Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Клозапин и патогенетические мезанизмы его токсических эффектов при острых отравлениях (обзор литературы) 14
1.1. Общая характеристика нейролептиков 14
1.2. Характеристика клозапина 16
1.2.1. Общая характеристика атипичных нейролептиков 16
1.2.2. История создания и внедрения клозапина в клиническую практику 16
1.2.3. Химическая структура, метаболизм клозапина 17
1.2.4. Фармакокинетические и фармакодинамические особенности клозапина 21
1.2.5. Побочные эффекты при применении клозапина 22
1.2.6. Взаимодействие клозапина с другими веществами 23
1.3. Острые отравления клозапином 25
1.3.1 Эпидемиология острых отравлений клозапином 25
1.3.2 Клинические симптомы острых отравлений клозапином и патогенетические механизмы, обусловливающие их появление 26
1.3.3. Морфологические изменения в органах при острых отравлениях клозапином 29
1.4. Химико-токсикологическое определение клозапина 31
1.4.1. Методы изолирования клозапина из биологического материала 31
1.4.2. Обнаружение клозапина методом ТСХ 33
1.4.3. Обнаружение клозапина методом УФ-спекторметрии 34
1.4.4. Обнаружение клозапина методом ИК-спекторметрии 35
1.4.5. Обнаружение клозапина с применением современных физико-химических методов 36
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 40
Глава 3. Гистоморфологические изменения в лёгких при отравлении клозапином 57
3.1 Качественный анализ патологических изменений в лёгких после отравления клозапином и его комбинацией с этанолом 57
3.2. Результаты морфометрического анализа ткани лёгких при отравлении клозапином и его комбинацией с этанолом 77
ГЛАВА 4. Результаты определения содерания клозапина и его метаболитов в сыворотке крови и гомогенате легких подопытных животных 84
ГЛАВА 5. О возможных механизмах развития патологических изменений в легких при воздей ствии клозапина и его комбинации с этанолом (обсуждение полученных результатов) 93
Заключение: 101
Практические рекомендации 102
Перспективы дальнейшей разработки темы 102
Список литературы 104
- Химическая структура, метаболизм клозапина
- Клинические симптомы острых отравлений клозапином и патогенетические механизмы, обусловливающие их появление
- Результаты морфометрического анализа ткани лёгких при отравлении клозапином и его комбинацией с этанолом
- О возможных механизмах развития патологических изменений в легких при воздей ствии клозапина и его комбинации с этанолом (обсуждение полученных результатов)
Химическая структура, метаболизм клозапина
Начало «эре нейролептиков» положил в 1950-1952 гг. синтез хлорпромазина (аминазина). Сам термин «нейролептики» (нейролептические средства) был предложен в 1967 г. Позже в ряде стран сочли уместным заменить данный термин на «антипсихотические препараты». Такое название точнее отражает основное действие препаратов этой группы [Лужников Е.А., 1992].
Нейролептики подразделяются на так называемые «типичные» и «атипичные» [Видаль, 2017; Машковский, М.Д., 2010].
Нейролептическая терапия больных шизофренией классическими («типичными») нейролептиками долгое время рассматривалась в качестве стандарта, так как её использование достоверно приводило к снижению продуктивной симптоматики у пациентов с шизофренией. Она была относительно доступной и дешевой [Asenjo Lobos C. et al., 2010].
Тем не менее, при лечении такими нейролептиками возникал ряд затруднений, связанных с резистентностью к терапии и наличием тяжёлых, нередко необратимых побочных явлений, например, поздней дискинезии у пациентов. По данным литературы, она встречается в 5-45 % случаев [Woggon B., 1978].
Атипичные нейролептики вошли в широкую медицинскую практику в последние десятилетия. Их появление значительно расширило возможности психиатров в лечении шизофрении и других психических нарушений. Первым препаратом этого класса стал клозапин (Лепонекс, Азалептин, Клазарил, Ипрокс, Лапенакс, Лепотекс). В 90-е годы XX в. в клинической практике появились и другие препараты этой группы.
Нейролептики влияют на организм многогранно. Они оказывают успокаивающее действие, снижают психомоторное возбуждение и аффективную напряженность, ослабляют чувства страха, агрессивности. Основной особенностью нейролептиков является их способность обеспечивать лечебный эффект при шизофрении и иных психических заболеваниях, включая опийную наркоманию [Essali A. et al., 2009; Видаль, 2017]. Некоторые нейролептики (алифатические производные фенотиазина, резерпин и др.) обладают седативным, некоторые (бутирофеноны и др.) -активирующим эффектом. Ряд нейролептиков (Рисперидон, Оланзапин, Флупентиксол, Сульпирид) обладает антидепрессивным действием, хотя часть из них (преимущественно с седативным компонентом) при длительном применении может вызывать специфические (заторможенные) депрессии. Такими особенностями определяется профиль действия каждого конкретного препарата и показания к его применению [Asenjo Lobos C. et al., 2010; Видаль, 2010].
Разные нейролептики оказывают различное влияние на образование, накопление, высвобождение и метаболизм нейромедиаторов, что, в значительной степени, обусловливает их фармакологические свойства и терапевтическую эффективность. Одним из основных механизмов терапевтического действия нейролептиков является их способность влиять на дофаминергические процессы, нарушение которых отмечается при различных психических заболеваниях. Влиянием на дофаминовые рецепторы обусловлен и основной побочный эффект типичных нейролептиков – экстрапирамидные расстройства [Мосолов С.Н., 2004; Kurz M. et al., 1995]. Большинство нейролептиков хорошо всасывается при разных путях введения. Они легко проникают через гематоэнцефалический барьер. Эти препараты метаболизируются в основном в печени и выделяются с мочой, частично – с фекалиями [Калетина Н.И., 2008].
Атипичные нейролептики отличаются от типичных рядом особенностей. Наравне с «типичными», они, связываясь с дофаминовыми рецепторами головного мозга, оказывают выраженное антипсихотическое действие, снижают психомоторную активность и уменьшают психическое возбуждение. Например, атипичные нейролептики в отличие от классических (типичных) имеют более низкую степень сродства к дофаминовым D2-рецепторам и проявляют сродство к рецепторам других типов (дофаминовые, холинорацепторы). Этим обусловлены их более «мягкие» фармакологические свойства, делающие их более легко переносимыми препаратами [Видаль, 2017].
С влиянием нейролептиков на дофаминовую систему нервных клеток головного мозга связана часть нежелательных эффектов традиционных нейролептиков, например экстрапирамидные расстройства. В отличие от типичных, атипичные нейролептики не вызывают или редко вызывают экстрапирамидные нарушения [Мосолов Н.С., 2004]. При терапии атипичными нейролептиками по сравнению с типичными ниже вероятность появления эндокринных нарушений, например, повышения пролактина (гиперпролактинемии) [Kane J. et al., 1988].
Синтез клозапина был впервые осуществлен в 1958 году. Опыт его клинического применения был впервые описан психиатрами Н. Grоss и E. Langner [Gross H. et al., 1966], а также D. Bente и соавт. в 1967 году [Bente D., 1967]. Ими же было отмечено отсутствие влияния препарата на неврологическую сферу. Позже было установлено, что данный препарат позволяет добиться терапевтического улучшения у пациентов, резистентных к типичным нейролептикам. Широко использовать клозапин в клинической практике стали в 70-е годы XX в. Позже, в 1975 г. году широкое применение клозапина (особенно в Финляндии) было ограничено вследствие описания J. Idanpaan-Heikkila и другими исследователями случаев развития агранулоцитоза при его применении [Idanpaan-Heikkila J. et al., 1975]. Позже, после анализа доступных литературных данных, препарат был возвращен на фармацевтический рынок [Kane J. et al., 1988].
Клинические симптомы острых отравлений клозапином и патогенетические механизмы, обусловливающие их появление
Способ забора проб легких: Образцы ткани лёгких для последующего проведения морфологического исследования фиксировались в 4% нейтральном параформальдегиде и далее обрабатывались по общепринятой методике. Изготавливались гистологические срезы толщиной 5 мкм, которые наносились на предметные стёкла и окрашивались гемотоксилином и эозином. Препараты исследовались методом световой микроскопии в 10 полях зрения на микроскопе Nikon Eclipse E-400 с видеосистемой на основе камеры Watec 221S (Япония) при увеличении 200х и 400х.
Для последующего проведения ВЭЖХ - МС/МС лёгкие после декапитации животных отбирали, промывали дистиллированной водой, просушивали фильтровальной бумагой и замораживали. Предварительно пронумерованные ёмкости с органами хранили в морозильной камере при t=40С без добавления консервантов. Маркировка на гистологических препаратах и пробирках: «Clz, lun 1/2», где 1 - номер группы (от 1 до 6) 2 - номер крысы (от 1 до 5) Eth- наличие этанола. Методы описательной статистики Все полученные в ходе эксперимента данные (результаты морфометрического исследования, результаты химического токсикологического исследования с применением ВЭЖХ-МС/МС) были подвергнуты статистической обработке с помощью пакета программ Microsoft Excel 2007. Были рассчитаны следующие статистические параметры: среднее значение и ошибка среднего. Для определения достоверности полученных данных применяли U-критерий Манна-Уитни (за достоверную принималась разность средних при р0,05). Оборудование
Для проведения морфологического исследования пользовались микроскопом Nikon Eclipse E-400 с видеосистемой на основе камеры Watec 221S (Япония) при увеличении 200х и 400х. Морфометрический анализ проводили с использованием сетки Г.Г. Автандилова, количественные показатели оценивали в объёмных %.
Для проведния валидации методики ВЭЖХ-МС/МС и измерения содержания клозапина и его метаболитов в сыворотке крови и гомогенатах органов крыс использовали следующее оборудование:
Высокоэффективный жидкостной хроматограф с масс-детектором Agilent Technologies 430 Triple Quad LC/MS (Германия), весы лабораторные (ГОСТ 24104-2001) аналитические «MX5» «Mettler Toledo» (Швейцария) с погрешностью взвешивания не более ± 0,001 мг.
Для получения хроматограмм применяли программу Agilent Mass Hunter Workstation for series tripple Quadrapole vers. B06.00 build 6.0.6.25.4sp4; для обработки хроматограмм пользовались программой Agilent Mass Hunter Quantitive Analysis vers. B 07.00 build 7.0.457.0 Вспомогательные устройства Дозаторы переменного объема на 50,0, 200,0 Колор «Ленпипет» (РФ) 1000,0; и 5000,0 мкл «Biohit» (Финляндия) со сменными одноразовыми пластиковыми наконечниками «Экохим» (РФ); аппарат для встряхивания жидкости «Genius 3», «Vortex» (США); пробирки Эппендорфа «Экохим» (РФ); калиброванные мерные колбы вместимостью 50; 100; 250; 1000 мл (ГОСТ 1770-5э74), мерные цилиндры объёмом 50, 250, 1000 мл (ГОСТ 1770-74), центрифуга «Eppendorf» (Германия).
Аналитический метод [Романова О.Л. и др., 2016 (а)]
Измерение содержания клозапина и его метаболитов проводили предварительно валидированным (таблица 5) методом ВЭЖХ-МС/МС в режиме MRM c регистрацией положительных наиболее интенсивных переходов (m/z 327,14 270,1 (клозапин), m/z 343,1 256,1 (клозапин-N-оксид), m/z 313,1 270,1 (норклозапин) и m/z 278,2 105,1 (амитриптилин) с использованием высокоэффективного жидкостного хроматографа Agilent 1290 Infinity с масс-детектором Alligent Technologies 430 Triple Quad LC/MS (Германия) на колонке Thermo part №059130 C 18 3 M 120 A2,1X150 мм.
Для подбора условий масс-спектрометрического детектирования растворы клозапина (2,5 мкг/мл), норклозапина (0,25 мкг/мл), клозапин-N-оксида (0,1 мкг/мл) и амилриптилина (внутренний стандарт в концентрации 18,75 мкг/мл) анализировали путём прямого ввода в масс-спектрометр при помощи шприцевого насоса при ионизации в электроспрее в режиме регистрации положительных ионов.
При сканировании в режиме MC/MC (MRM) определяли ионы фрагменты IS и аналита. Для количественного анализа была проведена оптимизация режима МС/МС детектирования для достижения максимальной чувствительности. Полученные масс-спектры и хроматограммы представлены на рисунках 5-8.
Результаты морфометрического анализа ткани лёгких при отравлении клозапином и его комбинацией с этанолом
Появление в лёгких периваскулярных отёков, полнокровия и кровоизлияний наблюдалось в группах животных, изолированно получавших клозапин и комбинацию клозапина и этанола. Можно предположить, что это обусловлено повышением проницаемости сосудов микроциркуляторного русла, в том числе гипоксией комбинированного генеза. Наблюдаемое при изолированном введении клозапина и комбинированном введении клозапина и этанола повреждение эпителия, по всей видимости, обусловлено непосредственным токсическим влиянием клозапина на клетки эпителия, сопровождающимся усилением процесса перекисного окисления липидов (ПОЛ) и нарушением антиоксидантной системы защиты крови [Ильященко К.К. и др., 2015; Каган В.Е. и др., 2004; Калянова Н.А. и др., 2002]. Повышение агрегационной активности эритроцитов и тромбоцитов, наблюдаемые при изолированном отравлении клозапином и комбинированном отравлении клозапином и этанолом, предположительно, связаны с блокадой 5-НТ3 рецепторов в тромбоцита, что согласуется с рядом литературных данных [Машковский М.Д., 2010; Oyewumi L.K. et al., 2002].
Таким образом, наиболее ранним гистоморфологическим изменением при применении клозапина как монопрепарата (через 3 часа после его введения) явились нарушения кровообращения (полнокровие в системе лёгочной артерии, умеренное расширение артерий, умеренное венозное полнокровие, агрегация эритроцитов), которые усиливались к 24 часу (венозное полнокровие резко выражено, появлялись периваскулярные кровоизлияния). Кроме того, через 1 сутки после введения клозапина как монопрепарата отмечено появление признаков эмфиземы, чего не наблюдалось через 3 часа. Через 3 часа после комбинированного введения клозапина и этанола также отмечались различные нарушения кровообращения (выраженное венозное и капиллярное полнокровие, периваскулярные кровоизлияния, кровоизлияния в межальвеолярные перегородки, сладж). Наблюдали слущивание эпителия в просвет бронхов. Данное изменение не было отмечено в группе животных, получавших клозапин в качестве монопрепарата. К 24 часу выявленые расстройства кровообращения сохранялись (артериальное и резко выраженное венозное полнокровие). Появлялись признаки очаговой эмфиземы, чего не наблюдали через 3 часа.
Через 3 часа от начала эксперимента гистологические изменения в группе животных, получавших клозапин и этанол, более обширны и разнообразны, чем в группе, получавшей только клозапин. Гистологические изменения через 3 часа после совместного введения клозапина и этанола в основном включали в себя нарушения кровообращения (выраженное венозное и капиллярное полнокровие, периваскулярные кровоизлияния, кровоизлияния в межальвеолярные перегородки, сладж). К 24 часу эти изменения сохранялись (артериальное и венозное полнокровие, случаи сладжа). Кроме нарушений кровообращения через 24 часа после совместного введения клозапина и этанола наблюдалось расширение просвета бронхов, отслойка эндотелия в сосудах, чего не отмечали через 3 часа после совместного введения клозапина и этанола [Голубев А.М. и др., 2015; Романова О.Л. и др., 2017(а)].
Таким образом, определённая динамика гистоморфологических изменений наблюдалась при совместном введении клозапина и этанола (отмечены достоверные различия между группами 3 и 4) [Романова О.Л. и др., 2017; Романова О.Л. и др., 2016 (а)].
С целью колчественной оценки гистоморфологических изменений проводили морфометрическое исследование паренхимы лёгких. Морфометрический анализ проводили с использованием сетки Г.Г. Автандилова. Оценивали (в объёмных процентах, об. %) содержание площади альвеол, межальвеолярных перегородок, сосудов, лейкоцитов, долю лейкоцитов в межальвеолярных перегородках, площадь, занятую отёком и дистелектазами.
Данные морфометрического анализа гистологических срезов лёгких в контроле, через 3 и 24 часа после введения клозапина в дозе 150 мг/кг и совместного введения клозапина (150 мг/кг) и этанола (5 мл/кг) представлены в табл. 8 [Романова О.Л. и др, 2017 (б)].
О возможных механизмах развития патологических изменений в легких при воздей ствии клозапина и его комбинации с этанолом (обсуждение полученных результатов)
Жидкость проникает через стенки сосудов. Затем она проходит в интерстиции между клетками эпителия и транспортируется цитоплазматическими везикулами. Далее фильтрат направляется по градиенту гидростатического давления в интерстиций субплевральных отделов, периваскулярную и перибронхиальную соединительную ткань. Здесь расположены терминальные лимфатические сосуды. Жидкость проходит в просветы лимфатических сосудов через щели эндотелиальных клеток, попадает в собирательные лимфатические сосуды корней легких, а затем по грудному протоку – снова в кровеносное русло. Скорость, с которой жидкость накапливается в интерстиции, определяют гидростатическим и онкотическим давлением по обе стороны стенки капилляра [Moloney E.D. et al., 2003; Joviak M. et al., 2013; Фот Е.В. и др., 2013; Brogan T.V. et al., 2009]. Отёк лёгких, связанный с повышенной проницаемостью, может развиваться даже при постоянной величине гидростатического давления в микрососудах (8-12 мм. рт. ст.) через значительное время (6-48 часов) после воздействия факторов, оказывающих повреждающее действие на легкие. Появляется, в первую очередь, интерстициальный, а затем и альвеолярный отек [LeTourneau J.L. et al., 2012].
Изменения, выявлемые в бронхах подопытных крыс, характеризуются слущиванем эпителия, усилением секреции (особенно в группах, получавших комбинацию клозапина и этанола). Имеются чередование участков ателектаза, дистетектаза и эмфиземы. Вышеуказанные изменения также приводят к дальнейшему усугублению гипоксического состояния и повышению проницаемости сосудов микроциркуляторного русла, что, в свою очередь, также способствует развитию интерстициального и интраальвеолярного отека. Большую роль в усугублении гипоксии и дальнейшему развитию патологических изменений в легких является отсутствие эвакуации мокроты у подопытных животных [Голубев А.М. и др., 2015]. Гистоморфологические изменения в лёгких подопытных животных в группах, получавших комбинацию клозапина и этанола происходит более быстрыми темпами по сравнению с группами, получавших клозапин и этанол, что подтверждается результатами морфометрического исследования [Романова О.Л. и др., 2017 (а), 2017 (б)]. Это, вероятно, обусловлено влиянием этанола. В ходе проведения химико-токсикологического исследования в гомогенате лёгких наиболее высокое содержание клозапина и его метаболитов – норклозапина и клозапин-N-оксида мы наблюдали в группе животных, получавших комбинацию клозапина и этанола и выведенных из эксперимента через 24 часа. Этанол, вероятно, приводит к усилению кумуляции клозапина.
В представленной работе в ходе химического анализа пиковое содержание клозапина и его метаболитов в сыворотке крови у крыс, получавших комбинацию клозапина и этанола, наблюдали через 24 часа от начала опыта. Согласно данным литературы, пиковые концентрации клозапина наблюдают в пределах 2,5-4 ч, а период полувыведения Т1/2 клозапина – в пределах 7,6-20,8 ч. Данное противоречие, вероятно, объясняется депонированием клозапина и его метаболитов в легких с последующим выходом в кровь.
В основе патологических изменений, наблюдаемых в легких при воздействии клозапина и его комбинации с этанолом, предположительно лежат повреждение легочного эпителия, возникающие непосредственно под воздействием клозапина, и нарушение свертываемости крови, возникающее в результате с блокадой 5-НТ3 рецепторов в тромбоцитах.
Результаты проведённого исследования позволяют сделать следующие выводы:
1. Наиболее ранними морфологическими признаками (3 часа), отражающими токсические эффекты клозапина в отношении лёгочной паренхимы, являются нарушения кровообращения, ателектазы и дистелектазы, лейкоцитарная инфильтрация. Через 24 часа указанные явления нарастают и дополняются интраальвеолярным отёком и эмфизематозным расширеннием альвеол.
2. При сочетанном воздействии клозапина и этанола через 3 часа от начала эксперимента гистологические изменения в лёгких являются более обширными, разнообразными и развиваются более высокими темпами, чем при изолированном воздействии клозапина: помимо выраженного венозного и капиллярного полнокровия отмечаются кровоизлияния в межальвеолярные перегородки, периваскулярные кровоизлияния, сладж.
3. Комбинированный токсический эффект клозапина и этанола через 24 часа от момента их поступления в организм заключается в появлении дополнительных патологических изменений в лёгочной ткани: расширение просвета бронхов, отслойка эндотелия в сосудах, чего не наблюдалось через 3 часа.
4. При одновременном введении клозапина и этанола содержание клозапина и его метаболитов в сыворотке крови крыс и лёгочной паренихме через 24 часа заметно выше, чем при изолированном поступлении в организм клозапина. Содержание клозапина в лёгких животных, получавших клозапин и этанол, через 24 часа увеличивается более чем в 20 раз по сравнению с экспериментом, при котором клозапин вводился без этанола.
5. При острых отравлениях клозапином возникает комплекс гистоморфологических изменений в лёгких, совокупность которых позволяет конкретизировать ответную реакцию организма при данном патологическом процессе, дать ей количественную оценку и установить её танатогенетическую значимоть в различных условиях использования препарата.
Практические рекомендации В ходе диссертационного исследования изучены особенности патологических процессов, возникающих в лёгких при отравлении клозапином и его комбинацией с этанолом и их механизмы.
Полученные данные могут быть использованы в учебном процессе медицинских ВУЗов при изучении теоретических и клинических дисциплин: патологической физиологии, судебной медицины, патологической анатомии. Результаты проведённого исследования также могут применяться в работе бюро судебно-медицинской экспертизы при проведении экспертиз при подозрени на отравление клозапином для установления времени воздействия препарата.