Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 17
1.1 Интерлейкин 2 и интерферон-гамма как ключевые факторы иммунной защиты против Mycobacterium tuberculosis 17
1.2 Рецептор-опосредованный путь активации Т-лимфоцитов 23
1.2.1 Структура «иммунологического синапса» и его роль в активации T-лимфоцитов 23
1.2.2 Основные транскрипционные факторы рецептор-опосредованного пути активации Т-лимфоцитов 31
1.2.2.1 Транскрипционный фактор NF-кВ и его роль в иммунном ответе 31
1.2.2.2 Транскрипционный фактор NFAT и его роль в иммунном ответе 38
1.2.2.3 Транскрипционный фактор АР-1 и его роль в иммунном ответе 42
1.3 Цитокин-опосредованный путь активации Т-лимфоцитов 47
1.3.1 Роль цитокинов семейства интерлейкина 12 и их рецепторов в активации Т-лимфоцитов 48
1.3.2 Основные компоненты внутриклеточной JAK-STAT-сигнализации и роль транскрипционного фактора T-bet в цитокин-опосредованной активации Т-лимфоцитов 53
1.3.2.1 Тирозиновые киназы семейства JANUS 53
1.3.2.2 Транскрипционные факторы STAT 55
1.3.2.3 Транскрипционный фактор T-bet 58
1.3.2.4 Алгоритм цитокин-опосредованной активации Т-лимфоцитов 60
Глава 2 Материал и методы исследования 66
2.1 Объект исследования 66
2.2 Материал исследования 70
2.3 Дизайн исследования 70
2.4 Методы исследования 72
2.4.1 Выделение мононуклеарных лейкоцитов из крови 72
2.4.2 Выделение лимфоцитов из взвеси мононуклеарных лейкоцитов 73
2.4.3 Подсчет количества и определение жизнеспособности лимфоцитов в суспензии 73
2.4.4 Специфическая индукция выделенных клеток крови in vitro 74
2.4.5 Проточная цитофлуориметрия 83
2.4.5.1 Определение поверхностных молекул CD3, CD28 и внутриклеточного IL-2 лимфоцитов 83
2.4.5.2 Определение поверхностной молекулы CTLA4 на CD3-лимфоцитах 85
2.4.5.3 Определение внутриклеточных транскрипционных факторов NF-B, АР-1, NFAT1, NFAT2 и T-bet в CD3-лимфоцитах 86
2.4.5.4 Определение рецепторных молекул IL-12R2, gp130, WSX1 на CD3-лимфоцитах 87
2.4.5.5 Определение внутриклеточного IFN в CD3-лимфоцитах 88
2.4.6 Иммуноферментный анализ 89
2.4.6.1 Исследование базальной и CD3/CD28-индуцированной секреции IL-2 лимфоцитами 90
2.4.6.2 Исследование базальной и BCG-индуцированной секреции IL-12(p70) лимфоцитами 91
2.4.6.3 Исследование BCG-индуцированной секреции IL-12(p35) и IL-12(p40) лимфоцитами 92
2.4.6.4 Исследование базальной и BCG-индуцированной секреции IL-27 лимфоцитами 92
2.4.6.5 Определение содержания белков транскрипции STAT1 и STAT4 в лизатах IL-12/IL-27-индуцированных лимфоцитов 93
2.4.6.6 Определение содержания тирозиновых киназ JAK1, JAK2, TYK2 в лизатах IL-12/IL-27-индуцированных лимфоцитов 94
2.4.6.7 Исследование базальной и IL-12/IL-27-индуцированной секреции IFN лимфоцитами методом иммуноферментного анализа 94
2.4.7 Статистический анализ результатов 95
Глава 3 Результаты собственных исследований 96
3.1 Показатели функциональной активности CD3/CD28-индуцированных in vitro лимфоцитов у больных туберкулезом легких 96
3.1.1 Количество лимфоцитов, экспрессирующих молекулы CD3 и CD28, после CD3/CD28-индукции клеток in vitro у больных туберкулезом легких 96
3.1.2 Содержание CD3/CD28-индуцированных in vitro лимфоцитов, экспрессирующих молекулу CTLA4, у больных туберкулезом легких 99
3.1.3 Количество CD3/CD28-индуцированных in vitro Т-лимфоцитов, содержащих белки транскрипции NF-B, AP-1, NFAT, у больных туберкулезом легких 103
3.1.3.1 Количество CD3/CD28-индуцированных in vitro Т-лимфоцитов, содержащих белок транскрипции NF-B (p50), у больных туберкулезом легких 103
3.1.3.2 Количество CD3/CD28-индуцированных in vitro Т-лимфоцитов, содержащих белок транскрипции АР-1(c-JUN), у больных туберкулезом легких 106
3.1.3.3 Количество CD3/CD28-индуцированных in vitro Т-лимфоцитов, содержащих белки транскрипции NFAT, у больных туберкулезом легких 108
3.1.4 Количество лимфоцитов с внутриклеточным содержанием IL-2 после CD3/CD28-индукции клеток in vitro у больных туберкулёзом лёгких 114
3.1.5 Субпопуляционный состав CD3/CD28-индуцированных in vitro Т-лимфоцитов крови у больных туберкулёзом лёгких 115
3.1.6 Уровень базальной и CD3/CD28-индуцированной секреции in vitro IL-2 лимфоцитами у больных туберкулезом легких 119
3.2 Секреция in vitro интерлекинов семейства 12 в культуре мононуклеарных лейкоцитов у больных туберкулезом легких 121
3.2.1 Уровень базальной и BCG-индуцированной секреции in vitro IL-12(p70) мононуклеарными лейкоцитами у больных туберкулезом легких 121
3.2.2 Уровень BCG-индуцированной секреции in vitro IL-12(p35) и IL-12(p40) мононуклеарными лейкоцитами у больных туберкулезом легких 122
3.2.3 Уровень базальной и BCG-индуцированной секреции in vitro IL-27 мононуклеарными лейкоцитами у больных туберкулезом легких 124
3.3 Показатели функциональной активности IL-12/IL-27-индуцированных in vitro лимфоцитов у больных туберкулезом легких 125
3.3.1 Количество IL-12/IL-27-индуцированных in vitro лимфоцитов, экспрессирующих рецепторные молекулы к цитокинам семейства интерлейкина 12, у больных туберкулезом легких 125
3.3.1.2 Количество IL-12/IL-27-индуцированных in vitro Т-лимфоцитов, экспрессирующих рецепторные молекулы gp130 и WSX1, у больных туберкулезом легких 127
3.3.2 Концентрация тирозинкиназ JAK1, JAK2 и TYK2 в лизатах IL-12/IL-27-индуцированых in vitro лимфоцитов у больных туберкулезом легких 136
3.3.3 Концентрация белков транскрипции STAT1 и STAT4 в лизатах IL-12/IL-27-индуцированных in vitro лимфоцитов у больных туберкулезом легких 136
3.3.4 Количество IL-12/IL-27-индуцированных in vitro Т-лимфоцитов, содержащих белок транскрипции T-bet, у больных туберкулезом легких 138
3.3.5 Количество IL-12/IL-27-индуцированных in vitro лимфоцитов с внутриклеточным содержанием IFN у больных туберкулезом легких 141
3.3.6 Уровень базальной и IL-12/IL-27-индуцированной секреции in vitro IFN лимфоцитами у больных туберкулезом легких 145
Глава 4 Обсуждение результатов исследования 147
4.1 Патогенетические факторы нарушений рецептор-опосредованной активации Т-лимфоцитов 149
4.2 Патогенетические факторы нарушений цитокин-опосредованной активации Т-лимфоцитов 173
Выводы 193
Список принятых сокращений 195
Список литературы 198
- Структура «иммунологического синапса» и его роль в активации T-лимфоцитов
- Алгоритм цитокин-опосредованной активации Т-лимфоцитов
- Количество CD3/CD28-индуцированных in vitro Т-лимфоцитов, содержащих белки транскрипции NFAT, у больных туберкулезом легких
- Патогенетические факторы нарушений цитокин-опосредованной активации Т-лимфоцитов
Введение к работе
Актуальность темы исследования. В настоящее время не вызывает
сомнений, что патогенез туберкулезной инфекции обусловлен, с одной стороны,
изменениями биологических свойств возбудителя инфекции и увеличением доли
штаммов Mycobacterium tuberculosis, обладающих устойчивостью к средствам
этиотропной терапии, с другой стороны – нарушениями в иммунной системе хозяина
[Железникова Г.Ф., 2006; Воронкова О.В. и соавт., 2007; Тюлькова Т.Е. и соавт.,
2008; Ахматова Н.К., Киселевский М.В., 2012; Горлова Е.Е., 2010; Павлов В.А. и
соавт., 2011, Розов С.М. и соавт., 2016; Coll F. et al. 2018; Stutz M.D. et al. 2018].
Дисрегуляция механизмов иммунологической резистентности рассматривается как
один из ведущих факторов, предрасполагающих к возникновению, клинической
манифестации и прогрессированию туберкулезной инфекции. Исследования в
области изучения молекулярных основ вторичной иммунологической
недостаточности при туберкулезе легких (ТЛ) являются перспективными не только для понимания того, почему и как развивается болезнь, но и важными для разработки новых подходов к оптимизации лечения, направленных на повышение эффективности реакций противотуберкулезной защиты.
Туберкулез, ввиду паразитирования микобактерий внутри клеток
инфицированного организма, характеризуется, прежде всего, нарушениями
клеточно-опосредованного иммунитета, регуляторными и эффекторными клетками
которого являются Т-лимфоциты [Новицкий В.В. и соавт., 2006; Скрягина Е.М.,
2008; Воронкова О.В. и соавт., 2010; Чернушенко Е.Ф. и соавт., 2010; Чурина Е.Г. и
соавт., 2011; Новицкий В.В. и соавт., 2012; Elliott T.O. et al., 2015]. На данный
момент выделяют два главных пути активации T-лимфоцитов при их
взаимодействии с антигенпрезентирующими клетками (APC). Первый – рецептор-
опосредованный – реализуется при контактном взаимодействии Т-лимфоцита с АРС
для передачи антигенной специфики Т-лимфоциту через Т-клеточный рецептор для
распознавания антигена (CD3-TCR) при участии молекул костимуляции. Развитие
второго пути опосредуется цитокинами АРС при взаимодействии с
комплементарными им рецепторами на мембране Т-лимфоцита [Ивашкин В.Т., 2008; Ярилин А.А., 2010; Zuiga J. et al., 2012]. Оба пути активации Т-лимфоцитов приводят к поляризации дифференцировки «наивных» Т-лимфоцитов-хелперов (Th0) в Т-лимфоциты-хелперы типа 1 (Th1) и являются обязательными для формирования полноценного иммунного ответа на возбудитель инфекции.
Результирующим этапом рецептор-опосредованной активации Th1-
лимфоцитов являются синтез и секреция интерлейкина (IL) 2 – фактора роста для
всех субпопуляций Т-лимфоцитов, обеспечивающего их клональную пролиферацию
в ответ на антиген [Ивашкин В.Т., 2008; Ярилин А.А., 2010; Commins S.P. et al.,
2010]. Итогом цитокин-зависимой активации становится способность
активированных Th1-лимфоцитов синтезировать интерферон (IFN) , основными биологическими функциями которого являются активация эффекторных Т-
лимфоцитов и клеток врожденного иммунитета, осуществляющих деструкцию антигена (моноцитов/макрофагов, гранулоцитов, натуральных киллеров, или NK-клеток), стимуляция экспрессии молекул гистосовместимости класса II на АРС [Абатуров А.Е., 2007; Костанян И.А. и соавт., 2010; Ярилин А.А., 2010; Maher S.G. et al., 2010; Commins S.P. et al., 2010].
Учитывая ключевую роль секреции IL-2 и IFN для контроля над туберкулезной инфекцией, ее недостаточность или избыток может быть причиной неэффективности иммунного ответа на M. tuberculosis.
В работах, посвященных изучению in vitro секреции IL-2 при туберкулезе,
часто отмечается ее дефицит из-за уменьшения количества и дисфункции (гипо- и
анергии) Т-клеток [Кошкина А.А., 2012; Воронкова О.В. и соавт., 2010; Новицкий
В.В. и соавт., 2009; 2011; Уразова О.И. и соавт., 2010; Черенько С.А., Матвеева С.Л.,
2011]. Однако не до конца ясны механизмы, лежащие в их основе. Не исключено, что
причиной недостаточности IL-2 при туберкулезе могут быть нарушения рецептор-
опосредованной (контактной) активации Т-лимфоцитов [Ивашкин В.Т., 2008;
Ярилин А.А., 2010; Dustin M.L., Groves J.T., 2012; Dustin M.L., 2014], в том числе
дефицит молекул костимуляции – CD28 на Т-лимфоцитах и СD80/СD86 на APC,
обеспечивающих «усиление» специфического (антигенного) сигнала активации Т-
клеток через CD3-TCR [Bromley S.K. et al. 2001; Ивашкин В.Т., 2008; Ярилин А.А.,
2010]. Блок костимуляции приводит к апоптозу Т-лимфоцитов. При этом показано,
что инактивировать сигналы костимуляции и, напротив, запускать программу Т-
клеточной гибели могут молекулы, экспрессируемые клетками с
иммуносупрессорной функцией, к примеру, цитотоксический Т-лимфоцитарный
антиген 4 (CTLA4) на поверхности регуляторных Т-клеток (Treg) [Ярилин А.А.,
2010; Chen L., Flies D.B., 2013; Gardner D. et al. 2014]. Другим фактором нарушений
рецептор-опосредованной индукции Т-лимфоцитов, их анергии и гипосекреции IL-2
может быть несостоятельность или дефицит механизмов сигнальной трансдукции и
ядерных факторов NF-kB, AP-1, NFAT, участвующих в транскрипции гена IL2
[Macian F., 2005; Ивашкин В.Т., 2008; Ярилин А.А., 2010].
Что касается IFN, то результаты исследований, посвященных анализу его концентрации в крови и продукции in vitro у больных туберкулезом, носят противоречивый характер. В одних случаях авторы указывают на их увеличение [Новицкий В.В. и соавт., 2008; Воронкова и соавт., 2010; Уразова О.И. и соавт., 2010; 2011; Черенько С.А., Матвеева С.Л., 2011; Писаренко М.С., 2013], в других – на снижение в связи с угнетением Т-клеточного звена иммунной системы [Салина Т.Ю., Морозова Т.И., 2004; 2012; Мезенцева М.В. и соавт., 2011; Черенько С.А., Матвеева С.Л., 2011]. Вопрос о том, чем обусловлена такая разница в описании результатов, и какие молекулярные механизмы лежат в основе нарушений интерферонопродукции при туберкулезе, остается открытым.
Известно, что основными цитокинами АРС, опосредующими активацию Т-лимфоцитов в индуктивную фазу Th1-зависимого иммунного ответа, секрецию и рецепцию IFN, являются интерлейкины 12 и 27 [Симбирцев А.С., 2004; Watford W.T. et al. 2004; Pompei L. et al. 2007; Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., 2008; Pot C. et al. 2010]. Их влияние определяется экспрессией на Т-клетках рецепторных
молекул, состоящих из конститутивных и индуцибельных (синтезируемых в ответ на активацию) субъединиц. При этом синтез и экспрессия индуцибельных рецепторов к одним цитокинам может зависеть от синтеза и секреции других цитокинов. Так, экспрессия индуцибельной 2-субъединицы рецептора к IL-12 (IL-12R2) на Т-лимфоцитах активируется IL-27 через WSX1/gp130-рецепторный комплекс к цитокину [Hunter C.A., 2005; Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., 2008; Silver J.S., Hunter C.A., 2010; Hunter C.A., Kastelein R., 2012].
Поскольку взаимодействие цитокинов с комплементарными им рецепторами на поверхности Т-лимфоцитов приводит к запуску сигнальных JAK-STAT-путей, основными компонентами которых, применительно к Th1-иммунному ответу, являются тирозиновые янус-киназы JAK1, JAK2, TYK2 и транскрипционные факторы STAT1, STAT4 и T-bet [Минеев В.Н. и соавт., 2010; Kaushal M., Chorawala N.M., 2012], очевидно, что их дефицит может быть причиной нарушений активации Т-лимфоцитов и секреции IFN.
Несмотря на то, что алгоритмы рецепторной и цитокин-опосредованной
активации Т-лимфоцитов в общем известны, сведения о молекулярных механизмах
дисрегуляции иммунного ответа на различных этапах межклеточных
взаимодействий при туберкулезе носят фрагментарный и разнородный характер.
Степень разработанности темы исследования. Учитывая существенную роль нарушений Т-клеточного звена в иммунопатогенезе туберкулеза, большое внимание уделяется раскрытию механизмов супрессии противотуберкулезного иммунитета, активации различных типов программируемой гибели Т-клеток, нарушению их пролиферативной и цитокинсекреторной активности, а также поиску путей иммунокоррекции указанных нарушений.
В работах, направленных на изучение дисрегуляционной патологии
иммунитета, представлен широкий спектр нарушений функций клеток
макрофагального звена, в частности, показано снижение их фагоцитарной, антигенпрезентирующей и секреторной активности [Сахно Л.В. и соавт., 2008; 2009; Сорняков С.Н. и соавт., 2012; Сахно Л.В., Черных Е.Р., 2012; Хаитова З.К. и соавт., 2012; 2013; Romagnoli A. et al. 2012; Ottenhoff T.H., 2012]. Установлены нарушения процессов созревания и генерации APC при туберкулезе, приводящие к формированию толерогенных клеточных клонов макрофагов и дендритных клеток (DC), обладающих иммуносупрессорной активностью в отношении CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов [Сахно Л.В. и соавт., 2010; Тихонова М.А. и соавт., 2012; Сахно Л.В., Черных Е.Р., 2012; Теплова Н.В., 2012; Тыринова Т.В. и соавт., 2012; Хаитова З.К., 2013; Siddiqui K.F. et al., 2014; Kim H. et al., 2017]. In vitro «перепрограммирование» DC с помощью цитокинов и антигенов является перспективным направлением в терапии туберкулезной инфекции.
Важным аспектом исследований механизмов супрессии и апоптоза Т-лимфоцитов при ТЛ является изучение субпопуляций Treg [Железникова Г.Ф., 2011; Новицкий и соавт., 2012; Чурина Е.Г. и соавт., 2011; 2012; 2013; Churina E.G. et al., 2012; Хаитова З.К., 2013; Arram E.O. et al., 2014; Daz A. et al., 2015; Parkash O. et al., 2015]. Treg-опосредованное угнетение антигензависимой дифференцировки и клональной пролиферации Т-лимфоцитов-хелперов может лежать в основе
формирования Т-клеточной анергии при туберкулезе. Установлены молекулярно-клеточные механизмы, с помощью которых Treg и другие регуляторные Т-клетки реализуют свои иммуносупрессорные свойства: контактная супрессия при участии молекул CTLA4/B7, LAG3, гранзимов и др., супрессия посредством локальной секреции ингибиторных цитокинов (трансформирующего фактора роста (TGF) , IL-10, IL-35), супрессия за счет конкурентного связывания факторов роста [Onishi Y. et al., 2008; Mandapathil M. et al., 2010; Sakaguchi S. et al., 2010; Железникова Г.Ф., 2011; Chaturvedi V. et al., 2011; Munn D.H., 2011; Sakaguchi S., 2011; Trinath J. et al., 2012; Feruglio S.L. et al., 2015; Розов С.М. и соавт., 2016]. Однако до сих пор не установлено, какие типы регуляторных Т-клеток играют ключевую роль в развитии стойкой Т-клеточной иммуносупрессии при туберкулезной инфекции, какие конкретные механизмы используются данными клетками для реализации своих супрессивных свойств и как это соотносится с различными клинико-патогенетическими вариантами ТЛ.
Предположение о связи генетически обусловленных изменений продукции
активирующих и супрессорных цитокинов с характером протекания иммунного
ответа, тяжестью и продолжительностью инфекционных заболеваний
способствовало активному поиску генов-кандидатов, определяющих
подверженность туберкулезу. Установлено, что подверженность туберкулёзной инфекции ассоциирована с полиморфизмами генов ряда цитокинов – IL1В, IL2, IL4, IL12, IFNG и TGFB [Наследникова И.О. и соавт., 2010; Никулина Е.Л. и соавт., 2010; Байке Е.Е. и соавт., 2015; Qrafli M. et al., 2017]. Результаты данных исследований актуальны для решения проблемы целесообразности избирательной стимуляции продукции цитокинов в случае, если организм генетически детерминирован на низкий уровень их образования и, напротив, мишень-ориентированной блокады передачи сигнала активации в цепочке «рецептор-ядро-ген» при гиперсекреции супрессорных цитокинов.
В то же время следует учитывать, что для направленной коррекции нарушений
противотуберкулезного иммунитета необходимо четкое понимание молекулярных
механизмов его реализации и факторов, ей препятствующих. Однако, несмотря на
значительные успехи в области молекулярной иммунологии, патофизиологии
иммунитета и других смежных областях медико-биологической науки, молекулярно-
генетические механизмы, связанные с нарушениями инициации Th1-
ассоциированного иммунного ответа, в том числе на этапе рецепторной и цитокин-
зависимой активации Т-лимфоцитов при туберкулезной инфекции, сохраняются
практически неисследованными. Остается открытым вопрос о том, какие сигнальные
факторы инициируют или блокируют экспрессию генов антимикобактериальной
защиты и на каком этапе происходит разрушение кооперативных взаимодействий
между клетками иммунной системы – на уровне распознавания презентируемых АРС
антигенных детерминант, костимуляции, транскрипционных факторов, экспрессии
генов и кодируемых ими пептидов (цитокинов и их рецепторов)? Каковы
особенности этих нарушений при разных клинических формах болезни и связаны ли
они с биологическими характеристиками инфицирующего штамма возбудителя?
Цель исследования: установить общие закономерности и механизмы
нарушений CD3/CD28-рецепторной и IL-12/IL-27-цитокиновой активации Т-лимфоцитов при инфильтративном и диссеминированном туберкулезе легких.
Задачи исследования:
-
Выявить нарушения рецептор-опосредованной активации Т-лимфоцитов в ответ на индукцию CD3/CD28-антирецепторными антителами in vitro на клеточном (по экспрессии поверхностных кластеров дифференцировки (CD) 3 и 28, CTLA4) и внутриклеточном (по содержанию белков-регуляторов транскрипции NF-kB, NFAT, AP-1) этапах у больных инфильтративным и диссеминированным лекарственно-чувствительным и лекарственно-резистентным туберкулезом легких.
-
Оценить клеточный этап цитокин-опосредованной активации Т-лимфоцитов in vitro по базальной и BCG-индуцированной секреции мононуклеарными лейкоцитами цитокинов семейства интерлейкина 12 (IL-12 (p70, p35, p40) и IL-27) и экспрессии комплементарных им рецепторов IL-12R2 (к IL-12) и WSX1/gp130 (к IL-27) у больных инфильтративным и диссеминированным лекарственно-чувствительным и лекарственно-резистентным туберкулезом легких.
-
Оценить внутриклеточный этап цитокиновой активации IL-12/IL-27-индуцированных in vitro Т-лимфоцитов по содержанию тирозиновых киназ JAK 1 и 2, TYK2 и белков-регуляторов транскрипции STAT 1 и 4, T-bet в лимфоцитах крови у больных инфильтративным и диссеминированным лекарственно-чувствительным и лекарственно-резистентным туберкулезом легких.
-
Охарактеризовать функциональный ответ Т-лимфоцитов in vitro на CD3/CD28-рецепторную (по количеству IL-2-позитивных клеток и секреции IL-2) и IL-12/IL-27-цитокиновую (по количеству IFN-позитивных клеток и секреции IFN) стимуляцию у больных инфильтративным и диссеминированным лекарственно-чувствительным и лекарственно-резистентным туберкулезом легких.
-
Установить общие закономерности нарушений CD3/CD28-рецепторной и IL-12/IL-27-цитокиновой in vitro активации Т-лимфоцитов у больных туберкулезом легких и особенности их молекулярных механизмов в зависимости от клинической формы заболевания и лекарственной чувствительности возбудителя.
Научная новизна исследования. Впервые проведено многоуровневое
исследование нарушений отдельных этапов CD3/CD28- и IL-12/IL-27-
опосредованной активации Т-лимфоцитов при in vitro ее моделировании и дана их комплексная оценка при туберкулезе легких с учетом клинико-патогенетического варианта болезни.
Обосновано, что после CD3/CD28-индукции in vitro дефицит CD3/CD28-экспрессирующих лимфоцитов сочетается со снижением количества субпопуляций IL-2-позитивных клеток (CD3+CD28+IL2+, IL2+) и гипосекрецией IL-2 с наибольшей выраженностью при диссеминированной форме лекарственно-устойчивого ТЛ. Доказано, что у больных ТЛ увеличение относительного и абсолютного числа Т-
лимфоцитов с иммуносупрессорным фенотипом CTLA4+ и, напротив, дефицит Т-клеток, содержащих NF-B и NFAT2 - факторы рецепторно-ядерной трансдукции сигнала Т-клеточной активации, сопровождается снижением секреции IL-2. Показано, что дисрегуляция сигнальной трансдукции в условиях CD3/CD28-индукции клеток in vitro сочетается с увеличением числа Т-лимфоцитов с иммунофенотипами CD3+NFAT1+ и CD3+AP-1+ при лекарственно-резистентном варианте инфильтративного ТЛ и снижением их количества при диссеминированном лекарственно-чувствительном (CD3+NFAT1+) и лекарственно-резистентном (CD3+AP-1+) ТЛ. Выявленные изменения позволяют заключить, что нарушения рецептор-опосредованной активации Т-лимфоцитов при ТЛ определяются на всех этапах ее реализации, начиная с формирования иммунологического синапса вследствие дефицита образующих его рецепторных молекул CD3 и CD28, CTLA4-зависимой супрессии сигнала костимуляции Т-клеток, и заканчивая нарушением передачи активирующего сигнала в ядро клетки в связи с дефицитом белков транскрипции NF-B и NFAT2 в Т-лимфоцитах.
Впервые установлено также, что при ТЛ, за исключением диссеминированной формы его лекарственно-резистентного варианта, отмечается гипосекреция провоспалительного цитокина IL-12(p70) и его биологически активной субъединицы IL-12(p35) мононуклеарными лейкоцитами крови in vitro на фоне выраженной гиперсекреции IL-27 и обладающего иммуносупрессорной активностью полипептида IL-12(p40). При диссеминированном лекарственно-резистентном ТЛ гиперсекреция IL-12(p40) сочетается с соответствующей норме in vitro секрецией IL-12(p70), IL-12(р35) и IL-27 мононуклеарными лейкоцитами, изолированными из цельной крови. Показано, что у больных ТЛ абсолютный дефицит СD3+IL-12R, СD3+gpl30+, CD3+WSX1+ и СD3+WSXl+gpl30+ клеток отмечается на фоне увеличения численности Т-лимфоцитов, характеризующихся высокой экспрессией gpl30-связывающей рецепторной молекулы WSX1 (CD3+WSXl+hl, СD3+WSXl+hlgpl30+ и СD3+WSXl+hlgpl30-), способной подавлять пролиферацию Т-лимфоцитов. Вместе с тем, установлено снижение количества Т-лимфоцитов с внутриклеточной экспрессией фактора T-bet, являющегося главным индуктором транскрипции гена IFN в условиях активации Т-клеток цитокинами АРС. Дефицит СD3+ лимфоцитов, экспрессирующих транскрипционный регулятор дифференцировки ТЫ-лимфоцитов T-bet, оказался наиболее выраженным при диссеминированном лекарственно-резистентном ТЛ. Обнаружено, что в лизатах лимфоцитов крови у всех больных ТЛ, независимо от клинической формы заболевания и чувствительности M. tuberculosis к лекарственным средствам, отмечается снижение концентрации компонентов JAK-STAT-сигнального каскада передачи импульса цитокиновой активации -тирозиновых янус-киназ JAK1, JAK2, TYK2 и белков транскрипции STAT1, STAT4. Показано также, что для ТЛ характерна базальная и 1Ь-12/1Ь-27-индуцированная in vitro гиперсекреция IFN лимфоцитами крови на фоне дефицита CD3+IFN+ и CD3+IFN" клеток и увеличения числа лимфоцитов, не имеющих фенотипического СВЗ-маркера Т-клеток (CD3"IFN+). Сочетание указанных изменений позволяет заключить, что нарушение 1Ь-12/1Ь-27-зависимой активации Т-клеток при ТЛ отмечается на всех ее этапах, начиная с нарушений секреции активирующих
цитокинов, экспрессии воспринимающих их рецепторов, и заканчивая дефицитом компонентов JAK-STAT-сигналинга, и опосредует дефицит CD3+ клеток с внутриклеточным содержанием IFN – маркерного цитокина T-лимфоцитов-хелперов типа 1. Вместе с тем, гиперсекреция IFN лимфоцитами in vitro на фоне увеличении численности IFN+ клеток, негативных по Т-клеточному кластеру дифференцировки CD3, дает основание полагать, что основными клетками-продуцентами цитокина при ТЛ являются не Т-лимфоциты, а натуральные киллеры, или NK-клетки.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные
фундаментальные данные расширяют имеющиеся представления об
иммунопатогенезе туберкулеза органов дыхания и туберкулезной инфекции в целом, и вносят дополнительный вклад в понимание молекулярных механизмов нарушений периода инициации Т-клеточного иммунитета и формирования состояния гипо- и анергии Т-лимфоцитов, приводящих к дисрегуляции иммунного ответа при туберкулезе легких. Результаты оценки нарушений реализации ключевых звеньев активации Т-клеток на этапе их взаимодействия с АРС и распознавания антигена в условиях экспериментального in vitro моделирования направленной рецептор-зависимой и цитокин-опосредованной индукции лимфоцитов представляются значимыми с позиций новых знаний о механизмах формирования иммунных отклонений при различных клинико-патогенетических вариантах туберкулеза легких. Полученные новые данные обосновывают необходимость коррекции нарушений индуктивной фазы иммунного ответа на ранних этапах активации Т-клеток с учетом клинической формы заболевания и чувствительности M. tuberculosis к лекарственным средствам противотуберкулезной терапии и могут служить основой для разработки новых подходов к диагностике, профилактике осложнений и патогенетически обоснованной терапии заболевания, в том числе на основе применения молекулярно-клеточных технологий.
Результаты работы применяются на кафедрах патофизиологии, иммунологии и аллергологии, фтизиатрии и пульмонологии ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России в курсах лекций и практических занятий для обучения студентов врачебных (лечебного и педиатрического) и медико-биологического факультетов.
Методология и методы исследования. Для реализации поставленных задач в
работе использовались методы in vitro стимуляции Т-лимфоцитов антирецепторными
антителами и рекомбинантными цитокинами для экспериментального
моделирования их активации при контактном и цитокин-зависимом взаимодействиях с антигенпрезентирующей клеткой в индуктивную фазу клеточно-опосредованного иммунного ответа. Исследования выполнялись на базе ЗАО «Томские клеточные технологии» и лабораторий ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России. В качестве материала для исследований использовали венозную кровь, а объекта – лимфоциты и мононуклеарные лейкоциты. Основные методы исследования:
-
Выделение, культивирование и экспериментальное моделирование in vitro индукции лимфоцитов крови моноклональными антителами к рецепторным молекулам CD3 и CD28;
-
Выделение, культивирование и экспериментальное моделирование in vitro
индукции лимфоцитов крови рекомбинантными цитокинами IL-12 и IL-27;
-
Выделение, культивирование и экспериментальное моделирование in vitro специфической (антигенной) индукции мононуклеарных лейкоцитов крови с использованием вакцинного штамма BCG;
-
Типирование лимфоцитов крови после CD3/CD28-индукции in vitro для определения поверхностных молекул (CD3 – общий кластер дифференцировки Т-клеток; CD28 – молекула костимуляции; CTLA4 – ингибиторная молекула) и внутриклеточных белков (факторы транскрипции NF-B, NFAT, АР-1 и цитокин IL-2) (проточная цитометрия);
-
Типирование лимфоцитов крови после IL-12/IL-27-индукции in vitro для определения поверхностных молекул (CD3 – общий кластер дифференцировки Т-клеток; IL-12R2 – 2-субъединица к рецептору для IL-12; WSX1/gp130 – рецептор к IL-27) и внутриклеточных белков (фактор транскрипции T-bet и цитокин IFN) (проточная цитометрия);
-
Измерение in vitro базальной и индуцированной секреции лимфоцитами крови IL-2 (после инкубации с CD3/CD28-антирецепторными антителами) и IFN (после инкубации с рекомбинантными цитокинами IL-12/IL-27) (метод твердофазного иммуноферментного анализа);
-
Измерение in vitro базальной и антиген-стимулированной (после инкубации с вакцинным штаммом BCG) секреции мононуклеарными лейкоцитами крови IL-27, IL-12(p70) и его субъединиц IL-12(p35) и IL-12(p40) (метод твердофазного иммуноферментного анализа);
-
Определение содержания белков транскрипции STAT1, STAT4 и тирозинкиназ JAK1, JAK2, TYK2 в лизатах лимфоцитов крови (метод твердофазного иммуноферментного анализа);
-
Статистический анализ результатов. Положения, выносимые на защиту:
-
Патогенетическими факторами нарушений клеточного этапа рецептор-опосредованной активации Т-лимфоцитов в условиях CD3/CD28-индукции in vitro при туберкулезе легких являются дефицит поверхностных рецепторов CD3 и CD28, участвующих в формировании иммунологического синапса, и CTLA4-зависимая супрессия костимуляторного сигнала.
-
Нарушения внутриклеточной трансдукции сигнала CD3/CD28-рецепторной in vitro активации Т-лимфоцитов при туберкулезе легких связаны с дефицитом белков транскрипции NF-B, NFAT2 и вариабельностью числа NFAT1+ и AP-1+ Т-клеток при инфильтративной (увеличение) и диссеминированной (снижение) формах заболевания.
-
Дисбаланс in vitro секреции цитокинов семейства IL-12 (гипосекреция IL-12 (p70 и p35) на фоне гиперсекреции IL-12-рецепторного антагониста IL-12(p40) и IL-27) при туберкулезе легких сочетается с дефицитом IL-12/IL-27-индуцированной экспрессии Т-лимфоцитами их рецепторов (IL-12R2 и WSX1/gp130) при увеличении числа Т-клеток с высокой экспрессией ингибиторной молекулы WSX1 (WSX1+hi).
-
Нарушения внутриклеточного этапа IL-12/IL-27-цитокиновой in vitro
активации Т-лимфоцитов при туберкулезе легких обусловливаются дефицитом
сигнальных тирозинкиназ JAK (1 и 2), TYK2 и белков-регуляторов
транскрипции STAT (1 и 4), T-bet.
5. Дисрегуляция клеточного и внутриклеточного этапов рецепторной и
цитокиновой in vitro активации Т-лимфоцитов, наиболее выраженная при диссеминированном лекарственно-резистентном туберкулезе легких, при инфильтративной и диссеминированной формах болезни обусловлена однотипными механизмами и приводит к нарушению дифференцировки Т-лимфоцитов-хелперов типа 1 (Th1) и синтеза Th1-цитокинов IL-2 и IFN. Гиперсекреция IFN in vitro ассоциируется с увеличением числа IFN+ CD3-негативных лимфоцитов.
Степень достоверности и апробация результатов. Полученные результаты имеют высокую степень достоверности, которая подтверждается достаточным объемом клинико-лабораторного материала и числом проведенных экспериментов in vitro, использованием современных методических приемов и высокоинформативных методов исследования (проточная цитофлуориметрия, иммуноферментный анализ), высокотехнологичного оборудования и адекватных критериев для статистической обработки результатов.
Основные положения диссертации докладывались и обсуждались: на IX
Съезде фтизиатров России (Москва, 2011); X Научно-практической конференции
молодых ученых «Актуальные вопросы охраны здоровья населения регионов
Сибири» (Красноярск, 2012); XVIII Межгородской научной конференции молодых
ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2012); II
Международной научно-практической конференции «Актуальные направления
фундаментальных и прикладных исследований» (Москва, 2013); XVII Юбилейной
Всероссийской научно-практической конференции «Многопрофильная больница:
проблемы и решения» (Ленинск-Кузнецкий, 2013); Юбилейной научно-практической
конференции, посвященной 70-летию образования Новосибирского НИИ
туберкулеза «Эффективное решение проблем туберкулеза: от научной идеи до медицинской практики» (Новосибирск, 2014); III Конгрессе Национальной Ассоциации фтизиатров России (Санкт-Петербург, 2014); XV Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2015); XVI Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2017); на научно-образовательных семинарах кафедр патофизиологии, фтизиатрии и пульмонологии ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России (Томск, 2012-2017).
Работа осуществлена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (государственный контракт №16.512.11.2046), Российского фонда фундаментальных исследований (проект №11-04-98057-р_сибирь_а), Совета по грантам Президента Российской Федерации для ведущих научных школ (гранты НШ-614.2012.7, НШ-4184.2014.7, НШ-2690.2018.7).
Публикации. По материалам диссертации опубликована 31 работа, из них 1 монография, 19 статей в научных журналах, включенных в перечень
рекомендованных ВАК при Минобрнауки России рецензируемых научных изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертаций на соискание ученой степени доктора наук, 11 статей и тезисов в материалах конференций, форумов, конгрессов, съездов.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 231 странице, состоит из введения, четырех глав, включающих обзор литературы, описание объекта, материала и методов исследований, собственных результатов и их обсуждение, выводов, списков сокращений и литературы. Работа иллюстрирована 35 рисунками и 28 таблицами. Библиографический список включает 382 источника, в том числе 116 отечественных и 266 зарубежных авторов.
Личное участие автора в получении результатов, изложенных в
диссертации. Соискатель принимал непосредственное участие в разработке научной
идеи, постановке цели и задач диссертации, отработке методических приемов,
организации и проведении экспериментальных работ. Лабораторные исследования
проводились соискателем лично или при его прямом участии. Результаты получены,
статистически обработаны и обсуждены автором самостоятельно. На их основе
соискателем подготовлены к публикации материалы по теме диссертации (тезисы,
статьи, монография) – полностью или их разделы в соавторстве.
Оформление диссертации и автореферата выполнены автором лично.
Структура «иммунологического синапса» и его роль в активации T-лимфоцитов
Обычно, понятие «иммунологический синапс» подразумевает собой структурированную зону прямого контакта между иммунокомпетентными клетками, обеспечивающего прочную связь между ними и передачу антигенной специфики от презентирующей антиген клетки (активирующей) на распознающие детерминанты воспринимающей (активируемой) клетки, с последующим запуском механизмов сигнальной трансдукции, приводящих к активации, пролиферации и дифференцировке последней [29, 114, 115. 185]. Применительно к рецептор-опосредованной (Receptor-Dependent, RM) активации Т-лимфоцитов в процессе формирования иммунного ответа на M. tuberculosis, «иммунологический синапс» (Immunological Synapse, IS) – это лиганд-рецепторная зона передачи активационного сигнала при непосредственном контакте Т-клеточного рецептора лимфоцитов с иммуногенным комплексом (антигенный пептид + молекула главного комплекса гистосовместимости) APC в процессе их межклеточной кооперации. При этом особенности ответной реакции Т-лимфоцитов, как правило, зависят от множества факторов, в числе которых «прочность» межклеточных контактов, определенные условия взаимодействия ТCR с иммуногенным комплексом, наличие костимулирующих сигнальных молекул и корецепторные взаимодействия, выступающие в роли «структурных стабилизаторов» и усиливающие активационный импульс [29, 114, 117, 143, 185, 347].
Установлено, что презентация антигенных детерминант APC (в частности дендритными клетками) начинается с образования комплекса, состоящего из антигенных эпитопов и собственных белков, кодируемых генами главного комплекса гистосовместимости, с последующей экспрессией этого комплекса на поверхностной мембране клеток [29, 115, 143, 196]. На данный момент выделяют три класса молекул МНС – МНС класса I, II и III, из которых в регуляции иммунного ответа участвуют антигены первых двух классов, синтезирующиеся в эндоплазматическом ретикулуме активированных APC. Антигены МНС класса I и II являются схожими по своему строению и представляют собой крупные белковые молекулы, состоящие из нескольких тяжелых и легких полипептидных цепей, от конформации которых зависит размер встраиваемых в комплекс процессированных антигенов. Показано, что молекулы МНС класса I экспрессируются практически на всех ядросодержащих клетках и связывают антигены, синтезируемые самой клеткой (вирусные, опухолевые, собственные мутированные). Молекулы класса II, напротив, экспрессируются в основном на иммунокомпетентных клетках и связывают процессированные экзоантигены, поступившие в клетку извне. К экзоантигенам относятся и расщепленные фрагменты M. tuberculosis, а, следовательно, именно молекулы МНС класса II играют решающую роль в презентации антигена наивным Т-лимфоцитам при микобактериальной инвазии. Кроме того установлено, что конформационная структура цепей молекул МНС обоих классов образует своеобразный антигенсвязывающий «карман» для встраивания антигенных эпитопов. При этом у молекул МНС класса II этот «карман» значительно больше, чем у МНС класса I [9, 115, 143, 196, 260, 311, 331]. Это, в свою очередь, обеспечивает загрузку более крупного экзогенного эпитопа (13-25 аминокислотных остатков) на молекулу МНС II с возможностью более «детальной» его презентации наивным Т-клеткам. Процесс загрузки экзогенного полипептида контролируется белком CLIP (Class II Associated Invariant Protein), ассоциированным с МНС класса II, который загружается в «карман» молекулы МНС II, предотвращая случайную загрузку молекулы эндогенным белком, выполняя при этом роль «универсального заменителя». Комплекс «CLIP-MHC II» переносится в аппарат Гольджи и далее доставляется к поздним эндосомам, содержащим экзогенный белок, расщепленный до необходимого к презентации размера. Здесь белок CLIP ферментативно отщепляется от молекулы МНС II и замещается экзогенным эпитопом, после чего комплекс «эпитоп-МНС II» доставляется на поверхность клеточной мембраны [115, 260, 311, 331].
Таким образом, комплекс «эпитоп-МНС II» выполняет своего рода роль «системы наведения», позволяющей Т-лимфоцитам отличать антигены эндогенного и экзогенного происхождения, а, следовательно, определять путь их дальнейшей активации, а также избегать полного блока инфекционными агентами всех специфических к ним рецепторов и тем самым способствовать развитию иммунного ответа. Но если комплекс «эпитоп-МНС II» является передающей информацию стороной, участвующей в формировании IS, то в роли воспринимающей стороны выступает Т-клеточный рецептор, который распознает конформационную структуру собственных молекул МНС II, измененную встроенным антигенным белком.
Показано, что T-клеточный рецептор представляет собой одновалентный гетеродимер, состоящий из двух цепей с молекулярной массой 40-50 кДа, не являющихся продуктами иммуноглобулиновых генов, что существенно отличает его от подобного рецептора B-лимфоцитов, являющегося двухвалентным мембраносвязанным мономером иммуноглобулина [196, 216, 227, 347, 348]. Кроме того, TCR не секретируется во внеклеточное пространство, что также отличает его от иммуноглобулинового рецептора. Вместе с тем, оба рецептора, несмотря на различие, обладают одним общим свойством, связанным с построением активного антигенсвязывающего центра за счет взаимодействия двух V-доменов [29, 54, 146, 216].
На данный момент выделяют два вида TCR – TCR1 и TCR2, каждый из которых связывается с разными типами T-лимфоцитов. TCR1 состоит из гамма- и дельта-цепей, появляется на ранних стадиях онтогенеза и присутствует в минорной фракции Т-лимфоцитов. TCR2 – основной Т-клеточный рецептор, состоит из альфа- и бета-цепей и присутствует у большинства (90-95%) Т-лимфоцитов. Обе цепи TCR имеют по одному наружному вариабельному V-домену и константному С-домену, гомологичным соответствующим доменам иммуноглобулинов, соединенных между собой дисульфидной связью, которая образуется в области их C-доменов, расположенных вблизи клеточной мембраны. Вариабельные домены альфа- и бета-цепей имеют не менее 7 гипервариабельных участков, которые формируют активный центр рецептора. Кроме того, в структуре TCR имеется шарнирная область, содержащая цистеиновый остаток, который обеспечивает соединение альфа- и бета-цепей рецептора с помощью дисульфидных связей. За шарнирной областью располагаются трансмембранный гидрофобный домен (22 аминокислотных остатка) и короткий хвостовой домен (5-16 аминокислотных остатков), погруженный в цитоплазму клеток [29, 146, 216, 355]. По общему строению гамма-дельта-форма TCR очень близка к своему двойнику – TCR2, но в отличие от него, гамма- и дельта-цепи могут как соединяться дисульфидной связью, образуя димерную структуру, так и существовать в виде несвязанных мономеров. Фиксация TCR на клеточной мембране происходит за счет гидрофобного трансмембранного домена, характерной чертой которого является присутствие в нем положительно заряженных аминокислотных остатков [115, 355].
У всех T-лимфоцитов субъединицы TCR связаны с мембранным полипептидным комплексом CD3-молекулы, который состоит из полипептидных цепей CD3-гамма, CD3-дельта, CD3-эпсилон, CD3-дзета или CD3-эта. Наиболее вероятный стехиометрический состав CD3-молекулы представлен 1122 или 11211 вариантами. Субъединицы CD3-гамма, CD3-дельта и CD3-эпсилон кодируются тесно сцепленными генами и имеют сходную структуру, образованную одним константным иммуноглобулиновым доменом, трансмембранным доменом и длинной (до 40 аминокислотных остатков) цитоплазматической частью. Цепь CD3-дзета имеет короткий внеклеточный домен, трансмембранный участок и длинный цитоплазматический домен. Иногда вместо цепи CD3-дзета в состав комплекса входит цепь CD3-эта – более длинный продукт того же гена, полученный путем альтернативного сплайсинга [29, 196, 216, 322].
Трансмембранный сегмент каждой из субъединиц CD3 содержит отрицательно заряженный аминокислотный остаток, а TCR, как отмечалось ранее – положительно заряженный, благодаря чему все субъединицы нековалентно (за счет электростатических взаимодействий), но прочно объединяются в общий функциональный комплекс Т-клеточного рецептора. Поэтому, логично рассматривать весь рецептор (CD3CR) как восьмипептидный комплекс, образованный гетеродимером TCR и молекулой CD3 [115, 322]. При этом показано, что две цепи CD3-эпсилон образуют два гетеродимера: CD3-эпсилон-гамма и CD3-эпсилон-дельта, которые соединены с - и -цепями TCR соответственно. Цепь CD3-дзета образует гомодимерную или (в случае включения в комплекс цепи CD3-эта) гетеродимерную структуры. Поскольку структура цепей молекулы CD3 не содержит вариабельных участков, она не способна распознавать антиген. В комплексе CD3CR распознавание является функцией исключительно TCR, а CD3-молекула обеспечивает вынос молекулы TCR на поверхность клеточной мембраны и придание ей соответствующей пространственной структуры, способной «принять» активационный сигнал после контакта с антигеном, а также передачу этого сигнала от TCR в геном Т-лимфоцита через запуск активационных каскадных реакций с участием посредников [115, 146, 322].
Алгоритм цитокин-опосредованной активации Т-лимфоцитов
К настоящему моменту установлено, что цитокин-опосредованная активация Т-лимфоцитов протекает с поэтапным включением интерлейкинов IL-27 и IL-12 в активационный процесс, который начинается с взаимодействия IL-27 со своим специфическим рецептором. В состоянии покоя цитоплазматические домены двух цепей рецептора – gp130 и WSX1 соединены нековалентной связью с тирозиновыми киназами JAK1 и TYK2, находящимися в неактивном состоянии [146, 239, 242, 318]. Связывание IL-27 с gp130/WSX1 приводит к димеризации рецептора и образованию рецепторного кластера, что, в свою очередь, служит сигналом к активации JAK1 и TYK2 путем их трансфосфорилирования по тирозиновым остаткам и димеризации. Активные JAK1/TYK2-киназные гетеродимеры фосфорилируют тирозиновые остатки рецепторного кластера в зоне его активационной субъединицы (gp130), создавая тем самым места для связывания с белками STAT1. Один из неактивных и разобщенных в цитоплазме мономерных белков STAT1, связывается с фосфотирозином gp130-субъединицы рецептора через SH2-домен, что становится предпосылкой для фосфорилирования тирозина (Tyr701) молекулы STAT1 активными JAK1/TYK2-димерами. В ходе такого фосфорилирования происходит преобразование активности STAT1-мономера, появление у него способности связываться с другой молекулой STAT1-мономера, что сопровождается JAK1/TYK2-фосфорилированием последней и образованием активного фактора транскрипции, который отделяется от цитоплазматических участков рецепторной молекулы и транслоцируется в ядро клетки, где активирует транскрипцию соответствующих генов, и в первую очередь – гена TBX21 [146, 174, 207]. Результатом транскрипции гена TBX21 становится первичная экспрессия транскрипционного фактора T-bet, что является основным эффектом IL-27 на данном этапе цитокин-опосредованной активации Т-лимфоцитов (Рисунок 4). Фактор T-bet индуцирует в Т-клетке «раннюю» наработку IFN и его рецептора CD119, а также экспрессию 2-субъединицы рецептора IL-12, которая обеспечивает полноценный сигнал от одноименного цитокина [146, 174, 207, 343].
Следует отметить, что «ранняя» T-bet-зависимая индукция синтеза IFN, секретируемого на данном этапе в незначительных объемах, направлена в первую очередь на усиление Th1-поляризации самих Т-хелперных клонов и является недостаточной для длительного поддержания IFN-секреции Т-клетками в объемах, необходимых для стимуляции моноцитов/макрофагов, дендритных клеток и CTL. Усиление Th1-поляризации в данном случае подразумевает локальное действие IFN на секретирующую его Т-клетку, опосредуя в ней запуск IFN-зависимой сигнальной цепи «STAT1 – T-bet – IFN» через активацию специфического рецептора при участии тирозиновых киназ JAK1 и JAK2 [50, 146, 147, 208, 290, 338, 349, 371]. При этом действие первично наработанного IFN заканчивается, когда на наивных Т-клетках экспрессируется IL-12R2.
С экспрессией IL-12R2-субъединицы начинается второй этап активации Т-лимфоцитов, опосредованный влиянием IL-12, конечным итогом которого является стабилизация интерфероногенеза [146, 174, 208]. Взаимодействие р40/р35-гетеродимера IL-12 с субъединицами IL-12R1 и IL-12R2 рецептора приводит к его димеризации формированием рецепторного кластера, что сопровождается активацией киназ JAK2 и TYK2 путем их трансфосфорилирования и димеризации (Рисунок 5). Рисунок 5 – IL-12-зависимая активация JAK-STAT-сигналинга в лимфоцитах (оригинальная схема, составленная по данным литературы)
Активные JAK2/TYK2-димеры фосфорилируют тирозиновые остатки на соответствующих цепях рецептора: TYК2-киназа, как правило, фосфорилирует тирозин цепи IL-12R1, киназа JАК2 – субъединицы IL-12R2. Показано, что для дальнейшей передачи сигнала наиболее важен тандем активационной 2-цепи рецептора с киназой JAK2, которая фосфорилирует тирозин, находящийся в 800-ом положении аминокислоты IL-12R2. Фосфотирозин активационной цепи рецепторного кластера становится «зоной посадки» для STAT4-мономерного белка и их связывание является сигналом для фосфорилирования самой молекулы STAT4, которая приобретает способность объединяться в димер с другой STAT4-молекулой и вызывать ее фосфорилирование киназными JAK2/TYK2-димерами. После этого активированный STAT4-димер выходит из места связывания и транслоцируется в ядро клетки, где индуцирует экспрессию генов TBX21, IFNG, а также рецептора к IL-18 (Рисунок 5) [174, 250, 316]. Экспрессия IL-18R на Th1-лимфоцитах сопровождается включением в интерфероногенез IL-18, продуцируемого активированными APC, который, действуя в тандеме с IL-12, приводит к максимальной продукции IFN Th1-лимфоцитами, что позволяет клетке поддерживать секрецию необходимых для эффекторных функций количеств IFN [116, 221, 236].
Количество CD3/CD28-индуцированных in vitro Т-лимфоцитов, содержащих белки транскрипции NFAT, у больных туберкулезом легких
Количество CD3+NFAT1+ субпопуляции лимфоцитов после CD3/CD28-индукции клеток IN VITRO практически у всех больных ТЛ оставалась в пределах контрольных значений. Исключением было увеличение процентного числа CD3+NFAT1+ клеток у пациентов с ИТЛ как относительно нормы, так и по сравнению с группой больных ДТЛ (Рисунок 19, 20). Что касается численности NFAT1-негативных Т-лимфоцитов (CD3+NFAT1-), то у больных ТЛ, вне связи с клинической формой заболевания, отмечалось уменьшение абсолютного и относительного содержания данной субпопуляции клеток (Рисунок 19, 20).
Анализ содержания NFAT1-позитивных Т-лимфоцитов с учетом чувствительности M. TUBERCULOSIS к лекарственным средствам позволил зарегистрировать разнонаправленные изменения у больных инфильтративным и диссеминированным ТЛ. При инфильтративной форме ЛРТЛ отмечалось увеличение абсолютного и относительного количества Т-лимфоцитов, экспрессирующих белок NFAT1, относительно показателя у здоровых лиц и больных инфильтративной формой ЛЧТЛ, у которых содержание CD3+NFAT1+ не превышало значений в группе контроля (Таблица 11). При диссеминированной форме ТЛ, напротив, отмечалось снижение (относительно нормы) численности CD3+NFAT1+ клеток в случае лекарственно-чувствительного варианта заболевания и отсутствие изменений количества NFAT1-позитивных Т-лимфоцитов при ЛРТЛ (Таблица 11).
Что касается Т-лимфоцитов, негативных по NFAT1-маркеру, то численность данной субпопуляции клеток была значимо ниже контрольных значений во всех группах обследованных больных ТЛ. Выраженность указанных изменений варьировала в зависимости от клинической формы заболевания и лекарственной чувствительности M. TUBERCULOSIS. При этом максимальное снижение числа CD3+NFAT1- клеток отмечалось при лекарственно-резистентном варианте ДТЛ (Таблица 11).
При оценке численности Т-лимфоцитов, содержащих другую изоформу белка транскрипции NFAT – NFAT2, регистрировалось снижение абсолютного и относительного количества CD3+NFAT2+ клеток при обеих формах ТЛ по сравнению с их числом у здоровых добровольцев. При этом более существенное уменьшение численности CD3+NFAT2+ лимфоцитов зафиксировано у пациентов с ДТЛ (Рисунок 21, 22). Процентное содержание NFAT2-негативных Т-лимфоцитов (CD3+NFAT2-) у больных ТЛ не зависело от клинической формы заболевания и характеризовалось более низкими значениями, чем у здоровых добровольцев, а их абсолютное количество соответствовало норме (Рисунок 21, 22).
Анализ численности Т-клеток, содержащих белок транскрипции NFAT2, с учетом чувствительности M. TUBERCULOSIS к лекарственным средствам позволил установить уменьшение абсолютного и относительного числа CD3+NFAT2+ лимфоцитов у больных ТЛ относительно контроля. Наиболее выраженными указанные изменения были в группе больных с лекарственно-резистентным вариантом ДТЛ. Исключение составили пациенты с инфильтративной формой ЛРТЛ, у которых содержание Т-лимфоцитов, экспрессирующих NFAT2, не отличалось от контрольных значений и значимо превышало аналогичные показатели у больных ТЛ других обследуемых групп (Таблица 12).
Вместе с тем, у пациентов с диссеминированной формой ЛРТЛ отмечалось снижение (по сравнению с нормой) относительной численности NFAT2-негативных Т-лимфоцитов, а при инфильтративном ЛЧТЛ – уменьшение абсолютного и относительного числа CD3+NFAT2– лимфоцитов (Таблица 12). Содержание CD3+NFAT2– лимфоцитов при инфильтративном ЛРТЛ, как и при диссеминированной форме ЛЧТЛ, не отличалось от такового у здоровых добровольцев (Таблица 12).
Таким образом, у больных ТЛ определяется нарушение механизмов сигнальной трансдукции CD3/CD28-опосредованной активации Т-лимфоцитов IN VITRO, которая проявляется дефицитом клеток, содержащих белки транскрипции NF-B и NFAT2, наиболее выраженным при диссеминированном ЛРТЛ. Нарушения трансдукции сигнала в условиях направленной CD3/CD28-стимуляции клеток IN VITRO дополняется повышением численности Т-клеток с иммунофенотипами CD3+AP-1+ и CD3+NFAT1+ при инфильтративном ЛРТЛ, и снижением их количества при диссеминированном лекарственно-чувствительном (CD3+NFAT1+) и лекарственно-резистентном (CD3+AP-1+) ТЛ.
Патогенетические факторы нарушений цитокин-опосредованной активации Т-лимфоцитов
Как отмечалось ранее, активация Т-клеток протекает по двум магистральным путям, среди которых выделяют и цитокин-опосредованный – CMPA. При рассмотрении роли нарушений CMPA Т-клеток в развитии, течении и исходе туберкулезной инфекций особое значение уделяется способности возбудителя, его компонентов и/или продуктов воспалительной реакции индуцировать секрецию интерлейкинов семейства IL-12 (IL-12, IL-27), являющихся основными индукторами CMPA Т-лимфоцитов и секреции интерферона (IFN) – маркерного цитокина активированных Th1-клеток [41, 42, 115, 346].
Известно, что активный гетеродимер IL-12(p70) в своем строении имеет две гликозилированные субъединицы – p40 и p35. При этом субъединица IL-12(p35) имеет решающее значение для проведения сигнала внутрь Т-лимфоцита и запуска процессов, способствующих дифференцировке наивных Т-клеток в Th1, а субъединица IL-12(p40) участвует в связывании цитокина со специфическим рецептором. Активность обеих субъединиц проявляется только при одновременном их синтезе в иммунокомпетентной клетке, т.е. при формировании биологически активной молекулы цитокина – IL-12(p70) [42, 162, 166, 168, 220, 266, 366]. Рецептор для IL-12(p70) также состоит из двух субъединиц – IL-12R1 и IL-12R2. Однако на покоящихся Т-лимфоцитах рецептор к IL-12(p70) конститутивно представлен только одной субъединицей (1), что снижает его сродство к стимулирующим сигналам IL-12(p70) [42, 146, 339]. Цитокином, индуцирующим экспрессию IL-12R2-субъединицы рецептора к IL-12 на Т-лимфоцитах, является IL-27 [42, 141, 180, 195, 222]. IL-27, как и IL-12(p70), состоит из двух субъединиц (EBI3 и IL-27p28) и является лигандом для WSX1/gp130-рецептора Т-клеток. Т-клеточный цитокиновый рецептор (WSX1, TCCR) относится к цитокиновым рецепторам типа 1 и имеет гомологию с gp130-молекулой, образуя с последней функциональный рецепторный комплекс, обладающий способностью передавать активационный сигнал после его связывания с IL-27 [42, 141, 233, 239, 320]. Взаимодействие IL-12 и IL-27 со своими рецепторами обеспечивает CMPA Т-клеток, однако, в отличие от RMPA, при цитокиновой активации отмечается определенная последовательность включения цитокинов в активационный процесс с чередованием клеточных и внутриклеточных этапов. Вместе с тем, изменения в секреции либо рецепции основных «пусковых» цитокинов CMPA Т-клеток при туберкулезной инфекции может опосредовать дисбаланс иммунологических реакций, снижение противоинфекционной резистентности организма-хозяина и развитие заболевания.
В свете вышеизложенного у больных ТЛ проводилась оценка цитокинсекреторной (IL-12(p70), IL-12(p35), IL-12(p40), IL-27) активности мононуклеарных лейкоцитов крови после стимуляции антигеном (BCG), а также экспрессии на Т-клетках специфических рецепторных молекул к данным цитокинам (IL-12R2, WSX1, gp130) в условиях их направленной IL-12/IL-27-индукции in vitro.
В ходе проведенного исследования было установлено увеличение спонтанной секреции IL-27 у всех обследованных больных ТЛ по сравнению с таковой у здоровых лиц, наиболее выраженное при инфильтративном ЛЧТЛ (Таблица 17). BCG-индукция клеток in vitro вызывала усиление секреции IL-27 относительно ее базальной секреции, а также по сравнению с показателями у здоровых добровольцев. При этом наиболее значимыми данные изменения были у пациентов с лекарственно-чувствительным вариантом ТЛ. Исключение составили больные с диссеминированной формой ЛРТЛ, у которых значения BCG-индуцированной секреции IL-27 оставались в пределах нормы (Таблица 17). Уровень базальной и стимулированной секреции IL-12(p70) мононуклеарными лейкоцитами крови у больных ТЛ, напротив, оказался ниже, чем в норме (Таблица 15). При этом минимальные значения спонтанной его секреции регистрировались у больных с инфильтративным ЛРТЛ. Исключением оказались пациенты с диссеминированной формой ЛРТЛ, у которых значимых изменений со стороны базальной и индуцированной секреции IL-12(p70) выявлено не было (Таблица 15). Секреция IL-12(p35) in vitro в условиях BCG-индукции у больных с диссеминированным ЛРТЛ оставалась в пределах нормы, но снижалась (относительно контрольных величин) у пациентов в других группах исследования. При этом инфильтративный и диссеминированный ЛЧТЛ характеризовались более низким уровнем BCG-индуцированной секреции IL-12(p35), чем у здоровых добровольцев и по сравнению с параметрами в группах больных с аналогичными клиническими формами ЛРТЛ (Таблица 16). Вместе с тем, у больных с различными вариантами ТЛ (в зависимости от лекарственной чувствительности/резистентности возбудителя) регистрировалось увеличение секреции IL-12(p40). Уровень секреции цитокина был сопряжен с резистентностью возбудителя инфекции к противотуберкулезным средствам, что проявлялось более выраженной гиперсекрецией IL-12(p40) при инфильтративной и диссеминированной формах лекарственно-резистентного варианта ТЛ. При этом максимально высокие концентрации IL-12(p40) были зафиксированы у пациентов с инфильтративным ЛРТЛ (Таблица 16).
Как отмечалось ранее, IL-27 является цитокином, обеспечивающим активацию T-лимфоцитов на начальных этапах иммунного ответа за счет индукции экспрессии 2-субъединицы рецептора к IL-12 [141, 180, 195, 222]. К позитивным эффектам IL-27 (в плане Th1-иммунного ответа), кроме стимуляции экспрессии IL-12R2, относят его способность подавлять экспрессию Th2-направляющих факторов транскрипции GATA-3 и STAT6; в синергизме с IL-12(p70) существенно повышать продукцию IFN Th1-лимфоцитами [42, 195, 214, 226]. Можно предположить, что высокий уровень секреции IL-27, установленный в настоящем исследовании, является компенсаторной реакцией в ответ на гипосекрецию IL-12(p70), направленной на стимуляцию экспрессии 2 субъединицы рецептора к IL-12 и образование высокоаффинного рецепторного комплекса с целью повышения вероятности связывания с ним IL-12 и последующей трансдукции сигнала активации Т-лимфоцита. Однако среди эффектов данного цитокина отмечают и его способность проявлять противовоспалительные свойства. В частности, показана способность IL-27 тормозить секрецию IL-2 и IFN активированными Th1-клетами на поздних стадиях воспалительного процесса, контролируя баланс между активацией клеточного звена иммунитета и объемом разрушения собственных тканей организма [144, 214]. Данный эффект реализуется через способность IL-27 индуцировать IL-10-секреторную активность Treg. С одной стороны, высокие уровни спонтанной и стимулированной секреции IL-27 при лекарственно-чувствительном варианте ТЛ можно связать с «необходимостью» в ограничении чрезмерной гиперергической реакции иммунной системы на возбудитель. С этой позиции более выраженное повышение IL-27-секреции при инфильтративной форме ЛЧТЛ объясняется большей выраженностью иммунных реакций, отмечаемых при данной клинико-диагностической форме ТЛ. С другой стороны, синергизм IL-10 с IL-27 приводит к существенному угнетению бактерицидной активности макрофагов, секреции ими IL-12(p70) и снижению их антигенпрезентирующей функции, тем самым препятствуя контролю за ростом микобактериальной популяции [224, 380]. Следовательно, при ТЛ высокий уровень секреции IL-27 на фоне гипосекреции IL-12(p70), установленный в настоящем исследовании, может являться следствием влияния M. tuberculosis на APC, направленного на выживание патогена внутри фагоцитирующей клетки.
К биологическим эффектам возбудителя туберкулеза в отношении APC и их функциональных свойств, на наш взгляд, можно отнести и гиперсекрецию IL-12(p40), выявленную в настоящей работе. Как уже отмечалось, важным условием формирования биологически активной гетеродимерной молекулы IL-12(p70) является секреция двух ее субъединиц (p35 и p40) в пределах одной клетки. Резкое угнетение секреции IL-12(p35), например, под влиянием IL-10, индуцированного IL-27, приводит к дефициту IL-12(p70) и способствует накоплению IL-12(p40), повышенная секреция которого отмечается в норме и усиливается под влиянием бактериальных агентов. Наряду с гипосекрецией гетеродимера IL-12(p70) и его p35-субъединицы, повышенная секреция IL-12(p40) может стать очередным препятствием на пути формирования Th1-иммунного ответа против M. tuberculosis. Полагают, что в высоких концентрациях IL-12(p40) способен формировать неактивные гомодимеры, связывание которых с рецептором IL-12R1/IL-12R2 приводит к блокаде последнего и препятствует передаче сигнала активации внутрь клетки [42, 166, 167, 305].
Что касается диссеминированного ЛРТЛ, при котором BCG-индуцированная секреция цитокинов (IL-27, IL-12(p70), IL-12(p35)) оставалась в пределах нормы, то вероятным представляется то, что нарушения цитокин-опосредованной (Cytokine-Mediated, CM) активации Т-лимфоцитов при данной форме туберкулеза в большей степени связаны с «дефектами» непосредственно Т-клеточного звена иммунитета. Исследования RMPA Т-клеток показали, что при диссеминированном ЛРТЛ имеет место более выраженный дефицит Т-лимфоцитов и секреции ими IL-2. Кроме того, при данной клинической форме ТЛ показано увеличение числа апоптотических форм Т-клеток и выраженные структурные изменения плазматической мембраны лимфоцитов крови, проявляющиеся утратой ворсинчатости, пузыревидными вздутиями на фоне снижения микровязкости анулярной липидной фазы и нарушением белок-липидных контактов [30, 31, 45, 80, 110, 111]. Выраженность описанных изменений в лимфоцитах связывают с биологическими свойствами возбудителя, обладающих устойчивостью к противотуберкулезным средствам, и рассматривают как один из способов стратегии выживания M. tuberculosis, определяющей в конечном итоге гибель Т-клеток-эффекторов, способствующих уничтожению патогена.