Модуляция системы комплемента антимикробными пептидами Умнякова Екатерина Сергеевна

Введение к работе

Актуальность проблемы. Несмотря на интенсивное развитие

современной науки, коррекция патологических процессов, связанных с нарушением функционирования иммунной системы, затруднена или не представляется возможной. До сих пор для лечения большинства таких заболеваний не найдено адекватной терапии, или же она доступна очень узкому кругу людей, что обуславливает необходимость проводить исследования механизмов функционирования отдельных компонентов иммунной системы и их взаимодействия. Такого рода исследования актуальны не только для понимания механизмов работы иммунной системы, но и для практического использования полученных знаний с целью создания принципиально новых лекарственных препаратов. Особый интерес в этой связи представляет исследование системы врожденного иммунитета как более эволюционно древнего приобретения, чем адаптивный иммунитет. Обладая широким арсеналом механизмов, предотвращающих нарушение постоянства состава внутренней среды организма, которое может быть обусловлено множеством внешних и внутренних факторов, эта система незамедлительно реагирует на чужеродные агенты, воспринимая их как угрозу организму хозяина [Кокряков, 2006].

Антимикробные пептиды (АМП) и система комплемента являются
гуморальными составляющими системы врожденного иммунитета. Их
колокализация и коэволюция позволяют предположить существование тесного
взаимодействия между различными АМП и белками комплемента. Такого рода
взаимодействия могут иметь существенное значение в процессе регуляции
иммунного ответа со стороны системы комплемента, однако в свою очередь не
исключается и влияние компонентов комплемента на биологическую
активность АМП. Неконтролируемая или недостаточная активация

комплемента может приводить к развитию патологии разного рода, например,
возрастной макулодистрофии, пароксизмальной ночной гемоглобинурии,
наследственного ангионевротического отека, атипичного гемолитико-

уремического синдрома, аутоиммунной гемолитической анемии, системной красной волчанки [Tichaczek-Goska, 2012; Ricklin et al., 2016; Merle et al., 2015]. В настоящее время для лечения этих заболеваний действенной терапии не найдено, а поддерживающая терапия доступна лишь узкому кругу пациентов. При болезни Альцгеймера, антифосфолипидном синдроме, ишемическо-геморрагических поражениях компоненты комплемента являются важными факторами развития осложнений [Merle et al., 2015]. Поскольку в настоящее время существует ряд трудностей при лечении вышеописанных заболеваний, остается актуальным поиск веществ, модулирующих работу комплемента. Возможными претендентами на эту роль могут выступать АМП.

Степень разработанности темы исследования. До сих пор особенности взаимодействия АМП с системой комплемента остаются малоизученными. В литературе имеются разрозненные и противоречивые сведения о влиянии отдельных АМП на активацию комплемента. Как правило проводилось изучение взаимодействия АМП с рецепторными молекулами классического и лектинового путей: С1q и MBL соответственно, с

использованием принципиально различных подходов и моделей [Panyutich et al.,
1994; Prohszka et al., 1997; Bhat et al., 2007; Groeneveld et al, 2007]. В данном
диссертационном исследовании оценивали активацию комплемента с помощью
методов in vitro, условия которых частично отражают патофизиологические
процессы, происходящие в организме при активации комплемента в условиях
аутоиммунной гемолитической анемии и бактериемии. В первом случае
использовался стандартный лабораторный метод для оценки активности
комплемента – лизис сенсибилизированных эритроцитов барана – в сочетании с
иммуноферментным анализом (ИФА) для определения уровня С3а. При
аутоиммунной гемолитической анемии также происходит активация

комплемента на поверхности эритроцитов, что приводит к формированию
мембран-атакующего комплекса (МАК) и разрушению красных кровяных телец,
что отражается в используемой нами модели in vitro. Во втором случае
воспроизводили активацию комплемента in vitro в условиях бактериемии,
которая сопровождает течение множества инфекционных заболеваний. В
данной модели в присутствии сыворотки, содержащей компоненты
комплемента, происходила пермеабилизация бактериальных мембран и
разрушение клеток под действием МАК, что также имеет место при попадании
бактериальных клеток в кровяное русло при инфекционных заболеваниях,
осложненных бактериемией. Таким образом, в данной работе проводилось
изучение действия АМП in vitro в условиях, приближенных к

патофизиологическим при развитии аутоиммунной гемолитической анемии и бактериемии.

Цель диссертационного исследования – охарактеризовать белок-белковые
взаимодействия антимикробных пептидов с рецепторной молекулой

классического пути – С1q и оценить их влияние на активацию комплемента.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать методы выделения C1q и -дефенсинов человека.

2. Изучить возможность белок-белковых взаимодействий С1q c
антимикробными пептидами.

1. Оценить влияние антимикробных пептидов на активацию комплемента с помощью антитело-зависимого лизиса эритроцитов барана и теста на проницаемость наружной и внутренней мембран Escherichia coli ML-35p.

2. Оценить антимикробную активность дефенсинов в присутствии белка комплемента C1q.

Научная новизна. Впервые для выделения белка C1q из сыворотки крови
человека применили модификацию метода аффинной хроматографии с
использованием иммунного комплекса (ИК), представленного

миелопероксидазой (МПО) человека, иммобилизованной на бромциан-
активированной сефарозе, и антителами кролика к МПО человека. Разработана
тест-система с использованием конъюгата белка C1q c пероксидазой хрена для
рецепторно-ферментного анализа (РФА), позволяющего оценить способность
АМП связываться с C1q. Нами впервые показано взаимодействие белка C1q с
АМП ареницином-1 (Ar-1) и протегрином-1 (PG-1) с помощью методов РФА и
ИФА, а также метода поверхностного плазмонного резонанса (ППР). Впервые
проанализировано влияние PG-1, Ar-1, тахиплезина-1 (Tach 1) на

гемолитическую активность комплемента с использованием

сенсибилизированных эритроцитов барана. Впервые оценено действие -дефенсинов человека (HNPs), PG-1, Ar-1 и Tach 1 на активность комплемента с помощью теста на проницаемость бактериальных мембран. В данном исследовании изучено влияние белка C1q на антимикробную активность HNPs и дефенсина мухи Calliphora vicina. Также впервые оценили влияние сыворотки крови человека на антибиотическую активность дефенсина мухи C. vicina.

Теоретическое и практическое значение.

В ходе выполнения диссертационного исследования были получены сведения, представляющие ценность как для фундаментальной, так и для прикладной науки. Изучение взаимодействия HNPs с белком комплемента C1q позволило расширить представления о биологической активности данных АМП в организме. Изучение взаимодействия гетерологичных АМП (PG-1, Ar-1 и Tach 1) представляет ценность для прикладной науки. Эти пептиды, имеющие низкую молекулярную массу и стабильную структуру -шпильки, способны активировать и подавлять комплемент, что создает предпосылки для использования их в качестве основы для разработки новых терапевтических средств, которые были бы способны направленно модулировать активацию системы комплемента.

Основные положения, выносимые на защит у:

1. Антимикробные пептиды -дефенсин (HNP-1), -дефенсин (HBD2), PG-1, Ar-1 и Tach 1 взаимодействуют с компонентом комплемента C1q.

2. -Дефенсины человека могут ингибировать активность комплемента in vitro.

3. Пептиды, формирующие структуру антипараллельной -шпильки (PG-1, Ar-1 и Tach 1), могут как ингибировать, так и активировать комплемент in vitro в зависимости от их концентрации.

4. В присутствии белка C1q человека снижается антимикробная активность дефенсинов различного видового происхождения.

Личный вклад в проведение исследования. Личный вклад автора в выполненную работу состоит в самостоятельном проведении исследований, анализе полученных данных и их интерпретации. Работа была проведена в отделе общей патологии и патологической физиологии ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины». Изучение белок-белковых взаимодействий методом ППР проводилось совместно с сотрудниками отдела молекулярной генетики ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины» (д.б.н. Соколов А.В.). Масс-спектрометрический анализ проводили сотрудники ресурсного центра СПбГУ «Развитие молекулярных и клеточных технологий» (к.б.н. Мальцева А.Л.) и отдела токсикологии ФГУП «НИИ ГПЭЧ» ФМБА России (к.б.н. Дубровский Я.А.).

Степень достоверности и апробация результатов. Степень

достоверности результатов обусловлена использованием адекватных

поставленным задачам методов исследования, корректной статистической обработкой полученных данных и их воспроизводимостью в достаточном количестве независимых экспериментов.

Материалы исследования были представлены на:

5. Объединенном научном форуме, включающем Международную научную конференцию по биоорганической химии «XII чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова» и VIII Российский симпозиум «Белки и пептиды» с конкурсом работ молодых ученых (18-22 сентября 2017, Москва, Россия).

6. The 16th European Meeting on Complement in Human Disease (8-12 сентября 2017, Копенгаген, Дания).

7. VI Международном симпозиуме «Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и патологии» (20–24 июня 2017, Санкт-Петербург, Россия).

8. XVI Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (5-8 июня 2017, Санкт-Петербург, Россия).

9. Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (12-14 сентября 2016, Санкт-Петербург, Россия).

10. The 6th International Meeting on Antimicrobial Peptides (31 августа – 3 сентября 2016, Лейпциг, Германия).

11. Antimicrobial peptide symposium: towards an integrated view of AMP diversity, functions and applications» (6-8 июня 2016, Монпелье, Франция).

12. ХХ Международной пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (18–22 апреля 2016 года, Пущино, Россия).

13. The 8th International Conference on Complement Therapeutics (1-6 сентября 2015, Ханья, Греция).

14. The 15th European Meeting on Complement in Human Disease (27-30 июня 2015, Уппсала, Швеция).

15. VII Российском симпозиуме "Белки и пептиды" (12-17 июля 2015, Новосибирский Академгородок, Россия).

16. V Международном симпозиуме «Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и патологии» (23–26 июня 2015, Санкт-Петербург, Россия).

17. XV Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (1-4 июня 2015, Санкт-Петербург, Россия).

18. Международной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 55-летию ИБХ РАН и 80-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (15–19 сентября 2014, Москва, Россия).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 152 страницах машинописного текста и оформлена согласно традиционным требованиям. Содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение результатов, выводы и приложение. В диссертации 9 таблиц и 35 рисунков. Прилагаемый список литературы содержит 220 наименований.