имели тенденцию к увеличению агрегации тромбоцитов при внесении АДФ 5 мкг/мл к концу острого периода. У наблюдаемых клинической группы с IGI=2,4 и более, в отличие от лиц с индексом 2–2,2, наблюдалась низкая степень и скорость агрегации, индуцированной коллагеном. В течение острого периода ОНМК больные с индексом 2,4 и более показали снижение скорости агрегации от момента мозгового удара к концу периода формирования инфаркта мозга (табл. 3.4.6.3.). Также нами отмечено, что у пациентов с IGI более 2-х в динамике заболевания при индукции агрегации различными активаторами радиус агрегатов увеличивался, у больных с IGI менее 2 картина была разнородной.
Таким образом, у носителей предиктивных аллелей генетического полиморфизма toll-like рецепторов параметры агрегации тромбоцитов разнонаправленные, однако у больных–обладателей двух и более предиктивных для развития ишемического инсульта аллелей в геноме индуцированная (преимущественно коллагеном и низкими дозами АДФ) агрегация сопровождается увеличением радиуса агрегатов в динамике заболевания, а также более низкой степенью светопропускающей способности при индукции агрегации.