Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Перспективы использования скаффолдов для стимуляции репаративной регенерациикостной ткани (обзор литературы) 18
1.1. Структурно-функциональные особенности костной ткани 18
1.2. Регенерация и ремоделирование костной ткани 20
1.3. Современные принципы восстановления и замещения утраченной костной ткани 25
1.4. Современный этап развития скаффолд-технологии: структура, функции и свойства матриц для стимуляции регенерации тканей 27
1.5. Особенности скаффолдов для замещения дефектов и стимуляции регенерации костной ткани 33
Глава 2. Материал и методы исследования 41
2.1. Объекты исследования 41
2.1.1. Объекты экспериментального исследования – скаффолды 41
2.1.2. Организация экспериментов с лабораторными животными 41
2.1.3. Методика субкутанной имплантации скаффолдов у животных 42
2.1.4. Объекты исследования микроциркуляции кожи при субкутанной имплантации скаффолдов 43
2.1.5. Объекты гистоморфологического исследования при субкутанной имплантации скаффолдов 43
2.1.6. Объекты биохимического исследования при субкутанной имплантации скаффолдов 43
2.2. Методы исследования 44
2.2.1. Исследование изменений микроциркуляции кожи над зоной имплантации или имитации имплантации скаффолдов 44
2.2.2. Гистоморфологические методы исследования 46
2.2.3. Методы биохимических исследований 47
2.3. Статистическая обработка материала 47
Глава 3. Местные и системные реакции организма в ответ на хирургическую травматизацию мягких тканей, имитирующую имплантациискаффолда 48
3.1. Изменения перфузионного показателя и активных механизмов модуляции микроциркуляции кожи при травматизации мягких тканей в объеме, соответствующем подкожной имплантации скаффолда 48
3.2. Локальные тканевые реакции области травматизации мягких тканей при оперативном вмешательстве в объеме, соответствующем подкожной имплантации скаффолда 53
3.3. Изменение концентрации маркеров острой фазы воспалительной реакции при оперативном вмешательстве в объеме, соответствующем подкожной имплантации скаффолда 55
Глава 4. Изменения перфузии кожи и структуры мягких тканей при субкутанной имплантации скаффолда, не обладающего биосовместимостью 58
4.1. Изменения перфузионного показателя и активных механизмов модуляции микроциркуляции кожи при имплантации скаффолда, не обладающего биосовместимостью 58
4.2. Динамика заселения матрицы клетками соединительной ткани при подкожной имплантации скаффолда, не обладающего биосовместимостью 64
4.3 Изменение маркеров острой фазы воспалительной реакции при имплантации скаффолда, не обладающего биосовместимостью 71
4.4. Изменение механизмов регуляции ангиогенеза при имплантации скаффолда, не обладающего биосовместимостью 72
Глава 5. Местные и системные реакции организма при подкожной имплантации скаффолда на основе поликапролактона и гидроксиапатита 74
5.1. Изменения перфузионного показателя и активных механизмов модуляции микроциркуляции кожи при имплантации скаффолда на основе поликапролактона и гидроксиапатита 74
5.2. Локальные изменения морфологии тканей при подкожной имплантации скаффолда на основе поликапролактона и гидроксиапатита 84
5.3. Изменение маркеров острой фазы воспалительной реакции при имплантации скаффолда на основе поликапролактона и гидроксиапатита 91
5.4. Изменение механизмов регуляции ангиогенеза при имплантации скаффолда на основе поликапролактона и гидроксиапатита обсуждение полученных результатов 95
Заключение 104
Практические рекомендации 105
Перспективы дальнейшей разработки темы 105
Список литературы
- Современный этап развития скаффолд-технологии: структура, функции и свойства матриц для стимуляции регенерации тканей
- Объекты исследования микроциркуляции кожи при субкутанной имплантации скаффолдов
- Локальные тканевые реакции области травматизации мягких тканей при оперативном вмешательстве в объеме, соответствующем подкожной имплантации скаффолда
- Динамика заселения матрицы клетками соединительной ткани при подкожной имплантации скаффолда, не обладающего биосовместимостью
Современный этап развития скаффолд-технологии: структура, функции и свойства матриц для стимуляции регенерации тканей
Регенерация костной ткани, как и любой другой, может быть физиологической и репаративной. Физиологическая регенерация представляет собой процесс обновления изношенных в результате жизнедеятельности структур клеток и тканей в здоровом организме. Репаративная (восстановительная) регенерация – это восстановление клеток и тканей, поврежденных или утраченных в результате воздействия внешнего повреждающего или травмирующего фактора (Третьяков А. А. и соавт., 2012). В настоящее время во всем мире травмы опорно-двигательного аппарата являются второй из наиболее распространенных причин для обращения за врачебной помощью, что составляет 25% от общего объема медицинских расходов (Chehade M., 2008). По частоте распространнности патология опорно-двигательного аппарата уступает лишь сердечно-сосудистым и онкологическим заболеваниям (ВОЗ). Однако у лиц молодого трудоспособного возраста эта проблема носит весьма актуальный характер и является основной причиной потери трудоспособности. В последние годы также наблюдается тенденция к росту патологии опорно-двигательной системы, а это, в свою очередь, автоматически увеличивает запрос на замещения дефектов костной ткани (Кирилова И.А., 2011).
При повреждении целостности кости е заживление в большинстве случаев протекает через сложный, но хорошо «отрегулированный» механизм эндохондрального или перихондрального окостенения в сочетании с ремоделированием (Gerstenfeld L.C., 2003). Процесс заживления перелома делится на четыре последовательных этапа. При переломе, остеотомии или травме кости, приводящих к нарушению е целостности, на 1-м этапе формируется гематома в месте повреждения. Следует отметить, что гематома, формирующаяся непосредственно после травмы в зоне перелома, содержит не только клетки периферической крови, но и костного мозга. Кроме того, формирование гематомы занимает достаточно продолжительный период времени, что обусловлено особенностями кровеносного русла костной ткани, в частности венозного его отдела. Вены костей, согласно морфологической классификации, относятся к безмышечному типу и сращены своей наружной оболочкой с костной тканью, что препятствует их спадению, а следовательно, и остановке кровотечения (Кузнецов С.Л. и соавт., 2012; Быков В.Л. и соавт., 2013; Афанасьев Ю.И. и соавт., 2016).
При образовании гематомы происходит е инфильтрация лейкоцитами, которые выделяют ряд цитокинов, запускающих процесс воспаления, что инициирует 2-й этап регенерации (Marsell R. et al., 2011; Oryan A. et al., 2013). В случае травмы происходит строго регулируемая, кратковременная, локальная секреция цитокинов. Пик продукции провоспалительных факторов происходит в первые 24 часа после травмы и завершается к 7-м суткам. При более детальном рассмотрении цитокинового баланса следует отметить, что острая воспалительная реакция при травме кости включает в себя секрецию иммунокомпетентными клетками фактора некроза опухоли-альфа (ФНО-альфа), интерлейкина (ИЛ) ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-11 и ИЛ-18 (Gerstenfeld L.C. et al., 2004; Marsell R. et al., 2011). Данные провоспалительные цитокины стимулируют ангиогенез, оказывая положительное воздействие на репаративные процессы, а также опосредованно активируют рецепторы TNFR1 и TNFR2, которые экспрессируются как на остеобластах, так и на остеокластах. Однако TNFR2 экспрессируется только после травмы, что указывает на более специфическую роль в репаративной регенерации костной ткани (Kon T. et al., 2001; Balga R. et al., 2006). Среди всех продуцируемых провоспалительных веществ ИЛ-1 и ИЛ-6 предположительно вносят наибольший вклад в регенерацию переломов (Marsell R. et al., 2011; Oryan A. et al., 2013). ИЛ-1 вырабатывается макрофагами в острой фазе воспаления и инициирует выработку ИЛ-6 остеобластами, который способствует образованию первичной мозоли, а также стимулирует ангиогенез на поврежденном участке при помощи активации любого из двух его рецепторов ИЛ-1RI или ИЛ-1RII (Kon T. et al., 2001; Lee S.K. et al., 2006). ИЛ-6 вырабатывается только в период острой фазы и стимулирует ангиогенез, выработку эндотелиального фактора роста (VEGF), а также дифференцировку остеобластов и остеокластов (Yang X. et al., 2006; Marsell R. et al., 2011). Несмотря на стимулирующее влияние цитокинов на процесс образования костной мозоли, общеизвестно их негативное влияние на репаративные процессы в костях и суставах при длительном или хроническом воздействии, что свидетельствует об исключительной важности временного паттерна выделения данных факторов (Marsell R. et al., 2011).
Ключевым моментом 2-го этапа регенерации при переломах является формирование первичной мозоли, состоящей из соединительной, хрящевой и костной тканей. В ходе экспериментальных работ на животных (крысах, кроликах, мышах) обнаружено, что пик формирования мягкой костной мозоли происходит спустя 7–9 дней после травмы (Zhang M. et al., 2011; Cappello T. et al., 2013; Oryan A. et al., 2013). Источниками образования первичной мозоли являются хондробласты, остеобласты и соединительнотканные клетки периоста и эндоста костей. Для того чтобы процесс регенерации протекал в оптимальных условиях, необходимы специфические мезенхимальные стволовые клетки (МСК), которые способны пролиферировать и дифференцироваться в клетки хрящевой и костной ткани (Oryan A. et al., 2011, 2012; Moshiri A. et al., 2013). Откуда эти клетки приходят в зону перелом – вопрос, который на сегодняшний день является открытым. Большинство данных указывает, что МСК мигрируют в область перелома из окружающих мягких тканей и костного мозга. Однако недавние исследования свидетельствуют о том, что набор циркулирующих с током крови МСК может иметь большое значение для оптимальной регенерации поврежденного участка (Marsell R. et al., 2011; Moshiri A. et al., 2013). Для регенерации пролома кости требуется обеспечение адекватного кровоснабжения, что наглядно демонстрирует важную роль реваскуляризации для успешного восстановления целостности кости. Процесс васкуляризации регулируется двумя молекулярными путями: это ангиопоэтин-зависимый путь и VEGF-зависимый путь (Parizi A.M. et al., 2012; Moshiri A. et al., 2013). В группу ангиопоэтинов в первую очередь входят ангиопоэтин-1 и -2, которые являются сосудистыми морфогенетическими белками. Их экспрессия инициируется в начале регенераторных процессов, и предполагается, что они способствуют первичному сосудистому разрастанию (спрутингу) сосудов в надкостнице. Однако VEGF-путь считается ключевым регулятором ангиогенеза. Было показано, что остеобласты и гипертрофированные хондроциты экспрессируют высокие уровни VEGF, и тем самым способствуют инвазии кровеносных сосудов и перестройку аваскулярной хрящевой матрицы в васкуляризированную костную ткань (Moshiri A. et al., 2013). На 3-м этапе для дальнейшей регенерации кости первичная мягкая мозоль замещается твердой костной мозолью. Этот этап заживления переломов в некоторой степени имитирует развитие кости в эмбриональном периоде, характеризуясь сочетанием клеточной пролиферации и дифференцировки, уплотнения и минерализации межклеточного матрикса (Oryan A. et al., 2013). По своей сути данный этап включает в себя элементы первичного и вторичного остеогистогенеза. При этом вторичный остеогистогенез – окостенение хрящевых элементов первичной мозоли протекает двумя механизмами – пери- и энходральной оссификации. Так, перихондральный механизм характеризуется окостенением в соединительно-тканной мембране надкостницы непосредственно рядом с дистальным и проксимальным концами отломков, что постепенно приводит к формированию твердой мозоли, обеспечивая перелому полужесткую фиксацию, позволяющую нагрузку травмированного сегмента (Суздальцева Ю.Г. и соавт., 2007; Marsell R. et al., 2011; Oryan A. et al., 2013). На 3-м этапе, после формирования первичной мозоли, также происходит активация процесса энхондрального окостенения, который заключается в формировании костной ткани между костными отломками (Marsell R. et al., 2011). Связь между регенерацией костной ткани и развитием костей стала еще более отчетливой вследствие недавнего исследования роли Wnt-белкового семейства, которое имеет большое значение как в эмбриогенезе, так и при репаративной регенерации костной ткани. Wnt-белки предположительно обеспечивают дифференцировку плюрипотентных МСК в остеобластые линии, а на более поздних стадиях развития регулируют формирование остеобластов костной ткани. Активация энходрального окостенения в мягкой мозоли сопровождается гипертрофией хондроцитов и накоплением минеральных веществ во внеклеточном матриксе, то есть омелением хряща. Каскад регуляторных реакций при резорбции
Объекты исследования микроциркуляции кожи при субкутанной имплантации скаффолдов
Исследование микроциркуляции в сосудах кожи и механизмов его модуляции проведено на 3-х группах крыс-самцов: I группа (n = 10) – группа сравнения – включала животных, которым проводилось хирургическое вмешательство, включающее формирование «кармана» в подкожной клетчатке и наложение швов, но без имплантации скаффолда. II группа (n = 10) – группа отрицательного контроля – включала животных, которым выполнялась подкожная гетеротопическая имплантация скаффолда на основе ПКЛ, на поверхности которого был адсорбирован чужеродный белок с целью провокации воспалительной реакции (скаффолд, не обладающий биосовместимостью). III группа (n = 10) – животные с проведенной подкожной гетеротопической имплантацией скаффолда на основе ПКЛ и ГА в область холки.
С целью оценки морфологической картины тканевых реакций и динамики заселения матриц клетками соединительной ткани проводили исследование препаратов мягких тканей зоны имплантации скаффолда или же области имитации имплантации (области оперативного вмешательства у животных группы сравнения) у 90 животных, разделенных на три группы, как описано в предыдущем разделе. Выведение животных из опыта осуществляли путем декапитации по 10 особей из каждой группы на 7, 14 и 21-е сутки эксперимента. 2.1.6. Объекты биохимического исследования при субкутанной имплантации скаффолдов
С целью определения активности воспалительного процесса и механизмов регуляции ангиогенеза при имплантации скаффолдов проводили биохимические исследования сыворотки крови трех групп животных. Для биохимического исследования получали сыворотку из крови, взятой у животных пункцией правых отделов сердца с последующим 15-минутным центрифугированием при 3 тыс. об. в минуту. Забор крови у животных производили непосредственно перед выводом из эксперимента во всех группах на 7, 14, 21-е сутки.
Изменения микроциркуляции проводилось методом лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) с помощью компьютеризированного лазерного анализатора микроциркуляции крови «ЛАКК-ОП» (производство НПП «Лазма», Россия) с использованием программы LDF 2.20.0.507WL.
Перед регистрацией ЛДФ-граммы проводилась проверка «нулевого» показания анализатора. Для этого рабочий торец зонда с насадкой устанавливался перпендикулярно внутренней поверхности белого диска из фторопласта, вращением ручки «уст. нуля» на передней панели добивались нулевого показания на индикаторном табло. Проверка «нулевого» показания анализатора «ЛАКК-ОП» проводилась с целью повышения достоверности получаемых результатов. Металлическая насадка со световодным зондом фиксировалась на области холки животного, непосредственно над зоной имплантации или имитации имплантации скаффолда при помощи атравматического пластыря. Изменения потока крови в микроциркуляторном русле кожи животного регистрировались в виде кривой (ЛДФ-граммы), отображаемой на экране монитора компьютера, сопряженного с анализатором «ЛАКК-ОП». Длительность стандартной записи составляла 8 минут и осуществлялась на 7, 14 и 21-е сутки эксперимента.
Расчет параметров базального кровотока проводился в два этапа. На первом этапе рассчитывали показатель перфузии (М) – величина среднего потока крови в интервалах времени регистрации или среднее арифметическое значение перфузии в перфузионных единицах (пф. ед.). Типичный вид кривых, отражающих изменение потока крови в микроциркуляторном русле у белых крыс-самцов, представлен на рис. 1.
На втором этапе проводился вейвлет-анализ ЛДФ-граммы с использованием программного обеспечения LDF версии 3.0.2.395. При изучении активных механизмов модуляции микроциркуляции с помощью спектрального вейвлет-анализа оценивали величины пиковых частот, абсолютных и нормированных амплитуд осцилляций в эндотелиальных (0,01–0,076 Гц), нейрогенных (0,076– 0,2 Гц) и миогенных (0,2–0,74 Гц) диапазонах (Humeau A. et al., 2004; Крупаткин А.И., 2013; Александрин В.В., 2014; Иванов А.Н. и соавт., 2014). Интерпретация результатов проводилась в соответствии с трактовками, изложенными в (Крупаткин А.И., Сидоров В.В., 2005). Типичный вид графиков, отражающих спектральные характеристики осцилляций кровотока в микроциркуляторном русле кожи интактных крыс-самцов, отображен на рис. 2.
Для проведения морфологического исследования проводили забор мягких тканей области имплантации, включающих скаффолд, единым блоком. Материал для морфологического исследования фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина (ООО «Биовитрум», Россия), обезвоживали в спиртах восходящей крепости, после чего для выполнения срезов препараты заливали в парафин. Срезы толщиной 5 – 7 мкм окрашивали гематоксилином Майера (ООО «Биовитрум», Россия) и эозином (ООО «Биовитрум», Россия). Для покрытия срезов применяли Bio-Monht («Bio Optica», Италия). Исследование препаратов проводили при помощи микроскопа AxioImager Z2 (производство Carl Zeiss, Германия). Оценивали структуру, клеточный состав, состояние микроциркуляторного русла окружающих скаффолд мягких тканей, динамику их заселения клеточными элементами и состав клеточных популяций. При оценке динамики состава клеточных популяций скаффолдов проводили подсчет количества фибробластов, фиброцитов, нейтрофильных лейкоцитов, моноцитов и макрофагов, а также лимфоцитов на одно поле зрения при увеличении х 400.
Определение концентрации VEGF проводили в сыворотке крови, полученной, как описано в разделе 2.1.6, на автоматическом микропланшетном спектрофотометре «EpochBioTek Instruments» методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием набора реактивов «VEGF Rat» фирмы RnD Systems (США). Определение концентрации С-реактивного белка (СРБ) проводили в сыворотке крови, полученной, как описано в разделе 2.1.6, иммунотурбидиметрическим тестом DiaSys Diagnostic Systems GmbH (Германия), с помощью анализатора Sapphire-350 (Ирландия). Активность церулоплазмина определялась по степени окисления раствора пара-фенилендиамина в сыворотке крови модифицированным методом Ревина и выражалась в условных единицах (у. е.) (Пишак В.П. и соавт., 1998).
Локальные тканевые реакции области травматизации мягких тканей при оперативном вмешательстве в объеме, соответствующем подкожной имплантации скаффолда
Стенки сосудов микроциркуляторного русла утолщены, эндотелий частично десквамирован. В мягких тканях, окружающих скаффолд, и в нем самом определяются сидерофаги, а также свободнолежащие глыбки гемосидерина. В структуре скаффолда выявляются единичные клетки соединительной ткани на фоне выраженной лейкоцитарной инфильтрации (рис. 9 Б).
Скаффолд на основе ПКЛ с чужеродным белком и его перифокальная зона на 14-е сутки эксперимента Г-Э: А – граница скаффолда и окружающих его тканей. Об. 20 х; Б – лейкоцитарная инфильтрация скаффолда Об. 20 х; В – гигантские клетки инородных тел Об. 63 х В составе лейкоцитарной инфильтрации преобладают нейтрофилы, обнаруживаются моноциты, макрофаги и лимфоциты (табл. 8). При этом количество нейтрофильных лейкоцитов и лимфоцитов не претерпевает статистически значимой динамики, а количество макрофагов – статистически значимо увеличивается по сравнению с 7-ми сутками эксперимента (табл. 8), отмечается формирование гигантских клеток инородных тел (рис. 9 В).
Таким образом, данные морфологического исследования препаратов мягких тканей зоны имплантации скаффолда, не обладающего биосовместимостью, свидетельствуют о продолжающейся местной воспалительной реакции у данной группы животных на 14-е сутки эксперимента.
Через 21-е сутки вокруг имплантированного скаффолда наблюдается сформированный барьер грануляционной ткани (рис. 10 А), инфильтрированный клетками лейкоцитарного ряда, среди которых присутствуют макрофаги, моноциты, лимфоциты и плазматические клетки (рис. 10 Б). В перифокальной области отмечается неравномерное кровенаполнение сосудов микроциркуляторного русла, а местами отмечаются мелкоочаговые кровоизлияния и диапедез эритроцитов. На 21-е сутки эксперимента скаффолд инфильтрирован клетками лейкоцитарного ряда, определяются преимущественно нейтрофилы (рис 10 В), единичные макрофаги и гигантские многоядерные клетки, плазматические клетки, лимфоциты (табл. 8). При этом по сравнению с 14-ми сутками эксперимента динамика состава лейкоцитарной инфильтрации проявляется только уменьшением числа лимфоцитов в поле зрения. В составе скаффолда, кроме лейкоцитов, выявляется небольшое количество фибробластов и фиброцитов, количество которых увеличивается по сравнению как с 7-ми, так и с 14-ми сутками эксперимента (табл. 8). Васкуляризация скаффолда выражена слабо – в отдельных зонах наблюдаются единичные сосуды микроциркуляторного русла. А
Скаффолд на основе ПКЛ с чужеродным белком и его перифокальная зона на 21-е сутки эксперимента Г-Э: А – граница скаффолда и окружающих его тканей. Об. 20 х; Б – перифокальная зона Об. 63 х; В – инфильтрация скаффолда Об. 63х Полученные морфологические данные подтверждают отсутствие биосовместимости скаффолда на основе ПКЛ с адсорбированным чужеродным белком. Изменения морфологической картины препаратов мягких тканей области имплантации скаффолда, не обладающего биосовместимостью, свидетельствует о развитии активной воспалительной реакции в период с 7-х по 21-е сутки, сопровождающейся выраженной лейкоцитарной инфильтрацией. Принимая во внимание данные предыдущего раздела, изменения перфузии, миогенного и нейрогенного контроля, вероятно, обусловлены действием провоспалительных цитокинов, выделяемых лейкоцитами. К 14-м суткам воспалительная реакция в зоне имплантации скаффолда, содержащего чужеродный белок, переходит в пролиферативную фазу, что приводит к началу формирования отграничивающего барьера. На фоне выраженной лейкоцитарной инфильтрации скаффолда заселение его клетками соединительной ткани происходит крайне слабо. Васкуляризация скаффолда также не выражена. Клеточный состав скаффолда у животных данной группы на всех сроках наблюдения представлен преимущественно лейкоцитами.
Таким образом, в группе отрицательного контроля интенсивная воспалительная реакция протекает с преобладанием альтеративных и экссудативных процессов, которые проявляются выраженной лейкоцитарной инфильтрацией, а также слабыми васкуляризацией и колонизацией скаффолда клеточными элементами. Показатели ЛДФ соответствуют картине морфологических изменений, возникающих при имплантации скаффолдов с одсарбированным чужеродным белком, что подтверждает целесообразность интерпретации стойкого повышения перфузии, реализуемого за счет снижения миогенного тонуса в качестве критериев отсутствия биосовместимости скаффолдов.
Динамика заселения матрицы клетками соединительной ткани при подкожной имплантации скаффолда, не обладающего биосовместимостью
Полученные результаты свидетельствуют о том, что при подкожной имплантации оригинального отечественного скаффолда, изготовленного из ПКЛ и ГА, локальные изменения перфузии кожи имеют транзиторный характер, сопровождаются незначительными изменениями нейрогенного и миогенного тонуса только на 7-е сутки эксперимента. Отсутствие выраженных изменений миогенного тонуса сосудов микроциркуляторного русла, в свою очередь, обусловливает быструю нормализацию перфузии кожи в области имплантации скаффолдов на основе ПКЛ и ГА. При этом степень выраженности и продолжительность сдвигов перфузии, нейрогенного и миогенного механизмов е модуляции не превышает таковые у ложнооперированных животных, что позволяет сделать заключение о травматическом характере их генеза. Полная нормализация миогенного тонуса микрососудов и перфузии кожи в области имплантации матриц из ПКЛ и ГА к 14-м суткам эксперимента, свидетельствует об отсутствии у этих скаффолдов гистопатогенных эффектов. В связи с этим транзиторные сдвиги перфузии, не сопровождающиеся выраженными изменениями активной модуляции микроциркуляции при имплантации скаффолдов, следует считать прогностически благоприятным и рассматривать в качестве критериев биосовместимости матриц.
Для верификации выявленных микроциркуляторных критериев наличия и отсутствия биосовместимости в соответствии с рекомендациями межгосударственного стандарта оценки биологического действия медицинских изделий ISO (ГОСТ 10993-2011) было проведено морфологическое исследование комплекса мягких тканей области имплантации матриц на основе ПКЛ и ГА, в сравнении со скаффолдами, содержащими чужеродный белок.
Полученные данные морфологических исследований подтверждают то, что при имплантации скаффолда, содержащего чужеродный белок, развивается интенсивная и продолжительная воспалительная реакция, с преобладанием процессов альтерации и экссудации, характеризующихся полнокровием сосудов микроциркуляторного русла, отеком и выраженной лейкоцитарной инфильтрацией тканей, окружающих скаффолд. При этом пролиферативные процессы проявляются формированием к 21-м суткам соединительнотканного барьера, инфильтрированного лейкоцитами, препятствующего заселению скаффолда элементами соединительной ткани и васкуляризации, приводя в конечном итоге к отграничению матрицы от окружающих его тканей. Морфологические признаки воспаления в области имплантации и отсутствие интеграции скаффолда, содержащего чужеродный белок, характеризуют отсутствие биосовместимости. Учитывая, что лейкоциты являются продуцентами провоспалительных цитокинов (Gerstenfeld L.C. et al., 2004; Marsell R. et al., 2011), интенсивная лейкоцитарная инфильтрация объясняет стойкое снижение миогенного тонуса, обусловливающего увеличение перфузии кожи над областью имплантации скаффолдов с чужеродным белком, а обнаруженное в гистологических препаратах полнокровие сосудов верифицирует выявленные с помощью лазерной допплеровской флоуметрии микроциркуляторные критерии отсутствия биосовместимости матриц.
В противоположность группе отрицательного контроля при морфологическом исследовании зоны имплантации скаффолдов на основе ПКЛ и ГА были обнаружены слабовыраженные воспалительные изменения, проявляющиеся умеренным полнокровием сосудов, отеками и инфильтрацией единичными лейкоцитами перифокальной зоны только на 7-е сутки эксперимента. Вместе с тем скаффолды на основе ПКЛ и ГА интенсивно заселялись соединительнотканными элементами начиная с 7-х суток после имплантации и васкуляризовались к 14-м суткам. Отсутствие выраженных воспалительных изменений перифокальной зоны, активное заселение соединительнотканными элементами и васкуляризация доказывают биосовместимость скаффолдов на основе ПКЛ и ГА. Соответствие транзиторных изменений перфузии и модуляции кровотока кожи над областью имплантации матриц на основе ПКЛ и ГА динамике слабо выраженных реактивных изменений тканей перифокальной области верифицирует указанные изменения микроциркуляции в качестве критериев биосовместимости скаффолдов. Представленные данные согласуются с результатами исследований ряда авторов, демонстрирующими биосовместимость скаффолдов, содержащих ПКЛ-элементы, в условиях in vitro (Видяшева И.В. и соавт., 2014; Bregy А. et al., 2008; Badra S. et al., 2012; Lebourg M. et al., 2012; Kamath М.S. et al., 2013). Кроме того, в литературе имеются данные, что при подкожной имплантации скаффолда на основе ПКЛ мышам также происходит заселение его соединительнотканными элементами на фоне умеренной инфильтрации лимфоцитами и макрофагами (Seyednejad Н. et al., 2012). Сопоставление результатов собственных исследований с указанными литературными данными позволяет заключить, что параметры биосовместимости разработанных скаффолдов на основе ПКЛ с ГА не уступают аналоговым матрицам из ПКЛ.
Таким образом, изменения перфузии кожи над областью имплантации матриц соответствуют морфологической картине тканевых реакций, что позволяет использовать метод лазерной допплеровской флоуметрии для динамической оценки биосовместимости скаффолдов в ходе субкутанных имплантационных тестов. Совокупность результатов функциональных и морфологических исследований свидетельствуют о хорошей биосовместимости оригинальных отечественных скаффолдов на основе ПКЛ и ГА, что определяет перспективы их использования в тканевой инженерии и позволяет рекомендовать апробацию в клинических условиях.
Ключевым патогенетическим аспектом, определяющим биосовместимость скаффолда, является интенсивность воспалительной реакции, возникающей при его имплантации в организм (Kon E. et al., 2012). Воспаление как типовой патологический процесс характеризуется не только локальными тканевыми и сосудистыми реакциями, но и системными проявлениями (Иванов А.Н. и соавт., 2015; Dhollander А.А. et al., 2012), поэтому для комплексной оценки параметров биосовместимости были исследованы концентрации СРБ и ЦП в крови при имплантации матриц на основе ПКЛ и ГА в сравнении с ложнооперированными крысами, а также животными, которым проводилась имплантация скаффолдов с чужеродным белком. Полученные данные свидетельствуют о том, что динамика маркеров острой фазы воспаления – СРБ и ЦП у животных всех 3-х групп соответствует изменениям перфузии и миогенного тонуса микрососудов кожи и степени выраженности локальных реактивных изменений, в частности лейкоцитарной инфильтрации тканей в области имплантации. Принимая во внимание тот факт, что ЦП и СРБ синтезируются печенью, в ответ на повышение уровня провоспалительных цитокинов выявленное в ходе исследования увеличение их концентрации в сыворотке, вероятно, обусловлено выделением цитокинов лейкоцитами в области имплантации скаффолдов (Шевченко О.П., 1996; Ким Л.Б. с соавт., 2006).
Отсутствие биосовместимости скаффолдов, содержащих чужеродный белок, характеризуется выраженным увеличением концентрации в крови белков острой фазы воспаления на протяжении трех недель эксперимента. Вместе с тем заселение скаффолдов, не обладающих биосовместимостью, клетками соединительной ткани при субкутанной имплантации крысам не происходит. Следовательно, выраженная и продолжительная воспалительная реакция препятствует заселению скаффолда клетками. Полученные результаты согласуются с данными других авторов, касающимися взаимосвязи процессов воспаления и заселения скаффолдов клетками. Так, было продемонстрировано, что воспалительная реакция, сопровождающаяся лейкоцитарной инфильтрацией, затрудняет заселение гидрогелевых скаффолдов на основе природных полимеров – хитозана и коллагена (Rcker M. et al., 2006).