Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 10
1.1 Этиология привычного невынашивания беременности 10
1.2 Свободнорадикальные процессы в организме человека 22
1.2.1 Активные формы кислорода 22
1.2.2 Перекисное окисление липидов 24
1.2.3 Антиоксидантная система организма человека 26
1.3 Состояние оксидантной и антиоксидантной систем во время беременности 28
Глава 2. Материалы и методы 33
2.1 Характеристика и критерии отбора пациентов 33
2.2.2 Математическое моделирование хемилюминограмм кривых нейтрофилов методом деконволюции 38
2.2.3 Определение антиоксидантной активности плазмы крови методом кинетической хемилюминесценции 39
2.2.3 Оценка оксислительной модификации альбумина по триптофановой флуоресценции 40
2.3 Статистическая обработка материала 41
Глава 3. Клиническая характеристика пациентов 42
Глава 4. Результаты собственных исследований и их обсуждение. 48
4.1 Оценка функциональной активности нейтрофильного звена лейкоцитов методом хемилюминесценции с двойной последовательной стимуляцией 48
4.2 Анализ кривых методом деконволюции 63
4.3 Оценка антиоксидантной активности плазмы крови методом кинетической хемилюминесценции 69
4.4 Оценка триптофановой флуоресценции альбумина 73
Глава 5. Заключение 76
Выводы 79
Практические рекомендации 81
Список сокращений 82
Список использованной литературы 84
- Этиология привычного невынашивания беременности
- Состояние оксидантной и антиоксидантной систем во время беременности
- Оценка функциональной активности нейтрофильного звена лейкоцитов методом хемилюминесценции с двойной последовательной стимуляцией
- Оценка антиоксидантной активности плазмы крови методом кинетической хемилюминесценции
Введение к работе
Актуальность исследования
Медицинская и социальная значимость проблемы невынашивания беременности, обусловлена ее влиянием на демографические показатели в РФ. В структуре акушерско-гинекологической заболеваемости невынашивание заминает одно из первых мест, оказывая влияние на уровень перинатальной заболеваемости, смертности и репродуктивное здоровье женщин (Айламазян, Э.К., 2007). Частота невынашивания беременности составляет 15-27% от общего числа всех выявленных беременностей, при этом на долю привычного выкидыша (ПНБ) приходится от 5 до 20%. К наиболее частым причинам ПНБ относят: генетические, эндокринные, иммунологические, гемастазиологические нарушения репродуктивной системы, бактериальные и вирусные инфекции (Сидельникова, В.М., 2002).
Однако, генез невынашивания зачастую остается неясным (идиопатическое ПНБ), составляющего около 50%. Несмотря на успехе в диагностике и лечении самопроизвольных прерываний беременности, частота ПНБ остается достаточно высокой и не имеет тенденции к снижению. Вопрос об этиологической роли свободнорадикальных процессов при невынашивании беременности широко дискутируется в литературе. Изменения в тканях плаценты процессов свободнорадикального окисления (СРО), вызывающие повреждения структуры и нарушение проницаемости клеточных мембран играет немаловажную роль в патогенезе невынашивания беременности (Jauniaux, E., 2016). Данные деструктивные процессы возникают вследствие проявляющегося дисбаланса между интенсивностью СРО и эффективностью системы антирадикальной защиты. Однако вопросы, связанные с изучением механизмов генерации активных форм кислорода (АФК) и активностью антиоксидантной защиты у женщин с ПНБ остаются практически не изученными.
В связи с этим представляет научный и практический интерес изучение механизмов генерации активных форм кислорода, состояние антиоксидантной системы у женщин с ПНБ, а также оценка доли окисленного альбумина, как маркера системного оксидативного стресса. Эти исследования позволят внести ясность в патофизиологические механизмы, приводящие к прерыванию беременности, а также возможно помогут разработать диагностические и прогностические параметры.
Цель исследования – Выяснение патофизиологической роли свободно-радикальных процессов при привычном невынашивании беременности и на этой основе предложить диагностические и прогностические параметры
Задачи исследования
-
Исследовать радикал-продуцирующую функцию нейтрофилов крови у женщин с привычным невынашиванием беременности (ПНБ).
-
Определить антиоксидантный профиль плазмы крови у женщин с ПНБ.
-
Оценить степень системного оксидативного стресса у женщин с ПНБ по степени окисленно-модифицированного альбумина
-
Сопоставить полученные показатели окислительного стресса с клиническими данными и предложить диагностические и прогностические параметры.
Научная новизна работы
-
Проведенное исследование впервые выявило, что во время беременности, как физиологической, так и протекающей на фоне угрозы прерывания, нейтрофилы находятся в состоянии прайминга, о чем свидетельствует повышенный уровень базальной продукции свободных радикалов и повышенный ответ на стимулы.
-
Впервые установлено, что у женщин с неразвивающейся беременностью ответ нейтрофилов на стимулы был снижен, что указывает на иммуносупрессивное состояние, препятствующее самопроизвольному прерыванию беременности.
-
Впервые установлено, что антиоксидантная активность плазмы крови снижена после самопроизвольного аборта, что свидетельствует о расходовании антиоксидантов крови из-за развивающегося окислительного стресса в момент прерывания беременности.
-
Впервые установлено, что при неразвивающейся беременности антиоксидантная активность плазмы повышена, что указывает на присутствие в крови специфических молекул, обладающих антиоксидантными свойствами.
-
Впервые установлено, что у здоровых беременных, беременных с угрозой прерывания нет системного оксидативного стресса, затрагивающего белковое звено.
Теоретическая и практическая значимость
-
Продемонстрирована потенциальная возможность использования лабораторных критериев окислительного стресса в качестве прогностических маркеров преждевременного прерывания беременности и неразвивающейся беременности.
-
Доказана эффективность кинетической хемилюминесценции для оценки функционального состояния нейтрофилов и антиоксидантной активности плазмы крови у женщин с угрозой прерывания.
-
Доказана эффективность определения доли окисленного альбумина в качестве параметра, характеризующего транспортную функцию альбумина и маркера системного окислительного стресса у беременных женщин.
-
Полученные данные подтвердили необходимость персонифицированного подхода к выбору антиоксидантной терапии во время угрозы прерывания и дозирования гормональных препаратов.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. У здоровых беременных стимулированная радикал-продуцирующая функция
нейтрофилов повышена по сравнению с небеременными женщинами.
2. При неразвивающейся беременности нейтрофильное звено иммунитета
характеризуется сниженной базальной и стимулированной радикал-продуцирующей активностью.
3. Непосредственно сразу после выкидыша базальная и стимулированная активность
нейтрофилов повышена по сравнению со здоровыми беременными. У беременных с угрозой прерывания отмечалась повышенная стимулированная активность по отношению к здоровым беременным.
4. При нормальной беременности и беременности с угрозой прерывания не
развивается системного окислительного стресса, затрагивающего белковое звено.
5. В группах здоровых женщин, здоровых беременных женщин и с угрозой
прерывания антиоксидантная емкость плазмы различается незначимо; при выкидыше этот показатель снижается, а при неразвивающейся беременности повышается.
Степень достоверности и апробация результатов
Научные положения, описанные данные, выводы и рекомендации, сформулированные в работе базируются на исследовании 125 пациентов с их письменного согласия. Дизайн исследования включал клиническую оценку пациентов, а также современные методы исследования. Полученные данные были статистически обработаны при помощи пакета программ для статистической обработки данных GraphPad Prisma 6.0.с использованием параметрических и непараметрических методов оценки результатов. Основные результаты исследования доложены и обсуждены на совместной научно-практической конференции коллектива сотрудников кафедры патологии человека лечебного факультета и кафедры акушерства и гинекологии №1 лечебного факультета ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова МЗ РФ 25 сентября 2017г. Результаты диссертационного исследования доложены в устных докладах и материалах следующих международных конференций и конгрессов: Российская научно-практическая
конференция с международным участием: «Снегиревские чтения-2016». День молодых исследователей. Москва. XXVII Ежегодная международная конференция РАРЧ «Репродуктивные технологии сегодня и завтра» Санкт-Петербург 2017г. ХXX Юбилейный международный конгресс c курсом эндоскопии «Новые технологии в диагностике и лечении гинекологических заболеваний» Москва 2017.
Личный вклад автора
Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, анализе и обобщении полученных результатов. Автор подготовил обзор данных отечественных и зарубежных источников литературы по теме исследования, сформулированы цель и задачи диссертационной работы. Автором составлена компьютерная база данных 125 беременных, проведена аналитическая и статистическая обработки, даны научное обоснование и обобщение полученных результатов, сформулированы выводы и даны практические рекомендации. Автор самостоятельно проводила лабораторные исследования функциональной активности нейтрофилов; антиоксидантной емкости плазмы, определение доли окисленного альбумина. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач, их практической и клинико-лабораторной реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и докладах и их внедрения в практику.
Внедрение результатов диссертации в практику
Полученные результаты используются в педагогическом процессе, в лекциях и практических занятиях по подготовке ординаторов и слушателей на кафедрах акушерства и гинекологии №1 и патологии человека лечебного факультета ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова МЗ РФ.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности
Научные положения диссертации соответствуют: паспорту специальности 14.03.03 – патологическая физиология. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно – пунктам 1,2 и 9, паспорту специальности.14.01.01 – акушерство и гинекология. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 1 и 4 паспорта специальности.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 7 работ, из них 3 в научных рецензируемых изданиях, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования РФ для публикаций основных результатов диссертаций на соискание ученой степени кандидата медицинских наук.
Объем и структура диссертации
Этиология привычного невынашивания беременности
На сегодняшний день невынашивание беременности является серьезной социальной проблемой, оказывающей влияние на демографическую ситуацию в стране. Вследствие этого одним из приоритетных направлений в современном акушерстве является разработка оптимальной тактики ведения и лечение данной категории пациенток, а также ясное понимание основных патогенетических процессов при неразвивающейся беременности [14].
Привычное невынашивание — полиэтиологичное осложнение беременности, в основе которого лежат нарушения функции репродуктивной системы. Согласно ВОЗ диагноз привычного невынашивания устанавливается после трех или более случаев самопроизвольного выкидыша и наблюдается у 1% всех супружеских пар [15]. Однако в настоящее время в мировой литературе под привычным выкидышем подразумевают две и более потери беременности [8] Частота привычного невынашивания в популяции составляет 2-5% от числа всех беременностей. В структуре невынашивания частота привычного выкидыша составляет от 5 до 20% [16].
К наиболее частым причинам ПНБ относят эндокринные, генетические, иммунологические, гемастазиологические нарушения репродуктивной системы, бактериальные и вирусные инфекции [15]. Зачастую, ПНБ вызывается стразу несколькими этиологическими факторами, одни из которых могут быть предрасполагающими, другие разрешающими. В свою очередь к прерыванию беременности приводят те факторы, которые вызывают изменения и гибель плодного яйца, а также нарушают связь плодного яйца с материнским организмом [7]
Большую роль в развитии самопроизвольных выкидышей у женщин играют социально-биологические факторы, особое место при которых занимает хронический стресс, вредные привычки, низкий уровень жизни, а также изменившееся репродуктивное поведение в современном обществе [17-19]. Рядом авторов установлено, риск потери плода у женщин резко увеличивается после 35 лет, возрастая с 9% в 20-24 года до 75% после 45 лет, а также у мужчин после 40 [20, 21]. Slama R. и соавт. (2005) предполагают, что повышенный риск спонтанных абортов, связанный с мужским возрастом, является следствием увеличения частоты хромосомных аномалий в сперматозоидах, что способствует увеличению хромосомных нарушений у плода [22].
По данным В.Н. Серова частота невыясненных причин невынашивания составляет 41,2% [23]. На сегодняшний день большинство авторов придерживаются мнения о значительной роли генетических, тромбофилических и иммунных факторов в большинстве необъяснимых случаев ПНБ [24-29].
Хромосомные аномалии
Многочисленными исследованиями установлена высокая частота хромосомных нарушений у плода при самопроизвольных абортах [30]. По данным Boue J. и соавт. (1975) при генетическом исследовании в 50—65% абортусов выявлены хромосомные аномалии [31]. У женщин с привычным невынашиванием значительные структурные аномалии кариотипа встречаются в 10 раз чаще, чем в популяции и составляют 2,4% [32-34].
Тромбофилии
Известно, что у 30-50% женщин с ПНБ имеются различные нарушения системы гемостаза. К основным тромбофилическим нарушениям, осложняющим беременность и приводящим к потере беременности на любом ее этапе, относятся наследственные и приобретенные тромбофилии. К наследственным тромбофилиям относят: дефицит антитромбина, протеина С и S, гепарин-кофактора II, дефицит фактора XII, дис- и гипоплазминогенемия, дисфибриногенемия, дефицит тканевого активатора плазминогена, лейденовская мутация гена V фактора свертывания крови. К наиболее распространённой приобретенной форме тромбофилии относится антифосфолипидный синдром (АФС), частота встречаемости которого среди пациенток с ПНБ составляет 27-42% [35]. Согласно данным литературы, без лечения гибель эмбриона/плода наблюдается у 90-95% женщин, имеющих антифосфолипидные антитела. Патогенез АФС состоит в выработке материнским организмом антител у фосфолипидам клеточных мембран. В результате возникает дисбаланс в противосвёртывающей системе крови с развитием тромбозов, нарушением процессов имплантации и инфарктом плаценты [36-38].
Антифосфолипидные антитела (АФА) нарушают процессы ранней инвазии трофобласта. Они непосредственно влияют на инвазивные свойства трофобласта, нарушают его клеточную дифференцировку и созревание, снижают секрецию ХГЧ [39]. Под влиянием антител нарушается выделение клетками трофобласта интегринов и катехинов, необходимых для межклеточных взаимодействий и инвазии. Тромбоз, является основной причиной потерь беременности и задержки роста плода. АФА нарушают баланс системы гемостаза, влияя на различные его ступени: активируя коагуляцию и тромбоцитарное звено, блокируя фибринолиз и антикоагулянтную систему и вызывая эндотелиальную дисфункцию. По данным различных авторов, применение низких доз ацетилсалициловой кислоты, и низкомолекулярных гепаринов позволят уменьшить число репродуктивных потерь [40-42]
Эндокринные факторы
Среди эндокринных факторов, приводящих к потере беременности, к наиболее значимым относятся гипофункция яичников, проявляющаяся недостаточностью лютеиновой фазы (НЛФ), гиперандрогения (ГА) различного генеза, гиперпролактинемия, а также гипофункция щитовидной железы [43, 44].
Известно, что для сохранения и успешного развития беременности необходим достаточный уровень прогестерона. Дефицит прогестерона ведет к неполноценной секреторной трансформации эндометрия, в результате чего будет неполноценная имплантация и в итоге — прерывание беременности.
Прогестерон играет важную роль в развитии беременности, в частности, опосредованно через Т-лимфоциты, он ингибирует реакцию отторжения плода [45-47]. При обследовании пациенток с привычным невынашиванием, у 85% из них находят недостаточность лютеиновой фазы [5]. Развитие недостаточности лютеиновой фазы (НЛФ), предполагает несколько путей или факторов, вовлекаемых в патологический процесс — снижение гонадотропин-релизинг гормона, снижение фолликул-стимулирующего гормона, неадекватный уровень лютеинизирующего гормона, неадекватный стероидогенез или нарушения рецепторного аппарата эндометрия [48]. Однако в настоящее время большинство исследователей придерживаются мнения, о том, что недостаточность желтого тела не играет большой роли в прерывании беременности. По всей видимости, механизм прерывания беременности связан не с пониженным уровнем прогестерона, а с нарушениями в рецепторном звене эндометрия, вследствие частых абортов, хронического эндометрита, пороков развития матки, инфантилизма и внутриматочных синехий [49, 50]. Имеются сведения о том, что нарушения в рецепторном звене могут быть результатом нарушенной экспрессии гена рецепторов прогестерона [51]. Согласно представлениям Bick R.L. и соавт., (1998) снижение уровня гормонов при беременности обусловлено тем, что неадекватное плодное яйцо не стимулирует мать к должной продукции гормонов [52]. Формирование неполноценного плодного яйца может быть обусловлено гиперсекрецией ЛГ и гипосекрецией ФСГ в I фазу цикла.
Гипоэстрогения на этапе селекции доминантного фолликула приводит к снижению овуляторного пика ЛГ и снижению уровня эстрадиола, замедлению темпов развития преовуляторного фолликула, преждевременной индукции мейоза, внутрифолликулярному перезреванию и дегенерации ооцита. Снижение продукции эстрадиола ведет к неполноценной продукции прогестерона и отсутствию должной секреторной трансформации эндометрия. В этих условиях стимуляция фолликулогенеза даст лучший эффект, чем постовуляторное назначение прогестерона [23].
Гиперандрогения — патологическое состояние, обусловленное изменением секреции и метаболизма андрогенов, частота данной патологии составляет около 20-30%. Выделяют гиперандрогению надпочечникового, яичникового генеза (синдром поликистозных яичников), а также смешанные формы, частота которых составляет 57-58 %. Характерными гормональными критериями являются выраженное повышение уровня ДЭА (дегидроэпиандростерон) в крови и умеренная транзиторная гиперпролактинемия [53] .
Состояние оксидантной и антиоксидантной систем во время беременности
Беременность – это состояние, при котором происходит метаболическая перестройка в организме матери, необходимая для правильного развития и роста плода. Плацентарные нарушения на ранних сроках гестации лежат в основе развития таких осложнений как самопроизвольное прерывание беременности, гестоз, неразвивающаяся беременность и синдром задержки роста плода [133]. Установлено, что нарушение баланса про- и антиоксидантой систем приводят к развитию окислительного стресса в тканях фето-плацентарного комплекса. При физиологической беременности развитие эмбриона на ранних сроках должно проходить в среде с низким содержанием кислорода. Локальная гипоксия защищает развивающийся плод от негативных и тератогенных воздействий свободных радикалов, кислородно-опосредованного повреждения синцитиотрофобласта и повышения апоптоза, а также способствует поддержанию стволовых клеток в плюрипотентном состоянии [134, 135]. При выкидыше первичные нарушения связанны с плацентарной дегенерацией, заключающейся в фрагментированном и тонком трофобласте, неполноценной инвазии синцитиотрофобласта в эндометрий, неполной закупоркой спиральных артерий и преждевременным проникновением материнской крови в межворсинчатое пространство. В норме состояние окислительного стресса возникает к концу первого триметра, к 10 неделе гестации, в период формирования артериальной циркуляции связанной с притоком материнской крови через регрессирующие ворсины хориона и увеличения напряжения кислорода в плаценте. В течение долгого времени считалось, что присоединение материнского кровотока происходит непосредственно в момент имплантации [136]. Однако ряд исследователей на основе анатомических и ультразвуковых исследований, утверждали, что значительного притока материнской крови не происходит до 12 недель беременности [137]. Eric Jauniaux et al., исследовали изменения в напряжении кислорода в плаценте в конце 1 триместра. С помощью многопараметрического зонда было установлено, что напряжение кислорода резко возрастает от 20 мм рт.ст. на 8-й недели беременности до 50 мм рт.ст. в течение 12 недели. Этот рост совпадает с морфологическими изменениями в маточных артериях, которые способствуют свободному потоку материнской крови в плаценту. Этот процесс связан с увеличением концентрации мРНК и активности антиоксидантных ферментов: каталазы, глутатионпероксидазы, а также марганца и меди, цинка, супероксиддисмутазы в пределах плацентарной ткани. Вызванный в результате этого окислительный стресс выполняет в этой ситуации важные физиологические функции, участвуя в запуске механизмов дифференцировки клеток с одной стороны, а с другой может приводить к повреждению ворсинчатого дерева и прерыванию беременности [138]. Во втором триместре после формирования полноценной плаценты и притока материнской крови в межворсинчатое пространство напряжение кислорода возрастает в 3 раза и тем самым увеличивает плацентарный окислительный стресс. Этот процесс физиологичен и необходим для адекватного роста плода, однако данное состояние при дефиците антиоксидантной системы, изменяет плацентарное ремоделирование, приводит к эндотелиальной дисфункции, ослаблению метаболической и детоксицирующей функций плаценты и, в конечном счете, приводит к нарушению роста и развития плода [139].
В настоящее время внимание клиницистов сосредоточено на изучении оксидантного статуса беременных женщин и роли АФК в патогенезе различных осложнений беременности [140, 141]. Так, имеются сведения об участии АФК в преждевременном разрыве околоплодных оболочек [142], в развитии гестоза [143].
В связи с тем, что все обменные процессы между матерью и плодом осуществляются через плаценту, трофобластический и эндотелиальный компоненты которых включают в себя фосфолипидные мембраны, исследование свободнорадикального окисления в повреждении мембран при беременности и ее патологии является актуальным.
В современной литературе рядом ученых активно обсуждается участие свободнорадикальных процессов при невынашивании беременности [100]. Известно, что во время беременности происходит изменения в метаболизме белков, жиров и углеводов, направленные на обеспечение жизнедеятельности материнского организма и развитие плода [144, 145]. При этом отмечается увеличение процессов ПОЛ, обусловленное повышением концентрации полиненасыщенных жирных кислот, а также усилением тканевого дыхания и увеличением количества поглощаемого кислорода [146]. В норме избыточное количество ПОЛ инактивируется антиоксидантами. По данным Vural et al. (2000) у женщин с ПНБ было значительное снижение уровня аскорбиновой кислоты и -токоферола в плазме крови, что свидетельствует о пониженном антиоксидантном статусе [147].
По данным Маматиевой М.А, у женщин с привычным невынашиванием беременности отмечалось значительное повышение продукции супероксидного анион-радикала и снижение супероксиддисмутазы в сыворотке крови, что свидетельствует о развитии окислительного стресса в организме матери [148]. Нazem k. Ghneim был установлен сниженный уровень образования СОД и экспрессии гена hsSOD1 и повышение супероксидного анион-радикала у женщин с привычной потерей плода, а также сниженный уровень цинка, меди и селена [149].
Имеются сведения об участии оксидативного стресса в развитии гестозов. При гестозах повреждающим фактором липидного слоя клеточных мембран является активация ПОЛ, TNF-, ИЛ-6, фосфолипазы А2, тканевой гипоксии, на фоне угнетения антиоксидантной активности [150, 151]. Из данных Лебеденко В.С. известно, что при патологическом течении беременности, осложненной гестозом, происходит существенное и некомпенсированное увеличение уровня продуктов, ПОЛ и свободных жирных кислот, а также снижение активности глутатионредуктазы в плазме крови и эритроцитов [152]. Рядом авторов выявлено значимое повышение общей оксидантной и снижение антиоксидантной активности в плазме беременных с прекэклампсией по сравнению с физиологической беременностью [150, 153].
Оксидативный стресс может оказывать деструктивное воздействие на клеточные структуры плаценты. По результатам исследования проведенного Кузьминых Т.У, Абрамченко В.В. при изучении тканей последа было установлено, что при осложненном течении беременности (угроза прерывания, гестоз, урогенитальная инфекция) имеются выраженные морфологические изменения в тканях последа, заключающиеся в повреждении биомембран и изменении иммунного гомеостаза. При преждевременном прерывании беременности отмечено усиление интенсивности процессов свободнорадикальных процессов, связанное с отложением патогенных иммунных комплексов в тканях последа. По данным Прокопенко В.М. спонтанное преждевременное прерывание беременности происходит в условиях развития окислительного стресса в митохондриях и постмитохондриальной фракции периферийного участка плаценты, где на фоне повышения уровня интенсивности процессов пероксидации наблюдается недостаточное увеличение общей емкости антиоксидантной защиты и ослабление вне зависимости от локализации ее глутатионзависимого звена [154].
В литературе имеются многочисленные данные относительно антиоксидантного статуса и эффективности применения различных антиоксидантов при осложненной беременности. Так, по данным Zachara BA, Wasowicz W у женщин с привычным невынашиванием беременности имелось значительное снижение концентрации селена и активности глутатионпероксидазы в эритроцитах и плазме крови по сравнению с небеременными женщинами [155]. Рядом исследователей [156, 157] установлено, что у женщин с ПНБ имелось снижение в сыворотке крови таких антиоксидантов как витамин А и Е, -каротин, билирубин. Кроме того, у женщин был отмечен повышенный уровень ПОЛ и глутатиона.
Акушерская патология сопровождается изменением баланса между процессами свободнорадикального окисления и антиоксидантной активностью, проявляющимся увеличением интенсивности пероксидации на фоне снижения уровня антиоксидантов в системе мать-плацента-плод [99].
В связи с вышеизложенным, рассмотрение вопросов, связанных с ролью свободнорадикальных процессов при невынашивании беременности, а также определение места антиоксидантной терапии в лечении данной патологии представляет научный и практический интерес.
Оценка функциональной активности нейтрофильного звена лейкоцитов методом хемилюминесценции с двойной последовательной стимуляцией
Хемилюминесценцию успешно применяется при изучении иммунных нарушений, нарушений метаболизма, дисфункции эндотелия, ишемии/реперфузии миокарда и мозга, онкологических и воспалительных заболеваний, а также многих других болезней, патогенез которых связан с оксидативным стрессом [161].
Новый метод ХЛ оценки функциональной активности нейтрофилов, основанный на последовательной стимуляции в образце цельной крови двумя стимулами, позволяет оценить максимальный радикал-продуцирующий потенциал нейтрофилов. Стимулы ФМА и ФМЛФ имеют разный механизм действия. ФМА (внутриклеточный механизм) проникает в клетку путем пассивной диффузии и активирует протеинкиназу С. ФМЛФ характеризуется внеклеточным рецепторным механизмом, причем стимуляция фМЛФ обусловлена последовательной сменой внеклеточного и внутриклеточного синтеза АФК. Взаимодействие фМЛФ со специфическими рецепторами приводит к немедленной выработке АФК во внеклеточную среду НАДФ-Н оксидазными комплексами, находящимися на плазматической мембране. Активация рецепторов фМЛФ стимулирует растянутый во времени процесс фагоцитоза и образование фагосом, в которых также происходит синтез АФК [158].
Основным источником АФК в крови являются фагоциты. Генерация осуществляется с помощью ферментного комплекса НАДФН-оксидазы. Изоформа NOX2, первая изученная НАДФН-оксидаза, представляет собой многокомпонентный ферментативный комплекс, направленный на перенос электрона на молекулу кислорода. Этот комплекс встроен в липидный бислой мембраны и может находится как на плазмалемме, так и на мембранах секреторных вакуолей, гранул, содержащих желатиназу, или специфических гранул нейтрофилов. Весь ферментативный комплекс состоит из нескольких субъединиц. В покоящейся клетке эти субъединицы разобщены и распределены между плазматической мембраной и цитозолем. Во время активации клетки каким-либо стимулом запускается каскад внутриклеточных посредников, сопровождающийся стремительным входом ионов кальция в клетку, активацией протеинкиназы С, фосфолипазы А2, что приводит к фосфорилированию белков p47-phox и p67-phox и сборке мембранного комплекса НАДФН оксидазы и активный синтез супероксидного радикала [162].
В эксперименте активацию клетки вызывают воздействием различных стимулов, которые подразделяют на корпускулярные (частицы латекса, опсонизированный и неопсонизированный зимозан, бактерии и их компоненты, активированный уголь) и растворимые агенты (фМЛФ, аллергены, пирогенал). Указанные индукторы воздействуют через рецепторный аппарат фагоцита. Безрецепторная активация клеток достигается после воздействия кальциевого ионофора А 23187 или активатором ПкС ФМА, который проникает в клетку за счёт пассивной диффузии [163].
Данные были проверены на нормальность распределения по критерию Шапиро–Уилка. Распределение данных не является нормальным, поэтому дальнейшие оценки проводили по непараметрическим критериям (р 0.005).
Оценка удельной активности нейтрофила
При определении удельной спонтанной активности нейтрофила А сп в группе К3 значения были выше в 4,5 раза по отношению к НБ (p = 0, 007), по отношению к УПБ в 2,1 раз, по отношению к группе К1 в 2,4 раза, однако различия не достоверны. Удельная пиковая активность нейтрофила в ответ на стимул ФМА была также достоверно выше у К3 по сравнению с НБ в 8 раз (p = 0,001), в 4,7 раз к К1 (p = 0,0027) и в 3,7 раз по отношению к УПБ (p = 0,001). Удельная активность в ответ на стимул ФМЛФ статистически значимо выше в группе УПБ по отношению к НБ в 2,4 раза (p = 0,003), в 2,5 раз по отношению к К3 (p = 0,05), в 1,7 раз относительно К1 (p = 0,003). Суммарная удельная радикал-продуцирующая активность нейтрофила была достоверно выше в группе УПБ по отношению к НБ в 2 раза (р = 0,002), в 2,6 раз относительно К3 (р = 0,01) и в 1,8 раз относительно К1 (р = 0,004). Оценка удельной активности нейтрофила представлена в табл. 4
Таким образом, удельная спонтанная активность нейтрофилов, а также удельная пиковая активность в ответ на стимул ФМА достоверно выше в группе пациенток после самопроизвольного выкидыша, что указывает на высокую генерацию АФК нейтрофилами в момент выкидыша. Удельная пиковая активность в ответ на стимул ФМЛФ и суммарная активность нейтрофила была выше в группе беременных с угрозой прерывания, что говорит о высокой радикалпродуцирующей способности нейтрофилов к генерации АФК на фоне угрозы прерывания (преимущественно за счет внутриклеточной продукции).
Оценка интегральной активности нейтрофила
Описание массива данных для интегральной спонтанной ХЛ для группы УПБ: Медиана для группы УПБ (0,21 V), межквартильный размах (0,09-0,6 V). Медиана для группы НБ (0,08 V), межквартильный размах (0,05-0,125 V). Медиана для К1 (0,16 V) (межквартильный размах (0,06-0,3V). Медиана для К2 (0,22 V) (межквартильный размах (0,15- 0,27V). Медиана для К3 (0,41 V) межквартильный размах (0,35-1,9V) (рис.7).
Интегральная спонтанная активность нейтрофила в группе УПБ выше в 2,6 раз по отношению к НБ. В группе К3 выше в 5,1 раз относительно группы НБ, в 1,86 раз выше чем К2, в 2,5 раз относительно К1 и в 1,9 раз выше УПБ. В группе К2 Acп в 2,7 раз выше чем в НБ.
Таким образом, пациенты, беременность которых протекает на фоне угрозы прерывания, а также пациенты после самопроизвольного аборта характеризуются высокой спонтанной активностью нейтрофилов, при этом у пациентов с неразвивающейся беременностью, напротив, отмечалась сниженная активность, указывающая на иммунносупрессию.
При сравнительном анализе параметра AФМА статистически значимые различия были выше в группах К3 по отношению к НБ в 10 раз, по отношению к К2 в 9,6 раз, к К1 в 7,7 раз, к УПБ в 4,8 раз (p 0,03), значения в УПБ выше НБ в 2 раза, К2 в 1,9 раз (p 0,02). Медиана для группы УПБ (1,2 V), межквартильный размах (0,57-6,7 V). Медиана для группы НБ (0,6 V), межквартильный размах (0,2-1,4 V). Медиана для К1 (0,7 V) (межквартильный размах (0,4-29 V). Медиана для К2 (0,62 V) (межквартильный размах (0,28- 4,1V). Медиана для К3 (6 V) (межквартильный размах (4-43,1V) (рис 8).
Оценка антиоксидантной активности плазмы крови методом кинетической хемилюминесценции
В настоящий момент проблеме иммунологических взаимоотношений в системе мать-плод уделяется особое внимание. Известно, что выживаемость семиаллогенного плода напрямую связана с угнетением иммунного ответа и перераспределением субпопуляции лимфоцитов в организме матери [1]. При физиологическом течении беременности отмечено доминирование Th 2 тип иммунного ответа, отвечающего за преимущественно гуморальные реакции, гемопоэз, ангиогенез. Сдвиг ответа в сторону Th1 приводит к активации антиген-специфических цитотоксических Т лимфоцитов, активизации макрофагов, натуральных киллеров и провоспалительных цитокинов (интерферон, ИЛ 1,ИЛ 2, TNF) [89].[63] Источником цитокинов в организме беременной женщины являются активизированные NK клетки, присутствующие в 80% в децидуальной оболочке матки, а также клетки фето-плацентарного комплекса. [16]В литературе описано протективное влияние прогестерона на развитие беременности как мощного иммуносупрессора путем опосредованного воздействия через систему цитокинов [89]. В момент взаимодействия прогестерона с рецепторами Т-клетки СД8+ продуцируют прогестерон-индуцированный блокирующий фактор (ПИБФ), который воздействуя на иммунокомпетентные клетки, направляет иммунный ответ матери в сторону менее активных NK клеток, несущих маркеры СD56+, CD16-. При наличии этих клеток иммунный ответ матери будет через Th-2типа. При низком содержании прогестерона или поражении рецепторного аппарата – иммунный ответ матери на трофобласт сдвигается в сторону лимфокинактивных киллеров (LAK) с продукцией провоспалительных цитокинов. Провоспалительные цитокины ограничивают инвазию трофобласта, нарушая его нормальное формирование, вызывают активацию протромбиназы, что обуславливает тромбозы, инфаркты и его отслойку, что в конечном счете приводит к выкидышу [69, 164] В настоящее время уделяется большое внимание различным субпопуляциям натуральных киллеров, различающихся по плотности экспрессии CD56 и CD16. [64]] Существуют два подмножества CD56 NK-клеток: высокоцитотоксичные клетки CD56dim, которые составляют 90% NK-клеток в периферической крови, и менее цитотоксические, но эффективно продуцирующие цитокины CD56bright. Было проведено исследование восприимчивости данных групп клеток к воздействию активных форм кислорода в присутствии окислителей. Установлено, что подмножество CD56bright клеток NK, в отличие от клеток CD56dim, остается жизнеспособным и функционально неповрежденным после воздействия радикалов. CD56bright клетки отличались высокой способностью к нейтрализации окислителей и повышенной экспрессией антиокислительных тиолов на поверхности клеток. Это указывает на то, что клетки CD56bright NK снабжены эффективной антиоксидантной защитной системой
Проверку данных на нормальность распределения групп проводили по критерию Шапиро-Уилка. Распределение в группах для параметра S(АОА) не было нормальным, и последующий анализ проводили, используя непараметрический критерий Манна-Уитни.
У пациентов после самопроизвольного аборта отмечалось достоверное снижение АОА по сравнению с группой К2 (p = 0,004) и УПБ (p = 0,04). Это может свидетельствовать об истощении антиоксидантной емкости плазмы крови перед выкидышем, либо вследствие него (рис. 18). Напротив, более высокий уровень АОА отмечался у группы пациентов с неразвивающейся беременностью, а также у двух пациентов из группы УПБ с последующим замиранием плода.
В обследованной группе здоровых женщин (n = 22) определены границы референсного интервала, куда попали 95% показателей — границы нормы, которые составили от 195 до 405 усл.ед, медиана 320. Из сопоставления данных следует, что в группе здоровых беременных есть случаи, выходящие за пределы нормальных значений, как в меньшую, так и в большую сторону.
Описательная статистика АОА для групп представлена в таблице 9
На основании анализа ХЛ кривых можно предположить, что во время самопроизвольного аборта происходит снижение антиоксидантной емкости плазмы. Эти данные косвенно свидетельствуют о развитии окислительного стресса в момент выкидыша в тканях фето-плацентарной системы и резком спаде уровня прогестерона.
Повышение АОА в группе с неразвивающейся беременностью возможно связано с накоплением различных токсических веществ с антиоксидантными свойствами, являющихся продуктом лизиса погибшего эмбриона, а также с гормональной поддерживающей терапией препаратами прогестерона, обладающими иммуносупрессивными эффектами. У двух пациентов из группы УПБ с последующим замиранием плода отмечался более высокий уровень АОА, что может являться прогностическим фактором. Эти данные указывают на необходимость определения эндогенного уровня прогестерона и индивидуального подхода к подбору дозировки и длительности терапии.
Из сопоставления данных следует, что в группе здоровых беременных есть случаи, выходящие за пределы нормальных значений, как в меньшую, так и в большую сторону. Возможно, для женщин со сниженной АОА требуется терапия антиоксидантами. Повышенные значения могут свидетельствовать или о компенсации оксидативного стресса, или быть следствием несбалансированной гормональной терапии.