Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные представления о механизмах развития мужского бесплодия (обзор литературы) .17
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Объекты и объем исследований 58
2.2. Методы обследования пациентов 59
2.3. Методы определения диоксинов, полихлорбифенилов и полибромированных бифениловых эфиров в биологических средах .64
2.4. Экспериментальные модели 69
2.5. Методы статистического анализа полученных результатов 74
ГЛАВА 3. Особенности репродуктивного статуса мужчин при идиопатическом бесплодии
3.1. Характеристика обследованных лиц 76
3.2. Параметры спермограммы .77
3.3. Метаболический профиль спермоплазмы 81
3.4. Активность ключевых ферментов и энергетический статус спермоплазмы 91
3.5. Цитокиновый спектр сыворотки крови и спермоплазмы 96
3.6. Содержание адипокинов и грелина в сыворотке крови и эякуляте .101
3.7. Уровень молекулярных маркеров фертильности .105
ГЛАВА 4. Характеристика процессов свободнорадикального окисления в сперме при идиопатическом бесплодии и их коррекция
4.1. Генерация АФК и антиокислительная активность .111
4.2. Характеристика метаболизма глутатиона 115
4.3. Оценка окислительной модификации ДНК и белков 119
4.4. Сравнительный анализ эффектов L-карнитина, коэнзима Q и биофлавоноидов прополиса на окислительный статус эякулята и сперматогенез у мужчин из бесплодных семейных пар .121
4.5. Восстановительный стресс сперматозоидов 129
ГЛАВА 5. Содержание диоксинов, полихлорбифенилов и полибромированных бифениловых эфиров в репродуктивных жидкостях при идиопатическом бесплодии
5.1. Диоксины в эякуляте и фолликулярной жидкости 133
5.2. ПХБ в эякуляте и фолликулярной жидкости 138
5.3. Полибромдифениловые эфиры в сперме и фолликулярной жидкости ...143
ГЛАВА 6. Экспериментальные модели мужской репродуктивной патологии и пути ее коррекции
6.1. Гонадотоксические эффекты ПХБ в эксперименте .148
6.2. Влияние дозированной физической нагрузки на стресс-индуцированные изменения эякулята и окислительного статуса
сперматозоидов крыс 156
ГЛАВА 7. Обсуждение полученных результатов 160
Выводы 200
Список литературы
- Методы определения диоксинов, полихлорбифенилов и полибромированных бифениловых эфиров в биологических средах
- Метаболический профиль спермоплазмы
- Оценка окислительной модификации ДНК и белков
- Полибромдифениловые эфиры в сперме и фолликулярной жидкости
Введение к работе
Актуальность проблемы. Охрана мужского здоровья – относительно новая и активно развивающаяся область медицины, сфера интересов которой не ограничивается эректильной дисфункцией и заболеваниями предстательной железы. Здоровье мужчины в ХХI веке подразумевает широкое осмысление всех сторон его существования, включая выбор образа жизни, взаимодействие с окружающей средой и отношение к медицине (Garfield C., 2008; R., D., 2014). Эта новая парадигма следует из факта, что более высокий социальный статус мужчин практически не отражается на их здоровье, они имеют более высокие показатели смертности, чем женщины, и продолжают отставать от них в продолжительности жизни и использовании услуг здравоохранения (Williams D., 2008).
Большинство публикаций о состоянии здоровья современного мужчины имеет ярко выраженную минорную тональность. Приведем лишь наиболее драматические дефиниции: «вымирающий пол» (Meryn S., Jadad A., 2001), «хрупкий мужчина» (Kraemer S., 2008), «кризис сперматозоида» (Aitken R., 1999). Одной из первых научных публикаций, заставивших признать остроту проблемы мужского здоровья, была работа Carlsen E. et al. (1992), в которой было продемонстрировано ухудшение параметров спермы у мужчин Западной Европы и Северной Америки за последние 50 лет. Несмотря на то, что немедленно появились как опровержения, так и подтверждения гипотезы об утрате способности мужчин к зачатию в ближайшей исторической перспективе, споры о существовании феномена «кризиса сперматозоида» не угасают до сих пор (Cocuzza M., Esteves S., 2014).
Результаты эпидемиологических исследований свидетельствуют о снижении фертильности мужчин в самых разных регионах, особенно в странах Восточной Европы (Lopez Teijon M. et al., 2007; J. et al., 2014; Agarwal A. et al., 2015). Отмечено уменьшение показателей репродуктивной функции у мужчин в Индии, Японии и, подчеркнем особо, в Китае, причем скорость этого процесса оказалась даже выше, чем у европейцев (Gao J. et al., 2007; Iwamoto T. et al., 2013). Аналогичные явления характерны и для российских мужчин, у которых обнаружено не только изменение качества эякулята, но и дефицит андрогенов (Галимов Ш.Н. и др., 2002; Калинченко С.Ю., Тюзиков И.А., 2009).
Дисфункция сперматозоидов – это самая частая причина бесплодия, которое затрагивает приблизительно одного из 15 мужчин (Kashanian J., Brannigan R., 2015). Это более высокая доля населения по сравнению с другими распространенными заболеваниями, такими, как например, сахарный диабет. По расчетам экспертов РАМН, мужская инфертильность явилась причиной нерождения примерно 3,5-4,0 млн. детей в России за последние 15-20 лет (Артюхин А.А., 2007). В срав-
нении с успехами в терапии женского бесплодия лечение мужчин остается малоэффективным и носит эмпирический характер с непрогнозируемым результатом (Ko E. et al., 2012). Таким образом, мужская субфертильность представляет собой серьезную глобальную проблему.
В настоящее время особое внимание привлечено к различным аспектам воздействия стресса на репродуктивное здоровье. Экстремальные воздействия различной природы оказывают выраженное негативное влияние на репродуктивную функцию (Потемина Т.Е. 2008; Гуторова Н.В. и др., 2012; Nirupama M. et al., 2012 и др.), которое ассоциировано с повреждением ДНК сперматозоидов (Божедомов В.А. и др., 2012; Aitken R. et al., 2013). Генез этих нарушений связан в первую очередь с патологией конденсации хроматина герминативных клеток, инициацией в них апоптоза и свободнорадикальных процессов.
Способность генерировать АФК – фундаментальное свойство сперматозоидов и основная причина окислительного стресса, ответственного за нарушение их функции (Борисов В.В., 2014; Lavranos G. et al., 2012; Raheem A. et al., 2012). Результатом гиперпродукции АФК является повреждение нуклеиновых кислот и митохондрий, вследствие чего сперматозоиды теряют подвижность и жизнеспособность. Этот путь приводит к экстернализации фосфатидилсерина, который способствует фагоцитозу сперматозоидов после оплодотворения, что предопределяет иммунный ответ на спермальные антигены и прогноз фертильности (Barroso G. et al., 2006). Несмотря на чувствительность к окислительному стрессу, функция сперматозоидов критически зависит от АФК, необходимых для активации сигнальных путей, связанных с капацитацией A., V., 2014).
Одной из первостепенных причин увеличения частоты мужского бесплодия является химическое загрязнение биосферы (Lange A. et al., 2009). Наибольший интерес вызывают диоксины, полибром- и полихлорбифенилы, фталаты, бисфе-нол А и целый ряд соединений с доказанной или потенциальной репро- и спермо-токсичностью (Delbes G. et al., 2010; L. et al., 2012). Например, бром- и фторпроизводные дифенилов используются как пламегасители в промышленной и бытовой электронике, а хлорпроизводные – как диэлектрики, что обусловило ежедневный контакт с ними практически всей человеческой популяции. Фталаты и бисфенолы нашли применение при производстве пластиковой посуды, парфюмерии, детских игрушек и т.д. Действуя совместно, эти вещества активны даже в том случае, если концентрация отдельных из них меньше предельно допустимой, т.е. для них характерен «эффект коктейля» (Birnbaum L., 2013). Между тем молекулярные и метаболические механизмы спермотоксического действия многокомпонентных смесей СОЗ, а также особенности накопления и распределения от-
дельных конгенеров в репродуктивных органах, особенно в сравнительном аспекте в мужском и женском организме, охарактеризованы недостаточно полно.
Таким образом, правомерно выделение двух основных механизмов увеличения частоты репродуктивной патологии у современного мужчины, которая скрывается под маской т.н. идиопатического бесплодия: экстремальных (стрессов различной природы) и фоновых воздействий (поступления экополлютантов в пороговых и субпороговых концентрациях). Многие аспекты влияния этих факторов на мужскую репродуктивную систему, связанные, в первую очередь, с состоянием регуляторных систем, молекулярными механизмами повреждения сперматозоидов, гормональным, метаболическим и цитокиновым профилем эякулята практически не исследованы.
Отсутствует интегральная схема метаболических изменений при бесплодии неизвестного происхождения, обобщающая динамическое состояние всех известных маркеров плодовитости на различных уровнях организации гипоталамо-гипофизарно-тестикулярной оси.
Не установлен вектор взаимодействий многочисленных соединений белковой, липидной и углеводной природы, содержащихся в семенной плазме, их взаимосвязь с морфофункциональными свойствами сперматозоидов и место в общей картине дезадаптации репродуктивной системы при этой патологии, что и предопределяет необходимость дальнейших изысканий в этой области.
Цель и задачи исследования. Целью исследования является выявление молекулярных механизмов повреждения и адаптации мужской репродуктивной системы в условиях стресса и экологического неблагополучия, разработка и обоснование патогенетически обоснованных методов повышения эффективности лечения мужского бесплодия.
Для достижения поставленной цели сформулированы следующие задачи:
-
Изучить морфофункциональные, биохимические и гормональные показатели эякулята, про- и антиоксидантный статус спермоплазмы, степень окислительной модификации ДНК и белков сперматозоидов при идиопатическом бесплодии.
-
Выявить уровни специфических маркеров фертильности (гликоделин, инги-бин В, лептин, адипонектин, грелин, мелатонин, акрозин и др.) в сыворотке крови и/или сперме на фоне стрессовых воздействий.
-
Дать оценку роли цитокинов различных классов – про- и противовоспалительных, хемокинов, ростовых факторов в развитии идиопатического бесплодия у мужчин.
-
Исследовать накопление и распределение галогенированных производных дифенилов в половых органах самцов и самок крыс.
-
Определить содержание приоритетных поллютантов класса бром- и хлор-дифенилов в эякуляте инфертильных мужчин. Оценить наличие связи между развитием патоспермии и уровнем загрязнителей окружающей среды в эякуляте.
-
В эксперименте на животных обосновать возможность использования дозированной физической нагрузки для предупреждения патоспермии, вызванной активацией процессов свободнорадикального окисления в репродуктивных органах при стрессе.
-
Охарактеризовать влияние препаратов с различным механизмом действия – L-карнитина, убихинона, биофлавоноидов прополиса – на показатели сперматогенеза у мужчин из бесплодных семейных пар.
-
Оценить значение изменений метаболического профиля, активности узловых ферментов обмена веществ, уровня молекулярных факторов фертилизации семенной плазмы, карбонильного и редуктивного стресса сперматозоидов в механизмах развития идиопатического бесплодия.
Научная новизна. Осуществлено комплексное углубленное исследование молекулярных и клеточных механизмов нарушения оплодотворяющих свойств эякулята и их ассоциаций с уровнем локальных и системных регуляторов фер-тильности, а также свободнорадикальным статусом мужчин, подверженных воздействию фоновых интоксикаций приоритетными загрязнителями окружающей среды и стресса различной природы.
Получены новые сведения об особенностях состава спермальной плазмы в норме и патологии. Проведена сравнительная оценка ее биохимического состава у фертильных и инфертильных мужчин, обнаружены множественные корреляционные связи между отдельными параметрами метаболизма и морфофункциональ-ными характеристиками сперматозоидов, их концентрацией.
Представлена обобщенная патохимическая модель метаболического профиля семенной плазмы как нутритивного и протективного окружения сперматозоидов, объединяющая индикаторы энергетического статуса, оксидативного повреждения, состояния пиридин- и тиолзависимых систем, обмена биополимеров, адипокинов, цитокинов и других модуляторов фертилизации.
Установлена ведущая роль многофункциональных соединений различного происхождения – мелатонина, гомоцистеина, лептина, грелина, активина, лактата, холестерина в перепрограммировании метаболических процессов в эякуляте при идиопатическом бесплодии.
Показано, что при инфертильности неясного генеза в семенной жидкости формируется количественный дефицит и нарушение соотношения факторов роста и хемокинов (SDF-1, TGF- и IL-7), принимающих непосредственное участие в
регуляции пролиферативных процессов и иммунного ответа в репродуктивной системе, детерминируя тем самым снижение оплодотворяющей способности сперматозоидов.
Уточнены и подробно охарактеризованы особенности состояния процессов перекисного окисления липидов и оксидативного повреждения белков и нуклеиновых кислот в эякуляте, обусловленные преимущественно угнетением глутати-онзависимого звена антиоксидантной защиты на фоне интенсификации образования активных форм кислорода, с последующим увеличением уровня патологических белковых/пуриновых дериватов и возникновением карбонильного стресса сперматозоидов.
Впервые продемонстрировано, что эмпирическая антиоксидантная терапия может приводить к развитию гипервосстановленного состояния редокс-систем эякулята, т.е. явлений редуктивного стресса как зеркального отражения окислительного стресса с аналогичными негативными последствиями для детородной функции. На базе этих данных сформулирована концепция управляемой перокси-дации и адекватной контролируемой терапии окислительного стресса сперматозоидов, согласно которой применение антиоксидантов, а также корректировка дозы и режима их назначения, должны сопровождаться обязательным динамическим мониторингом спермограммы и молекулярного профиля семенной плазмы.
Впервые выполнен анализ содержания в биологических жидкостях мужчин с идиопатическим бесплодием (сыворотке крови и сперме) наиболее актуальных поллютантов, обладающих гонадотоксическими свойствами – конгенеров поли-хлорированных диоксинов, фуранов и дифенилов, а также полибромированных дифениловых эфиров. Контаминация эякулята бесплодных мужчин полихлориро-ванными дибензо-пара-диоксинами/фуранами подтверждает гипотезу о взаимосвязи состояния окружающей среды и репродуктивной патологии.
Теоретическая и практическая значимость работы. Установлены зако
номерности обменных превращений в спермоплазме и их дизрегуляции при ре
продуктивных нарушениях неустановленной этиологии, охарактеризованы моле
кулярные и клеточные основы возникновения патологических и компенсаторных
реакций при инфертильности. Определены ключевые гормонально-
метаболические детерминанты дисфункции сперматозоидов, что открывает перспективы мишеньориентированной коррекции идиопатического бесплодия.
Выделены наиболее информативные лабораторные маркеры оценки степени тяжести и прогноза развития мужского бесплодия: определение индекса тератозо-оспермии (TZI), концентрации гомоцистеина в сперматозоидах, лептина, грелина и активина в семенной жидкости.
Дано теоретическое обоснование вероятности развития осложнений эмпирической терапии мужского бесплодия в форме редуктивного стресса. Для контроля антиоксидантной терапии инфертильных пациентов в случаях ее низкой эффективности целесообразно включение в стандартный алгоритм диагностики определения окислительно-восстановительного статуса глутатиона в спермоплаз-ме как чувствительного предиктора вероятности редуктивного повреждения сперматозоидов.
Получены прямые доказательства причастности полихлорированных диоксинов и фуранов к механизмам возникновения идиопатической инфертильности. Феномен их наличия в эякуляте пациентов позволяет рекомендовать использование этого теста в качестве неинвазивного индикатора экспозиции ксенобиотиками и для профилактики интоксикации.
Результаты работы будут востребованы не только в научных целях для расшифровки природы идиопатического бесплодия на молекулярном и субклеточном уровнях, но и могут быть использованы для создания инновационных методов диагностики и патогенетически обоснованного лечения этого недуга.
Внедрение результатов исследования в практику. Результаты и основные положения диссертационной работы включены в педагогическую практику и учебный процесс кафедр патологической и нормальной физиологии, гистологии, лабораторной диагностики ИДПО, урологии с курсом ИДПО, репродуктивного здоровья человека ИДПО с курсом иммунологии, гигиены труда и профессиональных болезней ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации; кафедр патофизиологии и биологической химии Первого Московского государственного медицинского университета имени И.М. Сеченова; кафедр общей патологии и биохимии ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации; кафедр патологической физиологии и патологической анатомии ГБОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации; кафедры биологической химии и клинической лабораторной диагностики ГБОУ ВПО «Дальневосточный государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, используются в работе ГБУЗ «Республиканский перинатальный центр» Республики Башкортостан.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Идиопатическое бесплодие в большинстве случаев сопровождается развитием патологии сперматозоидов в виде олиго-, астено- и тератозооспермии (61,4%). Однако значительную долю составляют пациенты без отклонений стан-8
дартной спермограммы, т.е. с нормоспермией, частота которой в структуре заболевания достигает 38,6%.
2. Вектор изменений метаболического статуса и структурно-
функционального состояния сперматозоидов и семенной плазмы указывает на их
угнетение. Сдвиги концентрации абсолютного большинства молекулярных мар
керов фертильности предшествуют отклонениям рутинных параметров спермо-
граммы, что диктует возможность их использования в диагностических и прогно
стических целях.
-
Важная роль в патогенезе идиопатического бесплодия у мужчин принадлежит, наряду с окислительным стрессом, процессам карбонильной модификации биополимеров эякулята, в частности, накоплению карбонилированных протеиновых производных, которое сопряжено с ограничением подвижности и увеличением количества морфологически измененных сперматозоидов.
-
Серьезным побочным эффектом антиоксидантной терапии инфертильно-сти является развитие неописанного ранее феномена редуктивного стресса сперматозоидов, сопровождающегося резким ухудшением качественных и количественных характеристик эякулята и изменением биохимического состава семенной жидкости.
-
Диоксины являются одной из превалирующих форм ксенобиотиков, детектируемых в эякуляте. Сравнительно высокий уровень этих загрязнителей окружающей среды в данной биологической среде свидетельствует о том, что этот путь представляет собой один из основных способов элиминации чужеродных соединений из организма. Индивидуальный спектр экополлютантов в семенной жидкости зависит от места проживания, профессионального маршрута и характера питания мужчины.
Личный вклад автора
Автором самостоятельно сформулированы цель и задачи исследования, проведен анализ отечественной и зарубежной литературы, лично разработаны программа и план исследования, осуществлен подбор адекватных методов достижения поставленных задач. Автор принимала непосредственное участие в отборе образцов биологических жидкостей у пациентов и их исследовании на содержание биохимических аналитов и молекулярных маркеров репродуктивной функции, ею выполнены статистическая обработка и анализ результатов диссертационной работы, написание статей, сформулированы научные положения и выводы. Лабораторные эксперименты выполнены лично или под руководством автора. Отдельные исследования проведены в сотрудничестве со специалистами Республиканского перинатального центра и клиник вспомогательных репродуктивных
технологий г. Уфы, а также Башкирского республиканского научно-исследовательского экологического центра.
Соответствие паспорту специальности
Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.03.03 – патологическая физиология. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно – пунктам 7, 9 и 10 паспорта специальности.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на Международном конгрессе «Профилактика нарушений репродуктивного здоровья от профессиональных и экологических факторов риска» (Волгоград, 2004); II, III, VI, IX, X, XII Российских научных форумах «Мужское здоровье и долголетие» (Москва, 2004, 2005, 2008, 2011, 2012, 2014); Всероссийских научно-практических конференциях «Проблемы риска здоровья населения России от воздействия факторов окружающей среды» (Москва, 2004), «Уралэкология, природные ресурсы – 2005» (Уфа, 2005), «Труд и репродуктивное здоровье работающего населения Северо-Запада России» (Апатиты, 2007); IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008); V Всероссийском форуме «Здоровье нации – основа процветания России» (Москва, 2009); V, VII и VIII Российских конгрессах «Мужское здоровье» (Кисловодск, 2009; Ростов-на-Дону, 2011; Ереван, 2012); VII Международном научно-практическом конгрессе «Человек в экстремальных условиях: клинико-физиологические, психологические и санитарно-эпидемиологические проблемы профессиональной деятельности (Москва, 2010); XXI и XXII Международных конференциях Российской ассоциации репродукции человека «Репродуктивные технологии сегодня и завтра» (Санкт-Петербург, 2011; Геленджик, 2012); VII Международном Конгрессе Профессиональной ассоциации андрологов России (Сочи, 2012); Всероссийской конференции «Фармакологическая коррекция процессов жизнедеятельности. Доклинические и клинические исследования новых лекарственных препаратов» (Уфа, 2012); XII Международном форуме “HCH & Pesticides” (Киев, 2013); II Международной научной конференции “European Applied Sciences: modern approaches in scientific researches” (Штутгарт, 2013); Международном симпозиуме «Биохимия – основа наук о жизни» (Казань, 2013); V Российской научно-практической конференции «Здоровье человека в XXI веке» (Казань, 2013); Российско-Азиатском Уро-Андрологическом Конгрессе (Санкт-Петербург, 2014); Международной научной конференции «Токсикология, эпигенетика и репродукция» (Москва, 2014); Первом республиканском Форуме отцов «Отец – опора семьи» (Уфа, 2014); Республиканской научно-практической конференции «Роль природных факторов
в лечении урологических заболеваний, репродуктивного здоровья мужчин» (Башкортостан, санаторий «Якты-Куль», 2014); VII Всероссийской конференции «Иммунология репродукции: теоретические и клинические аспекты» (Ростов-на-Дону, 2015); XV Всероссийском форуме с международным участием «Дни иммунологии» им. академика В.И.Иоффе (Санкт-Петербург, 2015). Апробация состоялась на заседании проблемной комиссии «Морфология и общая патология» ГБОУ ВПО Башкирского ГМУ 09.09.2015.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 56 работ, из которых 27 статей в журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации для публикации основных результатов диссертации на соискание ученой степени доктора наук, в том числе 6 статей в журналах, входящих в международные базы цитирования.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 247 страницах машинописного текста, содержит 8 рисунков, 42 таблицы и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, четырех глав результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, который включает 456 источников, из которых 59 отечественных и 397 зарубежных.
Методы определения диоксинов, полихлорбифенилов и полибромированных бифениловых эфиров в биологических средах
Другой важной проблемой было признание тесной связи мужского репродуктивного статуса с абдоминальным ожирением, сахарным диабетом II типа и кардиометаболическими расстройствами, которые нередко сопровождаются низким или субнормальным уровнем тестостерона (Тюзиков И.А., 2013; Oskui P. et al., 2013). Уровень распространенности гипогонадизма варьирует, по разным оценкам, от 10% до 40% у мужчин старше 45 лет. Общеевропейское увеличение доли мужского населения, имеющего гипогонадизм, а следовательно, кардиометаболические расстройства, велико.
Однако больше беспокоит тот факт, что эти проблемы возникают у молодых мужчин. Крупные исследования в Европе и США свидетельствуют о снижении уровня андрогенов у мужчин репродуктивного возраста и показывают отрицательную корреляцию между гиподинамией, состоянием окружающей среды, уровнем висцерального жира, инсулинорезистентностью и сывороточной концентрацией тестостерона (Галимов Ш.Н. и др., 2002; Eisen-berg M. et al., 2014a).
В связи с этим существуют весомые причины для беспокойства по поводу неудовлетворительного состояния здоровья у мужчин в Европе и других индустриальных стран. Мало того, что это имеет серьезные последствия для демографии, но это также является предиктором метаболического синдрома, соматической патологии, а также заболеваний мочеполовой системы. Коррекция этих нарушений сопряжена со значительными финансовыми затратами. Только в США, по данным Американской ассоциации общественного здоровья, экономический ущерб от мужской заболеваемости и смертности составляет до 480 млрд. $ ежегодно (Tucker C., 2012). Таким образом, необходимы более детальные исследования для уточнения механизмов развития этой патологии и состояния мужского здоровья, включая репродуктивную функцию.
Начиная со второй половины XX века демографические процессы в гендерном аспекте характеризуются двумя основными негативными трендами: более низкой продолжительностью и качеством жизни мужчин по срав-18 нению с женщинами и увеличением доли мужского бесплодия в браке (Rato L. et al., 2012; Barnes L., 2014).
Бесплодие – это неспособность пары в детородном возрасте к зачатию при регулярной половой жизни без применения контрацептивных средств в течение одного года. Частота мужского фактора бесплодия достигает сегодня, по различным оценкам, не менее 50% (Калинченко С.Ю., Тюзиков И.А., 2009; Kovac J. et al., 2013).
Феномен снижения мужской фертильности впервые был констатирован в 1992 г. на основе мета-анализа 61 публикации, в которых упоминалось о параметрах эякулята около 15 тыс. мужчин, обследованных в период с 1938 по 1991 гг. (Carlsen E. et al., 1992). Исследования свидетельствовали о значительном, на 50 %, уменьшении концентрации сперматозоидов у мужчин, не имеющих проблем с фертильностью, со 113106/мл до 66106/мл. Обсуждение этих результатов научным сообществом и многочисленные попытки реа-нализа полученных данных не привели к единому мнению (Safe S., 2013; Co-cuzza M., Esteves S., 2014). Вопрос о реальности глобальной тенденции снижения активности сперматогенеза остается дискуссионным, поскольку имеются сообщения о неизменности или даже увеличении качества эякулята в некоторых регионах (Fisch H., Braun S., 2013).
Вместе с тем, в масштабных проспективных исследованиях было обнаружено низкое качество спермы как в общей популяции, так и у молодых мужчин в странах Северной Европы и во Франции (Le Moal J. et al., 2013, 2014). Еще в конце XX столетия было показано, что около 20% молодых мужчин в европейских странах имели концентрацию сперматозоидов ниже референсных значений ВОЗ (20106/мл), а у 40% мужчин был диагностирован уровень концентрации гамет, который ассоциируется с увеличением периода ожидания беременности (40106/мл) (Bonde J. et al., 1998).
Нарушение репродуктивного статуса может иметь неблагоприятные последствия для здоровья в целом, так как у мужчин с низким качеством эякулята отмечено увеличение показателей смертности и уменьшение продол-19 жительности жизни. У индивидов с двумя или более аномальными параметрами спермы риск преждевременной смерти увеличивался в 2,3 раза по сравнению с мужчинами с нормальной спермой (Eisenberg M. et al., 2014b). С этих позиций качество спермы рассматривается как фундаментальный биомаркер мужского здоровья (Buck Louis G., 2014).
Исследования мужчин по всему миру с использованием стандартизированных протоколов показали значительные региональные различия в качестве спермы (Makarow M., Hojgaard L., 2010). У финских мужчин концентрация сперматозоидов была на 35% выше, чем у датских, в то время как у шотландцев и французов выявлено промежуточное значение этого показателя. Аналогичные различия в качестве спермы были найдены у фертильных мужчин различных городов США. Японские мужчины имели параметры эякулята на том же низком уровне, что и датские, а у мужчин из Индии обнаружено еще более низкое качество спермы (Mukhopadhyay D. et al., 2010; Iwamoto T. et al., 2013). Причины этой выраженной географической дифференциации неизвестны и требуют дальнейшего рассмотрения.
Наблюдаются также похожие региональные различия другой патологии мужской репродуктивной системы, в том числе рака яичек и врожденных пороков развития (Toppari J. et al., 2010). Рак яичка герминативных клеток является самым распространенной опухолью у молодых мужчин во многих странах. Еще до возникновения рака у таких пациентов отмечается снижение качества спермы и низкие показатели фертильности. Уровень заболеваемости герминативным раком растет в течение последних 40-50 лет в большинстве промышленно развитых стран и совпадает с тенденцией к уменьшению качественных и количественных характеристик спермы (Thorup J. et al., 2010; Dalgaard M. et al., 2012).
Метаболический профиль спермоплазмы
Произведена оценка состояния репродуктивной системы мужчин из семейных пар с идиопатическим бесплодием, обратившихся в ЛПУ г. Уфы (перинатальный центр, клиники ВРТ). Всего обследовано 510 человек. Все пациенты состояли в бесплодном браке от 1 до 10 лет. Критериями включения пациентов в исследование явились: отсутствие беременности у супруги пациента более 1 года при регулярной половой жизни без применения контрацепции, возраст от 20 до 45 лет, патология спермо-граммы, продолжительность проживания в данном районе не менее 5 лет, возраст супруги пациента от 18 до 40 лет.
Критериями исключения были тяжелая соматическая патология, заболевания яичек и их придатков, оперативные вмешательства на органах мошонки, паховых каналах и сосудах яичка, эпидемический паротит в анамнезе, хронический алкоголизм, курение, генетические аномалии, оценка эректиль-ной функции по шкале МИЭФ менее 10 баллов, репродуктивная патология у супруги пациента.
По итогам целенаправленного отбора была сформирована группа соматически здоровых сексуально активных пациентов с мужским фактором бесплодия (360 человек), которая явилась объектом углубленного клинико-лабораторного обследования.
Группу контроля составили 86 мужчин с доказанной фертильностью, отобранных согласно требованиям приказа Министерства здравоохранения № 67, предъявляемым к донорам спермы (2003). Представители контрольной группы имели от 1 до 3 здоровых детей в семье. Контрольная группа была сопоставима по возрасту, материально-бытовым условиям, обеспеченности медицинской помощью, структуре экстрагенитальной патологии, продолжительности проживания в данном районе и социальному положению. У всех пациентов было проведено комплексное клинико-лабораторное обследование с общеклиническим анализом эякулята, определением гормонального фона и содержания биохимических маркеров фертильности, оценкой метаболического, энергетического, цитокинового и свободнорадикально-го статуса сыворотки крови и спермы, а также концентрации некоторых распространенных загрязнителей окружающей среды в семенной жидкости.
Забор крови из периферических вен обследуемых производился в утренние часы в период между 8 ч 00 мин и 10 ч 00 мин натощак по стандартной методике (Меньшиков В.В. и др., 1999). Сыворотку крови до проведения исследования замораживали и хранили в низкотемпературном холодильнике при температуре 20 С не более 6 месяцев.
При определении содержания отдельных аналитов каждую пробу рассчитывали в двух параллелях, в дальнейшем использовали среднее арифметическое значение каждой пары образцов. Аналогичным образом производили подсчет стандартных разведений для построения калибровочных графиков.
Активность ферментов и содержание гормонов, цитокинов, метаболитов и других биологически активных соединений в сыворотке крови и спер-моплазме определяли биохимическими и иммунологическими методами с помощью стандартных тест-систем в соответствии с прилагаемыми инструкциями производителей (список см. табл. 2).
В отдельных случаях при отсутствии унифицированных тест-систем были использованы соответствующие авторские методики.
При биохимическом исследовании в семенной жидкости определялись основные субстраты энергетического и пластического обмена. Содержание глюкозы и общего белка в спермоплазме находили, соответственно, глюко-зооксидазным и биуретовым методом с помощью стандартных наборов. Содержание фруктозы определяли по интенсивности образования комплексного соединения продукта ее окисления -оксиметилфурфурола с резорцином. Таблица 2 Перечень использованных диагностических систем Соединение Наименование набора Производитель ингибин В ACTIVEтм Inhibin B DSL (США) гликоделин Glycodelin ELISA Bioserv (ФРГ) акрозин AcroScreen Fertility Technology Resources Inc (США) адипонектин Adiponectin ELISA BioVendor (Чехия) грелин Ghrelin EIA RayBiotech Inc (США) лептин Leptin Sandwich EIA DRG Int (США) фибронектин Fibronectin ELISA Kit Technoclone (Австрия) мелатонин Melatonin ELISA IBL Int (ФРГ) активин А Activin A ELISA BCM Diagnost (США) глутатион-Б-трансфераза GST Assay Kit Immundiagnostik (ФРГ) глутатионпероксидаза Gpx1 ELISA kit BioVendor (Чехия) супероксиддисмутаза Cu/ZnSOD Platinum Bender MedSystems (Австрия) ФНОа TNFa Bender MedSystems (Австрия) интерлейкины ір, 2, 4, 5-8, 10, IL-ip, 2, 4, 5-8, 10, 11, Bender MedSystems 11, 13, 17, 18 13, 17, 18 (Австрия) фактор стромальных клеток а SDF-la BCM Diagnost (США) трансформирующий фактор TGF-P BCM Diagnost (США) роста Р1 8-гидрокси-2 -дезоксигуанозин DNA Damage BCM Diagnost (США) карбонилированные белки Carbonylproteine ELISA Immundiagnostik (ФРГ) ТБК-активные продукты ТБК-Агат Агат-Мед (Россия) общая антиокислительная Total antioxidant status Randox Laboratories активность (Великобритания) цАМФ cAMP BCM Diagnost (США) АТФ ATP Bioluminescent Assay Kit Sigma-Aldrich Corp гомоцистеин Homocysteine EIA Axis-Shield (Великобритания) Уровень гидропероксидов липидов (LPx) определяли по Nourooz-Zadeh J. et al. (1994); содержание глутатиона находили с использованием реакции с 5,5-дитио-бис-(2-нитробензойной) кислотой (Rahman I. et al, 2006).
Концентрацию лимонной кислоты в семенной плазме определяли с помощью фотометрического метода (CitricScreen, «БиоХимМак»). Содержание лактата определяли в ЛДГ-реакции по приросту НАДН+Н.
Концентрацию альбуминов, креатинина, мочевины и кальция, активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ), аспартатаминотрансферазы (АСТ), алани-наминотрансферазы (АЛТ), щелочной фосфатазы (ЩФ), -глюкозидазы, ос-амилазы, глутатионредуктазы (ГР), креатифосфокиназы (КФК), малатдегид-рогеназы (МДГ), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ) исследовали на полуавтоматическом биохимическом анализаторе «Stat Fax 1904+» фирмы «Awareness Technology» (США).
Активность каталазы регистрировали по скорости утилизации перекиси водорода, о чем судили по снижению величины экстинкции при длине волны 260 нм, на которой Н202 имеет максимум светопоглощения (Карпищенко А.И., 1999).
Лабораторное исследование эякулята заключалось в определении физико-химических свойств и клеточного состава.
Перед сдачей анализа пациенты были проинформированы о времени воздержания, отсутствии тепловых процедур, приеме антибиотиков, больших доз алкоголя.
Каждому обследуемому была дана письменная инструкция по получению эякулята. Период воздержания составил в среднем 3-4 дня.
Эякулят получали путем мастурбации в стерильный нетоксичный пластиковый контейнер одноразового использования с широкой горловиной и крышкой. На контейнере отмечали лабораторный индивидуальный номер пациента, дату и время получения спермы.
Доставка биоматериала в лабораторию осуществлялась в течение 1 часа при температуре от 20 до 37 С. Образцы хранили в термостате при 37 С. Процедуру исследования проводили через 30-60 мин после эякуляции и полного разжижения коагулята.
Анализ семиологических образцов выполняли согласно «Руководству ВОЗ по лабораторному исследованию эякулята человека и взаимодействия сперматозоидов с цервикальной слизью» (1999), «Руководству ВОЗ по лабораторному исследованию и оценке человеческой спермы» (2010) и рекомендациям ведущих российских специалистов в области сперматологии (Брагина Е.Е., 2014).
Оценка окислительной модификации ДНК и белков
Креатинин, наряду с мочевиной, является метаболитом, содержание которого в спермоплазме во много раз превышает его уровень в сыворотке крови. Избирательный 10-кратный перепад концентраций креатинина вряд ли может быть простой случайностью. Удовлетворительного толкования этому феномену в литературе мы не нашли. Возможно, эта локальная особенность связана с гормоноподобными свойствами креатинина, а также его причастностью к обмену макроэргов (Фокина Е., Рослый И., 2014).
У бесплодных мужчин с патоспермией креатинин накапливается в спермальной плазме в еще большем количестве - до 133% референсных величин, что может иметь уже патологическое значение, поскольку он рассматривается как предшественник мутагенов и уремических токсинов (Wyss М., Kaddurah-Daouk R., 2000).
Столь же заметными были отклонения от нормальных значений концентраций других субстратов, вовлеченных в энергетический метаболизм, за исключением фруктозы, уровень которой в обеих группах пациентов с бесплодием статистически не отличался от контроля. Отметим, что для фруктозы в норме существует еще больший, чем для креатинина, 20-кратный градиент в сыворотке крови и спермальной плазме, который полностью объясним, принимая во внимание эссенциальную роль этой гексозы в энергетике сперматозоида.
Вместе с тем, установлен дефицит других энергетических субстратов мужских половых клеток - глюкозы и цитрата, более выраженный у мужчин с патоспермией. Содержание глюкозы у этих пациентов составило лишь 48% и 59% от показателей мужчин 1-й и 2-й групп (р 0,02 и р 0,05, соответственно).
Убыль цитрата оказалась достоверной также только в группе пациентов с патоспермией. Определение лимонной кислоты, которая является аллосте-рическим активатором гиалуронидазы, рекомендовано в лабораторных руководствах в качестве биомаркера секреторной деятельности предстательной железы. Наряду с этим, в последнее время большое внимание уделяется антиоксидантным свойствам цитрата, детерминированным его хелатирующей способностью в отношении катионов железа, инициаторам свободноради-кальных процессов (Неронова Н.А. и др., 2012).
Относительно пары лактат/пируват, регулятора окислительно-восстановительного статуса клетки, заметим, что их содержание в спермо-плазме бесплодных мужчин изменялось разнонаправленно - наблюдался прирост лактата, особенно при патоспермии, на фоне снижения пирувата, важного энергетического субстрата спермиев.
По соотношению лактата и пирувата можно косвенно судить о редокс-состоянии клеток, отдельных клеточных компартментов и биологических жидкостей. Как видно из наших данных, у фертильных мужчин коэффициент [НАД+]/[НАДН] спермоплазмы, который рассчитывается исходя из молярных концентраций лактата и пирувата, имеет очень большую величину по сравнению с другими объектами, в частности, с печенью или миокардом -более 4000 против 500-700 (Lamb Н. et al, 2008). У всех бесплодных пациентов мы констатировали статистическое значимое уменьшение значения этого показателя до 33-67% контрольных цифр, т.е. падение окислительного потенциала, способное повлечь за собой ограничение энергоснабжения сперматозоидов.
Найденные особенности состояния системы пиридиновых нуклеотидов в эякуляте могут иметь серьезные последствия и для метаболизма в целом, поскольку она причастна не только к регуляции энергопродукции и энергопотребления, но и к большинству обменных превращений (Oka S. et al, 2012).
Установлено также существенное понижение (на 56%, р 0,01) содержания в семенной плазме инфертильных мужчин с патоспермией ионизированного кальция, триггера реакций фосфорилирования флагеллярных белков гамет. Не исключено, что при идиопатическом бесплодии происходит нарушение механизмов транспорта этого катиона между сперматозоидами и окружающей средой. Исследование биохимического профиля спермальной жидкости выявило также более чем 1,5-кратное нарастание концентрации холестерина у мужчин с бесплодием неустановленного происхождения независимо от характера изменений спермограммы. Уровень холестерина в спермоплазме является одним из перспективных индикаторов качества эякулята, который отражает как динамическое и статическое состояние мембран половых клеток, так и некоторые стороны их биоэнергетики (Beer-Ljubic B. et al., 2009; Hereng T. et al., 2014).
Следующий аналит – фибронектин – относится к так называемым гли-кобиомаркерам, роль которых в генезе заболеваний мужской репродуктивной системы, несмотря на активные поиски, окончательно не определена. Фибро-нектин является одним из основных компонентов сгустка эякулята до разжижения и составляет не менее 1% от всех белков семенной плазмы.
Значительное увеличение содержания фибронектина у мужчин c па-тоспермией хорошо согласуется с данными других авторов (Attia A. et al., 2011), однако парадоксальный факт статистически достоверного его снижения в группе бесплодных пациентов с нормоспермией нуждается в отдельном рассмотрении при обсуждении результатов исследования.
Относительно содержания мелатонина в семенной плазме и эякуляте при бесплодии существуют противоречивые сведения. Мелатонин как эндогенный модулятор репродукции, осуществляет эту функцию посредством регуляции метаболических процессов, контроля продукции АФК, медиаторов воспаления и интенсивности апоптоза в гаметах и клетках Сертоли (Korkmaz A. et al., 2009; Rocha C. et al., 2014). По нашим данным, уровень этого гормона достоверно снижался в обеих группах пациентов и составил 51-57% контрольных величин.
Полибромдифениловые эфиры в сперме и фолликулярной жидкости
Именно этому органу принадлежит первостепенная роль в процессах созревания сперматозоидов, обретения ими подвижности и оплодотворяющей способности.
В эпидидимисе, равно как и в семенниках, в большем количестве, нежели в яичниках, кумулируют наиболее токсичные копланарные ПХБ с 4, 5 и 6 атомами хлора. По совокупности негативных эффектов эти конгенеры близки к диоксинам, поэтому для них установлены коэффициенты токсичности по отношению к эталонному диоксину – 2,3,7,8-тетрахлордибензо-пара-диоксину (Майстренко В.Н., Клюев Н.А., 2004). Величина этих коэффициентов, обозначаемых как WHOEF, колеблется в диапазоне от 10-1 до 10-5. Полученные данные в пересчете на эти коэффициенты – WHOEQ – отражены в табл. 39.
Такой способ выражения позволяет сравнивать сложные неоднородные по составу смеси диоксиноподобных соединений, поскольку при этом рассчитываются не просто суммарные содержания близких по структуре, но сильно отличающихся по токсичности (на 3-4 порядка) соединений, а легко сопоставимые унифицированные величины – токсические эквиваленты ВОЗ.
Подобный подход продемонстрировал принципиально те же тенденции распределения ПХБ в организме с преимущественным накоплением в жировой ткани и эпидидимисе с той разницей, что практически полностью нивелировались отличия между яичками и яичниками в пересчете на массу ткани и еще более заметно проявлялись эти отличия в пересчете на содержание ли-пидов. По-видимому, при интерпретации полученных необходимо необходимо учитывать наличие гематотестикулярного барьера, играющего важную роль в регуляции физиологических процессов и их компартментализации в репродуктивной системе.
Несложный расчет показывает, что накопление ПХБ в сперме составляет лишь 0,5%, 1,3% и 8,9% от их уровня, соответственно, в жировой ткани, эпидидимисе и яичках, т.е. в сперму проникает сравнительно небольшое количество поллютанта.
Итак, полихлорбифенилы обладают повышенной тропностью не только к жировой ткани, но и к репродуктивным органам, прежде всего, мужским, и это обстоятельство может выступать в качестве одной из предпосылок ослабления фертильного потенциала в условиях интоксикации этими антропогенными загрязнителями.
Действительно, по нашим данным, хроническое поступление ПХБ сопровождалось выраженным снижением оплодотворяющей способности эякулята (табл. 40).
При ежедневном введении токсиканта в течение 4 месяцев в суммарной дозе 0,05 LD50 уменьшалось как число беременных и родивших самок, так и количество рожденных крысят, что сопровождалось снижением величин индекса фертильности, гестации и плодовитости в 5, 1,3 и 2,1 раза, соответственно.
Общее количество самок Число беременных самок Число родивших самок Индекс фертильности Индекс гестацииКоличество родившихся крысят Пол детенышей, % самцов Индекс плодовитости 204320 75 1353,8 4,3 20 20 20 100 100 182 51,1 9Д
Наименьшие изменения претерпевал показатель индекса гестации, несущий информацию преимущественно о способности к вынашиванию беременности. В контрольной группе все животные дали потомство.
Одним из чувствительных индикаторов средовых влияний на репродуктивную функцию является соотношение полов потомства – sex ratio. Влияние полигалогенированных ароматических соединений на потомство, а именно, уменьшение доли мальчиков, было показано в нескольких независимых исследованиях на основе анализа полов новорожденных, родителями которых были мужчины и/или женщины, контактирующие с хлорорганиче-скими поллютантами (Ryan J. et al., 2002; Hertz-Picciotto I. et al., 2008). Однако мы не обнаружили значительных сдвигов величины этого параметра, хотя имелся умеренный тренд к смещению соотношения полов в сторону мужского на фоне ПХБ. бромированных бифенилов в штате Мичиган в начале 70-х годов прошлого столетия Вместе с тем, в систематическом обзоре публикаций, посвященных этой проблеме, отмечается отсутствие какого-либо влияния экспозиции ПХБ на соотношение полов новорожденных в 13 исследованиях из 15 (Nieminen P. et al., 2013). Таким образом, вопрос о влиянии ПХБ на sex ratio остается открытым.
Анализ биохимического состава спермоплазмы в условиях воздействия загрязнителей окружающей среды на модели хронической экспозиции поли-хлорированными бифенилами выявил следующие сдвиги (табл. 41).
В первую очередь при поступлении ПХБ изменялись параметры энергетического метаболизма. Уже через 2 месяца после начала затравки установлено снижение интенсивности фруктолиза, которое к исходу эксперимента нарастало – способность сперматозоидов к утилизации фруктозы составила, в зависимости от дозы экополлютанта, около 43-52 % от контрольных величин.
В целом особенностями метаболического статуса семенной жидкости в условиях отравления ПХБ явились: дозо- и хронозависимый характер изменения концентрации пластических и энергетических субстратов, дефицит общего белка, альбуминов, кальция и глюкозы, накопление лактата и конечных продуктов азотистого обмена.
При сопоставлении биохимического зеркала спермоплазмы инфер-тильных мужчин и экспериментальных животных обращает на себя внимание два обстоятельства. Во-первых, концентрации изученных эндогенных соединений у человека и крысы сильно различаются, что является, очевидно, следствием видовых особенностей обмена веществ. Во-вторых, несмотря на это, существует известный параллелизм и совпадение динамики метаболического профиля спермоплазмы в обоих случаях как отражение тождества повреждающих механизмов и вовлечения в патологический процесс общих ре-гуляторных и метаболических путей.