Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 16
1.1. Костная ткань: особенности метаболизма и его регуляции 16
1.2. Распространенность и факторы риска остеопороза 42
1.3. Влияние химических факторов производственной и окружающей среды на состояние костной ткани
Глава 2. Материалы и методы исследования 58
2.1. Объём и дизайн исследования 58
2.2. Методы исследования
2.2.1. Исследование обмена костной ткани 63
2.2.2. Исследование процессов свободно-радикального окисления и антиокислительной защиты
2.2.3. Методы исследования гормонов 68
2.2.4. Другие методы исследования 68
2.3. Статистическая обработка результатов 71
Глава 3. Патофизиологические механизмы развития остеопенического синдрома при действии компонентов медно-цинковой колчеданной руды
3.1. Метаболизм костной ткани, уровень маркеров ремоделирования и цитокинов при действии элементов медно-цинковой колчеданной руды
3.2. Действие компонентов медно-цинковой колчеданной руды на гистологическую структуру и морфометрические показатели костной ткани в эксперименте
3.3 Характеристика интенсивности свободно-радикальных процессов в костной ткани
3.4. Влияние компонентов медно-цинковой колчеданной руды на функциональное состояние печени и гистологическую структуру печени и почек
3.5. Влияние компонентов медно-цинковой колчеданной руды на гормональный статус крыс
Глава 4. Механизмы токсического действия ациклических хлорированных 109 углеводородов на костную ткань
4.1. Характеристика минерального обмена, уровня маркеров ремоделирования, локальных факторов регуляции и метаболизма костной ткани при действии дихлорэтана.
4.2. Изменения оксидантно-антиоксидантной системы костной ткани при длительном введении дихлорэтана
4.3. Гистологическая структура и морфометрия бедренной кости при подострой интоксикации низкими дозами дихлорэтана
4.4. Влияние подострой интоксикации дихлорэтаном на функцию и структуру печени, структуру почек экспериментальных животных
4.5. Уровень некоторых гормонов в сыворотке крови крыс, подвергнутых интоксикации дихлорэтаном
Глава 5. Влияние на обмен костной ткани витаминного препарата антиоксидантного действия и его сочетания механоактивированной (нанодисперсной) аморфной формой глюконата кальция при подострой интоксикации дихлорэтаном
5.1. Изменения показателей минерального обмена и маркеров ремоделирования костной ткани в периферической крови
5.2. Обмен коллагена и состояние оксидантно-антиоксидантной системы в костной ткани
5.3. Характеристика гистологической структуры костной ткани 161
5.4. Влияние нанодисперсной формы кальция глюконата, триовита и их сочетания на уровень гормонов в крови и функциональное состояние печени при подострой интоксикации дихлорэтаном
Глава 6. Обсуждение 173
Выводы 202
Список сокращений 205
Список литературы
- Распространенность и факторы риска остеопороза
- Исследование процессов свободно-радикального окисления и антиокислительной защиты
- Действие компонентов медно-цинковой колчеданной руды на гистологическую структуру и морфометрические показатели костной ткани в эксперименте
- Гистологическая структура и морфометрия бедренной кости при подострой интоксикации низкими дозами дихлорэтана
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Негативное влияние на костную ткань химических загрязнителей,
сопровождающих производственные процессы, является одним из
малоизученных аспектов развития остеопении и остеопороза (ОП). Данные
литературы о характере действия химических факторов на состояние костной
ткани весьма ограничены [А.Ф. Вербовой, 2002; Ф.Х. Камилов и др., 2007; Э.Р.
Бикметова и др., 2010; Т.П. Маклакова и др., 2010; C. Virdaud et al., 2012; E.R.
Yoness et al., 2012; E.E. Beier et al., 2013; S. Chukraborty et al., 2013]. С этих
позиций привлекают внимание токсичные металлы и хлорорганические
соединения. Так, болезни костно-мышечной системы, включая
малотравматичные переломы, занимают высокие ранговые (3-5-е) места среди работников предприятий по добыче руды и обогащению цветных металлов [И.Г. Махотин, 2004; Э.И. Таирова, 2007; Ж.Е. Баттакова и др., 2008; З.С. Терегулова и др. (ред.), 2010; Э.Р. Шайхисламова, 2010] и химических производств хлорорганического синтеза [С.Ф. Шаяхметов, и др., 2008; С.А. Максимов и др., 2008].
Изучение минеральной плотности костной ткани (МПК) у горнорабочих, добывающих медно-цинковую руду подземным способом, выявило резкое е снижение, которое выявляется в 4 раза чаще, чем в группе контроля. Формирование остеопении у горнорабочих было установлено уже в молодом возрасте, снижение МПК при этом коррелировало со стажем работы в подземных условиях [А.Р. Кудашева, 2005; 2010; Э.Ф. Аглетдинов, и др., 2011; Н.В. Нургалеев и др., 2013].
Исследования, проведенные на химическом предприятии, показали, что
у рабочих, имеющих производственный контакт с хлорированными
низкомолекулярными ациклическими углеводородами (дихлорэтан
дихлорпропан, хлорвинил, 3-хлорпропен, 3-хлор-1,2-диоксипропан,
трихлорпропан, эпихлоргидрид и др.), во всех возрастных группах выявляется резкое снижение костной прочности в 1,5-2 раза чаще, чем у работников других профессий [Ф.Х. Камилов и др., 2007; И.А. Меньшикова и др., 2007; Л.М. Рамазанова и др., 2008; Э.Р. Бикметова и др., 2010]. Развитие остеопороза происходит исподволь, заболевание не имеет четко выраженной ранней клиники, кроме уже развившихся низкотравматичных переломов [И.И. Дедов и др., 2011]. В этой связи особое значение приобретает определение факторов риска остеопороза [В.Г. Кукес и др. 2015; Дж. А. Канис и др., 2012]. С одной стороны, в основе остеопоротического процесса лежат генорегуляторные (инволюционные) механизмы [А.А. Кишкун, 2008; L. Zhang et al., 2014], с
другой, выявлены ведущие факторы риска, обуславливающие его развитие, ускоряющие снижение костной массы, нарушая е микроархитектонику и механическую прочность [О.М. Лесняк, Л.И. Беневоленская, 2010; Д.В. Акимова, 2014; J. Tian et al., 2015].
Негативное влияние химических загрязнителей производственной среды на костную ткань происходит на фоне действия общеизвестных факторов риска ОП, приводят к суммации отрицательных эффектов на процессы ремоделирования. Химические факторы производственной среды могут действовать как до включения инволюционных механизмов снижения костной массы, так и на их фоне. Патогенетические эффекты их действия могут отличаться большим разнообразием. При этом в производственных условиях работники, как правило, подвергаются действию не одного химического вещества, а смеси поллютантов.
Наличие значительного количества факторов развития остеопении и
остеопороза определяет необходимость подхода к этой актуальной проблеме
как к системному биологическому явлению, имеющему в выраженной степени
генетическую основу [Р.И. Хусаинова, Э.К. Хуснутдинова, 2015]. С другой
стороны, требуют углубленного исследования и обобщения механизмы
действия различных химических факторов в конкретных условиях
производства для обоснования и разработки целенаправленных
профилактических мероприятий среди работающих в определенных отраслях промышленности.
Цель исследования
Установить ведущие патогенетические факторы повреждения костной
ткани при действии компонентов медно-цинковой колчеданной руды и
низкомолекулярных ациклических хлорированных углеводородов в
эксперименте.
Задачи исследования
-
Охарактеризовать при длительном поступлении в организм животных компонентов медно-цинковой колчеданной руды содержание в костной ткани ряда элементов, изменения в крови показателей минерального обмена, маркеров костного ремоделирования (С-концевые телопептиды коллагена І типа и активность костной щелочной фосфатазы).
-
Оценить при действии элементов медно-цинковой колчеданной руды обмен коллагена, состояние оксидантно-антиоксидантной системы и гистологической структуры костной ткани.
-
Выявить при хронической интоксикации компонентами руды изменения гормонального статуса (тестостерон, фоллитропин, лютропин, пролактин, тиреотропин, тироксин, трийодтиронин, паратгормон, кортизол), содержания
25(ОН) витамина D3 и цитокинов (sRANKL, остеопротегерин, склеростин), функционального состояния печени, гистологической структуры печени и почек.
-
Выявить нарушения фосфорно-кальциевого обмена, уровня циркулирующих в крови маркеров костного ремоделирования (С-концевые телопептиды коллагена типа І и костная щелочная фосфатаза) при подострой интоксикации экспериментальных животных низкомолекулярным алифатическим хлорированным углеводородом (дихлорэтан).
-
Исследовать при подострой интоксикации дихлорэтаном обмен коллагена (содержание белковосвязанного и свободного оксипролина, интенсивность включения в белки радиоактивного пролина), интенсивность свободно-радикального окисления и показатели антиоксидантной защиты, гистологическую структуру костной ткани.
-
Определить уровень гормонов (тестостерон, эстрадиол, фоллитропин, лютропин, пролактин, паратгормон) и цитокинов (sRANKL, остеопротегерин, склеростин) в плазме крови. Исследовать функциональное состояние печени, структурные изменения ткани печени и почек при интоксикации животных дихлорэтаном.
-
Оценить эффективность действия антиоксидантного препарата и механоактивированной (нанодисперсной) аморфной формы кальция глюконата на показатели минерального обмена, уровень маркеров ремоделирования костной ткани в плазме крови экспериментальных животных на фоне подострой интоксикации дихлорэтаном.
-
Изучить влияние применения комбинации антиоксидантного препарата с нанодисперсной формой кальция глюконата на обмен коллагена, окислительный метаболизм и гистоструктуру костной ткани, содержание в крови гормонов, регулирующих костный обмен и функциональное состояние печени на фоне подострой интоксикации дихлорэтаном.
Научная новизна
Впервые установлены общие механизмы дискоординации процессов ремоделирования костной ткани с превалированием резорбции при воздействии разных химических факторов производственной среды – хлорированных алифатических углеводородов и элементов, содержащихся в медно-цинковых колчеданных рудах.
Получены новые данные, отражающие изменения структуры и обмена костной ткани при комплексном действии элементов, содержащихся в медно-цинковой колчеданной руде. Накопление в костях ряда тяжелых и токсичных металлов (цинк, медь, ртуть, кадмий, свинец, железо, марганец) приводит к усилению катаболических процессов, дезорганизации и разрушению
микроархитектоники с истончением, деструкцией и рассасыванием костных пластинок, а также к индукции синтеза цитокинов, активирующих остеокластический дифферон. Хроническая интоксикация элементами руды снижает в костной ткани уровень ферментативного и неферментативного звеньев антиокислительной защиты, инициирует свободнорадикальное окисление, вызывает дисбаланс продукции гормонов, участвующих в регуляции ремоделирования, а также нарушения функции и структуры основных органов детоксикации – печени и почек.
Показано, что длительное воздействие низких доз низкомолекулярных ациклических хлорированных углеводородов (дихлорэтан) и компонентов медно-цинковой колчеданной руды приводит к нарушению минерального обмена и ремоделирования костной ткани с превалированием процессов резорбции.
Негативное влияние на состояние костной ткани хлорированных углеводородов характеризуется усилением катаболизма и ингибированием синтеза основного белка внеклеточного матрикса – коллагена, снижением биосинтеза неколлагеновых белков и интенсивности минерализации костного матрикса, развитием процессов остеодеструкции и остеодистрофии, активацией продукции цитокинов, стимулирующих функции остеокластов и остеокластогенез и ингибирующих остеобластогенез.
Установлен свободнорадикальный механизм токсического действия на костную ткань хлорпроизводных алифатических углеводородов. Показано, что развитию деструкции костной ткани способствуют при этом также нарушения гормонального статуса со снижением секреции гормонов анаболического и остеогенного действия и повышением уровня гормонов, оказывающих катаболический и резорбтивный эффект на костную ткань.
Показан положительный эффект совместного применения
антиоксидантного препарата и механоактивированной (нанодисперсной)
аморфной формы кальция глюконата на метаболизм костной ткани при
подострой интоксикации дихлорэтаном в низких дозах. При этом,
установлено, что введение нанодисперсной формы кальция глюконата на фоне
интоксикации алифатическим галогенуглеводородом оказывает
положительное влияние на содержание в крови фосфора и ионизированного кальция, способствует снижению секреции паратгормона и усилению включения радиоактивного 45Са в костную ткань. Применение комбинации нанодисперсной формы кальция глюконата с антиоксидантным препаратом в этих условиях приводит к ингибированию процессов свободнорадикального окисления, повышению активности основных антиоксидантных ферментов и общей антиокислительной активности, ингибированию катаболизма и
интенсификации в костной ткани биосинтеза коллагена и неколлагеновых
белков, улучшению минерализации кости. Установлено также, что
комбинированное лечение антиоксидантом и нанодисперсной формой
кальциевой соли глюконовой кислоты положительно отражается на состоянии
гормонального фона, вызывая увеличение продукции половых гормонов и
снижение паратгормона и пролактина, а также на функции печени. Показано,
что использование комбинированного введения препарата кальция и
антиоксидантного препарата на фоне интоксикации хлорированным
углеводородом способствует сбалансированности течения процессов
ремоделирования костной ткани с ингибированием интенсивности резорбции, снижению деструкции и улучшению е гистологической структуры.
Научно – практическая значимость.
Установлено, что длительное воздействие в низких дозах
хлорированных алифатических углеводородов, элементов медно-цинковой
колчеданной руды приводит к ускорению развития остеопенического
синдрома. Сформулированы ведущие патофизиологические механизмы
токсического действия химических факторов производственной среды на
костную ткань. Экспериментально показана эффективность использования
механоактивированной (нанодисперсной) аморфной формы кальция
глюконата для лечения остеопенических состояний. Установлено
корригирующее действие совместного использования антиоксидантного
препарата (Триовит) и нанодисперсной формы кальция глюконата (Кальций-
МАГ) на нарушения метаболизма и микроархитектоники костной ткани в
условиях длительного воздействия на организм низких доз
низкомолекулярных алифатических хлорированных углеводородов
(дихлорэтан). Результаты проведенных исследований экспериментально
подтверждают возможность развития дисбаланса процессов ремоделирования
и нарушения метаболизма костной ткани среди работников химических
предприятий, имеющих профессиональный контакт с хлорорганическим
производством, а также среди горнорабочих, контактирующих с тяжелыми и
токсичными металлами. Выявленные патогенетические механизмы
остеотоксического действия химических факторов производственной среды позволяют целенаправленно и обоснованно разработать профилактические мероприятия и приемы в соответствующих промышленных предприятиях для снижения частоты костной патологии, а также являются основанием для проведения у работающих периодического контроля состояния костной ткани и фосфорно-кальциевого обмена. Результаты исследований позволили оформить патенты на изобретения Российской Федерации № 2506071 от 10.02.2014 г., № 2511649 от 10.04.2014 г., и № 2533264 от 04.12.2014.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Длительное поступление компонентов медно-цинковой руды приводит к накоплению ряда тяжелых металлов в костной ткани, что сопровождается дискоординацией процессов ремоделирования с превалированием резорбции, нарушениями микроархитектоники с истончением, дезорганизацией, деструкцией и рассасыванием костных пластинок, изменением фосфорно-кальциевого обмена.
-
Подострая интоксикация хлорированными низкомолекулярными ациклическими углеводородами (дихлорэтан) дозозависимо нарушает метаболизм костной ткани, усиливая катаболизм, резорбцию, остеокластогенез и ингибируя развитие остеобластогенеза.
-
Общим механизмом остеотоксического действия химических факторов производственной среды (хлорированные алифатические углеводороды, элементы медно-цинковой колчеданной руды) является интенсификация свободнорадикальных процессов на фоне ингибирования или недостаточности физиологических резервов антиокислительной защиты. Факторами, способствующими развитию остеопенических процессов, при воздействии химических факторов производственной среды являются нарушения функционального состояния печени и почек, дисбаланс содержания гормонов и цитокинов, регулирующих процессы ремоделирования и метаболизма костной ткани.
-
Применение комбинации антиоксидантного препарата с механоактивированной (нанодисперсной) аморфной формой кальция глюконата на фоне подострой интоксикации ациклическим хлоруглеводородом (дихлорэтан) оказывает положительный эффект на костный и фосфорно-кальциевый обмен, гормональный фон и функциональное состояние печени, вызывая корригирующее действие.
Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора
Достоверность результатов и обоснованность выводов базируется на адекватности экспериментальных моделей, достаточном объеме исследований, использовании сертифицированного оборудования и современных методов исследования, обработке результатов исследований с применением статистического пакета Statistica 6,0 for Windows.
Содержащиеся в работе данные получены лично автором или при его непосредственном участии на всех этапах выполняемой работы: постановка задач, методов, постановка экспериментальных исследований, статистическая обработка, оценка, анализ полученных результатов, написание статей, оформление диссертационной работы.
Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на:
Республиканской научно-практической конференции с международным
участием «Научный прорыв - 2010» (Уфа, 2010); на 75-й Республиканской
научно-практической конференции студентов и молодых ученых с
международным участием «Вопросы теоретической и практической
медицины» (Уфа, 2011); Всероссийской научно-практической конференции
«Связь заболевания с профессией с позиции доказательной медицины»
(Казань, 2011); Всероссийской научно-практической конференции
«Биохимические научные чтения памяти академика РАН Е.А. Строева»
(Рязань, 2012); Научно-практической конференции с международным
участием «Илизаровские чтения» (Курган, 2012, 2015); Международной
конференции молодых ученых «Медицинская наука – 2012» (Уфа- 2012);
Российской научно-практической конференции «Остеопороз – важнейшая
мультидисциплинарная проблема здравоохранения ХХI века» (Санкт-
Петербург, 2012); 8-й международной крымской конференции
«Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии» (Судак, Крым,
2012); III-й Международной научно-практической конференции
«Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической
медицине» (Казань, 2012); VI-й Международной научно-практической
конференции «Научная дискуссия : вопросы медицины» (Москва, 2012); IV,
VІІ Российских научно-практических конференциях «Здоровье человека в
ХХI веке» (Казань, 2012; 2015); Х Международной научно-практической
конференции «Роль природных факторов и туризма в формировании
здоровья населения» (Уфа – Иремель, 2012); Международном симпозиуме
«Биохимия основа наук о жизни», посвященного 150-летию образования
кафедры биохимии Казанского университета» (Казань, 2013); Х юбилейной
международной конференции «Окислительный стресс и
свободнорадикальные патологии» (Пицунда, Абхазия, 2014); Российской
научно-практической конференции «Медицинская биохимия: достижения и
перспективы» (Казань, 2015).
Внедрение результатов исследования в практику
Основные результаты диссертационного исследования используются в учебном процессе кафедр патологической физиологии, биологической химии, фармакологии №1 с курсом клинической фармакологии, общей гигиены с курсом гигиенических дисциплин медико-профилактического факультета ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедры биохимии и патофизиологии ГБОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия» Минздрава России, кафедры
биологической химии и патофизиологии ГБОУ ВПО «Ижевская государственная медицинская академия» Минздрава России, кафедры биохимии ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Минздрава России, кафедры патофизиологии с курсом клинической патофизиологии ГБОУ ВПО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова» Минздрава России.
Полученные результаты исследования использованы при написании монографии «Остеопороз: влияние химических факторов производственной среды на метаболизм костной ткани» (Ф.Х. Камилов и др., Уфа,2015).
Публикации
Соискатель имеет 69 опубликованных работ, из них, по теме диссертации опубликовано 45 научных работ общим объемом 29,6 печатных листа, в том числе 20 статей в научных журналах и изданиях, которые включены в перечень российских рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертации; 21 работа, опубликованная в материалах региональных, российских и международных конференций и симпозиумов, 1 монография, получены 3 патента на изобретения
Объем и структура работы
Распространенность и факторы риска остеопороза
Во внеклеточном веществе костной ткани содержатся также микрофибриллы, построенные из фибриллинов (FBN-1, FBN-2), обладающих способностью к обратимому растяжению. Молекулы фибриллинов, отличающиеся гибкостью, способны присоединять кальций, взаимодействовать с клетками. Они ассоциированы со специфическими гликопротеинами – MAGP-1, MAGP-2 и другими белками экстрацеллюлярного матрикса [464].
Неколлагеновые белки внеклеточного матрикса кости представлены протеогликанами – фибромодулином, дерматопонтином, остеоадгерином, бигликаном и декорином, а также гликопротеинами – остеонектином, остеопонтином, костным сиалопротеином II, остеокальцином, матриксным Gla-протеином, тромбоспондинами и др. В совокупности они составляют до 16% белков органической фазы костного матрикса [168], способствуют взаимодействию остеоида с минеральной частью и клетками кости, участвуют в процессах ремоделирования и моделирования, минерализации. Межклеточный матрикс содержит также гиалуронан, ростовые факторы, цитокины, липиды, некоторые белки плазмы крови – альбумин, аполипопротеин А-1, трансферрин, -2-гликопротеин, иммуноглобулины и др. В кости обнаруживается лимонная кислота, содержание которой может достигать до 1%. Остеогенные клетки характеризуются высокой активностью цитратсинтазы. Цитрат, образуя растворимые соли с кальцием, играет роль переносчика при остеогенезе и разрушителя кристаллов гидроксиапатита при остеолизе и резорбции костного матрикса.
В формировании и дальнейшем поддержании структуры костной ткани принимают участие клетки двух дифферонов: костный дифферон и дифферон мононуклеарных фагоцитов – остеокластический дифферон [130]. Основные клетки костной ткани – остеоциты, остеобласты и остеокласты характеризуются высокой метаболической активностью и разделением функций.
Остеобласты (ОБ) являются «организаторами архитектуры» костной ткани [418]. Они синтезируют компоненты экстрацеллюлярного вещества. Секреция в костный матрикс люмикана и интенсивная экскреция остеокальцина характерны для их завершения дифференцировки (созревания) остеобластов. Цитоплазматическая мембрана ОБ содержит группу белков, необходимых для их взаимодействия между собой, с другими клетками и экстрацеллюлярным матриксом – интегрины, остеоцитарный фактор 45 (OF 45) или MEPE (matrix extracellular phosphor-glycoprotein). В группу интегринов входят v3, v5, 56, v8, 21, 31, 51, связывающие ОБ с неколлагеновыми белками (витронектин, фибронектин), коллагеном типа I. Они необходимы для нормальной дифференцировки, реакции к механическим стимулам, минерализации внеклеточного матрикса [410, 412, 480]. Белок OF45 экспрессируется ОБ и остеоцитами, содержит RGD-последовательность для взаимодействия с экстрацеллюлярным матриксом. ОБ экспрессируют секретируемый в матрикс белок остеокрин (Ostn), являющийся лигандом натрийуретического пептида С, который стимулирует остеобластическую дифференцировку [425], и периостин (PLF), также стимулирующий дифференцировку ОБ и оссификацию в костномозговой полости [452]. ОБ экспрессируют остеоактивин, играющий анаболическую роль при завершении формирования костного матрикса и его минерализации [439]. Экспрессия остеоактивина индуцируется и регулируется костным морфогенетическим белком ВМР-2 с участием белка Smad-1.
ОБ экспрессируют также факторы транскрипции, действие которых определяет их протеом, или транскрипционный профиль. Среди этих факторов – RUNX-2 (runt related transcription factor-2) или Cbf-1 (core binding factor alpha-1); Twist, Osterix/Sp7; Dlx 5; Msx-2; NF-kB, Bapx 1. Центральное место занимает RUNX-2 [534], характеризуемый как «мастер-ген». Роль RUNX-2/Cbf-1 связана с дифференциацией ОБ, с поддержанием функциональной активности зрелых ОБ на механические воздействия. Активность RUNX-2/Cbf-1 регулируется белком Shn-3 (Schnurri-3), ламином А/С, транскрипционными факторами Twist, костными морфогенетическими белками BMP-2,4,7, факторами роста фибробластов -2, -9, инсулинподобными факторами роста, секреторными белками семейства Wnt: трансформирующие рост факторы – TGF-1, -2, -3, активин, ингибины [48, 196, 293, 321, 394, 405]. Функция RUNX-2 связана с транскрипционным фактором Osterix/Sp7, который так же, как и RUNX-2, необходим для остеобластической дифференцировки, координации функции ОБ. Osterix/Sp7 вызывает экспрессию генов коллагена типа 1, костного сиалопротеина, остеонектина, остеокальцина. Osterix/Sp7 экспрессируется под влиянием гена Dlx5, активируемого ВМР-2 [293].
Для нормальной синтетической активности зрелого ОБ необходимы белок, кодируемый протоонкогеном с-Src, фактор транскрипции, содержащий лейциновую застежку, и белок, богатый цинковыми пальцами FHL 2 [314].
Функционирование ОБ осуществляется согласованно, благодаря адгезивным взаимодействиям между ними и контактным соединениям коммуникационного типа [505]. Адгезивные соединения осуществляются белковыми комплексами, содержащими кадгерины: N-кадгерин, 11-кадгерин, ОБ-кадгерин. Контактные соединения, играющие центральную роль во взаимодействии ОБ и остеоцитов, осуществляются коннексонами (полукольцами), соединяющими ОБ с отростками остеоцитов или ОБ с ОБ. Остеобласты связаны между собой плотными соединениями, состоящими из трансмембранных белков – клаудинов и оклодинов, которые сами и экспрессируют [440]. Эти плотные контакты разделяют с помощью ОБ циркулирующую в лакунах и канальцах внутрикостную жидкость от плазмы крови, что имеет значение для метаболизма костной ткани, а также определяют однонаправленную секрецию продуцируемых ОБ компонентов внеклеточного матрикса с помощью специфических белков (rsce 6, NSF, VAMP1, синтаксин 4) [371].
По завершении формирования экстрацеллюлярного матрикса кости и его минерализации часть ОБ переходит в неактивное состояние. В поверхностном слое кости преобладающая часть подвергается апоптозу, другая часть, замуровываясь в лакунах толщи костного матрикса, окончательно дифференцируется в остеоциты [130, 170].
Исследование процессов свободно-радикального окисления и антиокислительной защиты
Для характеристики ремоделирования костной ткани в плазме крови методом твердофазного ИФА были исследованы КЩФ, С-концевые телопептиды І типа, sRANKL, склеростин, остепротегерин.
Активность КЩФ отражает процессы остеогенеза [164]. Для определения ее активности были использованы наборы реагентов «Metra BAF EIA kit» фирмы «Quidel Corporation». Фермент вырабатывается остеобластами, его экспрессия усиливается в процессе формировании кости при дифференциации преостеобластов [229].
Об интенсивности костной резорбции судили по уровню С-концевых телопептидов коллагена типа І (СТХ, Cross Laps), определение которых осуществляли с использованием реагентов «-Serum Cross Laps ELISA» фирмы «Nordie Bioscience diagnostic A.S.».
Уровень sRANKL в плазме крови оценивали с помощью наборов реагентов «FRE Soluble RANKL», OPG – «Osteprotegerin» фирмы Biomedica, Medizinproducte Gmb».
Концентрацию склероcтина определяли набором реагентов «Sclerostin» фирмы «Biomedica, Medizinproducte Gmb».
Иммуноферментный анализ проводили с использованием комплекта автоматического анализатора «Униплан».
Определение содержания в костной ткани свободного (СО) и белковосвязанного оксипролина (БСО) осуществляли согласно рекомендациям П.Н. Шараева и соавт. [16]. Принцип метода основан на окислении гидроксипролина хлорамином, продукты окисления которого взаимодействуют с пара-деметиламиноазобензальдегидом с образованием хромогена красного цвета. Концентрацию образовавшего продукта определяли фотометрически при длине волны 560 нм.
Определение концентрации гликозамингликанов (ГАГ) в костной ткани проводили по методу, описанному П.Н. Шараевым и др.[16]. В присутствии серной кислоты гексуроновые кислоты с карбозолом образуют 5-карбоксифурфурол, содержание которого оценивали фотометрически при длине волны 530 нм.
Интенсивность биосинтеза коллагена костной ткани определяли по скорости включения радиоактивного [14С]-пролина [100]. Радиоактивный пролин в дозе 0,3 МБк на 100 г массы тела животного вводили внутрибрюшинно за 24 часа до забоя. Обработку тканей животных после забоя проводили при температуре 0-2оС. Выделенные кости взвешивали и обезжиривали смесью этиловый спирт-диэтиловый эфир (1:1) в течение 48 часов, ещё в течение 2-х суток эфиром. Измельченную обезжиренную костную ткань декальцинировали (2н соляная кислота в 96% этаноле) в течение 24 часов при встряхивании, высушивали до постоянной массы [193]. Для экстракции коллагена добавляли цитратный буфер (рН 3,0) и оставляли при температуре 4оС на 24 часа. В надосадочной жидкости после центрифугирования определяли содержание белка по Лоури и радиоактивность. Радиоактивность измеряли на установке «Бета-2» с использованием сцинтилляционной жидкости (раствор Брея). Уровень радиоактивности выражали в импульсах в 1 мин на 5 мг белка.
Биосинтез неколлагеновых белков костной ткани исследовали по включению радиоактивного [14С]-тирозина. Радиоактивную аминокислоту вводили в дозе 0,2 МБк/100 г массы внутрибрюшинно за 24 часа. Обезжиривание и декальцинирование костной ткани осуществляли, как описано выше. Оставшийся осадок костной ткани после экстракции коллагена растворяли в 1н растворе КОН, измеряли в растворе содержание белка и радиоактивность.
Интенсивность минерализации костной ткани исследовали по включению радиоактивного 45Са в минеральную фазу. Радиоактивный кальций вводили в дозе 0,4 МБк на 100 г массы крысы внутрибрюшинно за 4 часа до забоя. Выделенные кости фиксировали в 10% растворе формалина. Навеску кости растворяли в 1н растворе КОН. Радиоактивность измеряли описанным выше способом. Уровень радиоактивности выражали в импульсах в минуту на 100 мг костной ткани.
Наиболее общими маркерами состояния обмена костной ткани являются содержание в плазме крови кальция, фосфора, магния и экскреция их с мочой. Концентрацию общего кальция, фосфора и магния исследовали на полуавтоматическом анализаторе FD-910 фирмы «Labsistems» согласно прилагаемым инструкциям к стандартным наборам реагентов фирмы «HUMAN». Определение ионизированного кальция (Са2+) осуществляли ионометрически с помощью ионселективных электродов, используя ионометр «Fresenius Ionometr-2».
Выраженность свободно-радикальных процессов в тканях кости оценивали методом хемилюминесценции, определением содержания продуктов перекисного окисления липидов и окислительной модификации белков.
Хемилюминесцентный анализ. Исследование хемилюминесценции гомогената костной ткани осуществляли с использованием хемилюминометра ХЛ-003 (Россия) по Ю.А. Владимирову [208]. Обработку хемилюминограмм производили с помощью специализированной компьютерной программы. Величину показателей выражали в условных единицах. Содержание белка в пробах определял по Лоури.
Навеску ткани кости промывали ледяным фосфатным буфером рН 7,45, гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе при охлаждении с 5 мл буфера. Буферным раствором гомогенат разводили до содержания белка 1 мг/мл. Хемилюминесценцию регистрировали в системе, которая содержала 1 мл тканевого гомогената, 19 мл калий-фосфатного буфера рН 7,45. Индукцию свечения проводили добавлением 1 мл 50 мМ раствора FeSO47H2O. Определяли спонтанное свечение, высоту быстрой и медленной вспышки, светосумму свечения.
Определение продуктов липопероксидации. Концентрацию первичных и вторичных ПОЛ определяли в гептан-изопраноловых экстрактах по методу, описанному Волчегорским И.А. с соавт. (233).
Липиды тканей извлекали гептан-изопраноловой смесью, которые затем разделяли. В гептановую фазу преимущественно экстрагируются нейтральные липиды (триацилглицеролы, эфиры холестерина и др.), в изопропаноловую – дифильные (фосфолипиды, сфинголипиды и др.). В обеих фазах измеряли поглощение при 220 нм (характеризует изолированные двойные связи), при 233 нм (ацилгидроперекиси), при 278 нм (кетодиены и сопряженные триены). Содержание продуктов ПОЛ рассчитывали по величине отношений экстинций Е233/Е220 и Е278/Е220 в каждой фазе в условных единицах.
ТБК-активные соединения (малоновый диальдегид и др.) изучали с использованием набора реагентов «ТБК-АГАТ» фирмы «АГАТ-МЕД». Продукты ПОЛ с тиобарбитуровой кислотой при кипячении образуют окрашенный комплекс, который экстрагируется бутанолом. В экстракте определяются оптическая плотность комплекса по разности поглощения при 535 нм и 570 нм.
Определение содержания окислительно-модифицированных белков осуществляли по методу, описанному Дубининой Е.Е. и соавт. [126] и адаптированному для работы с гомогенатами по уровню образования динитрофенилгидразонов. Одновременно изучали содержание карбонилированных белков в гомогенатах в ответ на индукцию свободно-радикального окисления in vitro Fe2+/Н2О2.
О состоянии антиоксидантной системы костной ткани судили по содержанию в гомогенатах восстановленной формы глутатиона, общей антиокислительной активности, активности супероксиддисмутазы (СОД), глутатионпероксидазы (ГПО) и каталазы.
Определение общей антиокислительной активности (ОАА) проводили с использованием системы, содержащей липопротеины, полученные из желтка куриного яйца путем гомогенизации и разведения в 20 раз в фосфатном буфере рН 7,45, по методике, описанной Г.И. Клебановым и соавт. [140]. В системе с наличием (опыт) и без наличия (контроль) гомогената ткани инициировали ПОЛ путем добавления 1 мл раствора, содержащего 50 ммоль FeSO47H2O. Интенсивность пероксидации измеряли на хемилюминометре ХЛ-003. ОАА оценивали путем вычисления торможения пероксидации в присутствии гомогената ткани:
ОАА = (светосумма ХЛконтроль – светосумма ХЛопыт) / светосумма ХЛконтроль100. Определение содержания глутатиона восстановленного. Концентрацию восстановленного глутатиона (ГВ) изучали по методике, описанной А.Н. Гавриловой в модификации [65] с добавлением 5,5-дитио-бис-(2-нитробензойной) кислоты (ДТНБ) к супернатанту гомогената костной ткани после осаждения белков сульфасалициловой кислотой. Расчет содержания ГВ производили по калибровочному графику и выражали в мкг/мг белка.
Определение активности супероксиддисмутазы (СОД) [КФ 1.15.1.1] осуществляли с использованием реагентов «RANSOD» фирмы «Randox Labor. LTD». Активность СОД определяли по степени ингибирования реакции образования формазона в результате окисления хлорида 2-(4-йодофенил)-3-(4-нитрофенол)-5-фенилтетразолия (I.N.T.) супероксиданионом, генерируемого при окислении ксантина ксантинокси дазой:
Действие компонентов медно-цинковой колчеданной руды на гистологическую структуру и морфометрические показатели костной ткани в эксперименте
Проксимальные канальцы нефрона сохраняют средний диаметр просветов, хотя имеются канальцы с суженным просветом. Канальцы, как правило, свободные, но ряд из них содержат слущенные эпителиальные клетки. В стенке канальцев наблюдается пролиферация некоторых эпителиоцитов, выявляются двуядерные эпителиальные клетки с развитым ядрышковым аппаратом. Цитоплазма таких клеток окрашена гематоксилином и эозином в насыщенный розовый цвет, характеризуя активный внутриклеточный метаболизм. Дистальные канальцы нередко расширены, в их просвете просматривается жидкость (рисунок 16б). В соединительной строме почки выявляются фибробласты, а также макрофаги и лимфоциты. В мозговом веществе определяются мозговые лучи, между которыми выявляется почечный лабиринт. Интерстиций мозговых лучей также содержит фибробласты, макрофаги, лимфоциты. Межканальцевые капилляры полнокровны, содержат эритроциты (рисунок 16в). В мозговом веществе почки эпителий собирательных протоков имеет типичное строение. Интерстициальная соединительная ткань мозгового вещества содержит фибробласты, а также лимфоциты и макрофаги (рисунок 16г).
У животных подопытной группы через 3 месяца после ежедневного введения суспензии порошка медно-цинковой колчеданной руды в корковом слое почек наблюдались деструктивно измененные почечные клубочки, их атрофия и сморщивание, обнаруживались единичные опустошенные почечные капсулы (рисунок 17а). Наблюдались признаки обширных кровоизлияний. Почечные клубочки в непосредственной близости с гематомами сморщены. В самой гематоме и в цитоплазме окружающих макрофагов видны темные включения (рисунок 17б). Вены коркового вещества имеют резко расширенные просветы, содержат форменные элементы крови, характеризуя венозный застой. Выявляются обширные очаги лимфо-гистиоцитарно-фибробластической инфильтрации (рисунок 17в), обширные разрастания коллагеновых волокон, распространяющиеся в интерстиций, характеризующие развитие интерстициального фиброза.
В проксимальных канальцах имеются признаки десквамации эпителиоцитов, фрагменты клеток находятся в просвете канальцев, которые выявляются в виде плотных скоплений, способствующие формированию белковых цилиндров и нарушению гидродинамики. Наблюдаются разрушения эпителиальных клеток дистальных канальцев в корковом веществе почки. Цитоплазма их порой лизирована, в цитоплазме определяются явления гидропической дистрофии вплоть до парциального некроза. Ядра этих эпителиоцитов плотные, сморщенные, пикнотичные (рисунок 17г).
В мозговом веществе почек эпителий собирательных протоков также имеет признаки гидропической дистрофии. Клетки, набухшие с перинуклеарным отеком, светлой разрушенной цитоплазмой. Они отслаиваются в виде целого пласта от базальной мембраны, которая остается оголенной. Просветы дистальных канальцев расширены, выявляются отдельные эпителиоциты, содержащие в цитоплазме темно-желтый пигмент (рисунок 17д). В интерстиции наблюдаются расширенные полнокровные капилляры. В наружном отделе мозгового вещества выявляются кровоизлияния, очаговое скопление лимфоидной ткани, в которой определяются лимфоциты, макрофаги, плазмоциты. В межклеточных пространствах мозгового вещества почек наблюдаются разрастание соединительной ткани, спавшиеся протоки собирательных трубочек. Вдоль собирательных трубок определяются прослойки плотных пучков волокнистой оформленной соединительной ткани (рисунок 17е).
Резюмируя результаты гистологического изучения структуры почек, можно констатировать нефротоксическое действие элементов, содержащихся в составе медно-цинковой колчеданной руды.
При хроническом ежедневном внутрижелудочном введении суспензии порошка руды у крыс подопытной группы наблюдалась сосудистая реакция, отражающаяся в дилатации, разрыве сосудов и обширных кровоизлияниях; воспалительно-клеточная инфильтрация отдельных участков коркового и мозгового вещества почек с последующим фиброзированием периваскулярной области и интерстиция, способствующие формированию тубулоинтестинального склероза; деструкция и атрофия отдельных почечных клубочков; выраженная дистрофия эпителиоцитов дистальных отделов почечных канальцев.
Таким образом, в печени и почках подопытных животных при хроническом (в течение 3-х месяцев) внутрижелудочном воздействии суспензией порошка медно-цинковой колчеданной руды выявляется значительное увеличение содержания ряда металлов. Вероятно, повреждение и снижение функции печени и почек – наиболее типичный результат длительного воздействия многих металлов в силу особой роли этих органов в концентрировании, детоксикации и экскреции токсикантов.
В литературе имеются сведения о негативном влиянии тяжелых и токсичных элементов на гормональную систему организма [103, 183, 199]. Особое внимание привлекает тестикулярная токсичность и тиреотоксичность этих металлов [260, 317, 417, 515].
В связи с этим были проведены исследования содержания в крови у самцов крыс, подвергнутых трехмесячному воздействию компонентами медно-цинковых колчеданных руд, гонадотропинов – фолликулостимулирующего (ФСГ) и лютеинизирующего (ЛГ) гормонов, пролактина, йодированных гормонов щитовидной железы (общего Т3 и общего Т4) и тиреотропного гормона (ТТГ), а также кортизола и паратиреоидного гормона (ПТГ). Кроме того, было исследовано и содержание 25-гидроксивитамина D3 [207]. Результаты приведены в таблице 17.
У подопытных животных при действии компонентов руды увеличивается продукция паратиреоидного гормона, характеризуя развитие вторичного гиперпаратиреоза. Гиперпродукция ПТГ приводит к усилению остеоцитами остеолиза и активирует процессы дифференциации и функционирования остеокластов. Одновременно ПТГ уменьшает старение и апоптоз остеобластов [378], поддерживает дифференциацию мезенхимальных стволовых клеток по клеточному циклу в остеогенную линию клеток [318, 323], а также контролирует в остеобластах синтез инсулиноподобного фактора роста-1. Однако анаболические эффекты ПТГ на костную ткань обнаруживаются лишь при кратковременном повышении [460].
Механизм действия ПТГ на метаболизм костной ткани обусловлен и тем, что он контролирует в почках активность фермента гидроксилирования 25(ОН)D3 и 25(ОН)D2 в кальцитриол, который также оказывает анаболический эффект на костную ткань, повышает реабсорбцию Са в почках и абсорбцию Са в тонком
Гистологическая структура и морфометрия бедренной кости при подострой интоксикации низкими дозами дихлорэтана
Межсосудистое пространство заполнено волокнистой соединительной тканью. Вокруг почечных клубочков имеются зоны воспалительно-клеточной инфильтрации, состоящей из лимфоцитов, плазмоцитов и макрофагов (рисунок 27в). Большинство проксимальных канальцев сохраняют средний диаметр просветов, в то время как дистальные канальцы часто расширены. В нефроцитах проксимальных канальцев наблюдаются признаки гидропической и зернистой дистрофии. Часть эпителиальных клеток при окраске гематоксилином и эозином имеет розовую цитоплазму зернистого вида, характеризуя метаболические нарушения, другая содержит просветленную, набухшую цитоплазму с пикнотичными сморщенными ядрами. В этих клетках выявляются перинуклеарный отек, признаки баллонной дистрофии, порой с выпадением ядер. Просветы проксимальных канальцев заполнены слущенными клетками. В интерстиции в значительном количестве определяются уплощенные резидентные макрофаги (рисунок 27г). В дистальных канальцах почки наблюдается резкое увеличение просвета протоков, признаки глубоких дистрофических и некробиотических изменений эпителиальных клеток. При окраске гематоксилином и эозином цитоплазма клеток окрашивается базофильно, она гомогенна, фрагментарно лизирована. Ядра в этих клетках пикнотичны, порой отсутствуют (рисунок 27д).
В кортикомедуллярной зоне интерстиций мозговых лучей инфильтрирован лимфоцитами и макрофагами. Иногда воспалительные клетки обнаруживаются в просвете канальца. Межканальцевые капилляры расширены, в них определяется стаз крови и лимфы. В канальцах почечного лабиринта просветы резко увеличены. Наблюдается интерстициальный фиброз. При окраске по Ван Гизону выявляются разрастания волокнистой соединительной ткани, представленные толстыми пучками коллагеновых волокон, локализованных периваскулярно и в толще паренхимы на месте поврежденных почечных канальцев (рисунок 27е).
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о развитии существенных изменений в ткани почек, затрагивающих все компоненты нефрона – почечные тельца, проксимальные и дистальные канальцы, кровеносные сосуды, а также интерстиций, которые можно охарактеризовать как токсическую нефропатию
Около 10% случаев терминальной стадии почечной недостаточности вызваны химическими факторами производственной среды, но подтвердить эти результаты достаточно трудно из-за длительного латентного периода между воздействием и клиническим проявлением болезни. До появления очевидной клинической картины может быть утрачена функция двух третей нефронов обеих почек [199]. При остром отравлении дихлорэтан вызывает токсическую энцефалопатию, острую дыхательную и сердечно-сосудистую недостаточность, токсический гастроэнтерит, токсическую гепатопатию и нефропатию. Почки отличаются высокой активностью цитохром Р-450 зависимых оксидаз. В тканях отмечается метаболизм незначительной части дихлорэтана с образованием 1-хлорозо-2-хлорэтана, который активно взаимодействует с белками, нуклеиновыми кислотами. Часть 1-хлорозо-2-хлорэтана гидролизуется до 2-хлорэтана или спонтанно переходит 2-хлорацетоальдегид, который, под действием альдегиддегидрогеназы, окисляется в токсичные 2-хлорэтанол и хлоруксусную кислоту. Детоксикация дихлорэтана и его метаболитов осуществляется конъюгацией с восстановленным глутатионом с образованием малотоксичных меркаптоуровых кислот. При этом дихлорэтан и его метаболиты в основном выделяются через легкие (10-42 %) и с мочой (51-73 %) [91, 199].
Результаты проведенных исследований, таким образом, позволяют констатировать, что при длительной экспозиции малыми дозами ДЭ в течение 2-х месяцев у животных наблюдаются нарушения функционального состояния печени, гистологической структуры печени и почек. Это может явиться дополнительным фактором, приводящим к установленным сдвигам фосфорно-кальциевого обмена с последующим снижением минеральной фазы костного внеклеточного матрикса и нарушениями метаболизма костной ткани.
При действии хлорорганических соединений наблюдается дезинтеграция функции эндокринных желез со снижением продукции половых гормонов, йодированных тиронинов, повышением выброса катехоламинов и глюкокортикостероидов [34, 62, 114]. Длительное поступление в организм химических соединений, несомненно, сопровождается развитием стереотипной реакции – неспецифического адаптационного синдрома.
В этой связи у животных, подвергнутых ежедневной интоксикации ДЭ, в течение двух месяцев в суммарных дозах 0,05ЛД50 и 0,1ЛД50 в сыворотке крови было исследовано содержание ряда гормонов (таблица 27).