Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Патофизиологические аспекты бесплодного брака 9
1.2. Оксидативный стресс и бесплодие 13
1.3. Заключение 27
Глава 2. Материалы и методы 29
Глава 3. Результаты исследования 37
3.1. Патофизиологический анализ современных проблем репродуктоло-гии и эмбриологии на примере деятельности лаборатории экстракорпорального оплодотворения 37
3.2. Влияние сред, используемых при оплодотворении и культивировании эмбрионов, на процессы свободнорадикального окисления в модельной системе
3.2.1. Влияние сред на процессы СРО в модельной системе, генерирующей АФК 53
3.2.2. Влияние сред на процессы СРО в модельной системе, в которой инициировали реакции ПОЛ
3.3. Исследование уровня общей антиоксидантной активности в средах, применяемых при оплодотворении и культивировании эмбрионов. 62
3.4. Влияние сред после проведения оплодотворения и культивирования эмбрионов на процессы свободнорадикального окисления в модельной системе
3.4.1. Влияние сред на процессы СРО в модельной системе, генерирующей АФК 63
3.4.2. Влияние сред на процессы СРО в модельной системе, в которой инициировали реакции ПОЛ
3.5. Исследование уровня общей антиоксидантной активности и ТБК-активных продуктов в средах после проведения оплодотворения и дальнейшего культивирования эмбрионов 68
3.6. Связь свободнорадикального окисления с частотой оплодотворения, качеством дробления и выходом в бластоцисты 70
3.7. Сравнение эффективности стандартных программ вспомогательных репродуктивных технологий и с дополнительным использованием хеми-люминесцентных методов 76
3.8. Влияние фолликулярной жидкости на процессы свободнорадикаль-ного окисления в модельных системах, генерирующих активные формы кислорода, и в которых протекают реакции перекисного окисления ли-пидов 80
Глава 4. Обсуждение результатов 84
Выводы 99
Практические рекомендации 101
Список сокращений 102
Список литературы
- Оксидативный стресс и бесплодие
- Влияние сред, используемых при оплодотворении и культивировании эмбрионов, на процессы свободнорадикального окисления в модельной системе
- Влияние сред после проведения оплодотворения и культивирования эмбрионов на процессы свободнорадикального окисления в модельной системе
- Влияние фолликулярной жидкости на процессы свободнорадикаль-ного окисления в модельных системах, генерирующих активные формы кислорода, и в которых протекают реакции перекисного окисления ли-пидов
Оксидативный стресс и бесплодие
Проблема бесплодия изучается с различных сторон. Данное состояние вызывается целым рядом причин. Развитие этой патологии протекает по различным механизмам. Не последнее место отводится и метаболическим процессам Процессы метаболизма эмбрионов изучались рядом других авторов начиная с 1987 (Gardner D.K., Leese H.J.) и по сегодняшний день.
И одним из самых перспективных является раскрытие связи между бесплодием и СРО (Колесникова Л.И., Петрова В.А., 2008). Это связано с разработкой и внедрением новых методик исследования.
В биологическом материале СР (свободные ракадикалы) способны, как правило, образовываться в реакции одноэлектронного восстановления органических молекул, в первую очередь, ненасыщенных жирных кислот, которые есть в липидах. В итоге появляется супероксидный анион-радикал, анион-радикал гид-роксила, синглентная форма кислорода, перекись водорода и гипохлорит. Эти радикалы имеют общее название – активные формы кислорода (АФК) (Kelley K.A. et al., 2010). Из всех фагоцитов самым мощным потенциалом кислород 14 зависимой реактивности обладают зрелые нейтрофилы (Кратков А.Е. и др/, 2010). Есть и иной источник СР в организме – это цепные процессы свободнора-дикального перекисного окисления липидов. СРО – один из основополагающих процессов в биологии, который обеспечивает нормальную жизнедеятельность организма (Зенков Н.К., 2007; Draper N.N. et al., 2007). В организме в норме поддерживается постоянство СРО. Осуществляется это посредством установления равновесия между прооксидант-ными и антиоксидантными системами. К ним относят специализированные ферментативные (глутатионпероксидаза, глутатионтрансфераза, глутатионредуктаза, каталаза, супероксиддисмутаза) и неферментативные антиоксиданты (аскорбат, глутатион, трансферрин, билирубин, мочевая кислота и другие) (Bast A., 2011).
Одним из основных факторов старения, дегенеративных изменений и артериосклероза, которые играют ключевую роль практически при любой патологии, считается окислительное повреждение белков и нуклеиновых кислот (Lushchak V.I., 2007).
СР принимают участие в большинстве физиологических процессов. Они отличаются очень высокой химической активностью. Это обусловлено наличием одного или больше неспаренного электрона на внешней оболочке атома (Зен-ков Н.К., 2007).
В последние годы много делается для определения того, как влияют свободные радикалы на мужскую половую функцию (Aitken R.J., 2013; Ochsendorf F.R., 2008). Один из важных признаков и вероятных причин плохой функции сперматозоидов является – оксидативный стресс, созданный повышенной выработкой АФК и/или разрушением антиоксидантной системы защиты в мужском репродуктивном тракте (Николаева М.А., Ушакова И.В., 2010). Последствия этого оксидативного стресса выражаются в пониженных подвижности и оплодотворяющем потенциале гамет, а также повреждения ДНК в ядре сперматозоидов (Божедомов В.А., Громенко Д.С., 2009). Морфология сперматозоидов способствует тому, что они особенно чувствительны к окислительному стрессу. Есть работы, говорящие о том, что большое количество активных форм кислорода может повредить сперматозоиды и служит ранее неизвестной причиной бесплодия (Божедомов В.А., Торопцева М.В., 2011).
Повышенное количество АФК отрицательно влияет на оплодотворяющую способность сперматозоидов (Ушакова И.В., Спориш Е.А., 2012). В исследованиях Iwasaki A. (1992) показан повышенный уровень СР в эякулятах 40% бесплодных мужчин (Iwasaki A. et al., 1992). АФК в повышенном количестве могут вызывать нарушения в сперматозоидах путем индукции оксидативного повреждения липидов, протеинов и ДНК, что является одним из механизмов патогенеза мужского бесплодия (Griveau J.F. et al., 1997; Kemal Duru N. et al., 2000). Кислородные радикалы в сперме могут продуцироваться морфологически либо функционально аномальными сперматозоидами (Soufir J.C. et al., 2011; Teves M.E. et al., 2009). В свою очередь сами сперматозоиды чувствительны к действию АФК в связи с большим количеством полиненасыщенных жирных кислот и невозможностью репарации ДНК (Donnelly E.T. et al., 2000).
Образование АФК в сперме мужчин с олигозооспермией значительно выше, чем при нормозооспермии (Henkel R. et al., 2013). Наибольшее количество АФК генерируется незрелыми сперматозоидами с неполноценной структурой (Iwasaki A., 2013; Ollero M. et al., 2001). А у зрелых сперматозоидов активность продукции АФК наименьшая. Содержание кислородных радикалов в сперме значительно выше у мужчин с варикоцеле, идиопатическим бесплодием, простатитом (Teves M.E. et al., 2009).
В эякулятах со сниженной фрагментацией ДНК в сперматозоидах обнаруживают повышенную активность перекисного окисления липидов (ПОЛ) (Atig F., 2012). Обнаружена корреляция между количеством АФК в эякуляте и низкой подвижностью и аномальной структурой сперматозоидов (Tartibian B., 2012).
Нейтрофилы, которые есть в сперме, более важный источник АФК, чем сперматозоиды (Feng R.X. et al., 2011). Именно с действием АФК лейкоцитов связывают повреждение сперматозоидов при инкубации (Atig F., 2012). Причем после обработки спермы на центрифуге АФК значительно больше, чем без центрифугирования (Feng R.X. et al., 2011). Добавление к среде витамина Е, являю 16 щегося природным антиоксидантом, при обработке спермы снижает эффект повреждающего действия АФК на ДНК сперматозоидов (Hatamoto L.K., 2006).
У некоторых пациентов отмечают дефицит специфичных ферментов и ан-тиоксидантных веществ, содержащихся в семенной плазме (Cebral E. et al., 2007). И как раз благодаря наличию в семенной плазме и самих сперматозоидах этих веществ отсутствует ярко выраженный повреждающий эффект. Эта система включает в себя такие ферменты, как супероксиддисмутаза, каталаза, глутатион-пероксидаза, целый комплекс эндогенных антиоксидантов (альбумин, глутатион, пируват, витамины Е и С) (Hatamoto L.K., 2006).
Была рассмотрена роль предстательной железы в защите сперматозоидов от АФК (Attia A.M. et al., 2011). Предстательная железа вырабатывает простасо-мы – мембранные пузырьки 120–200 нм диаметром, присутствующие в сперме. Они способствуют увеличению подвижности эякулированных сперматозоидов. Простасомы играют исключительно важную роль в антиоксидантной активности семенной плазмы, снижая активность лейкоцитов (Burden H.P. et al., 2006). Защитные способности спермоплазмы имеют сильные индивидуальные колебания (Hassan A. et al., 2011).
Выявлена корреляция между продукцией АФК и антиоксидантной способностью спермоплазмы и сочетанием данных показателей с мужским бесплодием (Pahune P.P., 2013). В семенной плазме у мужчин с бесплодием содержание ан-тиоксидантов значительно меньше, чем у фертильных мужчин (Lewis S.E. et al., 2008). Ведется исследование роли эндогенного витамина Е, который вместе с антиоксидантными энзимами в семенной плазме способен сохранять функции сперматозоидов, подверженных воздействию АФК лейкоцитов (Hatamoto L.K., 2006). Но также существует мнение, что антиоксидантная активность никак не связана с фертильностью (Jozwik M. et al., 2007).
Влияние сред, используемых при оплодотворении и культивировании эмбрионов, на процессы свободнорадикального окисления в модельной системе
Всем пациенткам для выявления причин бесплодия проводили гинекологическое обследование, УЗИ органов малого таза и эндоскопическое исследование эндометрия (по показаниям).
При трансвагинальной пункции фолликулов из полученной фолликулярной жидкости забирали ооциткумулюсные комплексы для программ ВРТ, а оставшуюся часть жидкости исследовали различными методами. Проводили центрифугирование для осаждения клеточных элементов. В полученной жидкости изучали влияние на генерацию активных форм кислорода в модельных системах.
Культуральные среды для оплодотворения и культивирования эмбрионов на ранних этапах также оценивали этими методами. Среды для исследования забирали сразу после пересаживания из них эмбрионов и изучали.
Объектом исследования служил 351 образец сред (среды фирмы SAGE Fertilization medium, Cleavage medium, Blastocyst medium), применяемых при оплодотворении и культивировании эмбрионов, полученных у 117 женщин в программах ВРТ.
Среда Fertilization medium имеет следующий качественный состав: хлорид натрия, хлорид калия, сульфат магния, фосфат калия, лактат кальция, бикарбонат натрия, глюкоза, пируват натрия, аланил-глутамин, таурин, L-аспарагин, L-аспарагиновая кислота, глицин, L-пролин, L-серин, цитрат натрия, этилендиа-минтетрауксусная кислота, гентамицин, фенольный красный.
Среда Cleavage medium имеет следующий качественный состав: хлорид натрия, хлорид калия, сульфат магния, лактат кальция, бикарбонат натрия, глюкоза, пируват натрия, аланил-глутамин, таурин, L-аспарагин, L-аспарагиновая кислота, глицин, L-пролин, L-серин, цитрат натрия, этилендиаминтетрауксусная кислота, гентамицин, фенольный красный.
Среда Blastocyst medium имеет следующий качественный состав: хлорид натрия, хлорид калия, фосфат калия, сульфат магния, лактат кальция, бикарбонат натрия, глюкоза, пируват натрия, таурин, глутатион, аланил-глутамин, L 34 аспарагин, L-аспарагиновая кислота, глицин, L-пролин, L-серин, L-аргинин, L-цистин, L-гистидин, L-изолейцин, L-лейцин, L-лизин, L-метионин, L-фенилаланин, L-треонин, L-триптофан, L-тирозин, L-валин, D-пантотенат кальция, холина хлорид, фолиевая кислота, инозитол, никотинамид, пиридоксин, рибофлавин, тиамин, гентамицин, фенольный красный.
Количественный состав фирма хранит как коммерческую тайну.
Заморозку и разморозку эмбрионов производили витрификацией по методу Kuwayama M. Во время заморозки эмбрионы помещались при 27С на 5–15 мин в раствор для уравновешинвания (ES). После первоначального «сморщивания» эмбрионы восстанавливали свои первоначальные размеры, что является окончанием процесса уравновешивания, после этого их последовательно переносили в три 20 мкл капли витрификационного раствора (VS). Время экспозиции в каждой капле 20 секунд. Далее эмбрионы были помещены на специальные носители (cryotop и cryotec) и погружены в жидкий азот (Kuwayama M.).
При разморозке носитель перемещался из жидкого азота, погружалась в водяную баню 37С на 3 секунды. Следующие растворы имели температуру 27С. Далее смешивали 1 каплю раствора для размораживания (TS) с каплей с эмбрионами. После экспозиции в смешанной капле в течение 1 мин эмбрионы переносились во 2 каплю TS на 1 мин., затем последовательно переносились в две 20 мкл капли раствора для разбавления (DS). Время экспозиции в каждой капле 2 мин. Далее проводилось 3 последовательные промывки через три отдельных 20 мкл капли раствора для промывки (WS). Время экспозиции в каждой капле 3 мин. (Kuwayama M., 2005).После этого эмбрионы переносились в среду для культивирования бластоцист (Blastocyst medium).
Регистрацию ХЛ проводили на аппарате «Хемилюминомер – 003» с компьютерным обеспечением, изготовленным в Межвузовской лаборатории технических систем медико-биологических исследований. Это – портативный экспресс-анализатор ХЛ-свечения, возникающего при химических и биохимических реакциях, биологических процессах, сопровождающихся образованием свободных радикалов (Фархутдинов Р.Р., 2010). Перед измерением свечения исследуемый образец смешивали с 20 мл фосфатного буфера, содержащего люминол (5-амино-2,3-дигидро-1,4-фталазиндион) в конечной концентрации 10-5М, и помещали в светоизолированную камеру прибора. Тщательно перемешивали и вели запись ХЛ в течение 5 мин.
Об интенсивности ЛЗХЛ судили по ряду параметров, в первую очередь, по СС и максимальной амплитуде свечения, которые соответствовали скорости образования АФК. Полученные результаты обработаны на компьютере с помощью специального пакета программы статистики.
Для регистрации Fe2+ - индуцированной ХЛ 0,1 мл фолликулярной жидкости добавляли к модельной системе, генерирующей АФК. В качестве модельной системы использовали 20 мл фосфатного буфера (КН2Р04 - 20 mM, КС1 -105 тМ, рН доводили до 7,45 титрованием насыщенным раствором КОН) с цитратом (50 тМ) и люминолом (10-5 М). В течение 10 секунд записывали темно-вой ток, после чего вносили инициатор образования АФК - 1 мл 50 тМ раствора сернокислого железа (FeS04x7H20). Конечная концентрация FeS04 в среде инкубации составляла 2,5 тМ. Запись свечения проводили в течение 5 минут при постоянном перемешивании. При оценке Те2+-индуцированной ХЛ определяли величину спонтанного свечения (СпС), продолжительности латентного периода от момента введения ионов железа до начала развития медленной вспышки. Также оценивали амплитуды быстрой и медленной вспышек.
Определение суммарной антиокислительной активности фолликулярной жидкости для оценки женской фертильности включал в себя оценку железоин-дуцируемой хемилюминесценции модельной системы, генерирующей АФК до и после добавления фолликулярной жидкости.
По степени подавления свечения модельной системы определялась суммарная антиокислительная активность фолликулярной жидкости по формуле (1): SAOA= (SMCO}K-SMC)/SMCx 100%, (1) где SAOA - суммарная антиокислительная активность, %; SMC - светосумма модельной системы, генерирующей АФК, отн. ед.; 8МСФЖ - светосумма модельной системы + фолликулярной жидкости, отн. ед. Аналогичным образом проводили изучение сред для оплодотворения и культивирования эмбрионов на ранних этапах развития в модельных системах, генерирующих АФК. Общую антиоксидантную активность определяли с помощью набора «RANDOX». При взаимодействии реагентов набора образуется радикал катион, и происходит стабильное сине-зеленое окрашивание, которое измеряется при 600 нм. Исследуемые вещества в добавленном образце обусловливают подавление цветной реакции до такой степени, которая пропорциональна их концентрации. Общая антиоксидантная активность вычисляется на основе уровня изменений окрашивания.
Активность перекисного окисления липидов оценивали набором «Агат» по накоплению продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, основную массу которых составляет малоновый диальдегид. При высокой температуре в кислой среде последний реагирует с 2-тиобарбитуровой кислотой с образованием окрашенного триметинового комплекса с максимумом поглощения при длине волны 532 нм. По интенсивности поглощения определяли уровень малонового диальдегида в исследуемых образцах.
Статистическая обработка результатов проводилась в операционной среде Windows XP с использованием статистической программы "Statistica 6.0". Характер распределения количественных признаков оценивался по критерию Колмогорова-Смирнова. Если показатель имел нормальное распределение, то применялись методы параметрической статистики (средняя арифметическая и ее стандартная ошибка – критерий Стьюдента). Для показателей, не имеющих нормального распределения, вычислялась медиана. Достоверность различий количественных показателей оценивалась по критерию Манна-Уитни (Гареев, Е.М., 2009).
Влияние сред после проведения оплодотворения и культивирования эмбрионов на процессы свободнорадикального окисления в модельной системе
На следующем этапе оценивали влияние на эти же показатели сред Fertilization medium, Cleavage medium, Blastocyst medium после проведения в них оплодотворения и культивирования эмбрионов на уровень СРО в модельной системе.
Искусственное оплодотворение яйцеклеток проводили двумя способами: проводили экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО) и интрацитоплазматиче-скую инъекцию сперматозоида (ИКСИ).
В программах ЭКО и ИКСИ есть одно принципиальное различие: в день оплодотворения. При процедуре ЭКО обработанные сперматозоиды добавляют в специальную чашку, содержащую ооцит-кумулюсный комплекс и среду для оплодотворения.
При процедуре ИКСИ ооцит-кумулюсный комплекс подвергается денудации – ферментная очистка от клеток, окружающих яйцеклетку. А в дальнейшем производится инъекция сперматозоида в каждый ооцит. И после этого оплодотворенные клетки оставляют в чашке со средой Fertilization medium. . При этом в обоих случаях оплодотворение проводилось в одной и той же среде – Fertilization medium 10%. Показатели интенсивности ХЛ и другие полученные результаты приведены для обоих способов искусственного оплодотворения. После проведения оплодотворения в последующие дни культивирование эмбрионов проводили в одних и тех же средах независимо от способа искусственного оплодотворения.
Результаты исследования модельной системы, генерирующей АФК, при добавлении сред Fertilization medium 10%, Cleavage medium 10%, Blastocyst medium 10% после проведенных программ ЭКО (рисунок 23) и ИКСИ (рисунок 24).
Записи ХЛ модельной системы, генерирующей АФК, после проведения в средах Fertilization medium 10%, Cleavage medium 10%, Blastocyst medium 10% ЭКО и дальнейшего культивирования этих эмбрионов Из рисунков 23 и 24 видно, что исследуемые среды укорачивали латентный период ХЛ практически в 2 раза. Влияние культуральных сред Fertilization medium 10%, Cleavage medium 10%, Blastocyst medium 10% после проведения программ ЭКО на интенсивность ХЛ в модельной системе, генерирующей АФК, усилилась. Максимально это было в среде Fertilization medium 10%.
На рисунке 24 видно, что влияние этих же культуральных сред после проведения программ ИКСИ на интенсивность ХЛ в модельной системе, генерирующей АФК, несколько усилилась, но меньше, чем после проведения ЭКО.
Записи ХЛ модельной системы, генерирующей АФК, после проведения в средах Fertilization medium 10%, Cleavage medium 10%, Blastocyst medium 10% ИКСИ и дальнейшего культивирования этих эмбрионов На рисунке 25 представлено соотношение светосуммы ХЛ исследуемых сред до и после проведения оплодотворения и культивирования эмбрионов.
Из рисунка 25 следует, что после проведения оплодотворения способами ЭКО и ИКСИ светосумма ХЛ модельной системы, генерирующей АФК, при добавлении сред повышалась. Особенно это характерно для среды Fertilization me 66 dium 10%. В свою очередь в среде для оплодотворения были существенные различия после ЭКО и ИКСИ. После проведения ЭКО влияние сред на генерацию АФК в модельной системе была выше, чем после ИКСИ.
Результаты исследования модельной системы, в которой протекают реакции ПОЛ, при добавлении сред Fertilization medium 10%, Cleavage medium 10%, Blastocyst medium 10% после проведенных программ ЭКО (рисунок 26) и ИКСИ (рисунок 27).
Записи ХЛ модельной системы, в которой протекают реакции ПОЛ, после проведения в средах Fertilization medium 10%, Cleavage medium 10%, Blastocyst medium 10% ИКСИ и дальнейшего культивирования этих эмбрионов (100% – светосумма модельной системы) Влияние сред после проведения оплодотворения и культивирования на интенсивность ХЛ в модельной системе, в которой протекают реакции ПОЛ, осталось практически неизменным.
Были изучены уровни ОАА и ТБК-активных продуктов в культуральных средах Fertilization medium, Cleavage medium, Blastocyst medium после проведения программ ЭКО и ИКСИ. Результаты исследований сред до и после проведения оплодотворения и культивирования эмбрионов приведены на рисунках 28 и 29.
Уровень ОАА в средах Fertilization medium, Cleavage medium, Blastocyst medium после проведения программ ЭКО и ИКСИ (ммоль/л) Статистически достоверные различия (p 0,05) отмечены .
Из рисунка 28 видно, что после проведения программы ЭКО в средах Fertilization medium, Cleavage medium, Blastocyst medium для оплодотворения и культивирования эмбрионов уровень ОАА стал ниже по сравнению с исходным уровнем. Это может свидетельствовать об усилении процессов СРО в средах после оплодотворения и развития эмбриона. После проведения программы ИКСИ уровень ОАА практически не изменился.
Уровень ТБК-активных продуктов в средах Fertilization medium, Cleavage medium, Blastocyst medium после проведения программ ЭКО и ИКСИ (% от контроля) Статистически достоверные различия (p 0,05) отмечены . Из рисунка 29 видно, что после проведения программ ЭКО и ИКСИ в средах Fertilization medium, Cleavage medium, Blastocyst medium уровень ТБК-активных продуктов стал выше по сравнению с исходным уровнем. Причем в ЭКО это увеличение было больше, чем в ИКСИ. Это может свидетельствовать о том, что в средах после оплодотворения и развития эмбриона содержание пере-кисных радикалов стало больше.
Влияние фолликулярной жидкости на процессы свободнорадикаль-ного окисления в модельных системах, генерирующих активные формы кислорода, и в которых протекают реакции перекисного окисления ли-пидов
Каждый месяц в яичнике начинает расти и развиваться пул ооцитов, но до мейоза 1 доходит только один доминантный ооцит. Этот процесс усиливается АФК и ингибируется антиоксидантами. Напротив прогресс до мейоза 2 определяется антиоксидантами (Behrman H.R., Kodaman P.H., 2001). Это говорит о наличии комплекса взаимоотношений между АФК и антиоксидантами в яичнике. АФК образуются преовуляторными фолликулами и являются важными индукторами овуляции (Ruder E.H., Hartman T.J., 2009). АФК, образующиеся в фолликулах, способны вызывать апопотоз, в то время как глутатион и фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) препятствуют этому. В ответ на образование ФСГ увеличивается уровень эстрогена, что способствует образованию каталазы в доминантном фолликуле, и, таким образом, создается препятствие апоптозу (Shkolnik K., Tadmor A., 2011).
Оксидативный стресс считается очень важным фактором, влияющим на исход программ ЭКО и ИКСИ. Метаболизм ооцита и недостаток антиоксидантов совместно с фолликулярной жидкостью способны повышать уровень АФК (Oyawoye O. et al., 2003). Фолликулярная жидкость состоит из транспортируемых из плазмы для фолликулов компонентов и секретов гранулезы и клеток теки (Revelli A. et al., 2009). Ооцит развивается внутри ФЖ, и это очень сильно влияет на качество клетки и ее взаимодействие со сперматозоидом. Таким образом, это может повлиять и на эмбриональное развитие и имплантацию (Jana S.K. K.N.B. et al., 2010).
В условиях пробирки гаметы и эмбрионы подвергаются избыточному влиянию АФК, и отсутствует ферментная антиоксидантная защита, которые в норме есть при естественном оплодотворении. Считается, что свободные радикалы влияют на исходы программ ЭКО и ИКСИ через влияние на ооциты, сперматозоиды и эмбрионы (Gupta S., et al., 2010).
ОС нарушает в человеческом ооците гомеостаз внутриклеточного Ca++, это способно оказать влияние на созревание и оплодотворение ооцита, что согласно схеме может нарушить активацию NADPH-оксидазы и в целом баланс про- и антиоксидантной систем. При овуляции продуцируются АФК внутри фолликула, но избыток АФК может увеличить риск к формированию ооцита плохого качества (Martin-Romero F.J., et al., 2008).
Добавление ФЖ укорачивало латентный период свечения и незначительно уменьшало максимальную амплитуду медленной вспышки в модельной системе, генерирующей АФК. Фолликулярная жидкость понижала интенсивность светосуммы, максимальной светимости и вспышки ХЛ в модельной системе, генерирующей АФК. Особенно это было выражено при добавлении ФЖ доноров ооцитов. Изучение фолликулярной жидкости является перспективным, так как она с одной стороны – естественная среда для ооцитов, а с другой – ее легко можно получить в необходимом количестве (Грищенко Е.И., 1999). Развитие эмбриона начинается с запасов ооцита, накопленных за годы, предшествующие и соответствующие его росту.
АФК, продуцируемые сперматозоидами и клетками ооцит-кумулюсного комплекса, необходимы для нормального оплодотворения и развития эмбриона. Недостаток АФК может способствовать тому, что оплодотворение может не наступить или эмбрионы будут развиваться хуже.
Процессы СРО играют важную роль при оплодотворении и культивировании эмбрионов. С одной стороны при физиологическом оплодотворении усиливается образование АФК и развитии эмбриона на ранних этапах, с другой – с содержанием АФК связано качество развивающихся эмбрионов.
В связи с этим ретроспективно сравнили эффективность программ ВРТ у женщин со стандартным морфологическим отбором эмбрионов и женщин с отбором эмбрионов как по морфологическим показателям, так и по показателям СРО.
Полученные результаты позволяют считать, что частота наступления беременности в группе с оценкой качества переносимых эмбрионов по СРО была достоверно выше, чем в группе с отбором эмбрионов по стандартной методике.
Полученные результаты свидетельствуют о значении процессов СРО в средах, применяемых при оплодотворении и культивировании эмбрионов, и в фолликулярной жидкости и возможности использования дополнительных методов, основанных на изучении процессов СРО в модельной системе, генерирующей АФК, при добавлении сред Fertilization medium 10%, Cleavage medium 10%, Blastocyst medium 10%, фолликулярной жидкости (рисунок 44).
На рисунке 44 схематично представлено влияние сред, применяемых при оплодотворении и культивировании эмбрионов, на процессы СРО. Все среды, применяемые при оплодотворении и культивировании эмбрионов, усиливали генерацию АФК, что, по всей видимости, способствовало улучшению качества эмбрионов (повышалась частота оплодотворения, улучшалось качество дробления и выхода в бластоцисты). И в целом это выражалось в повышении им-плантационных возможностей эмбрионов и увеличении частоты наступления беременности.
Подводя итоги проведенного исследования, можно сделать следующее заключение. Анализ современных проблем репродуктологии и эмбриологии выявил необходимость поиска дополнительных способов оценки качества эмбрионов, и с этой целью были опробированы и внедрены методы исследования СРО – ХЛ, ТБК-активных продуктов и ОАА.
Среды, применяемые при оплодотворении и культивировании эмбрионов, влияют на модельную систему, генерирующую АФК. Процессы инициирования СРО в модельной системе ускоряются в присутствии культуральных сред. Процессы свободнорадикального окисления имеют место в физиологических процессах оплодотворения и развития эмбриона.