Особенности экспрессии молекул-маркеров рака желудка при предраковых состояниях слизистой оболочки желудка Денисова Анна Борисовна

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Рак желудка, предраковые состояния и изменения слизистой оболочки желудка: современные представления об эпидемиологических особенностях этиологии, патогенеза и диагностики (обзор литературы) 12

1.1. Рак желудка: современные аспекты проблемы 12

1.2. Диагностика рака желудка, преканцерозных состояний и изменений слизистой оболочки 20

1.3. Значение экспрессии молекул-маркеров в ранней диагностике рака желудка, предраковых состояний и изменений слизистой оболочки 23

Глава 2. Материалы и методы исследования 37

2.1. Дизайн исследования 37

2.2. Методики эндоскопического и морфологического обследования 38

2.3. Методика проведения иммуногистохимического исследования 41

2.4. Методика детекции апоптоза в тканях СОЖ 43

2.5. Статистическая обработка материала 44

Глава 3. Формирование групп пациентов с предраковыми состояниями, изменениями слизистой оболочки желудка и раком желудка 46

3.1 Ретроспективный анализ заболеваемости, смертности, пятилетней выживаемости при раке желудка за последние 5-10 лет в Красноярском крае и городе Красноярске. 46

3.2. Общая характеристика пациентов 49

Глава 4. Сравнительная характеристика и экспрессии молекул-маркеров, апоптоза у пациентов с хроническим поверхностным гастритом, с предраковыми состояниями, изменениями слизистой оболочки желудка и раком желудка 59

4.1. Сравнительный анализ экспрессии VEGFR2, PI3K, AKT, mTOR, GSK3 в нормальной слизистой оболочке желудка и при различных патологических состояниях (от хронического поверхностного гастрита до рака желудка). 59

4.2. Анализ экспрессии молекул, маркирующих диспластические, метапластические и онкогенные изменения в слизистой оболочке желудка 65

4.3. Сравнительные данные апоптоза у пациентов с хроническим поверхностным гастритом, с предраковыми состояниями, изменениями слизистой оболочки желудка и раком желудка 68

4.4 Статический анализ экспрессии молекул-маркеров, апоптоза у пациентов с хроническим поверхностным гастритом, с предраковыми состояниями, изменениями слизистой оболочки желудка и раком желудка 72

Заключение 77

Выводы 89

Список сокращений 90

Список работ, опубликованных по теме диссертации 93

Список литературы 95

• Значение экспрессии молекул-маркеров в ранней диагностике рака желудка, предраковых состояний и изменений слизистой оболочки
• Общая характеристика пациентов
• Сравнительный анализ экспрессии VEGFR2, PI3K, AKT, mTOR, GSK3 в нормальной слизистой оболочке желудка и при различных патологических состояниях (от хронического поверхностного гастрита до рака желудка).
• Статический анализ экспрессии молекул-маркеров, апоптоза у пациентов с хроническим поверхностным гастритом, с предраковыми состояниями, изменениями слизистой оболочки желудка и раком желудка

Введение к работе

Актуальность темы исследования. Рак желудка (РЖ) является одним из самых распространенных онкологических заболеваний, которое характеризуется высокой смертностью (третьей по частоте среди всех онкологических заболеваний) и низкой выживаемостью. Россия, наряду со Швейцарией и Данией, относится к странам с высоким уровнем заболеваемости РЖ. В 2011 году в России заболеваемость РЖ составила 26,8 случаев, смертность – 23,23 на 100 тыс. населения, а в 2014 г. было зарегистрировано 36 тыс. новых случаев РЖ [Бектаева, Р. Р. и соавт., 2014].

Несмотря на значительный прогресс в области клинической и экспериментальной онкологии, данная патология диагностируется на поздних стадиях (III-IV степени), когда лечение затруднено [De Angelis R. et al., 2014]. Большинство больных к моменту верификации диагноза уже имеют метастазы в регионарных лимфоузлах [Михайлов М. К. и соавт., 2010]. Поэтому смертность от РЖ в нашей стране примерно равна заболеваемости с пятилетней выживаемостью – около 20 %. Вследствие этого в последнее время все большее значение придается мерам канцеропревенции в группах фоновых и предраковых заболеваний.

Предопухолевая патология делится на две составляющие: предраковые состояния и изменения слизистой оболочки желудка (СОЖ). К основным предраковым состояниям, значительно увеличивающим риск возникновения РЖ, относится атрофический пангастрит с кишечной метаплазией, к предраковым изменениям СОЖ – желудочная дисплазия, которая представляет собой предпоследний этап желудочного канцерогенеза.

Согласно современным представлениям, основной причиной дистального РЖ является инфекция H. Pylori [Sugano K. et al., 2015]. Считается, что риск развития РЖ у H. pylori-инфицированных субъектов значительно выше, чем у неинфицированных, и по разным данным увеличивается (в 6 – 25 раз) [Cheng X. J. et al., 2016].

Среди всех методов диагностики РЖ гастроскопия и гистологическое исследование являются наиболее эффективными в верификации патологии СОЖ. Современные методы гастроскопии с цифровой обработкой изображения и гистологическое исследование позволяют выявлять патологические образования даже самых небольших размеров [Князев М. В. и соавт., 2014].

Наряду с традиционными методами диагностики определение молекул-маркеров РЖ, экспрессия которых изменяется еще до малигнизации, может быть эффективным методом ранней диагностики заболевания. Экспрессия молекул-маркеров РЖ ассоциирована с механизмами сигнальной трансдукции при активировании рецепторов VEGF (сосудистый эндотелиальный фактор роста).

Активация сигнальных путей факторов роста вследствие мутации рецепторов или увеличение экспрессии занимает важное место в процессе опухолевого роста при РЖ, влияет на прогноз заболевания и результаты лечения [Kim J. Y. et al., 2013].

Ранняя диагностика заболевания на стадии предраковых состояний и изменений СОЖ создает условия для своевременной профилактики и лечения. При этом наибольший интерес представляют маркеры, регулирующие некоторые процессы в клетке (VEGFR, AKT, PI3K, mTOR, GSK3, молекулы сигнальных путей факторов роста, микроРНК, MET). Следует отметить, что данные молекулы регулируют апоптоз, процессы ангиогенеза, а также регулируют потребление нутриентов клеткой.

Несмотря на появившееся большое количество работ, касающихся изменения сигнальных путей факторов роста в процессе канцерогенеза, данных относительно комплексного изучения особенностей экспрессии молекул при предраковых состояниях и изменениях СОЖ, при обзоре литературы найдено не было.

Степень разработанности темы исследования. В настоящее время множество исследований посвящено изучению природы возникновения рака желудка. Особая роль

принадлежит работам, посвященным молекулярным механизмам канцерогенеза [Белковец, А.В. и соавт., 2014]. Описываются нарушения во множестве сигнальных путей, в том числе и в сигнальном пути PI3K/AKT/mTOR, связанном с VEGFR2 и GSK3 [A. Hendlisz, A. et al., 2016; Singh, S. S. et al., 2015, Ying, J. et al.,2015, Malley, C.O. et al., 2015, Иванова Э.В. и соавт., 2014]. Считается, что нарушения в этом сигнальном пути приводят к снижению апоптоза, увеличению васкуляризации опухоли, изменении метаболизма клеток и множеству других изменений в клетке [Tapia, O et al., 2014], что, в свою очередь, приводит к развитию злокачественной опухоли. Тем не менее, небольшое количество исследований посвящено изменениям этого сигнального пути на различных этапах опухолевой трансформации. Так, имеются отдельные данные об экспрессии mTOR при аденомах желудка в сравнении с нормальной слизистой и раком желудка [Xiao, L. Et al., 2009], экспрессии GSK3 при образовании полипов фундальных желез желудка и аденоматозных изменениях слизистой оболочки желудка [Radulescu, S. et al., 2013]. К сожалению, целостной картины, описывающей последовательное изменение молекул-участников сигнального пути VEGFR в литературе на сегодняшний момент нет, что явилось поводом для проведения данного исследования.

Цель исследования: изучить особенности экспрессии молекул, регулирующих пролиферацию и метаболизм клеток слизистой оболочки желудка и патогенетически значимых для развития предраковых состояний и изменений слизистой оболочки желудка и рака желудка.

Задачи исследования:

1. Изучить характер экспрессии белков, участвующих в регуляции процессов пролиферации клеток слизистой оболочки желудка (VEGFR2, PI3K, AKT, mTOR), при предраковых состояниях и изменениях слизистой, а также при раке желудка (аденокарцинома, перстневидноклеточный рак).

2. Оценить взаимосвязь экспрессии белка, участвующего в регуляции процессов метаболизма клеток слизистой оболочки желудка (GSK3), с ее предраковыми состояниями и изменениями, а также с развитием рака желудка (аденокарцинома, перстневидноклеточный рак).

3. Определить интенсивность апоптоза клеток слизистой желудка при предраковых состояниях и изменениях, а также при развитии рака желудка (аденокарцинома, перстневидноклеточный рак).

4. Оценить патогенетическую значимость и диагностическую ценность интенсивности апоптоза, экспрессии молекул, регулирующих пролиферацию, метаболизм, при предраковых состояниях и изменениях слизистой желудка и при развитии рака желудка (аденокарцинома, перстневидноклеточный рак).

Научная новизна исследования. Впервые с позиции комплексного подхода к изучению сигнальных путей сосудистого эндотелиального фактора роста, играющих важную роль в канцерогенезе, были охарактеризованы особенности экспрессии VEGFR2, PI3K, AKT, mTOR, GSK3 в процессе развития злокачественного образования в клетках слизистой оболочки желудка.

Доказано, что на различных этапах опухолевой трансформации происходят изменения экспрессии белков VEGFR2, PI3K, AKT, mTOR, GSK3 молекул с важной точкой в фазе хронического атрофического гастрита с дисплазией различной степени. Наиболее показателен в этом плане маркер AKT, при исследовании экспрессии которого впервые были найдены статистически значимые различия между группами.

Установлено, что уровень апоптоза клеток наименее выражен у пациентов с РЖ, причем перстневидноклеточный рак демонстрирует минимальное значение апоптозного

индекса. Обнаружена положительная корреляция индекса апоптоза с коэффициентом экспрессии GSK3.

Разработан новый патогенетически оправданный подход, основанный на
исследовании изменений в механизме пролиферации и метаболизма клетки,

способствующий повышению уровня диагностики поражений слизистой оболочки желудка, являющихся предраковыми.

Практическое и теоретическое значение работы.

Результаты настоящего исследования расширяют знания об изменениях в сигнальных
путях факторов роста в процессе канцерогенеза. Исследование позволило выявить
особенности и новые черты экспрессии VEGFR2, PI3K, AKT, mTOR, GSK3 при различных
состояниях СОЖ, в том числе при опухолевой трансформации. Наиболее ранние,

патогенетически значимые, изменения в динамике трансформации СОЖ наблюдаются в экспрессии mTOR с последующими изменениями экспрессии AKT. Это дает возможность определить потенциал к озлокачествлению и провести своевременную профилактику и лечение.

С целью дифференциальной диагностики предраковых состояний и изменений СОЖ и оценки эффективности терапии целесообразно дополнять стандартные диагностические процедуры (гистологическое исследование) определением экспрессии AKT, mTOR.

Оценка индекса апоптоза в клетках слизистой оболочки желудка может быть рекомендована при проведении дифференциальной диагностики предраковых изменений и состояний, РЖ, воспалительных изменений СОЖ. Полученные результаты могут быть использованы при разработке диагностических алгоритмов, тест-систем, терапии предраковых состояний и изменений СОЖ.

Методология и методы исследования. Для реализации поставленных задач выбраны
современные высокоинформативные методы исследования, позволяющие решить

поставленные задачи. Забор материала производился на базе КГБУЗ «Краевая клиническая больница», г. Красноярск. Иммуногистохимические методики окрашивания срезов производились на базе НИИ молекулярной медицины и патобиохимии, ФГБОУ ВО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздрава России. Морфологическое исследование биоптатов проводилось в КГБУЗ «Красноярское краевое патолого-анатомическое бюро», под руководством сотрудников кафедры анатомии и гистологии человека.

Основные методы исследования:

5. методы клинического обследования и эндоскопии;

6. иммуногистохимическая оценка экспрессии молекул, маркирующих пролиферацию и метаболизм клеток;

7. гистологическое исследование образцов тканей;

8. оценка апоптоза методом TUNEL;

9. статистические методы обработки результатов исследования.

Положения, выносимые на защиту:

10. Экспрессия молекул сигнального пути VEGFR, регулирующего процессы пролиферации в клетках слизистой оболочки желудка, изменяется в сторону увеличения по мере трансформации эпителия от хронического гастрита до формирования рака желудка.

11. Атрофический пангастрит с дисплазией маркируется максимальной, а поверхностный гастрит - минимальной экспрессией GSK3 в клетках слизистой желудка, что позволяет считать этот фермент вовлеченным в патогенез предраковых состояний слизистой и объектом дизрегуляции экспрессии при их развитии.

3. Индекс апоптоза клеток слизистой оболочки желудка соответствует стадиям патологических изменений: повышается при хроническом атрофическом гастрите с кишечной метаплазией, достигая максимума при явлениях дисплазии эпителия, и снижается при РЖ, в большей степени при перстневидноклеточном раке.

4. Наибольшее патогенетическое и диагностическое значение из тестируемых параметров имеет экспрессия AKT и mTOR: у пациентов с предраковыми изменениями слизистой оболочки желудка отмечается наибольшая экспрессия АКТ, у больных раком желудка регистрируется высокая экспрессия mTOR и низкая экспрессия АКТ.

Степень достоверности и апробация результатов. Материал получен на достаточном объеме данных, на современном поверенном оборудовании. Объем выборки n=99. Методы использованы в соответствии с современными стандартными протоколами, а результаты работы обработаны с использованием современных пакетов статистических методов.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на международном симпозиуме
«Quality in upper GI endoscopy», (г. Берлин, Германия, 2016 год); на Межрегиональной
научно-практической конференции «Актуальные вопросы гастроэнтерологии у взрослых»
(г. Красноярск, 2016 год); на заседании Красноярского краевого научно-практического
общества хирургов (г. Красноярск, 2016); на семинаре НИИ молекулярной медицины и
патобиохимии (г. Красноярск, 2016); на научно-практической конференции

«Терапевтические и хирургические в том числе и эндоскопические подходы к диагностике и лечению пациентов гастроэнтерологического профиля» в рамках 25-го специального форума «Енисей-медика» (г. Красноярск, 2017); на Национальном хирургическом конгрессе «ХХ Юбилейный съезд РОЭХ», (г. Москва, 2017).

Личный вклад автора. Автор лично принимал участие на всех этапах выполнения работы: в сборе информации, проведении эндоскопических исследований, во внесении в электронную базу данных, проведении иммуноцитохимического исследования. Автор провел поиск, критический анализ литературы по теме диссертации, анализ полученного материала, статистическую обработку, подготовил публикации.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы, 3 – в журналах, рекомендуемых ВАК РФ.

Конкурсная поддержка работы. Работа выполнена при поддержке грантов: Федерального государственного бюджетного учреждения "Фонд содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере", конкурс УМНИК; Краевого государственного автономного учреждения «Красноярский краевой фонд поддержки научной и научно-технической деятельности», Конкурс научно-технического творчества молодежи (студентов и аспирантов).

Объем и структура работы. Материал диссертации изложен на 112 страницах машинописного текста, иллюстрирован 19 рисунками, 8 таблицами. Работа состоит из введения, 4 глав: обзора литературы; материалов и методов исследования; результатов собственных исследований, а также заключения, выводов и списка литературы. Список литературы состоит из 163 источников, в том числе из 27 отечественных и 136 зарубежных.

Значение экспрессии молекул-маркеров в ранней диагностике рака желудка, предраковых состояний и изменений слизистой оболочки

Наряду с традиционными методами ранней диагностики РЖ могут использоваться молекулы-маркеры. Основные молекулы, участвующие в процессе канцерогенеза, а также в васкуляризации опухоли представлены в таблице 1. Вместе с тем чаще всего в литературе упоминаются следующие механизмы канцерогенеза, а также их маркеры: изменения в сигнальных путях факторов роста, нарушения в репарации ошибочно спаренных нуклеотидов, сбои в механизме осуществления апоптоза в тканях, метилирование ДНК, изменения в системе регуляции микроРНК, а также путь PI3K/Akt/mTOR в комплексе с GSK3 и VEGF. На сегодняшний день активно изучается наличие онкомаркеров в различных биологических жидкостях. Активация сигнальных путей факторов роста вследствие мутации рецепторов или увеличение экспрессии занимает важное место в процессе опухолевого роста при РЖ, влияет на прогноз заболевания и результаты лечения.

При РЖ в тканях происходит как неконтролируемая пролиферация клеток, так и снижение процесса апоптоза [113]. Апоптоз – ключевой механизм, необходимый для поддержания клеточного гомеостаза и элиминации поврежденных клеток. Сигналы извне, стресс клетки, нарушения клеточного цикла могут инициировать процесс апоптоза, включающий в себя морфологические и биохимические изменения в клетке, такие как блеббинг мембраны, сжатие клетки, консидерация хроматина и фрагментация ДНК. Существует два сигнальных пути в клетках млекопитающих. Один сигнальный путь называется внешним и активируется путем воздействия на рецепторы различных каспаз, а внутренний путь стимулируется митохондриями и высвобождением цитохрома С. Способность избегать апоптоза является важным компонентом раковой трансформации клеток и устойчивости опухолевой ткани к химиотерапии за счет повышенной экспрессии антиапоптотических белков, что требует нового подхода в разработке противораковых препаратов. Множество генов и факторов вовлечено в процесс апоптоза в тканях желудочно-кишечного тракта. Резистентность к химио- и лучевой терапии может быть обусловлена снижением действия проапоптотических медиаторов (как BCL-2- связанный Х белок (BAX), p53 (TP53)) и усилением действия антиапоптотических факторов (таких, как белок B-клеточной лимфомы - BCL-2 и сурвивин) [33 , 96 , 132]. Взаимоотношения между различными молекулами, участниками путей канцерогенеза, представлены на рисунке 1.

Еще одним механизмом, приводящим к развитию РЖ, могут стать изменения в сигнальном пути PI3K/AKT/mTOR, связанном с GSK3 и VEGFR2 (таблица 2).

PI3K – гетеродимер, который состоит из субъединицы 85- и субъединицы 110-кДа, и имеет тирозинкиназную активность, при этом регуляторная субъединица p85 является субстратом для множества цитоплазматических и рецепторных тирозин киназ. Активация PI3K стимулирует продукцию фосфоиназитол – 3,4,5-трифосфата, а он активирует киназы, в том числе AKT. В число мишеней AKT, которые активируются путем фосфорилирования, входит mTOR. mTOR активирует субъединицу p70 киназы S6, ингибирует эукариотический фактор инициации трансляции 4Е-связывающего белка, это приводит к увеличению клеточной пролиферации и белкового синтеза [154]. PI3K – важный участник регулирования опухолевого ангиогенеза за счет продукции сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF). При новообразованиях другой локализации, не только при РЖ, активируется сигнальный путь PI3K–AKT– mTOR и сопровождается экспрессией фосфо-AKT (29–86 %) и фосфо-mTOR (47–64 %) [158].

Киназы PI3K участвуют в фосфорилировании мембранных инозитольных липидов [146]. При активации PI3K образуется вторичный посредник фосфатидилинозитол 3,5–трифосфат (PIP3) из фосфатидилинозитола 4,5–дифосфата (PIP2), что, в свою очередь, вызывает миграцию к клеточной мембране белков, таких как киназы AKT/PKB, и фосфорилирование фосфатидилнезависимой киназой 1 PDK1 и PDK2 [156]. Повышенная экспрессия рецепторов наблюдается только в 20–30 % случаев, AKT активирован в 80 %. Сигнальный путь PI3K регулирует множество клеточных процессов, таких как пролиферация, рост, апопотоз и реорганизация цитоскелета. mTOR – центральная регуляторная киназа, она увеличивает синтез белков, стимулирующих ключевые клеточные процессы: клеточный рост, пролиферацию, клеточный метаболизм и ангиогенез – и экспрессируется в опухолевой ткани различной локализации. mTOR увеличивает трансляцию белков, регулирующих клеточный рост и деление, снижает трансляцию негативных регуляторов прогрессии клеточного цикла. Ингибирование mTOR вызывает катаболические процессы, включающие аутофагию в опухолевых клетках, и подавление клеточного роста [144]. mTOR увеличивает трансляцию HIF-1a, стимулирующего васкуляризацию как и VEGF. Активность комплекса mTOR увеличивается через фосфорилирование и ингибирование TSC2 и PRAS40 протеин киназой AKT. Ингибирование AKT стимулирует аутофагию путем снижения активности mTOR [68]. mTOR участвует в сигналах, регулирующих белковый синтез и других, инициированных потреблением нутриентов. Такая регуляция необходима, чтобы оградить клетку от ответа на сигналы роста и пролиферации, когда поступление нутриентов и энергии недостаточно для поддержки этих клеточных процессов, а если нутриентов и энергии достаточно, то mTOR «разрешает» клеточный ответ. mTOR входит в состав двух белковых комплексов, различных по функции: комплекс mTOR 1 (mTORC1) и комплекс mTOR 2 (mTORC2). mTORC1 связан с событиями в клетке, происходящими при действии цитостатика рапамицина. Функция mTORC2 окончательно не установлена, он не чувствителен к рапамицину, и он вовлечен в процессы изменения цитоскелета [159]. К настоящему времени были изучены полиморфизмы гена в качестве этиологического фактора в развитии опухолей различных органов, включая рак пищевода, легких, мочевого пузыря, толстой, прямой кишки, острой лимфобластной лейкемии. Большинство из этих нуклеотидных полиморфизмов встречаются в интронах и экзонах, функция которых неизвестна [161]. Эверолимус (RAD001, Afiinitor, Novartis) – дериват рапамицина для приема внутрь, который блокирует способность mTOR фосфорилировать p70S6K и 4E-BP1, вызывая арест клеточного цикла в стадии G0/G1, подавляя клеточный рост в опухолевой ткани [40]. Не все опухоли с повышенной активностью mTOR отвечают на его ингибирование. Это может объясняться наличием негативной обратной связи, при которой активируется путь PI3K/AKT/mTOR даже в присутствии рапамицина, вовлекая mTORC2 при неполном ингибировании mTOR [108].

mTOR активирован при РЖ и коррелирует с глубиной инвазии, уровнем дифференцировки и наличием метастазов в лимфатических узлах, высокая экспрессия mTOR стимулирует рост опухоли и метастазирование при РЖ. У 51,5 % пациентов с РЖ выявлена экспрессия mTOR, в то время как незначительная экспрессия mTOR или ее отсутствие определяется в нормальных тканях желудка. При III–IV стадиях заболевания положительная экспрессия mTOR выявляется у 93,3 % пациентов. Этот факт может свидетельствовать о том, что повышение экспрессии mTOR – позднее событие при РЖ [105]. При диффузном типе РЖ его экспрессия несколько выше, но также высока и при кишечном типе (58–64 % и 47–60 % соответственно) [150].

Протеинкиназа В (АКТ) – это семейство, включающее три внутриклеточных белка АКТ1, 2 и 3. Наиболее важные биологические последствия активации AKT, связанные со злокачественным ростом, можно разделить на три категории: выживание, рост (увеличение размеров клетки), пролиферация (увеличение количества клеток). AKT обладает также дополнительным эффектом на опухолевый ангиогенез при воздействии на HIF-1 и VEGF [146]. AKT – участник антиапоптотического сигнального пути – доминатно негативные аллели AKT блокируют выживание, опосредованное инсулиноподобным фактором роста 1 (IGF1), а активная AKT не дает запуститься PTEN-опосредованному процессу апоптоза. Повышение экспрессии AKT ассоциировано с негативным прогнозом, опухолевым ростом и устойчивостью к системной терапии [153]. Сигнальный путь AKT активируется различными факторами роста и кроме активации транслоцируется из цитоплазмы к внутренней поверхности мембраны, где связывается со специфическими фосфолипидами, продуцируемыми PI3K. Изоформы AKT 1, 2, 3 имеют перекрывающие друг друга функции: AKT 1 играет важную роль в процессах роста, AKT 2 вовлечен в сигнальные пути, связанные с инсулином, AKT 3 связан с развитием мозга [112].

Общая характеристика пациентов

В исследование были включены данные 99 пациентов в возрасте от 22 до 93 лет, медиана возраста составила 63,0 [54,0; 73,0]. Среди обследованных мужчин было 49 (49,5 %), женщин – 50 (50,5 %). Распределение больных по полу и по возрасту представлено в таблице 3.

Как видно из таблицы 3, среди обследованных преобладали пациенты в возрасте от 50 до 70 лет и старше (84,9 %).

При оценке клинической симптоматики было отмечено, что основными проявлениями заболевания были тяжесть в эпигастральной области у 10 пациентов (10,2 %), диспептические расстройства – 6 (6,1 %), снижение аппетита – 2 (2 %) и снижение массы тела – 5 (5,1 %). Обращал на себя внимание тот факт, что у большинства обследованных 59 (54,7 %) заболевание протекало латентно и выявлялось случайно при проведении эндоскопического исследования.

Продолжительность заболевания составляла от 2 месяцев до 5 лет. За последние 7 лет эндоскопическое обследование желудка было проведено 8 пациентам (8,2%). Основными эндоскопическими заключениями в прошлом были диффузный поверхностный гастрит, полипы желудка, у некоторых пациентов была диагностирована язва желудка. Следует отметить, что у двух пациентов, у которых при предыдущем эндоскопическом исследовании патологии СОЖ найдено не было, впоследствии был обнаружен РЖ.

На основании гистологических заключений было сформировано четыре группы пациентов: первую группу составили 27 пациентов (27,3 %) с хроническим неатрофическим диффузным гастритом, вторую группу –31 пациент (31,3 %) с хроническим атрофическим пангастритом с кишечной метаплазией, третью – 11 (11,1 %) пациентов с дисплазией СОЖ различной степени и четвертую – 30 пациентов (30,3 %) с аденкарциномой (n=15), перстневидноклеточным раком (n=5) и смешанным (n=10) РЖ некардиальной локализации.

Распределение пациентов по полу и возрасту представлены в таблице 4, анализ которой свидетельствует о том, что в 1 и 2-й группах преобладали женщины, в 3 и 4-й – мужчины. Медиана возраста в изучаемых группах среди мужчин и женщин достоверно не отличалась и составила в среднем от 62,0 [48,0; 68,0] до 65,5 [58,0; 74,0]. Достоверные различия при делении на группы по показателю возраста при подсчете критерия Манна – Уитни были найдены в группе 2 у пациентов с хроническим атрофическим пангастритом и кишечной метаплазией (p=0,01). Люди более старшего возраста были во 2-й группе.

Изучение особенностей клинических проявлений заболевания показало, что большинство обследуемых 1 и 2-й групп никаких жалоб не предъявляли (77,8 % и 74,2 % соответственно). Патология СОЖ у них была случайно обнаружена при гастроскопии. Основными клиническими симптомами у оставшихся 22,2 % и 25,8 % больных 1 и 2-й групп были диспептические расстройства (тошнота, отрыжка воздухом, горечь во рту по утрам), тяжесть и умеренные боли в эпигастральной области. В 3-й группе основные жалобы не отличались от клинических проявлений заболевания пациентов 1 и 2-й групп. В 4-й группе (РЖ) почти все пациенты имели жалобы на общую слабость, снижение аппетита и потерю массы тела, боли в эпигастральной области, рвоту съеденной пищей, тяжесть, быстрое насыщение (83,3 %). Пять пациентов (16,3 %) 4-й группы жалоб не предъявляли, и РЖ был у них случайной находкой. У большинства обследованных зарегистрирован короткий анамнез: только у 7 (25,9 %) пациентов 1-й группы, у 6 (19,3 %) 2-й группы, у 2 (18,2 %) 3-й группы и у 3 (10 %) 4-й группы ранее проводились эндоскопические исследования. При проведении эндоскопического исследования желудка в первой группе самой частой макроскопической формой был диффузный поверхностный гастрит (66,7 %, n=18) с наличием множественных нодулярных образований, гиперемией и отеком СОЖ фундального и антрального отделов желудка. Изолированного поражения СО фундальной части желудка не было найдено ни у одного из обследованных. Во 2-й группе кишечная метаплазия была заподозрена у 11 (35,9 %) больных, проявлялась наличием очагов пепельного или белесоватого цвета на фоне контурации и усиления сосудистого рисунка. В 3-й группе при проведении эндоскопии диспластические изменения СОЖ не были заподозрены ни у одного пациента. У 6 пациентов (5,4 %) данной группы были обнаружены полипы желудка, у 1 пациента – язва желудка, у 2 заподозрено злокачественное образование желудка, а у 1 пациента – эндоскопические признаки, свойственные изменениям при метаплазии СОЖ. В 4-й группе РЖ эндоскопически диагностирован в 86,7 % случаев. По локализации злокачественный процесс у 11 (36,7 %) пациентов определялся в теле желудка, у 8 (26,7 %) – в антральном отделе, у 12 пациентов распространялся на оба отдела. Следует отметить, что у пациентов 2, 3 и 4-й групп все макроскопические находки выявлялись на фоне диффузной атрофии СОЖ (рисунки 4-6).

Данные морфологического исследования, проведенного 99 пациентам 4 групп, свидетельствовали, что в 1-й группе (диффузный поверхностный гастрит) совпадение морфологического и макроскопического диагнозов составило 66,7 %. Диффузный поверхностный гастрит диагностировался по наличию в собственной пластинке СОЖ тела и антрального отдела мононуклеарных элементов (например, по наличию 1-2 и более плазмоцитов в поле зрения). Во 2-й группе совпадение морфологического и макроскопического диагнозов составило 35,9 %, где атрофические изменения характеризовались утратой желез желудка (если в поле зрения большого увеличения определялось менее 3-4 поперечно срезанных желез) с замещением их метаплазированным эпителием или фиброзной тканью. В очагах метаплазии определялись элементы, которые свойственны кишечному эпителию: каемчатые, бескаемчатые, бокаловидные энтероциты, клетки Панета и эндокринные. Кишечная метаплазия классифицировалась по степени распространённости изменений: слабая занимала до 5 %, умеренная до 20 %, выраженная – больше 20 %. Слабая кишечная метаплазия диагностирована у 15,7 %, умеренная – у 63,6 %, выраженная – у 20,7 %. Следует отметить, что у 73,5 % больных атрофические изменения регистрировались как в теле, так и в антральном отделе желудка. Метаплазия локализовалась в антральном отделе желудка. В 3-й группе на фоне атрофии и метаплазии у 11 пациентов обнаружены проявления дисплазии в СОЖ различной степени: у 5 пациентов была обнаружена тубулярная аденома с дисплазией легкой степени, у 5 – умеренной степени, у 1 – тяжелая дисплазия. В 4-й группе у 10 (66,6 %) пациентов была диагностирована аденокарцинома с локализацией в антральном отделе, у 5 (33,3 %) – в теле и у 5 (33,3 %) – распространялось на оба отдела. У 5 (16,7 %) пациентов был диагностирован перстневидноклеточный рак, у 10 (33,3 %) – смешанный тип (аденокарционома с перстневидноклеточной трансформацией). Аденокарцинома в свою очередь разделялась на высоко- (n=2, 13,35 %), умеренно- (n=11, 73,3 %) и низкодифференцированную (n=2, 13,35 %) (рисунок 7).

Сравнительный анализ экспрессии VEGFR2, PI3K, AKT, mTOR, GSK3 в нормальной слизистой оболочке желудка и при различных патологических состояниях (от хронического поверхностного гастрита до рака желудка).

Чтобы охарактеризовать процессы клеточной пролиферации, роста, ангиогенеза, согласно стандартному протоколу было проведено сравнительное исследование уровня экспрессии молекул, участвующих в сигнальных путях канцерогенеза, VEGFR2, AKT, mTOR, GSK3 с последующим подсчетом коэффициента экспрессии (КЭ) у пациентов с хроническим поверхностным гастритом, с предраковыми состояниями, изменениями СОЖ и раком желудка.

Сравнительные данные экспрессии VEGFR2, AKT, mTOR, GSK3 у пациентов с различной патологией СОЖ представлены в таблице 5, анализ которых показывает, что достоверно большие значения КЭ AKT зарегистрированы у пациентов 3-й группы с атрофическими изменениями СОЖ и диспластическими явлениями по сравнению с 1, 2 и 4-й группами. Показатели КЭ AKT в 1, 2 и 4-й группах между собой достоверно не отличались (p 0,05 во всех случаях) и регистрировались в пределах 93,1 [22,5; 128,3], 70,9 [54,4; 131,75] и 100,1 [65,6; 168,6] соответственно. Динамика изменений КЭ отражена на рисунке 8. Большие значения экспрессии VEGFR2 и GSK3 также определялись в 3-й группе пациентов с диспластическими изменениями СОЖ, однако они не достигали достоверных различий по сравнению с другими группами. Интересным являлся тот факт, что медиана уровня экспрессии VEGFR2 не изменялась при различных типах опухоли: аденокарциноме и перстневидноклеточном раке. Показатели коэффициента экспрессии mTOR, наоборот, были достоверно выше в 4-й группе у пациентов с РЖ по сравнению с 1 и 3-й группами. Результат иммуногистохимической окраски тканей представлен на рисунках 9, 10 и 11.

Таким образом, наиболее ярким представителем, диагностически значимым маркером состояний и изменений СОЖ явилась протеинкиназа В и mTOR. Первая с достоверно большими значениями выявляется у пациентов с предраковыми изменениями СОЖ, снижаясь при формировании РЖ, второй – наоборот, увеличивается при РЖ. Снижение КЭ mTOR при РЖ может быть обусловлено повышением выживаемости клеток и блокированием клеточной гибели. Снижение же его экспрессии на стадии диспластических изменений может быть связано с повышением уровня апоптоза, что подтверждает роль mTOR в клеточной гибели. Интересная картина наблюдается в отношении VEGFR2 и GSK3, хоть различия и не достигают достоверного уровня, тем не менее отчетливо прослеживается тенденция их изменения с максимальным повышением в группе с наличием диспластических изменений и резким снижением в группе 4 у пациентов с РЖ. Возможно, отсуствие различий связано с небольшим объемом выборки.

Статический анализ экспрессии молекул-маркеров, апоптоза у пациентов с хроническим поверхностным гастритом, с предраковыми состояниями, изменениями слизистой оболочки желудка и раком желудка

Проводился непараметрический корреляционный ранговый анализ Спирмена для определения взаимосвязи экспрессии молекул-маркеров и уровня ИА. Согласно полученным данным отрицательная корреляция была получена между показателем возраста и КЭ GSK3 (коэффициент ранговой корреляции - 0,3), положительная - между КЭ GSK3 и ИА (0,4).

Хотя при оценке диаграмм наблюдалась тенденция к появлению корреляции между показателем возраста и экспрессией остальных молекул-маркеров (рисунок 15).

Положительная корреляция была найдена между показателями интенсивности флуоресценции АКТ и mTOR, КЭ mTOR и интенсивностью флуоресценции mTOR, интенсивностью флуоресценции GSK3 и mTOR, интенсивностью флуоресценции GSK3 и VEGFR2, интенсивностью флуоресценции VEGFR2 и AKT, GSK3 и AKT. Но корреляционный анализ не отражает сложные, нелинейные зависимости между параметрами и не отражает связь группы и фактора. По этой причине было принято решение о проведении дополнительного анализа результатов. Первоначально было проведено разделение всех исследований на две группы: первая группа исследования и три оставшиеся вместе. Данное разделение было предпринято, чтобы определить различия между группами, уже являющимися предраковыми, или РЖ и группой, которая не обладает потенциалом к озлокачествлению. Подсчет различий осуществлялся методами непараметрической статистики Манна - Уитни. В ходе проведения анализа достоверные различия были найдены по параметру КЭ AKT (p = 0,035) и ИФ VEGFR2 (p = 0,005). Следующее разделение было проведено на группу с РЖ и группу, имеющую предпосылки к развитию РЖ (группы 2 и 3). Различия между этими группами были найдены по показателю апоптоза (p = 0,002). Достоверные различия при использовании методов непараметрической статистики в группах 2 и 3 были получены по нескольким параметрам: КЭ AKT, а также ИФ всех исследуемых маркеров, поэтому было решено провести дискриминантный анализ для определения вклада каждого параметра и выявления наиболее значимых признаков для различий групп. На основании анализа наиболее значимыми выступили ИФ mTOR (p = 0,011) и КЭ AKT (p = 0,002). По показателю ИФ mTOR лучше определялась группа с наличием диспластических изменений СОЖ, а по КЭ AKT – группа с атрофическим гастритом и метаплазией СОЖ.

Для оценки анализа различий между группами было произведено разделение всех пациентов на группы, в которые входили пациенты с предраковыми состояниями и изменениями СОЖ (с наличием атрофического гастрита с КМ или дисплазией СОЖ) и пациенты с хроническим поверхностным гастритом, который не имеет злокачественного потенциала. Для анализа этого был применен дискриминантный анализ, выделена совокупность маркеров: КЭ AKT, ИФ VEGFR2, ИФ mTOR, по которым группы отличались больше всего. По результатам анализа чувствительность составила 80 %, а специфичность - 91,7 %.

Таким образом, самым показательным маркером состояний и изменений СОЖ явилась киназа AKT, играющая важную роль в регуляции клеточного цикла, ангиогенезе и механизмах апоптоза. Она достоверно отличала между собой группы исследования, а также имела значение при выявлении различия между сгруппированными данными на основании их потенциала к озлокачествлению. Эта молекула может послужить тем маркером, на основании которого можно говорить о потенциале тканей к злокачественной трансформации, а также проводить дифференциальную диагностику между пограничными состояниями СОЖ.

На основании этого разработан рекомендуемый диагностический алгоритм (рисунок 16), включающий взятие биопсийного материала, наличие сомнительного гистологического заключения с целью дифференциальной диагностики, например, дисплазии высокой степени и рака, а также воспалительных изменений и дисплазии СОЖ.

В ходе работы было произведено клиническое наблюдение. Пациенту 58 лет в ходе рутинной гастроскопии, где был заподозрен хронический атрофический гастрит с кишечной метаплазией, было произведено взятие биопсийного материала при подозрении на наличие очагов кишечной метаплазии. По результатам гистологического исследования была обнаружена очаговая кишечная метаплазия без наличия инфицирования H.pylori. При этом ИА составил 3,1, КЭ mTOR 78,6, КЭ AKT 77,2, КЭ VEGFR2 970,2, КЭ GSK3 246,3, ИФ mTOR 0,0718, ИФ AKT 0,0312, ИФ VEGFR2 0,0222, ИФ GSK3 0,0049. Через два года пациенту повторно была произведена гастроскопия, где были обнаружены множественные эрозии и выраженные явления поверхностного гастрита. По результатам биопсии получена картина хронического гастрита. При проведении лабораторного эксперимента были получены следующие данные: ИА 34,1, КЭ mTOR 160,2, КЭ AKT 93,9, КЭ VEGFR2 114,8, КЭ GSK3 113,5, ИФ mTOR 0,0045, ИФ AKT 0,0238, ИФ VEGFR2 0,0199, ИФ GSK3 0,0042. Самые значительные изменения произошли по показателям КЭ и ИФ mTOR и КЭ VEGFR2. На рисунке 17 представлены фотографии окраски тканей СОЖ пациента методом TUNEL и иммуногистохимического анализа, произведенных в ходе первичного и последующего обращения.