Содержание к диссертации
Введение
Раздел 1. Перспективы системного применения аллогенных мезенхимальных стволовых клеток для коррекции стресс-индуцированных повреждений почек (обзор литературы) 17
1.1 Иммобилизация как разновидность стресс-воздействия 17
1.2 Морфофункциональная характеристика почек 20
1.3 Современные представления о патогенезе повреждения почек при стрессовом воздействии.. 25
1.4 Применение мезенхимальных стволовых клеток как перспективный метод регенерационной терапии 32
Раздел 2. Материалы и методы исследования 41
2.1 Объекты и дизайн исследования 41
2.1.1. Характеристика лабораторных животных 41
2.1.2. Экспериментальное моделирование иммобилизационного стресса и формирование экспериментальных групп 42
2.1.3. Подготовка материала для дальнейших исследований 43
2.2. Получение культуры мезенхимальных стволовых клеток костномозгового происхождения, ее идентификация и оценка пролифера-тивной активности. 48
2.3. Методы исследования 51
2.3.1. Методы изучения активности антиоксидантной системы и процессов свободно-радикального окисления 51
2.3.1.1. Определение содержания малонового диальдегида в сыворотке крови и гомогенатах почечной ткани 51
2.3.1.2. Определение активности супероксиддисмутазы (КФ1.15.1.1.) в сыворотке крови и в гомогенатах почечной ткани 53
2.3.1.3. Определение активности каталазы (КФ 1.11.1.6.) в сыворотке крови и в гомогенатах почечной ткани 55
2.3.1.4. Определение уровня восстановленного глутатиона (GSH) в сыворотке крови и в гомогенатах почечной ткани 56
2.3.1.5. Определения количества общего белка в гомогенате почечной ткани по биуретовой реакции 58
2.3.2. Методы определения индукции апоптоза 62
2.3.2.1. Оценка состояния компонентов нитроксидергической системы в сыворотке крови и в ткани почек 63
2.3.2.2. Определение уровня фрагментации ДНК в ядрах клеток почечной ткани 64
2.3.3. Оценка состояния энергетического обмена почечной ткани. 65
2.3.3.1. Оценка состояния адениловой системы почечной ткани 65
2.3.3.2. Методика определения активности лактатдегидро-геназы в почечной ткани 66
2.3.3.3. Методика определения активности лактатдегидро-геназы в сыворотке крови 66
2.3.4. Оценка функциональной активности почек 67
2.3.5. Гистоморфометрический метод исследования 68
2.4. Статистический анализ результатов 68
Раздел 3. Результаты проведенных исследований 70
3.1. Влияние введения мезенхимальных стволовых клеток на состояние компонентов антиоксидантной системы и процессы свободно радикального окисления в крови и почках при иммобилизационном стрессе 70
3.2. Влияние мезенхимальных стволовых клеток на биохимические проявления апоптоза в почечной ткани при иммобилизационном стрессе .83
3.3. Влияние мезенхимальных стволовых клеток на показатели энергетического обмена в почечной ткани и сыворотке крови крыс при иммобилизационном стрессе 92
3.4. Влияние мезенхимальных стволовых клеток на показатели функциональной активности почечной ткани при экспериментальном 24-часовом иммобилизационном стрессе 108
3.5. Влияние мезенхимальных стволовых клеток на гистоморфометри ческие изменения почечной ткани крыс при иммобилизационном стрессе 117
Раздел 4. Обсуждение полученных результатов 147
Выводы 167
Практические рекомендации 169
Список условных сокращений и обозначений 171
Список используемой литературы 172
Приложение А 203
- Морфофункциональная характеристика почек
- Определения количества общего белка в гомогенате почечной ткани по биуретовой реакции
- Влияние введения мезенхимальных стволовых клеток на состояние компонентов антиоксидантной системы и процессы свободно радикального окисления в крови и почках при иммобилизационном стрессе
- Влияние мезенхимальных стволовых клеток на гистоморфометри ческие изменения почечной ткани крыс при иммобилизационном стрессе
Морфофункциональная характеристика почек
Среди органов, обеспечивающих постоянство внутренней среды, почки играют наиболее значимую роль. Реализация почками важнейших физиологических механизмов и их активное участие в формировании ответа организма в условиях патологии обусловливает пристальное внимание к ней ученых разных специальностей [75, 85, 115, 143].
Так почки регулируют объем сосудистого русла, а также баланс жидкости во вне- и внутриклеточном водных бассейнах, а также обеспечивают осмотический гомеостаз жидкостных сред организма [75, 91, 115, 143] путем реализации ответов на сигналы от многочисленных волюмо- и осморецепторов и действие факторов гуморальной регуляции [75, 91, 115, 159, 232]. Кроме того, почки регулируют ионный баланс организма путем поддержания постоянства концентрации многочисленных ионов, включая Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Cl–, бикарбонат-анион (HCO3–), фосфаты и сульфаты в жидкостных средах организма [75, 91].
Почки активно участвуют в поддержании кислотно-основного равновесия, секретируя в просвет канальцев избыток Н+, обеспечивая тем самым процессы ацидогенеза и аммониегенеза, а также реабсорбцию бикарбонат-анионов НСО3–. Также они помогают регулировать системное артериальное давление, путем продукции ренина и изменения экскреции Na+. Кроме этого, почки являются местами производства ряда гормоноподобных веществ, которые проявляют как системное (эритропоэтин и 1,25-дигидроксихолекальцеферол), так и локальное действие (калликреин, простагландины, тромбоксан A2) [75, 91]. Последние являются активными участниками регуляции почечного кровотока и экскреции ионов. Так простагландины (в частности PgE2) вызывают вазодилятацию кровеносных сосудов (особенно в пределах мозгового вещества), а также ингибируют реабсорбцию Na+ и Cl – в канальцах нефрона и собирательных трубочках. При этом их выделение происходит преимущественно в ответ на ишемию почечной ткани для поддержания гемодинамики в сосудистых клубочках [75, 91, 246]. Калликреин, будучи мощным вазодилятатором, также участвует в регуляции почечного кровотока, увеличивает диурез и усиливает выведение натрия путем угнетения его реаб-сорбции в дистальных отделах нефрона [75, 91].
Также почки принимают участие в обмене всех классов биоорганических соединений, что подтверждается высокой активностью процессов глюконеогене-за, трансаминирования и дезаминирования аминокислот, нейтрализации аммиака [75]. Помимо этого, почки инактивируют ряд полипептидных гормонов, (инсулин, глюкагон и паратгормон), обеспечивают экскрецию из организма продуктов метаболизма, включая мочевину, мочевую кислоту и креатинин, а также лекарственных веществ и токсичных соединений, реализуя таким образом защитную функцию [9, 75, 143, 207].
Однако основной функцией почек, обеспечивающей поддержание гомео-стаза, является продукция и экскреция мочи, которая формируется в процессе ультрафильтрации, реабсорбции и секреции [30, 75, 91, 143].
Разнообразие и особенности функционирования почек объясняются их специфической структурной организацией [30, 75, 85, 134].
Почка представляет собой парный орган, покрытый соединительнотканной капсулой. В структуре почек выделяют корковое и мозговое вещество. Корковое вещество обычно имеет красновато-коричневый цвет и гранулированный вид, и является местом локализации всех сосудистых клубочков, извитых канальцев и кортикальных собирательных трубочек. Мозговое вещество более светлое с выраженной радиальной исчерченностью, сформированной за счет параллельно расположенных петель Генле, медуллярных собирательных трубочек и кровеносных сосудов [22, 30, 43, 85, 112, 134, 143].
Главной структурно-функциональной единицей почек является нефрон.
В почках содержится около 2 х 106 – 2,5 х 106 нефронов [85, 112, 134], каждый из которых состоит из почечного тельца, представляющего собой сосудистый клубочек, окруженный капсулой нефрона, и системы канальцев. Последние в свою очередь подразделяются на проксимальный и дистальный почечные канальцы, в которых выделяют извитой и прямой сегменты [22, 30, 75, 85, 94, 143]. Проксимальный прямой каналец, тонкий каналец и дистальный прямой каналец формируют петлю Генле. С помощью соединительных отделов дистальные извитые канальцы нефронов открываются в собирательные трубочки, которые в свою очередь объединяются в крупные папиллярные каналы [85, 93, 134, 143, 151].
Согласно локализации сосудистых клубочков, в корковом веществе и петли Генле различают три группы нефронов: суперфициальные, интракортикальные и юкстамедуллярные. Первые характеризуются тем, что все их отделы расположены в пределах коркового вещества, а сами почечные тельца располагаются в поверхностной зоне коры. Петли Генле таких нефронов короткие, часто лишены тонкого сегмента. Интракортикальные (промежуточные) кортикальные нефроны характеризуются почечными тельцами, расположенными в средней зоне коркового вещества, при этом петли Генле короткие и спускаются в наружную зону мозгового вещества [30, 59, 85, 93, 134, 143, 151]. Нефроны двух вышеуказанных групп характеризуются, превышением диаметров афферентных артериол над эфферентными, более высокой скоростью кровотока в сосудистых клубочках, более густой сетью перитубулярных капилляров, на которые распадаются выносящие артериолы. При этом капилляры открываются в радиально расположенные меж-дольковые вены, из которых кровь последовательно через дуговые вены и почечную вену попадает в систему нижней полой вены [30, 58, 59, 93].
Юкстамедуллярные нефроны, клубочки которых лежат на границе коркового и мозгового вещества, отличаются от других типов нефронов наличием длинных петель Генле с длинными тонкими сегментами, расположенными полностью в мозговом веществе [30, 58, 59, 85, 93, 112, 151]. Их сосудистые клубочки характеризуются одинаковым диаметром афферентных и эфферентных артериол, а иногда и более широким просветом последних. Особенностями их постгломеру-лярного кровоснабжения является то, что выносящие артериолы распадаются на пучки артериол, при этом периферически расположенные артериолы формируют густую перитубулярную капиллярную сеть в наружных отделах мозгового вещества, а имеющие в пучках центральное положение прямые артериолы спускаются глубоко в мозговое вещество и на различных уровнях поворачивают, формируя петли. Внутри пучков восходящие и нисходящие прямые сосуды тесно прилегают друг к другу, при этом количественно преобладают восходящие прямые сосуды, что обеспечивает утилизацию избытка воды из интерстиция и поддерживает медуллярный осмотический градиент. Медуллярные капиллярные сплетения впадают в восходящие отделы прямых вен, которые затем впадают в дуговые вены. При этом венозные сосуды юкстамедуллярных нефронов характеризуются развитой системой анастомозов [58, 59]. Доля участия юкстамедуллярных нефронов в мочеобразовании ниже по сравнению с кортикальными, однако, благодаря указанным особенностям, они принимают участие в процессах концентрирования и разведения мочи, а также обеспечивают шунтирование крови [30, 59, 85, 93, 112, 151].
Почечное тельце – начальный отдел нефрона, который состоит из сосудистого клубочка, сформированного разветвлением кровеносных капилляров между приносящей и выносящей артериолами, капсулы нефрона, состоящей из париетального и висцерального листков. Между листками капсулы нефрона образуется щелевидное пространство – полость капсулы нефрона (мочевое пространство), продолжающееся в извитую часть проксимального канальца [30, 75, 77, 85, 112, 134, 143, 151]. В составе листков капсулы клубочка выделяют базальную мембрану, продолжающуюся в извитые отделы проксимального канальца, и кубического эпителия [75, 85, 112]. Почечные тельца фиксируются в интерстиции с помощью тонких коллагеновых волокон [75, 85, 151].
Сосудистый клубочек представляет собой сеть анастомозирующих между собой капиллярных петель, на которые распадается афферентная артериола при ее вхождении в сосудистый полюс почечного тельца [75, 85, 112]. Затем капилляры сосудистого клубочка объединяются в эфферентную артериолу, которая после также распадается на капилляры, формирующие перитубулярную сосудистую сеть. За счет того, что у кортикальных нефронов диаметр приносящей ар-териолы больше, чем выносящей, в капиллярах клубочка повышается давление и создаются условия для фильтрации плазмы крови. Этому способствует особое строение стенки капилляра сосудистого клубочка, в которой выделяют фе-нестрированный эндотелий, базальную мембрану, обладающую отрицательным зарядом, а также эпителиальные клетки клубочка (подоциты) [75, 85]. Подоциты характеризуются наличием крупного тела с отходящими от него большими отростками, которые охватывают значительную поверхность капилляра. От больших отростков практически перпендикулярно отходят малые отростки, переплетающиеся между собой, и дающие начало третичным отросткам, которые проникают в наружную пластинку базальной мембраны. Фильтрационные щели, представляющие собой промежутки между вторичными отростками, формируют щелевые диафрагмы, обеспечивают морфологический компонент процесса образования первичной мочи [30, 75, 85, 112].
Около 99% объема первичной мочи реабсорбируется через систему канальцев нефрона и собирательных трубочек [85, 91, 112]. Кроме того, именно в канальцах нефрона происходит важнейший этап мочеобразования – секреции [75, 91].
Канальцевые отделы нефронов представлены проксимальными и дисталь-ными канальцами. Анатомически в каждом из них можно выделить извитой и прямой нисходящий сегмент. Проксимальный отдел начинается от мочевого полюса мочевого пространства, имеет относительно толстую стенку, образованную однослойным кубическим эпителием с округлыми ядрами, расположенными в ба-зальной части клеток, и щеточной каемкой на поверхности. Просветы проксимальных канальцев относительно узкие. Отличительной особенностью дисталь-ных канальцев является отсутствие щеточной каемки на поверхности эпителиоци-тов кубической формы, их выраженная базальная исчерченность, центральное расположение ядер, относительно широкий просвет. Также для эпителиоцитов канальцев данного вида характерно наличие незначительного количества микроворсинок на волнистой апикальной поверхности [26, 75, 75, 85, 112].
Изучение морфологических и гистоморфометрических особенностей структурных компонентов нефронов различных типов при разнообразных физиологических и патологических состояниях позволяет прогнозировать изменения мор-фофункциональных параметров почечной ткани, производить дифференциальную диагностику, разрабатывать методы профилактики и лечения нозологий, в реализацию патогенеза которых вовлекается почечная ткань [75, 136, 143].
Определения количества общего белка в гомогенате почечной ткани по биуретовой реакции
Для расчетов концентраций различных веществ в гомогенатах почечной ткани определяли общее количество белка в исследуемых пробах. Для этого готовили рабочий раствор биуретового реактива путем смешивания 20 мл биуретово-го реактива (сегнетовая соль, CuSO45H2O, KI в 0,2М NaOH) с 80 мл 30 мМ раствором KI в 0,2 М NaOH. В стеклянную лабораторную пробирку вносили 5 мл рабочего раствора биуретового реактива и добавляли 0,1 мл исследуемого гомоге-ната почек, приготовленного в сахарозной среде выделения. Содержимое пробирки тщательно перемешивали и оставляли при комнатной температуре на 30 минут для полного растворения белка. За счет наличия щелочной среды ионы меди при взаимодействии с белками пробы образуют комплексы фиолетового цвета. Проводили спектрофотометрическое исследование оптической плотности исследуемой пробы на СФ-46 при длине волны 540 нм против контроля (5 мл рабочего би-уретового реактива с 0,1 мл 0,9% NaCl) в кювете с длиной оптического пути 10 мм.
Концентрацию общего белка в ткани почек определяли по калибровочной кривой, построенной с использованием калибровочных растворов альбумина из человеческой сыворотки («Диа-М», Россия).
Об изменении активности процесса запрограммированной клеточной гибели при экспериментальном иммобилизационном стрессе и его коррекции МСК судили по динамике стабильных метаболитов оксида азота (NO) в сыворотке крови и в ткани почек, уровню фрагментации ДНК в почках.
Оксид азота (NO) – короткоживущая молекула с периодом полураспада 2 – 30 секунд. Уровень оксида азота в клетках определяли по содержанию его стабильных конечных метаболитов: нитритов (NO2-) и нитратов (NO3-).
Для этого использовалась модифицированная методика определения содержания нитрит- и нитрат-анионов в одной и тоже пробе [96].
Для определения исследуемых показателей в почечной ткани готовили гомогенат на сахарозной среде выделения (0,25 М сахарозы, 1 мМ ЭДТА) в конечном разведении 1:9. Далее проводили диализ 5 мл гомогената в течение 1,5 – 2 часов против 25 мл дистиллированной воды. Измеряли объем диализата, переносили его в стеклянные лабораторные пробирки. Для осаждения белков в пробирки с диализатом добавляли смесь 0,5 М КОН и 5% ZnSO4 в объемном соотношении 2:5, закрывали резиновыми пробками и отправляли на кипящую водяную баню (90С – 100С) на 6 минут. Пробирки охлаждали под струей холодной водопроводной воды, после чего центрифугировали в течение 5 минут на скорости 6000 оборотов в минуту. В отдельные стеклянные лабораторные пробирки отбирали 10 мл диализата для определения нитрит-анионов, 5 мл – для определения нитрат-анионов. Для определения содержание нитритов в пробу с 10 мл диализата вносили 1 мл свежеприготовленного согласно ГОСТу 4517-87 реактива Грисса, интенсивно встряхивали пробу 2 минуты. Оставляли пробы на 15 минут в температурных условиях 5С до появления розовой окраски. Измеряли оптическую плотность пробы на спектрофотометре СФ-46 при = 540 нм против дистиллированной воды. Проводили расчет содержания уровня нитрит-анионов по формуле, используя концентрации нитрит- и нитрат-анионов (мг), найденных по калибровочным кривым для рабочих растворов стандарта нитрита натрия и нитрата калия: , где
Так как реакция диазотирования специфична для нитрит-анионов, то применение ее для определения содержания нитратов возможно только после их предварительного восстановления [150]. Для этого в пробирку с 5 мл диализата вносили 0,3 г «сухого восстановителя» (1 г цинковой пыли, 100 г сернокислого марганца), 5 мл 12% уксусной кислоты и 1 мл реактива Грисса. Встряхивали пробирку в течение 2 минут. Выдерживали пробу при температуре 5 С 10 минут. Восстановление нитратов до нитритов и диазотирование происходили одновременно. Затем пробы центрифугировали 5 минут (4000 g), отбирали супернатант и исследовали на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 540 нм против контроля, для приготовления которого использовали 5 мл дистиллированной воды, 5 мл 12% уксусной кислоты и 1 мл реактива Грисса. В результате по аналогичной формуле можно установить суммарное содержание стабильных метаболитов оксида азота (NOx):
Содержание стабильных метаболитов оксида азота в почечной ткани выражали в мкг/мг белка. Уровень белка в гомогенатах почечной ткани определяли биуретовой реакцией.
Для определения метаболитов оксида азота в сыворотке крови сначала к 1 мл сыворотки добавляли 0,5 М КОН и 5% ZnSO4 в объемном соотношении 2:5, инкубировали 6 минут на кипящей водяной бане. После охлаждения пробы центрифугировали в течение 5 минут при 6000 оборотах в минуту. Отбирали 0,9 мл супернатанта, приливали к нему 1 мл свежеприготовленного реактива Грисса. После интенсивного встряхивания в течение 2 минут пробы выдерживали 15 минут при 5С. Измеряли интенсивность появившейся окраски в кюветах с длиной оптического шага 10 мм на СФ-46 ( = 540 нм). В качестве контроля использовали дистиллят. Концентрацию нитрит-анионов в исследуемой сыворотке определяли по калибровочному графику, построенного с использованием стандартных растворов нитрита натрия и нитрата калия. Концентрацию нитрит-анионов в сыворотке крови выражали в ммоль/л.
Затем в другой пробирке, содержащей 1 мл сыворотки, определяли суммарную концентрацию стабильных метаболитов оксида азота, для чего содержащиеся в ней нитрат-анионы восстанавливали до нитритов и определяли последние реакцией диазотирования [150]. К 1 мл сыворотки крови добавляли 0,06 г «сухого восстановителя» (1 г цинковой пыли, 100 г сернокислого марганца), 1 мл 12% уксусной кислоты и 1 мл реактива Грисса. Пробирку встряхивали 2 минуты и оставляли при температуре 5 С на 10 минут, после чего центрифугировали при 4000 g в течение 5 минут. Проводили спектрофотометрическое исследование супернатанта на СФ-46 ( = 540 нм) в кювете с длиной оптического шага 10 мм. В качестве контроля использовали раствор, приготовленного из 1 мл дистиллированной воды, 1 мл 12% уксусной кислоты и 1 мл реактива Грисса. По калибровочным графикам рассчитывали суммарную концентрацию стабильных метаболитов оксида азота в сыворотке крови и выражали ее в ммоль/л.
Содержание нитрат-анионов (NO3-) в образце определяли расчетом разницы между суммарным содержанием метаболитов оксида азота (NOx) и содержанием нитрит-анионов (NO2-) по формуле:
Для проведения исследований были использованы лабораторные реактивы отечественного производства марки ЧДА (чистый для анализа) и ХЧ (химически чистый).
Влияние введения мезенхимальных стволовых клеток на состояние компонентов антиоксидантной системы и процессы свободно радикального окисления в крови и почках при иммобилизационном стрессе
Развивающаяся стресс-реакция любой этиологии стимулируют продукцию О2-, что приводит к гиперпродукции активных форм кислорода (АФК) и угнетению активности компонентов антиоксидантной системы организма [54, 55, 128, 141].
В норме свободнорадикальные процессы в клетках почечной ткани инакти-вируются как компонентами ферментативного звена антиоксидантной системы (СОД, каталаза, пероксидаза), так и природными антиоксидантами, важнейшим из которых является восстановленный глутатион [3, 7, 123, 182].
В связи с тем, что в литературе практически отсутствуют данные о свобод-норадикальной природе нефропатий, целью данного фрагмента работы было изучение интенсивности ПОЛ и активности компонентов антиоксидантной системы в сыворотке крови и почечной паренхиме в условиях моделируемого иммобилиза-ционного стресса, а также анализ динамики исследуемых показателей при применении МСК.
Результаты исследований показали, что при 24-часовой иммобилизации в организме исследуемых животных развиваются процессы нерегулируемого пере-кисного окисления липидов, на что указывает повышение в сыворотке ткани и ткани почек концентрации вторичного продукта пероксидации – малонового диальдегида (Таблицы А.1 – А.2). МДА – наиболее известный маркер ПОЛ [9, 22, 54, 105], образующийся из альдоперекисей, которые в свою очередь являются продуктами превращений пероксидов фосфолипидов.
При анализе содержания МДА в сыворотке крови крыс, подверженных им-мобилизационному стрессу, было установлено резкое повышение его уровня, достоверно превышающее показатели интактных животных, с максимальными значениями в 1-е и 3-и сутки наблюдения. Так в 1-е сутки мониторинга (Рисунок 3.1) показатели МДА возросли на 177,14 % (р 0,001) относительно интактных значений, а на 3-и сутки – на 202,8 % (р 0,001), что может указывать на крайне высокий уровень пероксидации липидов при стрессовом воздействии чрезвычайной интенсивности. На 7-е сутки исследования уровень малонового диальдегида несколько снизился, но достоверно превышал показатели группы № 1 на 149,8% (р 0,001). На 14-е сутки эксперимента значения МДА у стрессированных крыс превышали интактные цифры на 71,02% (р 0,001), а на 21-е сутки – на 18,7% (р 0,01). К 30-м суткам исследования показатели МДА в сыворотке крови крыс контрольной группы статистически не отличались от интактных значений.
МДА в сыворотке крови, как маркера пероксидации липидов, несколько отличалась от таковой в группе контроля (Рисунок 3.1). В 1-е и 3-и сутки послестрессового периода показатели концентрации МДА в группе № 3 превышали интактные показатели соответственно на 179,6% (р 0,001) и 195,5% (р 0,001), при этом статистически не отличались от контрольных значений. На 7-е и 14-е сутки наблюдения у животных, леченных МСК, значения МДА достоверно превышали интактные показатели соответственно на 96,3% (р 0,001) и 18,8% (р 0,01), но при этом соответственно на 21,4% (р 0,001) и 30,5% (р 0,001) были ниже цифр контрольной группы на одноименные сутки. С 21-х суток наблюдения не было статистической разницы между значениями концентраций вторичного продукта ПОЛ в сыворотке крови групп № 1 и № 3. На 21-е сутки после иммобилизации у крыс, получавших в качестве средства коррекции МСК, уровень МДА был достоверно ниже на 14,1% аналогичных показателей крыс, перенесших иммобилизацию и получавших физиологический раствор. На 30-е сутки показатели МДА в группах № 2 и № 3 статистически не отличались.
В гомогенатах почечной ткани на 1-е и 3-и сутки реадаптационного периода также отмечалось достоверное повышение уровня малонового диальдегида по сравнению с интактными значениями у крыс контрольной группы соответственно на 126,1% (р 0,001) и 216,16% (р 0,001), в опытной группе – соответственно на 121,08% (р 0,001) и 210,2% (р 0,001). Это свидетельствует об активации процессов перекисного окисления мембран и истощении резервно-адаптационных возможностей клеток почечной паренхимы в ответ на гипоксию при иммобилизаци-онном стрессе. У крыс, подвергнутых 24-часовой иммобилизации, концентрации МДА в почечной ткани на 7-е сутки наблюдения достоверно превышали показатели интактных животных на152,6% (р 0,001), на 14-е сутки – на 77,23% (р 0,001), на 21-е сутки – на 16,4% (р 0,001), а на 30-е сутки статистически от них не отличались.
В группе животных, получавших МСК, с 7-х суток эксперимента отмечалась иная динамика. На 7-е сутки в опытной группе уровень МДА достоверно снизился по сравнению с интактными значениями на 109,3% (р 0,001), а по сравнению с контрольными показателями – на 17,3% (р 0,001). На 14-е сутки снижение значений МДА в группе № 3 снизилось относительно значений групп № 1 и № 2 соответственно на и 29,2% (р 0,001) и 27,1% (р 0,001). На 21-е и 30-е сутки не было статистических различий между показателями малонового диальдегида в почечной ткани крыс интактной и опытной групп. При этом у крыс, получавших клеточную терапию после иммобилизации, на 21-е и 30-е сутки концентрация МДА в исследуемой ткани снизилась соответственно на 9,4% (р 0,05) и 6,2% (р 0,05) относительно контрольных значений. Вероятно, это объясняется более эффективным функционированием внутриклеточных компонентов системы анти-оксидантной защиты (Таблица А.2, Рисунок 3.2).
Таким образом, уменьшение уровней малонового диальдегида в сыворотке крови и почечной ткани у животных опытной группы по сравнению с группой контроля, свидетельствует, что введение аллогенных мезенхимальных стволовых клеток при 24-часовом иммобилизационном стрессе способствует снижению активности процессов перекисного окисления липидов биологических мембран, тем самым уменьшая продукцию свободно-радикальных частиц. Так же это может косвенно указывать на более эффективное функционирование звеньев антиокси-дантной системы и повышение защитно-адаптационных возможностей организма.
Антиоксидантная система клетки включает в себя вещества различной химической природы, которые не только способны взаимодействовать со свободно-радикальными частицами и нейтрализовать их [128], но и регулировать активность внутриклеточных сигнальных систем, участвуя тем самым в клеточном метаболизме и формировании различных субклеточных структур [7, 9, 80, 118, 139].
Среди компонентов ферментативного звена АОС особое место занимает су-пероксиддисмутаза, которая формирует первую линию защиты клетки, превращая высокоактивный супероксидный анион в перекись водорода. Кроме того, СОД конкурирует с NO за супероксидрадикал, тем самым продлевая время его существования в биологических средах [7, 9].
При исследовании уровня данного фермента было установлено, что в условиях активации СРП при иммобилизационном стрессе уровень СОД в сыворотке крови экспериментальных животных резко снижался (Таблица А.1, Рисунок 3.3). В 1-е сутки послестрессового периода у иммобилизированных крыс активность СОД была на 28% (р 0,001) ниже интактных значений. На 7-е сутки исследования концентрация СОД в контрольной группе была минимальной (на 55% (р 0,001) от интактных показателей), что указывает на истощение адаптационных механизмов. В последующие сроки наблюдения наблюдалось постепенное восстановление активности фермента, однако к 30-м суткам она так и не достигла интактных значений. Так на 7-е сутки активность СОД в сыворотке крови крыс группы № 2 была снижена на 45,6% (р 0,001), на 14-е сутки – на 33,3% (р 0,001), на 21-е сутки – на 22,5% (р 0,001), на 30-е сутки – на 9,4% (р 0,01) относительно показателей группы № 1. Постепенное повышение активности СОД можно объяснить компенсаторной активацией антиоксидантной системы. В группе животных, которым вводили МСК, концентрация СОД в 1-е и 3-и сутки наблюдения также резко снижалась относительно интактных значений соответственно на 26% (р 0,001) и 52% (р 0,001). На 7-е сутки наблюдения в крови крыс опытной группы активность СОД была ниже показателей группы № 1 на 34,7% (р 0,001), однако на 20% (р 0,001) достоверно превышала значения в контрольной группе животных в аналогичные сроки. На 14-е и 21-е сутки показатели СОД в группе № 3 были ниже интактных цифр соответственно на 18% (р 0,001) и 6,5% (р 0,05). На 30-е сутки наблюдения активность исследуемого фермента в сыворотке крови опытных крыс приближалась к интактному уровню. Концентрация СОД в сыворотке крови животных, леченных МСК, была достоверно выше аналогичного показателя группы контроля: на 14-е сутки – на 21,7% (р 0,001), на 21-е сутки – на 20,5%, на 30-е сутки – на 13,6% (р 0,001).
Влияние мезенхимальных стволовых клеток на гистоморфометри ческие изменения почечной ткани крыс при иммобилизационном стрессе
Важным методом изучения состояния почечной ткани является анализ структурных изменений различных отделов нефрона, как в норме, так и при различных патологических процессах. Согласно данным литературы именно морфология и гистоморфометрические данные клубочкового аппарата кортикальных и юкстамедуллярных нефронов рассматриваются как наиболее информативные критерии морфофункционального состояния почечной ткани [1, 22, 53, 132, 134].
Почки экспериментальных крыс группы № 1 представляли собой орган бобовидной формы плотноэластической консистенции, покрытый легко отделимой плотной коллагеновой фиброзной капсулой.
При гистологическом исследовании в препаратах четко определялась капсула, корковое вещество с почечными тельцами и располагающимися между ними проксимальными и дистальными почечными канальцами извитыми канальцами, и мозговое вещество почки, в состав которого входили прямые канальцы, части петель Генле юкстамедуллярных нефронов, собирательные трубки и сосочко-вые протоки (Рисунки 3.24, 3.25).
Почечные тельца представлены сосудистыми клубочками, образующихся разветвлением кровеносных капилляров, расположенных между приносящими и выносящими артериолами, охватывающими клубочки капсулами нефронов, состоящих из париетального и висцерального листков, между которыми образуется щелевидное пространство – полость капсулы нефрона (мочевое пространство).
Почечные тельца кортикальных нефронов испытуемых животных интакт-ной группы имели следующие гистоморфометрические параметры (Таблица А. 10, А. 11): значения медианы общей площади почечных телец кортикальных не-фронов составляли 5748,3036 мкм2 (5219,46; 6053,532), площади сосудистых клубочков – 518,9042 мкм2 (444,4409; 587,8972), площадей просвета капсулы – 5230,4626 мкм2 (4658,3794; 5517,3132). Для юкстамедуллярных нефронов аналогичные характеристики у крыс группы № 1 соответственно имели значения медиан 5703,4861 мкм2 (5101,0391; 6172,6455), 528,3089 мкм2 (449,1138; 584,5986) и 5185,6247 мкм2 (4673,9668; 5668,4566) (Таблицы А.12, А.13).
Морфометрические характеристики кортикальных и юкстамедуллярных почечных телец соответствуют данным половозрелых крыс, описанным в литературе [22, 25, 59, 75, 81, 112, 134].
Канальцевые отделы нефронов в гистопрепаратов почек интактных животных представлены проксимальными и дистальными извитыми канальцами. Первые начинаются от мочевого полюса мочевого пространства, имеют относительно толстую стенку, образованную однослойным кубическим эпителием с округлыми ядрами, расположенными в базальной части клеток, и щеточной каемкой на поверхности.
Просвет проксимальных извитых канальцев относительно узкий. В значительно меньшем количестве определялись поперечные срезы дистальных канальцев, состоящих из извитых и прямых отделов. Отличительной особенностью этих канальцев является отсутствие щеточной каемки на поверхности эпителиоцитов кубической формы, их выраженная базальная исчерченность, центральное расположение ядер, относительно широкий просвет. Также для эпителиоцитов канальцев данного вида характерно наличие незначительного количества микроворсинок на волнистой апикальной поверхности.
Прямые отделы дистальных канальцев проходят в почечных пирамидах мозгового вещества вместе с тонкой нисходящей частью петли Генле и собирательной трубочкой в сопровождении кровеносных сосудов. На границе коркового и мозгового вещества визуализировались поперечные срезы дуговых артерий, междольковые артерии и вены.
При изучении гистопрепаратов почек крыс после 24-часового иммобилиза-ционного стресса выявлены изменения практически всех морфометрических характеристик как кортикальных (Таблицы А.10, А.11), так и юкстамедуллярных нефронов (Таблицы А.12, А.13).
В почечной ткани крыс, перенесших иммобилизацию, почечные тельца кортикальных и юкстамедуллярных нефронов сохраняли свою характерную структуру, однако местами визуализировались разрушенные тельца и тельца с разрушенными капиллярными клубочками. Также отмечалось значительное увеличение размеров почечных телец за счет выраженного полнокровия сосудистых клубочков и интерстициальной ткани коркового вещества почек. При этом изменения в юкстамедуллярных нефронах были выражены сильнее, что, вероятно, обусловлено их функцией шунтирования крови. Кроме того, отмечалось значительное увеличения площади мочевого пространства нефронов обоих видов. Местами определялось спадение клеток висцерального листка Боуменовой капсулы, что является признаком «выпадения» данного нефрона из процесса образования первичной мочи. Также наблюдалось расширение всех видов канальцев с преобладанием изменений в дистальных их отделах.
В эпителиоцитах проксимальных и дистальных канальцев кортикальных и юкстамедуллярных нефронов отмечались явления вакуольно-капельной дистрофии различной степени выраженности, помутнение цитоплазмы. Некоторые эпи-телиоциты имели признаки колликвационного некроза. Также отмечалась локальная десквамация эпителиоцитов канальцев и скопление клеточного детрита в их просветах. Местами наблюдались участки периваскулярной и вокругканальцевой полиморфноклеточной инфильтрации, кровоизлияния в перитубулярной системе сосудов.
Наиболее выраженные изменения отмечались в 1-е и 3-и сутки после окончания иммобилизации. Установленные исследованием изменения структуры почечной ткани при экспериментальном иммобилизационном стрессе совпадали с данными литературы [53, 90, 132, 189, 251].
Гистоморфологические изменения кортикальных нефронов крыс группы контроля были следующими (Таблицы А.10, А.11, Рисунки 3.26 – 3.31).
Проведенное гистоморфометрическое исследование почечных телец кортикальных нефронов показало, что у крыс группы контроля эксперимента в 1-е сутки постиммобилизационного периода наблюдалось достоверное повышение отмечалось достоверное повышение общей площади почечного тельца, площади сосудистого клубочка и площади просвета капсулы относительно данных интактной группы на 44,19% (р 0,001), 35,74% (р 0,001) и 127,78% (р 0,001) (Таблица А.10).
На 3-и сутки наблюдения общая площадь почечного тельца была больше интактных цифр на 53,61% (р 0,001), площадь сосудистого клубочка – на 43,32% (р 0,001), площадь просвета капсулы – на 155,55% (р 0,001).
В последующие сроки послестрессового периода наблюдалось постепенное восстановление морфометрических показателей почечных телец кортикальных нефронов, однако к концу эксперимента они статистически достоверно были выше показателей группы № 1. Так на 7-е сутки наблюдения значения общей площади почечного тельца достоверно превышали показатели интактных животных на 52,53% (р 0,001), на 14-е сутки – на 42,37% (р 0,001), на 21-е сутки – на 26,32% (р 0,001), а на 30-е сутки – на 7,96% (р 0,001).
Что касается значений площади сосудистого клубочка и площади мочевого пространства, то они также были достоверно выше интактных цифр на всех сро ках исследования: на 7-е сутки соответственно на 41,93% (р 0,001) и 152,4% (р 0,001), на 14-е сутки – соответственно на 33,58% (р 0,001) и 137,76% (р 0,001), на 21-е сутки – соответственно на 22,27% (р 0,001) и 56,77% (р 0,001), на 30-е сутки – соответственно на 9,52% (р 0,05) и 5,85% (р 0,001).
Анализируя гистоморфометрические показатели проксимальных канальцев кортикальных нефронов, отмечалось достоверное увеличение их наружного диаметра относительно показателей группы № 1, при этом высота эпителиальных клеток канальцев уменьшалась по сравнению с интактными значениями (Таблица А.11). Так наружный диаметр проксимальных канальцев кортикальных нефронов в 1-е и 3-и сутки постиммобилизационного периода превышал показатели крыс интактной группы соответственно на 14,93% (р 0,001) и 21,26% (р 0,001). На 7-е, 14-е, 21-е и 30-е сутки наблюдения значения исследуемого параметра оставались выше данных группы № 1 соответственно на 19,27% (р 0,001), 15,26% (р 0,001), 7,62% (р 0,001) и 3,38% (р 0,001).
Высота клеток эпителия проксимальных канальцев после 24-часовой иммобилизации в 1-е и 3-е сутки исследования уменьшилась по сравнению со значениями интактных животных соответственно на 11,96% (р 0,001) и 18,58% (р 0,001). В последующие сроки наблюдения значения исследуемого параметра постепенно возрастали, однако до 21-х суток оставались достоверно выше интактных цифр. Так на 7-е сутки эксперимента высота эпителиоцитов у контрольных крыс была ниже интактных данных на 11,17% (р 0,001), на 14-е сутки – 9,2% (р 0,001), на 21-е сутки – на 3,98% (р 0,001). К окончанию периода наблюдения показатели высоты эпителия проксимальных канальцев кортикальных нефронов крыс контрольной и интактной групп статистически не отличались.