Микрорнк и полиморфизм генов их биогенеза в патогенезе атеросклероза ЩЕГЛОВА НАТАЛЬЯ ЕВГЕНЬЕВНА

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Обзор литературы 10

1.1 Современные представления о патофизиологии атеросклероза 10

1.2 Роль генетических полиморфизмов в патогенезе атеросклероза 13

1.3 МикроРНК - новые регуляторы экспрессии генов 17

1.4 Роль генов AGOl, DGCR8, GEMIN3, GEMIN4, DROSHA, вовлеченных в биогенез микроРНК, в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний 19

Глава 2. Материалы и методы исследования 27

2.1 Объект и дизайн исследования 27

2.2 Клинические и биохимические методы исследования 28

2.3 Молекулярно-генетические методы исследования 29

2.4 Методы статистической обработки 32

Глава 3. Результаты собственных исследований 36

3.1 Характеристика некоторых показателей липидного метаболизма у больных гипертонической болезнью и ИБС постинфарктным кардиосклерозом 36

3.2 Изучение полиморфизмов генов AGOl, DGCR8, GEMIN3, GEMIN4, DROSHA в группе контроля и у больных гипертонической болезнью и ИБС постинфарктным кардиосклерозом

3.3. Показатели уровня экспрессии miR-126, miR-155, miR-221, miR-222 у больных гипертонической болезнью и ИБС постинфарктным кардиосклерозом 52

3.4. Качественные характеристики miR-126, miR-155, miR-221, miR-222 у больных гипертонической болезнью и ИБС постинфарктным кардиосклерозом

Заключение 64

Выводы 69

Практические рекомендации 70

Список сокращений 71

Список литературы 73

• Роль генетических полиморфизмов в патогенезе атеросклероза
• Клинические и биохимические методы исследования
• Изучение полиморфизмов генов AGOl, DGCR8, GEMIN3, GEMIN4, DROSHA в группе контроля и у больных гипертонической болезнью и ИБС постинфарктным кардиосклерозом
• Качественные характеристики miR-126, miR-155, miR-221, miR-222 у больных гипертонической болезнью и ИБС постинфарктным кардиосклерозом

Введение к работе

Актуальность проблемы

Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) лидируют в структуре причин смертности населения экономически развитых стран. Согласно данным Всемирной организации здравоохранения, во всем мире от этой патологии ежегодно умирает более 17 млн. человек (World health statistics, 2014). В Российской Федерации болезни системы кровообращения обусловливают около половины всех смертельных исходов. По официальной статистике смертность от ССЗ остается одной из самых высоких в нашей стране, так за 2012 год она составила 737,1 случая на 100 тыс. населения (Здравоохранение в России, 2013).

Основные типы болезней системы кровообращения включают цереброваскулярные заболевания, ишемическую болезнь сердца (ИБС), гипертоническую болезнь (ГБ). Процессы атеросклероза, тромбоза и артериальной гипертензии составляют патоморфологическую основу заболеваний сердечно-сосудистой системы, а нарушение мозгового кровообращения и ИБС -наиболее частые причины летальных исходов (Корягина Н.А., 2012; Торшин И.Ю., 2008).

В конце XX века на основе результатов ряда значительных эпидемиологических исследований была разработана концепция факторов риска развития атеросклероза и ИБС. Дальнейшее развитие этих представлений позволило признать, что болезни системы кровообращения являются результатом взаимодействия наследственных (генетических) факторов и внешних воздействий, реализующих генетическую предрасположенность (Оганов Р.Г., 2008).

Последнее десятилетие XX века стало временем активного внедрения молекулярно-генетических методов исследования в кардиологию. Это связано с тем, что знание генотипических характеристик пациента позволяет не только оценить риск жизнеугрожающих состояний, но и правильно определить тактику их профилактики. Кроме того, многочисленные исследования показали, что

изменение генной экспрессии играет важную патофизиологическую роль в развитии и прогрессировании ССЗ (Companioni О., 2011; Roberts R., 2014; Sivapalaratnam S., 2011).

Особый интерес в молекулярно-генетических исследованиях уделяется вопросам, связанным с участием в биологических и патологических процессах микрорибонуклеиновых кислот (микроРНК). В настоящее время известно, что микроРНК могут участвовать в таких патологических процессах, как онкогенез, ангиогенез, гипертрофия миокарда (MeolaN., 2009; Thum Т., 2011).

МикроРНК - это малые некодирующие молекулы рибонуклеиновых кислот (РНК), обычно длиной 19-24 нуклеотида, образуемые из более длинных РНК-предшественников, действие которых опосредовано их неполной гибридизацией с З'-нетранслируемой области целевой матричной РНК (Мглинцев В.А., 2012; Рогаев Е.И., 2008; Shah А.А., 2010).

Разработка и внедрение в лабораторную практику методов, позволяющих определять уровень специфических микроРНК в физиологических жидкостях, позволяет исследовать и использовать потенциал циркулирующих микроРНК в качестве новых маркеров заболеваний (Федоров А.В., 2012).

Степень разработанности темы

В настоящее время проводятся многочисленные исследования с целью изучения роли микроРНК в молекулярно-генетических механизмах развития ССЗ. Появляются новые данные о различных биологических эффектах микроРНК на компоненты сердечно-сосудистой системы. Согласно литературным источникам, нарушение функционирования определенных микроРНК может способствовать развитию таких патологических состояний как ИБС, постинфарктное ремоделирование миокарда и его сократительная дисфункция, хроническая сердечная недостаточность (Fasarano Р., 2010; Stather P.W., 2013; Stefano V.D., 2011).

Вместе с тем, следует указать, что количественные и качественные характеристики экспрессии микроРНК в различные периоды развития

атеросклероза в литературе отсутствуют. В связи с этим проведение подобных исследований представляется, безусловно, актуальным, особенно с учетом распространенности атеросклероза и его осложнений в популяции и необходимости разработки эффективных методов их терапии и профилактики.

Цель исследования - выяснить в условиях выраженного атеросклероза состояние экспрессии проангиогенных и антиангиогенных микроРНК, особенности полиморфизмов генов их биогенеза и представить патофизиологический анализ значения полученных данных.

Задачи исследования:

1. Определить уровень микроРНК в плазме крови у больных ГБ и ИБС постинфарктным кардиосклерозом (ИБС ПИКС).

2. Изучить характер изменения проангиогенных (miR-126, miR-155) и антиангиогенных (miR-221, miR-222) микроРНК в плазме крови у человека в условиях атерогенеза.

3. Изучить качественные характеристики плазменных микроРНК у больных ГБ и ИБС ПИКС.

4. Определить существование взаимосвязи между частотой встречаемости полиморфизмов генов биогенеза микроРНК AGOl, DGCR8, GEMIN3, GEMIN4, DROSHA и частотой случаев ГБ и ИБС ПИКС.

5. Представить обоснование патофизиологической значимости выявленных изменений молекулярно-генетического аппарата в развитии атеросклероза и его осложнений.

Научная новизна

6. Впервые изучены количественные и качественные характеристики плазменных микроРНК в условиях прогрессирующего атерогенеза у человека.

7. Впервые исследованы особенности полиморфизмов генов, регулирующих биогенез микроРНК, при осложненном развитии атеросклероза у человека.

8. Впервые обосновано представление об одном из вариантов конкретного участия микроРНК в патогенезе атеросклероза у человека.

Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты настоящего исследования вносят вклад в учение о молекулярно-генетических механизмах ССЗ. Полученные данные расширяют представление о роли микроРНК в атерогенезе и его последствиях.

Анализ результатов работы позволяет признать возможность их использования для поиска генетических предикторов осложненного течения атеросклероза и формирования новых представлений о патогенетической терапии ГБ и ИБС.

Методология и методы исследования

Для решения поставленных задач проведено лабораторное и молекулярно-генетическое обследование 65 мужчин. Объект исследования - здоровые мужчины и пациенты кардиологического отделения ГБУЗ Областной клинической больницы города Тверь. Предмет исследования - особенности участия микроРНК и генов их биогенеза в молекулярно-генетических механизмах развития атеросклероза. Достоверность полученных данных подтверждена методами математической статистики.

Положения, выносимые на защиту:

9. Длительное и осложненное развитие атеросклероза у человека сопровождается повышением в плазме крови содержания проангиогенной miR-126 и доминирующим нарастанием концентрации антиангиогенных miR-221 и miR-222.

10. Среди полиморфизмов генов AGOl, DGCR8, GEMIN3, GEMN4 и DROSHA, регулирующих биогенез микроРНК у человека, только генотип АА гена GEMIN4 коррелирует с частотой ГБ - ведущего фактора развития атеросклероза.

Личный вклад диссертанта

Участие автора в диссертационном исследовании выразилось в планировании исследования, наборе материала, проведении молекулярно-генетических исследований, обобщении и статистическом анализе полученных

данных. Лично автором выполнены все молекулярно-генетические тесты, включая выделение микроРНК, проведение обратной транскрипции и полимеразно-цепной реакции. Автором подготовлены статьи, опубликованные в изданиях, которые включены в перечень российских рецензируемых научных журналов для опубликования научных результатов диссертаций. Этический комитет заключил, что проведение настоящей работы соответствует этическим нормам, принятым для данного типа исследований.

Степень достоверности и апробация результатов исследования

О достоверности представленных результатов диссертационного исследования свидетельствуют электронная база исходных данных (65 человек), современные молекулярно-генетические методы исследования, корректные методы статистической обработки полученных данных.

Основные материалы работы доложены и обсуждены на расширенном заседании кафедры патологической физиологии Государственного бюджетного учреждения высшего профессионального образования «Тверской государственный медицинский университет» Минздрава России (протокол № 11 от 01.06.2015)

Результаты исследования представлены на V Всероссийском с международным участием медико-биологическом конгрессе молодых ученых «Симбиоз-Россия 2012» (Тверь, 2012); V Международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения - 2013» (Санкт-Петербург, 2013); I межвузовской научно-практической конференции молодых ученых «Молодежь и медицинская наука» (Тверь, 2013); IX международной научно-практической конференции «Внезапная смерть: от критериев риска к профилактике» (Санкт-Петербург, 2014); IX Международной научно-практической конференции «Внезапная смерть: от критериев риска к профилактике» (Санкт-Петербург, 2014); IV съезде физиологов СНГ (Сочи -Дагомыс, 2014).

Публикации: по теме диссертации опубликовано 8 работ, в том числе 3 статьи в научных журналах и изданиях, которые включены в перечень российских

рецензируемых научных журналов для опубликования основных результатов диссертационных исследований на соискание ученой степени доктора и кандидата наук.

Объем и структура диссертации: работа изложена на 91 странице машинописного текста, состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и списка иллюстративного материала. Работа содержит 25 таблиц и 8 рисунков. Список литературы включает 151 источник (51 отечественный и 100 зарубежных).

Роль генетических полиморфизмов в патогенезе атеросклероза

Патофизиологические основы заболеваний сердечно-сосудистой системы, за исключением достаточно редко встречающихся моногенных болезней, достаточно сложны. С эпидемиологической точки зрения, этиология заболевания включает комплексное взаимодействие многочисленных факторов окружающей среды (климата, диеты, физической активности, психологических особенностей личности и др.) и генетических факторов. Согласно ВОЗ, установлено свыше 3000 факторов риска, связанных с ИБС и инсультом, среди которых выделяют модифицируемые (такие как наследственная предрасположенность) и немодифицируемые (дислипопротеинемия, артериальная гипертензия, сахарный диабет, избыточная масса тела) [17, 44].

Процессы атеросклероза, тромбообразования и артериальной гипертензии являются наиболее частыми патологическими процессами, поражающими сердечно-сосудистую систему, а ГБ и ИБС наиболее частыми ССЗ, приводящими к смертельному исходу [5, 53].

При этом известно, что глобальная эпидемия ССЗ обусловлена широким распространением атеросклероза в популяции [9, 13, 29, 129].

К настоящему времени сложилось четкое представление об атеросклерозе как о мультифакториальном заболевании, в основе которого лежат сложные нарушения биохимических, иммунологических и молекулярно-генетических процессов [5]. Современная теория атеросклероза формируется на основе огромного количества данных, полученных ранее и сегодня как путем экспериментального моделирования атеросклероза, так и на основе длительных клинических исследований [20, 34].

Приоритет в признании роли холестерина как основного фактора развития атеросклероза принадлежит русскому ученому Н.Н. Аничкову, который еще в начале XX века в эксперименте доказал возможность развития атеросклероза у кроликов, получавших холестериновую диету. Результаты его опытов позволили сформулировать инфильтрационную теорию, ядро которой выражается в знаменитой формуле Н.Н. Аничкова: «Без холестерина не может быть атеросклероза». В дальнейшем по мере развития биохимии липидов данная формула была модифицирована в утверждение, что атеросклероз не может развиваться без атерогенной гиперлипопротеинемии, а именно, нарастания содержания в плазме крови атерогенных липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) и содержащегося в них холестерина [18, 29].

В 1954 году было начато знаменитое многолетнее эпидемиологическое исследование ССЗ во Фремингеме (США). Ученые включили в анализ почти 8,5 тыс. участников в возрасте от 30 до 74 лет (средний возраст - 49 лет), которые на момент обследования не имели сердечно-сосудистой патологии. За 12 лет наблюдения у 1174 участников (из них 456 женщин) развилось первое ССЗ (ИБС, инсульт, облитерирующий атеросклероз артерий нижних конечностей). Результаты данного исследования позволили количественно оценить абсолютный, относительный и определяющий риск многих факторов, способствующих развитию атеросклероза и его осложнений. В частности, было подтверждено ведущее значение в развитии атеросклероза расстройств обмена липидов, таких как гиперхолестеринемия и ожирение, а также артериальной гипертензии [38, 54, 92].

Все последующие теории атерогенеза в большей или меньшей степени, но обязательно включали холестериновый компонент, как главный фактор инициации формирования атероматозного процесса. В качестве примера остановимся на следующих из них.

А.Н. Климову и соавт. (1966, 1969) удалось получить атеросклеротические бляшки на аорте у кроликов путем длительного парентерального введения им гомологичной сыворотки, полученной от животных с экспериментальной гиперхолестеринемией [18]. Американские исследователи Ross R. и Glomset J.A. в середине 70-х годов XX века предложили гипотезу развития атеросклероза как ответ на повреждение эндотелия артерий. В качестве инициирующего фактора атеросклеротического процесса они рассматривали нарушение целостности эндотелия. К наиболее распространенным факторам, вызывающим повреждение эндотелия, были отнесены оксид углерода, артериальная гипертензия, дислипопротеинемия [5].

В 1980 году Ф. Куммероу воспроизвел перекисную теорию атеросклероза с помощью введения лабораторным животным больших количеств окисленных стеринов, что дало возможность в экспериментальной разработке получить основные признаки атеросклеротического поражения сосудов [18].

В перекисной теории атерогенеза ключевая роль отводится модифицированным окисленным липопротеинам низкой плотности (мЛПНП), которые образуются преимущественно в интиме артерий на начальных стадиях развития атеросклероза, и их концентрация увеличивается по мере его прогрессирования. Считается, что мЛПНП стимулируют иммунное воспаление и образование пенистых клеток, причем именно эти липопротеины с высокой скоростью захватываются эндотелиальными и гладко-мышечными клетками стенки сосудов, что и приводит к накоплению холестерина в интиме артерий [5, 18,77].

Тромбогенная теория атерогенеза предполагает активное участие компонентов системы гемостаза в формировании атеросклеротической бляшки. В настоящее время накоплены многочисленные клинические, патоморфологические и экспериментальные данные о взаимосвязи процессов атеро- и тромбогенеза [5, 15,18].

В последние годы стала очевидной взаимосвязь между системой липопротеинов и факторами свертывания крови. Существуют данные, что липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП) и липопротеины промежуточной плотности (ЛППП) обладают способностью активировать тромбоциты и свертывающую систему крови, мЛПНП способны стимулировать спонтанную агрегацию тромбоцитов. Установлено также, что гипертриглицеридемия сопровождается возрастанием активности X, IX, VII плазменных факторов свертывания и протромбина [15].

При этом свое атерогенное влияние данные факторы реализуют, как правило, через расстройства липидного обмена, проявляющиеся развитием гиперхолестеринемии, нарастания плазменных ЛПНП и ожирения. Данный вывод не противоречит большинству современных патогенетических концепций развития атеросклероза.

Таким образом, многочисленные исследования в области этиологии атеросклероза показывают большую роль внешних факторов. В тоже время, в свете современных представлений, в этиологию ССЗ и атеросклероза наряду с неблагоприятными факторами окружающей среды существенный вклад вносят генетические составляющие [2, 21, 44, 80, 93].

Роль генетических полиморфизмов в патогенезе атеросклероза Генетика атеросклероза является сложным и до конца не изученным разделом учения о данной патологии. Так, в модельных исследованиях на мышах, трансгенных или подвергшихся генетическому «нокауту», было показано, что на формирование атеросклеротических поражений сосудов оказывают влияние более 100 генов [18].

Семейная гиперхолестеринемия была первым описанным моногенным заболеванием, приводящим к повышению уровня холестерина в плазме крови. Частота этого дефекта в гетерозиготном состоянии составляет 1 на 500 человек, в гомозиготном состоянии встречается намного реже - 1 на 1 млн. человек [146]. Гомозиготы страдают от тяжелого коронарного атеросклероза и, как правило, умирают в молодом возрасте от инфаркта миокарда. Тем не менее, для большинства заболеваний нельзя идентифицировать единичные генетические детерминанты, так как их манифестация связана сразу с изменениями сразу в нескольких генах [22]. Применительно к мультифакториальным заболеваниям наибольшее практическое значение имеет анализ полиморфизмов генов-кандидатов, представляющих собой отклонения в последовательности нуклеотидов дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), в относительно разной степени, влияющие на функцию кодируемых белков (ферментов). Генетические полиморфизмы распространены в популяции, как правило, достаточно широко и встречаются с частотой более 1% [12].

Полиморфные гены представлены в популяции несколькими разновидностями - аллелями, которые могут быть как протективными, так и аллелями генов высокого риска. Чаще всего мутантные аллели существенно влияют на риск заболевания только в присутствии определенных факторов внешней среды, модифицировав или исключив которые, можно существенно снизить вероятность развития патологии [21].

Эффективность изучения генов, участвующих в патогенезе многофакторных заболеваний, к числу которых относится и атеросклеротическое поражение сосудов, осложняется большим количеством генов-кандидатов и комплексным взаимодействием генетических и средовых факторов. Тем не менее, уже к настоящему времени идентифицирован полиморфизм десятков генов, претендующих на роль генетических маркеров атеросклероза [35].

К генетическим факторам риска атеросклероза относятся, прежде всего, изменения генов белков, связанных с регуляцией метаболизма липидов. Кроме того, разнообразные генетические дефекты генов, контролирующих структуру и функцию сосудистой стенки, а также генов, отвечающих за агрегацию тромбоцитов, воспаление, гипергомоцистеинемию, артериальную гипертензию, также ведут к ускоренному развитию атеросклероза [21, 35, 81].

Клинические и биохимические методы исследования

Настоящее исследование одобрено Этическим комитетом ГБОУ В ПО Тверского ГМУ Минздрава России. Исследование включало в себя клиническую и экспериментальную часть. Клиническая часть исследования проводилась на базе ГБУЗ «Областная клиническая больница» города Твери и поликлиники ГБОУ ВПО Тверского ГМУ Минздрава России. Экспериментальная часть исследования выполнена на базе клинико-диагностической лаборатории поликлиники ГБОУ ВПО Тверского ГМУ Минздрава России.

В исследование были включены 65 мужчин, 50 из которых находились на стационарном лечении в кардиологическом отделении ГБУЗ Областной клинической больницы города Твери, и 15 здоровых мужчин, проходивших диспансеризацию в поликлинике ГБОУ ВПО Тверского ГМУ Минздрава России.

Сформированы выборки из трех групп сравнения. В I группу включили 15 здоровых мужчин от 29 до 47 лет (средний возраст 33,93±1,14 лет). II группа состояла из 30 пациентов, страдающих ГБ в возрасте от 29 до 65 лет (средний возраст 47,73±1,97 лет). Критерии групповой принадлежности: мужской пол и наличие ГБ I-II стадии с артериальной гипертензией 2 степени (максимальные цифры артериального давления 179/109 мм рт. ст.) без систолической дисфункции миокарда левого желудочка [50] и отсутствие на момент обследования диагноза ИБС. В III группу были включены 20 мужчин, имеющих в анамнезе подтвержденный клинически и лабораторно инфаркт миокарда в возрасте от 46 до 84 лет (средний возраст 60,4±1,9 лет). Критерии включения в данную группу больных: наличие верифицированного диагноза ИБС ПИКС. При формировании выборок больных учитывали схемы лечения. Все больные на момент исследования получали соответственно сходную антигипертензивную и антиангинальную терапию, определяемую стандартами лечения Всероссийского научного общества кардиологов (ВНОК) [36].

Критерии исключения: лица, страдающие сахарным диабетом и другими эндокринопатиями, сопутствующими заболеваниями почек, легких, желудочно-кишечного тракта, печени, дыхательной системы, заболеваниями крови, наследственными болезнями и нарушениями обмена веществ, отягощенным аллергологическим анамнезом, аллергическими заболеваниями и имеющие профессиональные вредности.

При клиническом обследовании всех групп определяли следующие параметры: возраст, масса тела, рост, показатели общего холестерина (ОХС) и холестерина липопротеинов высокой плотности (ХС ЛПВП). Взвешивание производили на медицинских весах «РП-150МГ» (ОСТ-Фарм, Казахстан), точность измерения массы тела - до 0,1 кг, рост измеряли с помощью ростомера «Диакомс» (Фарм-Инвест, Россия), точность измерения длины дела - до 0,05 м.

Используя антропометрические данные, рассчитывали индекс массы тела (ИМТ) по классической формуле: ИМТ = m тела (кг)/ рост (м).

Интерпретацию значений ИМТ проводили согласно классификации, предложенной ВОЗ в 1997 году [37]. Согласно данной классификации ИМТ при дефиците массы тела равен менее

Концентрации ОХС И ХС ЛПВП в сыворотке крови определяли на полуавтоматическом биохимическом анализаторе «FP-901» (Labsystems, Финляндия). Забор крови у пациентов производился натощак после 14-часового ночного голодания. При определении оптимальных уровней показателей липидного спектра плазмы руководствовались рекомендациями ВНОК [6, 14]. Для оценки атерогенности липидного обмена использовали коэффициент атерогенности (КА), который рассчитывали классическим способом (формула 1): КА = (охс-хс лпвпухс ЛПВП (1) За нормальное значение К А принимались значения в пределах от 2 до 2,5 ед. При коэффициенте атерогенности, равным 3-4 ед., вероятность развития атеросклероза расценивалась как умеренная, при величине более 4-х - как высокая, согласно рекомендациям ВНОК.

Генетические исследования были проведены на базе молекулярно-генетической лаборатории ГБОУ ВПО Тверской ГМУ Минздрава России (руководитель - д.м.н., профессор Калинкин М.Н.).

Среди всех микроРНК для проведения исследования были выбраны ангиогенные miR-126, miR-155, и антиангиогенные miR-221, miR-222, описанные в главе 1.

Тотальная РНК, включая микроРНК, была получена комбинированным методом из плазмы крови с помощью набора «miRNeasy Mini Kit» (Qiagen, Германия) и лизирующего реагента «TRIzol LS Reagent» (Invitrogen, США), описанным в англоязычной литературе [89, 113, 126]. В вакуумные пробирки Vacutainer получали 5 мл донорской крови. Образцы крови центрифугировали с использованием центрифуги «Sigma 4-16KS» (Sigma Laborzentrifugen, Германия) 10 мин при 5000g. 100 мкл плазмы смешивали с 750 мкл TRIzol LS. После 5 мин инкубации при комнатной температуре добавляли 200 мкл хлороформа и с помощью вортекса «Микроспин FV-2400» (BioSan, Латвия) встряхивали 15 сек, далее опять инкубировали 2-3 мин при комнатной температуре. Затем центрифугировали 15 мин при t = 4С при 14000g. К поверхностному водному слою добавляли 1,5 объёма 100% этанола. Каждые 700 мкл полученной смеси центрифугировали 15 сек при комнатной температуре при 13000 g, после чего в смесь добавляли 700 мкл буфера RWT («miRNeasy Mini Kit») и опять центрифугировали при комнатной температуре 15 сек при 13000g. 500 мкл буфера RPE («miRNeasy Mini Kit») смешивали с полученным раствором и центрифугировали при комнатной температуре, удаляя остатки после каждого цикла. Последним этапом добавляли 15 мкл свободной РНК-азы, центрифугировали 1 мин при 13000g.

Оценка количества выделенной микроРНК производилась с помощью системы спектрофотометра «NanoDrop 1000 NP» (Thermo Scientific, США), выход продукта составил от 30 до 800 нг/мкл (А260/280=1,99). Полученные образцы замораживали при t = -40С.

Для полученных образцов микроРНК проводили обратную транскрипцию на четырехканальном амплификаторе «Veriti» («Applied Biosystems», США) для получения комплементарной ДНК (кДНК) с использованием набора «TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit» («Applied Biosystems», США) [102] no стандартной схеме, представленной производителем.

Изучение полиморфизмов генов AGOl, DGCR8, GEMIN3, GEMIN4, DROSHA в группе контроля и у больных гипертонической болезнью и ИБС постинфарктным кардиосклерозом

В ходе проведенных исследований были получены результаты, характеризующие состояние экспрессии микроРНК и полиморфизма ряда генов, определяющих регуляцию биогенеза микроРНК, в условиях прогрессирующего атерогенеза. Выраженность развития атеросклероза у обследованных пациентов подтверждалась наличием атерогенных расстройств липидного обмена, таких как гиперхолестеринемия, высокий показатель КА, избыточная масса тела, а также сформированной артериальной гипертензией и хронической сердечной недостаточностью, возникшей вследствие расстройств коронарного кровоснабжения.

Понимание патофизиологической значимости перестроек функционирования некоторых звеньев молекулярно-генетического аппарата, выявленных нами при атеросклерозе у человека, структурируется в виде следующих положений.

Положение 1. Известно, что высокая вариабельность экспрессии микроРНК как в норме, так и, безусловно, при патологии, подтверждается многочисленными экспериментальными и клинико-лабораторными исследованиями [48, 73, 120]. Многократно уже отмечалось, что при развитии патологических состояний изменяется, как правило, уровень экспрессии не исключительно одной, а множества микроРНК. В силу данного положения фиксация изменения количества нескольких ключевых микроРНК, несомненно, может быть использована для понимания, как патофизиологических основ развития конкретного заболевания, так и поиска молекулярно-генетических подходов к его ранней диагностики. В настоящем исследовании установлено, что уровень экспрессии miR-126 в плазме крови увеличился в 256 раз у больных ГБ и в 266 раз у больных ИБС ПИКС по сравнению с аналогичными показателями у здоровых людей. При этом из литературы известно, что miR-126 специфично экспрессируется в эндотелиальных клетках и является проангиогенной, то есть стимулирующей активную пролиферацию клеток эндотелия интимы артерий [83, 145]. Поскольку одним из важнейших процессов, лежащих в основе патогенеза ИБС, является ангиогенез, можно предположить, что усиление пролиферации эндотелиальных клеток при ИБС, несомненно, патофизиологически взаимосвязано с микроРНК [24]. В тоже время, нельзя не отметить, что в других работах показано снижение уровня экспрессии miR-126 у больных с хронической сердечной недостаточностью, которое связывают со снижением перфузии эндотелия и его метаболической активности, что, в свою очередь, влияет на высвобождение микроРНК [26].

Участие miR-155 в патогенезе ССЗ, таких как ГБ и ИБС ПИКС, в настоящем исследовании косвенно не подтвердилось, поскольку уровень экспрессии данной микроРНК в плазме крови превышал не более чем в пять раз таковой показатель в контрольной группе. В тоже время, согласно некоторым литературным данным, miR-155 может ассоциироваться с сердечно-сосудитой патологией за счет подавления в эндотелии и гладкой мускулатуре сосудов экспрессии первого типа рецепторов ангиотензина 2 [78, 145]. В некоторых работах описан и антиатерогенный эффект miR-155 [68]. Полученные данные позволяют предположить, что многофакторные заболевания, к которым относятся ГБ и ИБС, характеризуются сложным взаимодействием генетического материала и факторов, недетерминированных генами, таких как возраст, эмоциональный статус, индивидуальные особенности питания [4, 24, 31].

Уровень экспрессии miR-221 оказался выше в 195 раз в группе больных ГБ и в 261 раз выше в группе больных ИБС ПИКС. Также в проведенном исследовании, уровень экспрессии miR-222 оказался выше в 213 раз у пациентов ГБ и в 196 раз выше у пациентов ИБС ПИКС. MiR-221 и miR-222 относятся к антиангиогененным микроРНК, блокирующим пролиферацию эндотелиальных клеток, и тем самым, являются важным звеном в регулировании ангиогенеза и восстановлении сосудистой стенки [67, 104, 105]. В связи с этим, полученные результаты можно расценивать как ответную реакцию на повреждение интимы артерий при ГБ и ИБС. Представляется доказательно значимой ссылка на сравнительно недавно обнаруженный эффект аторвастатина (препарата из группы статинов) на уровень экспрессии miR-221 /miR-222 в эндотелиальных клетках, полученных от больных с ИБС [30, 121].

Следовательно, повышение в плазме крови уровня экспрессии miR-126, miR-221, miR-222 при ГБ и ИБС ПИКС, несомненно, является одним из патофизиологических звеньев развития атеросклероза и его осложнений у человека.

Положение 2. Качественный анализ взаимосвязей исследуемых микроРНК у пациентов с ГБ и ИБС ПИКС, проведенный с помощью ковариационной матрицы и дисперсионного анализа, позволил заключить, что в группе здоровых людей доминирующий вариационный ряд выглядит следующим образом: вначале - miR-126, далее miR-222, miR-221, miR-155. В группах больных ГБ и ИБС ПИКС последовательность доминирования следующая: miR-221, далее miR-126, miR-155, miR-222.

Как уже многократно отмечалось выше, miR-126 относится к проангиогенным микроРНК, стимулируя пролиферацию клеток эндотелия и ангиогенез [83, 84]. Можно предположить, что преобладание экспрессии данной микроРНК в группе изученных нами здоровых людей связано с ее постоянным и стабильным влиянием на процесс пролиферации эндотелиоцитов в физиологических условиях.

Качественные характеристики miR-126, miR-155, miR-221, miR-222 у больных гипертонической болезнью и ИБС постинфарктным кардиосклерозом

Для подтверждения правильности сделанных выводов было проведено попарное сравнение показателей ACt контрольной группы с группами ГБ и ИБС ПИКС с помощью U-критерия Манна-Уитни [23, 91]. Данный критерий является непараметрическим статистическим критерием и используется для сравнения двух независимых выборок по уровню какого-либо признака, измеренного количественно. Результаты данных сравнения подтверждают правильность выше высказанных выводов. Так, группы больных ГБ и ИБС ПИКС достоверно отличаются от контрольной группы по уровню плазменных miR-126, miR-221, miR-222 (р 0,001), для miR-155 достоверных различий получено не было (таблица 24). Таблица 24 - Сравнение показателей ACt в контрольной группе, у больных

Таким образом, согласно результатам проведенных нами исследований обнаружено, что уровни экспрессии miR-126, miR-221, miR-222 у больных ГБ и ИБС ПИКС достоверно превышают аналогичные показатели контрольной группы здоровых людей. С другой стороны, изменение уровня экспрессии miR-155 не удалось ассоциировать с изученными нами заболеваниями, что, возможно, указывает на отсутствие выраженной роли miR-155 в патогенезе сердечнососудистой патологии.

Полученные данные свидетельствуют о том, что miR-126, miR-221, miR-222, по-видимому, могут использоваться для изучения патогенеза молекулярно-генетических основ и патогенетической терапии ССЗ.

Качественные характеристики miR-126, miR-155, miR-221, miR-222 у больных гипертонической болезнью и ИБС постинфарктным кардиосклерозом В данном разделе представлены качественные характеристики взаимосвязей микроРНК, представленных показателями: miR-126, miR-155, miR-221, miR-222. Как уже указывалось выше, для каждой патологии меняется экспрессия не одной, а сразу нескольких микроРНК. Поэтому для определения взаимосвязей между изучаемыми микроРНК в исследуемых группах был проведен корреляционный анализ Спирмена, который показывает степень статистической зависимости между двумя числовыми переменными.

Коэффициент корреляции рассчитывали, как коэффициент ковариации степени выраженности микроРНК, деленный на произведение среднеквадратических отклонений степени вариации микроРНК, где коэффициент ковариации представляет собой среднее произведение отклонений степени вариации двух (любых) микроРНК от их средних значений степени вариации [43].

При сведении в одну таблицу коэффициентов ковариации была получена ковариационная матрица, отражающая взаимосвязи микроРНК. Далее ковариационная матрица использовалась в качестве специфического интегрального портрета исследуемых групп.

Ниже приведены ковариационные матрицы исследуемых групп: I группа (группа здоровья), II группа (больные ГБ), III группа (больные ИБС ПИКС) (рисунки 5-7).Доминирование антиангиогенной miR-221 у больных ГБ и ИБС ПИКС, по-видимому, может рассматриваться как ответная реакция на атероматозную альтерацию интимы артерий при ГБ и ИБС ПИКС. На данный факт указывается подробно в следующей литературе [101, 134]. В тоже время антиангиогенная miR-222 занимает последнее место в спектре доминирования исследуемых микроРНК у больных ГБ и ИБС ПИКС, что вступает в определенное противоречие с проведенными нами рассуждениями патофизиологического характера.

Тем не менее, выявление в настоящем исследовании различий в экспрессионной иерархии различных микроРНК в норме и в условиях атерогенеза имеет, безусловно, патофизиологическую перспективу в исследовании процесса развития атеросклероза и его осложнений.

Положение 3. В обзоре литературы уже было отмечено, что современная медицина расценивает ССЗ как мультифакториальную патологию, в основе которой, помимо средовых факторов, лежат сложные нарушения биохимических, иммунологических и молекулярно-генетических процессов.

Учитывая особенности биогенеза микроРНК [85, 119, 120, 127], можно предположить, что эффективность их работы будет зависеть от полиморфных вариантов как самих генов микроРНК, так и от генов, продукты которых задействованы на разных этапах развития и функционирования данного класса молекул. Это предположение находит подтверждение в ряде исследований последних лет [30, 69, 74, 114]. Об этом свидетельствуют и полученные нами данные.

В проведенном исследовании показано отсутствие статистического различия между частотой встречаемости полиморфизмов генов AGOl, GEMIN3, DGCR8, DROSHA и риском развития ГБ и ИБС ПИКС у мужчин. Также не установлена связь между данными заболеваниями и количеством гомозигот по минорному аллелю G и гетерозигот гена GEMIN4. Только частота гомозиготного носительства мажорного аллеля А гена GEMIN4 оказалась значимо выше у больных ГБ в сравнении с группой пациентов с диагнозом ПИКС. Так, носительство аллеля А и генотипа АА увеличивает риск ГБ в 3,05 и 5,23 раз. Как описывалось в главе III, полученные данные согласуются с исследованиями Wilker Е.Н. и соавт. (2010), в которых доказано влияние полиморфизма данного гена на уровни как систолического, так и диастолического артериального давления [148]. На основании комбинации неблагоприятных генотипов по генам биогенеза микроРНК можно выделить среди больных группы с низким, средним и высоким риском развития соответствующей патологии. Однако отсутствие достаточного количества данных в литературе указывает на необходимость проведения в этом направлении дополнительных исследований. Таким образом, выявленная сопряженность микроРНК и развития заключительной стадии атеросклеретического процесса у человека имеет, безусловно, патофизиологический характер. Это касается как направленности изменения уровня экспрессии ряда определяемых нами микроРНК, так и порядка доминирования микроРНК в их спектре. Кроме того, анализ полученных данных позволяет высказать предположение, что функционирование микроРНК в условиях атерогенеза может зависеть не только от множества полиморфизмов генов их биогенеза, но и от перестройки работы других регуляторных систем организма, на что указывается и рядом авторов [56, 59, 97].