Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1. Рак толстой кишки. Современные представления о патологии 14
1.1. Формирование первичной опухоли толстой кишки: путь хромосомной и микросателлитной нестабильности 18
1.2.Воспаление как фактор развития опухолевого роста 24
1.2.1. Модели для исследования рака толстой кишки 27
1.2.2. Диффузная эндокринная система толстой кишки у человека и лабораторных животных (крыс) 33
1.3. Ацетилхолин 37
Глава 2. Материалы и методы 42
2.1.Общий дизайн исследования 42
2.2.Эксперименты in vitro з
2.2.1. Краткое описание клеточной линии рака толстой кишки SW620 44
2.2.2. Методы работы с культурой клеток 44
2.3. Эксперименты in vivo 55
2.3.1. Экспериментальные модели in vivo 57
2.3.1.1.Моделирование язвы толстой кишки 57
2.3.1.2.Моделирование опухолей толстой кишки 59
2.3.1.3.Моделирование язвы толстой кишки в сочетании с введением канцерогена 60
2.3.2.Биохимические методы и гистологическая техника 60
2.4. Статистическая обработка результатов 62
Глава 3 Собственные результаты и обсуждение 63
3.1. Биологические эффекты от воздействия ацетилхолина на опухолевые клетки SW620 63
3.1.1. Определение рабочих концентраций раствора ацетилхолина для in vitro исследований 63
3.1.2. Сопоставление полученных данных и определение пролиферативной активности вещества 68
3.1.3. Микроскопический анализ влияния ацетилхолина на характер роста популяций SW620 71
3.1.4. Исследование концентрации EGF, ММР-3 и ММР-9 76
3.1.5. Влияние ацетилхолина на экспрессию молекул главного комплекса гистосовместимости человека первого и второго классов 82
3.1.6. Влияние ацетилхолина на фазы клеточного цикла клеточной линии SW620 84
3.2. Влияния ацетилхолина на рост и развитие полипов толстой кишки у крыс 96
3.2.1. Определение рабочих концентраций раствора ацетилхолина для in vitro исследований 97 3.2.2. Патофизиологические изменения внутренних органов на фоне применения канцерогена АОМ 109
3.2.3 Патофизиологические изменения внутренних органов при моделировании язвы в сочетании с введением канцерогена АОМ 115
3.2.4. Сравнительная оценка концентраций EGF и матриксных металлопротеиназ 3 и 9 типов в крови и образцах тканей в экспериментальных моделях 120
3.3. Анализ причин летальности и послеоперационных осложнений при работе с животными
Выводы 127
Практические рекомендации 128
Перспективы дальнейшей разработки темы 128
Библиография 129
- Формирование первичной опухоли толстой кишки: путь хромосомной и микросателлитной нестабильности
- Методы работы с культурой клеток
- Сопоставление полученных данных и определение пролиферативной активности вещества
- Сравнительная оценка концентраций EGF и матриксных металлопротеиназ 3 и 9 типов в крови и образцах тканей в экспериментальных моделях
Введение к работе
Актуальность темы. Рак толстой кишки (РТК) занимает первые места в структуре опухолевых заболеваний в экономически развитых странах [Давыдов М.И., 2011]. К факторам риска относят наследственную предрасположенность [Корчагина, 2009], возраст, хронический стресс, длительное воспаление органов желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) и нерациональное питание [Савицкий С.Э., 2009]. Особенности развития РТК не позволяют создать полноценную программу скриннига [Моисеенко В.М., Волков Н.П., 2014; Заридзе Д.Г., 2009] и/или адекватную исследовательскую модель РТК [Corpet D.E, 2003].
Биологически активные вещества нейроэндокринного происхождения, в том числе ацетилхолин (Ах), обладают способностью изменять физиологические процессы, происходящие в ЖКТ. Вопрос его влияния на процесс воспаления достаточно изучен [Трубицына И.Е., 2004; Парфенов А.И., 2002; Трубицына И.Е., Винокурова Л.В., 2006; Коротько Г.Ф., 2009], однако остается много вопросов о его действии на начальный этап канцерогенеза при хроническом воспалении. Слизистая оболочка ЖКТ выполняет функции диффузной эндокринной железы. Она имеет как прямую, так и обратную связь с центральной нервной системой [Воробьев А.В., 2010]. Клетки этой системы – апудоциты – обеспечивают метаболизм биогенных аминов и ацетилхолина в частности. Благодаря Ах и его действию на эту систему происходит регуляция секреции пептидных гормонов, которые вовлечены в начальный этап роста опухолевых клонов и способствуют их селекции [Blankenstein, 2005; Arias, et al., 2009]. В конце 90-х гг. ХХ века было показано одновременное нейрональное и ненейрональное влияние Ах: через систему рецепторов клеток слизистой оболочки кишки и через систему биологически активных веществ, выделяемых апудоцитами [Pelisser-Rota, et al., 2013]. В 2000 гг. предположили, что Ах может продуцироваться и/или накапливаться опухолевыми клетками, стимулируя их рост в тканях [Delbro D., 2012; Novotny A., et al., 2011]. Установлено, что процессы нарушения гомеостаза Ах в тканях и опухолевый рост в слизистой оболочке толстой кишки (СОТК) связаны, а клетки многих клеточных линий экспрессиру-ют рецепторы для Ах [Belo A., 2011; Pelisser-Rota, et al., 2011].
Отсутствие полноценной экспериментальной модели, воспроизводящей опухолевый рост в слизистой оболочке толстой кишки у лабораторных животных, является причиной активного исследования исключительно генетических причин опухолей [Corpet D.E., 2003]. Однако распространенность такого вида опухолей невелика, и, учитывая данный факт, требуется изучение спонтанного, а также
связанного с воспалением опухолевого роста. Таким образом, изучение роли Ах в процессах опухолевого роста как на изолированной системе (in vitro), так и в организме (in vivo) является актуальным направлением для экспериментальной онкологии и патофизиологии.
Разработанность темы. Несмотря на активное изучение молекулярных механизмов возникновения опухолей, в том числе и РТК, остается неразработанной область нейро-иммуно-эндокринной регуляции. Вопрос о нейрональной регуляции опухолевого роста в кишечнике до сих пор изучен недостаточно подробно, что объясняет актуальность настоящего исследования.
Цели исследования. Установить возможные патофизиологические механизмы влияния ацетилхолина на процесс пролиферации клеток эпителия слизистой оболочки толстой кишки in vivo и in vitro.
Задачи исследования.
-
In vitro выявить влияние различных доз ацетилхолина на опухолевую клеточную линию SW620 (рак толстой кишки человека).
-
Определить in vitro концентрации ацетилхолина, которые способствуют изменению количества митозов в популяции опухолевых клеток.
-
Выявить in vitro влияние ацетилхолина на уровень экспрессии поверхностных молекул главного комплекса гистосовместимости I и II классов.
-
Создать экспериментальные модели для изучения начальных этапов роста опухоли толстой кишки у крыс.
-
Определить изменение концентрации ацетилхолина в слизистой оболочке толстой кишки в динамике заживления язвенного дефекта.
-
Определить влияние ацетилхолина на изменение концентрации эпидермального фактора роста, матриксных металлопротеиназ 3 и 9 типов в экстрактах слизистой оболочки толстой кишки у крыс.
Научная новизна. Впервые для исследования патофизиологического значения ацетилхолина в разных модельных системах применили метод параллельного изучения факторов межклеточного взаимодействия: эпидермального фактора роста и матриксных металлопро-теиназ 3 и 9 типов. Впервые разработана модель опухолевого роста в толстой кишке у крыс путем индукции воспаления в сочетании с введением 1,2-азоксиметана. Определены факторы, влияющие на рост полипов толстой кишки у крыс с разным способом индукции первичной трансформации. Впервые параллельно in vitro и in vivo определено влияние ацетилхолина на концентрацию матриксных металлопротеи-наз 3 и 9 типов и эпидермального фактора роста.
Теоретическая и практическая значимость работы. Показана тесная взаимосвязь между процессом пролиферации клеток толстой кишки крыс как в нормальной ткани, так и на фоне воспалительного процесса. Концентрация ацетилхолина в образцах тканей может быть использована в качестве маркера фазы воспаления слизистой оболочки толстой кишки. Разработанные модели могут быть использованы в экспериментальной патофизиологии.
Методология и методы исследования. Методы поиска, анализа и обобщения литературных данных; методы моделирования и ветеринарной работы: наблюдение, оперативное вмешательство и послеоперационный уход; методы работы с клетками эукариот; биохимические методы исследования: титрование по Хестрину в модификации Трубицыной И.Е.; методы работы на проточном цитометре: реакция прямой иммунофлюоресценции, работа с витальными красителями для работы с клетками; методы аналитической химии: приготовление растворов, измерение оптической плотности растворов, измерение рН среды; методы математической обработки полученных экспериментальных данных: анализ данных на распределение, проведение исследования внутри экспериментального массива, сравнение между сериями экспериментальных данных.
Внедрение результатов. Результаты диссертационной работы внедрены в учебный процесс на кафедре общей патологии и патологической физиологии медицинского института РУДН.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Ацетилхолин оказывает влияние на опухолевые клетки SW620 in vitro. В зависимости от дозы он может как стимулировать рост клеток, так и вызывать их гибель.
-
Ацетилхолин in vitro в низких концентрациях (от 10-4М и ниже) способен влиять на синтез интрацеллюлярных молекул эпидермально-го фактора роста и матриксных металлопротеиназ 3 и 9 типов.
-
In vivo концентрация Ах в первые трое суток от начала воспаления определяет нормальную пролиферативную активность клеток в зоне альтерации.
-
Разработанные экспериментальные модели позволяют изучать начальные этапы роста опухоли толстой кишки у крыс.
-
Изменение концентрации Ах в ранний послеоперационный период является маркером воспалительного процесса.
Степень достоверности полученных данных. Клетки линии SW620 были использованы согласно договору о безвозмездном научном сотрудничестве между ЦНИИГ и Федеральным государственным бюджетным учреждением «Российский онкологический научный центр им.
Н.Н. Блохина» Минздрава России. Для работы на клеточной культуре использовали стандартную производственную питательную среду и кондиционирующие добавки, телячью эмбриональную сыворотку, сертифицированную для работы с культурами клеток (все производства ПанЭко, РФ). Пластик и расходные материалы использовали одноразовый. Посуду из стекла использовали только для кратковременного хранения растворов и воды для разведения. Для экспериментов in vivo использовали белых лабораторных крыс Wistar из разведения питомника ФИБХ РАН (МО, г. Пущино-на-Оке). Для оценки статистически значимых различий использовали данные, полученные в сериях экспериментов. Оценку проводили после определения типа распределения данных и использовали непараметрические критерии сравнения как парных зависимых, так и парных независимых выборок.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на ежегодных сессиях ЦНИИГастроэнтерологии и ГБУЗ МКНЦ ДЗМ: 41-я Научная сессия ЦНИИГ; XXXIX сессия ЦНИИ гастроэнтерологии "Мультидисциплинарный подход к гастроэнтерологическим проблемам» 2012 г.; «Расширяя границы» 5-6 марта 2015 г.; «Принципы доказательной медицины в клиническую практику» 2-3 марта 2016 года; на расширенном заседании кафедры общей патологии и патологической физиологии РУДН с привлечением сотрудников ГБУЗ МКНЦ ДЗМ.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано
16 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах, входящих в перечень, утвержденный ВАК Министерства образования и науки РФ.
Объем и структура диссертации.
Диссертация построена по традиционному принципу и включает разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, заключение и выводы. Материалы изложены на 146 листах машинописного текста, содержат 25 рисунков и 22 таблицы. Библиографический список включает 197 работ.
Формирование первичной опухоли толстой кишки: путь хромосомной и микросателлитной нестабильности
Благодаря исследованиям на животных, было установлено, что общебиологическими закономерностями развития опухолей толстой кишки является наличие синергических воздействий на генетический аппарат клетки [8; 11; 69; 111]. Согласно современной концепции ступенчатого (или многошагового) канцерогенеза, сформулированной норвежским ученым Кнудсоном в 1981 году [124], «формирование опухоли – это не одноразовое событие, а цепь последовательных и взаимосвязанных событий, в ходе которых происходит накопление повреждений генома клеток» – возникает геномная нестабильность. Показано, что важную роль в отборе дефектных клеток играет микроокружение [9; 18; 61; 119]. Особенно выражено это действие в случае развития доброкачественных опухолей – полипов слизистой оболочки [142].
С точки зрения патофизиологии, любой полип слизистой оболочки является опухолью, которая обладает злокачественным потенциалом [8]. Однако его реализация зависит от суммарных стимулирующих факторов, в том числе воспалительного генеза [1; 12; 45; 73; 64; 75; 108]. Этот вывод является частным случаем реализации так называемой «теории раздражения», предложенной Фроловым В. А., (2006). Из этой теории следует, что состояние воспаления тканей ускоряет процессы деления клеток, и, таким образом, качество тканей изменяется [32]. Как было показано ранее, в органах ЖКТ в ответ на воспалительные реакции срабатывает интегральная система – энтериновая система, которая наиболее плотно локализована на СО этих органов и выполняет активную роль в поддержании их физиологической активности. Регуляция этой системы осуществляется через сеть взаимодействий парасимпатической НС и непосредственно самой тканью органа [135]. Таким образом, следуя логике теории, к созданию измененной клетки приведет несколько событий: сверхактивность парасимпатической системы, активация энтериновой системы и возникновение точки излома при репарации клетки: переход «количество-качество» - т.е. определяется направления эволюции произойдет изменение ДНК – мутация, необходимая для того, чтобы пережить стресс и снять ограничение на рост новой популяции или нет [1; 3; 93; 119;]. При стабильном состоянии окружающих тканей генетические факторы, определяющие активность канцерогенеза, могут длительно «молчать» [76; 96; 128; 188;].
Таким образом, развитие опухолевого клона можно рассматривать двояко. С одной стороны, существует индивидуальная патология генетического материала клетки (наследственные и спонтанные генетические раки), с другой – клон развивается как следствие нарушения системы сигнальных путей в организме в целом (химический канцерогенез и все его варианты) [8]. Оба этих подхода имеют право на существование. Однако, изолированные друг от друга в процессе изучения, они не дают ответа на вопрос - что же происходит в случае возникновения избирательной чувствительности клетки к пролиферативным стимулам в живом организме. На наш взгляд, этот вопрос является краеугольным в процессе изучения этой патологии. В случае сочетанного воздействия на организм, цитокины и нейромедиаторы перестают выполнять свою основную роль и становятся регуляторами роста измененной клетки [116; 128; 130; 131; 141; 143].
Клинически-значимая постепенность изменений в клеточной популяции сформировала определение рака, как хронического, патологического процесса, развивающегося однонаправлено, стадийно и линейно [122], на что делается акцент при изучении клинической онкологии, и, в частности медицинской патофизиологии [1; 8; 141],однако биологически эта микроэволюция проходит более широко. В настоящее время выделены три фазы развития патологии: инициация, промоция и прогрессия опухолевого клона. Они достаточно охарактеризованы, а их изолированной специфике посвящена объемная библиография. Показано, что на этапе инициации (опухолевой трансформации) происходят изменения на генетическом уровне – микро/макро мутации ДНК, которые можно инициировать введением химических канцерогенов [23]. Отражением возникающих в результате инициации изменений можно считать различного рода дисплазии, разрастания слизистой оболочки, формирования полипов, в том числе слизистой оболочки кишки [1; 47].
Промоция – следующий шаг в развитии опухоли, заключающийся во взаимодействии между трансформированной клеткой и рядом факторов (внешних и/или внутренних); в результате чего образуется обширный клон измененных клеток, т.е. формируется первичный опухолевый узел. Однако сложившаяся на этом этапе опухоль обычно неспособна к инфильтрирующему росту и метастазированию в силу наличия эффекта противоопухолевого иммунного надзора и наличию системы матриксных металлопротеиназ [47; 62; 65]. Этот активный сдерживающий механизм опухолевый клон старательно пытается выключить [3; 41; 53; 65].
Как только данный этап пройден, опухоль способна к неограниченному росту и его самостимуляции. Возникает этап перехода к третей фазе - инфильтрирующему росту и образованию метастазов. Этот процесс имеет выраженную видовую специфичность, что требует уточнения роли нейроактвных веществ в опухолевом росте, так как их действие напрямую изменяет способность опухоли строить собственную систему питания через измененные кровеносные сосуды [67; 68; 69].
Методы работы с культурой клеток
В остальных случаях клеточный цикл временно блокировали обработкой колмицидом после 2-ого культурального пассажа. Данный метод позволяет накопить максимальное количество клеток в метафазе (80-86%). Для этого монолслой 2-ого пассажа после размораживания клеток обрабатывали колмицидом как описано выше, но без последующей трипсинизации. После окончания инкубации с препаратом среду из КФ удаляли, заменяли несколько раз на чистую СК, после чего добавляли полную СК и инкубировали в СО2-инкубаторе. Для работы использовали синхронизацию на 2 пассаже после размораживания ОК и время работы не более чем 6 культуральных пассажей.
Для определения эффектов, оказываемых Ах на клетки линии SW620 использовали следующие протоколы: (1) определение популяционных эффектов после обработки клеток АХ, (2) определение жизнеспособности после обработки Ах и методы оценки скорости роста: МТТ-метод, тесты миграции, CVS-метод, колониеобразование, витальное окрашивание по Гольдману и световая микроскопия. Ко второй группе исследований относятся цитометрические исследования клеток, а к третьей – ИФА-определение секреции эпидермального фактора роста, матриксных металлопротеиназ 3-его и 9-ого типов.
Оценка скорости удвоения клеток, скорости образования колоний, формирования монослоя использовали по методике, описанной в руководстве Р.Я. Фрешни (2012). В стерильные пластиковые чашки Петри диаметром 10 см помещали по 2х105 клеток в СК и обрабатывали их Ах в различных концентрациях и с разным временем экспонирования. После окончания инкубации с препаратом среду удаляли, вносили новую СК без препарата и культивировалив течение необходимого времени с ежедневным подсчетом количества дочерних клеток под инвертированным микроскопом (определение скорости удвоения). Для определения скорости колониеобразования использовали модификацию метода: общее время инкубации составляло 240 часов, колониями считали образования, содержащие более 30 клеток. Также скорость удвоения популяции оценивали по Гольдману путем сравнения количества клеток в разных экспериментальных точках.
Исследование пролиферативной активности in vitro методом МТТ проводили на 3-5 пассаже и дополнительно использовали следующие реактивы: a) Буферный раствор для приготовления раствора ацетилхолина (Ах). В качестве буферного раствора использовали среду RPMI1640 с добавлением стерильного раствора HEPES до конечной концентрации 0,1 мМ; b) Стоковый (концентрированный) раствор Ах. Для приготовления раствора на аналитических весах взвешивали сухой реактив Ах (Украина) и медленно растворяли в буферном растворе. Полученный концентрат фильтровали через одноразовую фильтровальную систему NalgeneTM (США) в стерильную пробирку 5 мл. Раствор использовали в этот же день. c) Реактив МТТ (ПанЭко, РФ) в концентрации 5мг/мл, стерильный, который готовили из сухой производственной навески по приложенной инструкции.
Для оценки влияния Ах на жизнеспособность и изменение скорости пролиферации клеточной линии SW620 использовали метод МТТ, адаптрованный Э.Ш. Соломко (2011) и А.Н. Иншаковым (2012) по Mosmann, (1983). Продукт реакции реактива МТТ и митохондриальных эстераз при растворении образует окрашенный раствор, оптическую плотность которого можно оценить при длине волны 490-540 нм [162]. Интенсивность окраски раствора прямо пропорциональна количеству живых клеток в суспензии [63]. Метод имеет ограничения применения, так как исходно был разработан для клеток крови [127] и лишь впоследствии адаптирован для адгезивных культур (работа с ними предполагает использование детергентов: раствор ЭДТА или ферменты с протеиназной активностью), которые влияют на активность митохондриальных НАД(Ф)-зависимых интрацеллюлярных оксиредуктаз и внемитохондриального НАД(Ф), количество которых может различаться из-за процессов обработки культуры)[56; 80; 125]. Для интерпретации результатов используют как парное сравнение (по принципу «доза1 vs доза 2», так и проводят независимые сравнения – для уточнения динамических зависимостей: «дата 1 vs дата 2»).
Для предотвращения гидролиза Ах в водных растворах рабочие реактивы готовили ex tempore методом серийных разведений из стокового 10М до конечных концентраций в лунке 0,25М; 0,125М; 0,0625М; 0,03М; 0,015М; 0,008; 0,004М; 0,002М; 0,001М, 0,001М; 0,0001М и 0,000001М; pH рабочих растворов Ах составлял 7,2-7,4.
МТТ-метод. В зависимости от времени инкубации (24, 48, 72 или 96 часов). Для этого клетки в количестве 4х10, 3х10, 2,5х10, или 2х10 штук соответственно, в объеме 190 мкл, помещали в лунки 96-и луночного плоскодонного планшета. Инкубировали 24 часа для адаптации клеток после действия детергентов, после чего в необходимых количествах вносили Ах. Использовали три типа контрольных точек: (1) клетки без препаратов; (2) чистая бессывороточная среда RPMI-1640 и (3) чистая СК. Результаты теста определяли через 24, 72 и 96 часов культивирования с Ах. После окончания инкубации в каждую лунку добавляли по 10 мкл стокового (5 мг/мл) раствора МТТ и инкубировали в течение 3 часов, после чего удаляли надосадочную жидкость, и добавляли 200 мкл ДМСО. Раствор перемешивали и инкубировали 10 мин при 37С, после чего определяли оптическую плотность среды на анализаторе иммуноферментных реакций «Униплан» («Пикон», РФ) при 490 нм, используя ДМСО как нулевой контроль.
Сопоставление полученных данных и определение пролиферативной активности вещества
Оценка результатов метода носит качественный характер, что является его ограничением для количественной оценки эффектов от препарата [94]. Тем не менее, это помогает оценить наличие клеточного движения, его направленность и скорость заживления деффекта. Метод позволяет собирать достаточный объем образцов для исследования – для количественного определения матриксных металлопротеиназ [74; 159], факторов роста и тд [60]. Мы использовали модификацию данного метода, предложенную в работе Соломко, (2011), с праллельным измерением концентраций матриксных металлопротеиназ и фактора роста эпителия.Данные представлены на рисунке 10.
Установлено, что Ах влияет на скорость роста культуры ОК ТК SW620, и обладает слабым времяопосредованым эффектом на формирование клеточных структур с плотными межклеточными контактами типа монослойной выстилки дна культурального флакона (КФ). 72 часа с Ах
Скратч-тест. Фотографии состояния монослоя после его разрушения и внесения Ах, 72часа инкубации, увеличение х20 и х Вероятнее всего, Ах формирует предпосылки к более раннему прохождению стадий клеточного цикла. При использовании Ах в течение 24, 48, 72 и 96 часов в конечных концентрациях 10-4-10-6 М были установлены изменения характера роста культуры: на дне КФ образовывались многослойные зоны роста клеткок, которые окрашивались в более темный цвет, и мешали оценке скорости миграции. При исследовании способности клеток к миграции описанным методом была установлена тенденция к более активному зарастанию дефекта в группах, где был использован Ах. При этом говорить о достоверно более активной миграции мы не можем – клетки не «наползают на рану», а открепляются и занимают свободное пространство благодаря описанным выше активным центрам деления. К 72-ому и 96-ому часу инкубации в группах, обработанных Ах выявляется наиболее выраженная тенденция к образованию шарообразных колоний.
Визуальное исследование этих зон при микроскопии позволило предположить, что бляшки являются наиболее активными центрами деления клеток - они способны длительно нарастать на слое, затем открепляться от него, перемещаться в СК и при оседании на дно образовывать новые пролиферирующие колонии. Для подтверждения этого предположения провели два типа окраски: по Лейшману, и с 0,04% раствором трипановым синим. При окраске по Лейшману данные образования прокрашивались ярко, часто легко удалялись с пластика при промывке, что позволяет предположить в данных центрах слабые межклеточные контакты. Однако при витальной микроскопии этот центр плохо захватывает 0,04%раствор трипанового синего, что выявляет повышенную жизнеспособность клеток в этой области. Учитывая, что окраска по Лейшману позволяет зафиксировать и окрасить мембраны клеток, а окраска раствором 0,04% трипанового синего оценить при микроскопии жизнеспособность клеток, различная чувствительность клеток к красителям свидетельствует в пользу того, что центр таких колоний является зоной активной пролиферации клеток.
При инкубации ОК SW620 в присутствии Ах в конечной концентрации 10-5М отмечали наибольшее количество плотных клеточных контактов, характер роста клеточного слоя отличался от контрольного, что видно из рисунка 11. Рисунок 11 Характер роста клеток SW620 под воздействием Ах, увеличение Х40. Микрофотографии монослоя. А.Контроль после 24 часов инкубации. Б.Контроль после 96 часов инкубации В. Ах 10-5 М, 24 часа инкубации. Г. Ах 10-5 М 96 часов инкубации.
Мы считаем, что изменение характера роста клеточной линии SW620 в ответ на действие Ах in vitro может быть связано с наличием белка p53, функциональная связь которого с Ах была показана ранее в работах Cheng и Raufman 2005-2008 гг. [60; 147] и Ritzenthaler 2009 года [170]. Известно, что активация белка р53 происходит в ответ на многочисленные стрессовые стимулы, в частности в ответ на повышение концентрации монооксида азота.
При воздействии Ах концентрация монооксида азота возраствает, что приводит к вторичному отбору наиболее жизнеспособных клонов ОК, в которых утрачена чувствительность к про-апоптотическому сигналу опосредованному белком р53 [81; 195]. Увеличение концентрации белка р53 в быстро пролиферирующих клетках, по сравнению с делящимися медленно клетками, было описано ранее [3].
Биологическое значение увеличения концентрации р53 в данном случае в том, что клетки, которые быстро реплицируют ДНК, более подвержены возникновению повреждений генетического аппарата, чем, например, неделящиеся клетки в фазе G0. Следовательно, увеличение концентрации р53 — подготовка клетки для быстрой реакции на возможное возникновение повреждений ДНК. Очевидно, что для остановки клеточного цикла в условиях стимуляции пролиферации внеклеточными ростовыми факторами (например факторами роста, гистогормонами и т.д.) требуется более высокая концентрация р53, чем в условиях фазы G0. В связи с тем, что результатом передачи пролиферативного сигнала является одновременно активация протоонкогенов, и, инактивация р53, было предположено, что активный рост клеток SW620 после обработки Ах связан с тем, что антиапоптотическое действие ростовых факторов, реализуется уже после апоптотического воздействия р53 на популяцю. Таким образом остаются только те клетки, которые не погибли через р53-опосредованный путь кдеточной гибели. Вокруг этих клеток происходт разрастание популяции дочерних клонов и формируется зона измененного характера роста - бляшка.
Сравнительная оценка концентраций EGF и матриксных металлопротеиназ 3 и 9 типов в крови и образцах тканей в экспериментальных моделях
В полости некоторых альвеол обнаруживали скопления большого количества макрофагов. Также наблюдали неравномерное кровенаполнение крупных и мелких сосудов с преобладанием сильного их кровенаполнения и скопления в их просвете большого количества форменных элементов крови с явлениями эритростаза. В срезах были представлены бронхи без признаков склероза стенок крупного, среднего и мелкого размера. Слизистая оболочка бронхов была утолщена, имела складчатую форму, что свидетельствовало об их спазме. Эпителий слизистой оболочки крупных бронхов высокий призматический без признаков повреждения. Эпителий средних и мелких бронхов вытянутой пальцевидной формы, апикальная часть реснитчатых эпителиоцитов в состоянии деструкции, часто отпадает в просвет бронха, ворсинчатая камка на апикальной части большинства клеток плохо выражена, часто полностью отсутствует, что оценивалось, как признак ярко выраженной слизистой дистрофии. В просвете некоторых бронхов встречается скопление большого количества зернистой белковой массы - слизи. В эпителиальном слое слизистой оболочки встречаются немногочисленные бокаловидные клетки. Базальная мембрана эпителия бронхов не утолщена. Перибронхиальные лимфатические узлы значительно увеличены, часто встречаются диффузные скопления лейкоцитов в перибронхиальной ткани. Таким образом, наиболее типичным нарушением в группе животных с язвой были изменения со стороны ткани легких.
При оценке изменений со стороны печени грубых макроскопических изменений не выявили, однако, в обеих группах определяли участки развития жировой дистрофии, что мы связываем с составом корма.
Кроме морфологической оценки состояния кишки в группах «интактные» и «язва» была определена концентрация Ах в области воспаления в послеоперационный период с 3 по 20 день. Предпосылкой для исследования послужили данные литературы о роли Ах в процессе репарации и иммунной реактивности. Также, учитывая собственные данные о влиянии Ах на секрецию факторов роста и поддержания межклеточных контактов, а также выводов Raufmann, Novotny и их соавторов о возможном участии n7AcH в процессах опухолевого роста, требовалось установить его концентрацию в биологических образцах, полученных от животных с индуцированным воспалением.
Для этого применили биохимический метод титрования Хестрина, в модификации Трубицыной И.Е. На 30 образцах ткани оценили динамику изменения концентрации Ах в СО ТК у крыс, которым индуцировали язву описанным выше способом. Контролем служили интактные одновозрастные животные. Было установлено, что при индукции язвы толстой кишки методом химического ожога изменение концентрации Ах носят времязависимый характер. Диаграмма изменения концентрации представлена на рисунке 19.
Как видно из диаграммы, увеличение количества Ах происходило в первые сутки (0,52±0,04 мг/мг ткани) и достигало максимума к 5-ому послеоперационному дню (1,2±0,04 мг/мг ткани). Через 2 дня после пика наблюдали плато-эффект, который предвещал падение концентрации Ах к 12-ому дню (от 0,95±0,04 мг/мг ткани и до 0,6±0,04 мг/мг ткани) вплоть до 20 дня и далее. Все это время количество Ах в группе контроля не превышало значения 0,38±0,03 мг/мг ткани.
Таким образом, было установлено, что при индукции язвы СОТК крыс методом химического ожога концентрация Ах изменяется со временем и его действие минимизировано после 12-ого дня. Основываясь на данных литературы [48] мы не можем игнорировать тот факт, что это явление должно найти отражение в работах, посвященных исследованию болезни Крона, так как до сих пор нет надежных маркеров начала воспалительной реакции и развития рефрактерности к препаратам. Возможно, именно профиль нейромедиаторов как регуляторов воспаления может решить эту проблему.
Суммируя полученные данные, были сделаны выводы, что процесс воспаления толстой кишки не носил узконаправленное действие, а его последствия имели генерализованный эффект. В частности, в связи с тем, что Ах мог оказывать дистантное действие на органы и системы [31], в частности на легкие наши наблюдения позволяют по-новому взглянуть на проблему ранних послеоперационных осложнений, которые формируются в системе органов дыхания [29].
В частности, в публикациях Barnes P. J.(2013) [40] Montuschi P. (2014) [123] указано возможное участие Ах в процессах бронхообструкции и указывается перспективность использования Ах и рецепторов к нему, расположенных на поверхности клеток альвеолярной выстилки, в качестве таргетных компонентов для лекарственных средств при хронической обструктивной болезни легких. Аналогичного мнения придерживаются Medjber, K. (2015) и Improgo, M.(2013), и ряд других авторов, которые указывают на недостаточную изученности системы Ах и, в частности, его рецепторной части при раке легких[98; 118]. Авторы указывают на то, что создание таргетных препаратов для лечения рака легкого не может быть полноценным, если не будет детально изучена роль n7AcHR. Учитывая данные литературы и собственные результаты, следует наметить дальнейшие пути изучения роли Ах при воспалении, но уже для тканей легких.
Резюмируя, можно заключить, что модифицированная модель язвы желудка по Okabe, с учетом уменьшения диметра кольца и времени аппликации оказалась технически воспроизводимой на толстой кишке, что может быть использовано для экспериментального моделирования.