Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Межклеточные взаимодействия в межальвеолярной перегородке и события в аэрогематиче-ском барьер в норме и при воздействии на лёгкие бактериального лпс (обзор литературы) 9
1.1 Состав и межклеточные взаимодействия в межальвеолярной перегородке 9
1.2 Механизмы защиты легких при хемоиндуцированном воздействии на них 16
1.2.1 Активация цитокинового каскада и сосудистых реакций 16
1.2.2 Защитные свойства сурфактанта легких 28
1.3 Апоптоз как ответ на воздействие аэрополлютантов 33
Глава 2. Организация и методы исследования 37
2.1 Соответствие правилам проведения экспериментальных исследований 37
2.2 Моделирование однократного ингаляционного воздействия ЛПС 37
2.3 Методы оценки общей реакции на ингаляционное воздействие 40
2.4 Забор и пробоподготовка биоматериала 40
2.5 Определение концентрации ЛПС 42
2.6 Количественное определение ФНО- 44
2.7 Методы морфологического и гистологического исследования 44
2.8 Метод иммуногистохимического исследования 45
2.9 Моделирование адсорбции бактериального ЛПС на поверхности сур-фактанта альвеол 46
2.10 Методы математического анализа количественных результатов и
построение математической модели з
Глава 3. Клеточные реакции и молекулярные процессы при взаимодействии ингаляционного лпс с отдельными компонентами легочного ацинуса 51
3.1 Общетоксический эффект однократной ингаляции ЛПС 51
3.2 Содержание ЛПС в материалах животных в модели его однократного ингаляционного поступления 53
3.3 Количественное содержание ФНО- в материале животных при однократном ингаляционного поступления ЛПС в организм 56
3.4 Результаты морфологического и гистологического исследования легочной ткани в модели однократного респираторного воздействия бактериального ЛПС 58
3.5 Иммуногистохимическое исследование легочной ткани после однократной ингаляции ЛПС 63
3.6 Результаты исследования бронхоальвеолярного смыва в модели однократного воздействия ЛПС 69
3.7 Исследование концентрации ЛПС в фосфолипидном слое модели сур-фактант-альвеолярного комплекса 72
3.8 Математическое моделирование эффектов ЛПС при однократном ингаляционном поступлении в организм 73
Обсуждение полученных результатов 81
Выводы 91
Список сокрацений 92
Список литературы 93
- Активация цитокинового каскада и сосудистых реакций
- Апоптоз как ответ на воздействие аэрополлютантов
- Метод иммуногистохимического исследования
- Результаты морфологического и гистологического исследования легочной ткани в модели однократного респираторного воздействия бактериального ЛПС
Активация цитокинового каскада и сосудистых реакций
Альвеолоциты II типа ответственны за продукцию щелочной фосфотазы, гликопротеина 330 kDa, белков сурфактанта, фосфолипидов и специфичного цитокератина-19. Секреция веществ клетками осуществляется экзоцитозом по мерокриновому типу. Эпителиоциты II типа обладают огромным регенераторным потенциалом, поэтому их относят к самой активно пролиферирующей субпопуляции клеток, об этом свидетельствует присутствие полиплоидных элементов. Основная масса клеток находится в неактивном состоянии [17]. К факторам, регулирующие пролиферацию альвеолоцитов II типа, относят: эпидермальный фактор роста, инсулин, кислый и основной факторы роста фибробластов, экстрацеллюлярный матрикс, макрофагальные факторы и факторы, находящиеся в бронхоальвеолярной жидкости.
Среди мононуклеаров выделяют различные типы клеток, присутствующие в каждом из регионов ткани легких – альвеолярные, бронхиальные плевральные, и интерстициальные. Особое место в формировании барьерной функции легких занимают АМ, на долю которых приходится более половины популяции легочных макрофагов. Специфические аэробные условия их жизнедеятельности привели к возникновению новых отличных от других клеток свойств: утрата миелопероксидазной активности, преобладание окислительного фосфорилирования, синтез преимущественно липид-содержащих веществ, усиление бактерицидных свойств за счет гидролитических ферментов и поглотительной способности.
В основном АМ находятся в гипофазе сурфактант-активного комплекса. Их базальная часть прилегает к эпителиоцитам, а апикальная к мембранам сурфактанта. В процессе жизнедеятельности в АМ образуются токсичные метаболиты, это происходит за счет окислительного фосфорилирования липопротеидов и фосфолипидов. Токсины инактивируются (окисляются) липазой и фосфолипазой. Катаболизм фосфолипазы осуществляется посредством протеаз, контролируемых -анти-трипсином и родственными ему ингибиторами гидролаз.
В свою очередь АМ разделяют на биосинтезирущие, фагоцитирующие и секреторные, что обуславливается преобладаемой функцией и степенью дифференцировки клетки. По своему строению эти макрофаги несколько различаются. У молодых активно биосинтезирующих АМ синтетический аппарат клетки остается развитым: рибосомы, цитоплазматическая сеть, вакуоли пластинчатого комплекса с изолированными ферментативными системами, использующиеся для внутриклеточного пищеварения и окончательного формирования лизосомального аппарата.
Фагоцитирующие, самые крупные среди всех представителей АМ. Их можно дифференцировать по ацентрично расположенному ядру, развитым сетям митохондрий и лизосомального аппарата. На поверхности мембраны у них имеются цитоплазматические микровыросты и псевдоподии. Наличие фагосом доказывает участие не только в механизмах инфекционной и противоопухолевой защиты, но и в процессах апоптоза [27].
Процесс апоптоза АМ, являясь неспецифическим фактором поддержания гомеостаза внутренней среды, условно может быть подразделен на 2 фазы: первая – это стадия формирования апоптотических сигналов и вторая – демонтаж клеточных структур по каспаз-зависимому пути (цистеиновых протеаз). Протеаз, участвующих во второй стадии, насчитывают 14 видов. Они могут активировать цитокины, индуцировать каспазы, и непосредственно участвовать в апоптозе. Активация неактивных каспаз – прокаспаз осуществляется посредствам проапоптических сигналов, к которым относят физические, химические и физико-химические факторы повреждения (например, радиация, действие токсических агентов, повреждение ДНК и т.д.).
В частности повреждение молекулы ДНК активирует ген p53 и, тем самым запуская механизм апоптоза [86, 129]. Таким образом, воздействие факторов снижающие или повышающие способность АМ к апоптозу может лежать в основе развития различных легочных заболеваний [113].
На долю АМ, обладающих преимущественно секреторной функцией приходится около 4-8 %. Отличительной особенность этих клеток является хорошо выраженный секреторный аппарат, в виде большого количества осмиофильных пластинчатых телец в эктоплазме, а также развитой цитоплазматической сети.
Секретируемых АМ биологически активных веществ насчитывается несколько десятков. Продукты секреции АМ могут функционировать не только на уровне дыхательной системы, но и за ее пределами. Примером такой активности являются производные фосфолипидов (эйкозаноиды), которые служат фактором активации тромбоцитов, а также лейкотриены, тромбоксаны и простагландины, выполняющие важную роль в механизмах развитии респираторных патологий. Синтез вышеперечисленных биологически активных молекул, регулируется по принципу обратной связи. Важным медиатором, действующим на лимфоциты, лейкоциты, фибробласты, эндотелий и др., является ИЛ-1 [24].
Помимо этого, АМ продуцируют факторы, оказывающие избирательное действие на определенные клетки-мишени: фактор активации фибробластов, макрофагальный фактор роста, белок р33, стимулирующий пролиферацию альвеолоцитов II типа, ИЛ-4, ФНО-, ИЛ-6 [24]. Отдельного внимания заслуживает колониестимулирующий фактор, индуцирующий лимфо-, грануло-и/или моноцитопоэз. Установлено, что на мембране макрофага располагаются рецепторы чувствительные к глюкокортикоидам, уменьшающим выброс цитокинов, а также эстрогенам, стимулирующим их секрецию [74].
Апоптоз как ответ на воздействие аэрополлютантов
Легкие постоянно подвергаются различному воздействию со стороны взвешенных в воздухе частиц, микроорганизмов и газов, которые потенциально могут оказать негативное воздействие на легочный гомеостаз и тем самым повысить уязвимость органа для инфекционных агентов [168, 171]. Значительная площадь альвеолярной поверхности и постоянный контакт с различными факторами окружающей среды, создают потенциальные условия для развития инфекций [154]. Способность органов дыхания оставаться относительно устойчивыми к действию различных возбудителей объясняется эффективной системой защиты организма [168, 171].
Защитные свойства дыхательных путей обеспечивается альвеолярным эпителием, который выстилает внутреннюю поверхности легких действуя как физический барьер для частиц и микроорганизмов, попадающих в дыхательные пути. В частности клетки столбчатого эпителия дыхательных путей используют мукоцилиарный механизм очистки для удаления микроорганизмов и твердых частиц. Также эпителиальные клетки способны вырабатывать цитокины, хемокины и факторы роста для борьбы с инфекционными агентами [171]. Другие клетки, в том числе нейтрофилы, макрофаги и лимфоциты могут мигрировать в места развития инфекции в качестве основных биоэффекторов, участвующих в ликвидации патогенных микроорганизмов или, при необходимости, принимать участие в адаптивной иммунной реакции. Эпителиальные клетки также синтезируют и секретируют различные антимикробные медиаторы, пептиды и белки, которые обладают бактерицидными свойством или использоваться нейтрофилами или макрофагами для обеспечения бактериального клиренса [171].
К настоящему времени установлено, что в состав сурфактанта входят поверхностно-активные вещества (ПАВ), наиболее очевидной функцией которых является снижение сил поверхностного натяжения в альвеолах, стремящихся уменьшить их радиус и тем самым предотвращается их коллапс [154, 157. 163, 174, 189], а так же ПАВ уменьшают работу, связанную с дыханием [154, 163]. Также сурфактант служит барьером от патогенов [163], улучшает мукоцилиарный транспорт, ограничивает развитие отека легких за счет высокого поверхностного натяжения [73] и ингибирует компоненты сыворотки, попавшие в дыхательные пути [154]. В настоящее время стали актуальными исследования биологической роли ПАВ как неотъемлемой части защиты организма, оказывающей иммуномодулирующее действие, этому посвящены последние исследования с использованием моделей легочной инфекции с сурфактанттерапией [144, 223].
Легочный сурфактант представляет собой сложную смесь липидов и белков, образующих мономолекулярную пленку на поверхности раздела фаз [48, 65]. Все млекопитающие обладают достаточно схожим составом сурфактанта и включают в себя около 90% липидов [110, 156, 177, 191] и 10% белков-апопротеинов, которые называются протеины сурфактанта (surfactant proteins, SP) [73, 163]. На сегодняшний день выделяют SP-A, -B, -C, -D [65, 171].
Липидная фракция сурфактанта представлена преимущественно фосфолипидами [119, 163]: дипальмитоилфосфатидилхолином (ДПФХ) - 45%, фосфатидилхолином - 25%, фосфатидилглицеролом - 5%, остальные фосфолипидами - 5% [73, 110]. Также в состав фосфолипидной фракции входят фосфатидилинозит, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин (всего 5%). Другие липиды сурфактанта - холестерин, триглицериды, ненасыщенные жирные кислоты и сфигномиелин суммарно составляют около 10% [177].
Компоненты сурфактанта синтезируются в альвеолоцитах II типа и клетками Клара [88, 65, 167]. После биосинтеза, он накапливаться в виде осмиофильных (имеющие липидную природу) ламеллярные (пластинчатые) тельца до момента их секреции в просвет альвеол через механизм кальций-зависимого экзоцитоза [167]. Секретируясь, изначально упакованная структура сурфактанта (пластинчатое тельце), разворачивается, преобразуясь в тубулярный миелин, и охватывает в виде мономолекурярного слоя липидов и протеидов внутреннюю поверхность альвеолы на границе сред воздух/жидкость. Молекулы фосфатидилхолина синтезируются преимущественно по цитидил-трифосфатному пути, регулирующийся ферментами фосфорилхолинцитидилтрансфераза и холинфосфотрансфераза. Белки гликозилируются в аппарате Гольджи и далее соединяются с фосфолипидами. В ходе дыхательных движений, циклически изменяется площадь внутренней поверхности альвеол, в результате чего пленка сурфактанта постепенно разрушается, превращаясь в небольшие пузырьки (везикулы), которые либо захватываются альвеоцитами II типа для ресинтеза, либо полностью удаляются из респираторной зоны альвеолярными макрофагами. Процессы синтеза новых порций сурфактанта и утилизации везикул происходят достаточно быстро. Однако, если по какой-либо причине прекращается кровоток через какой-то участок легкого, то ранее синтезированный сурфактант подвергается быстрому разрушению, а продукция свежих порций приостанавливается.
Если сурфактант центрифугировать в плотных средах, то он может быть разделен на две фракции: более плотную названную как «крупные агрегаты», состоящую из секретированных пластинчатых телец и тубулярного миелина, а также на менее плотную фракцию с «малыми агрегатами» сурфактанта, в основном представленную везикулярными образованиями. Установлено, что крупные агрегаты сурфактанта содержат белок сурфактанта и обладают ценными биофизическими свойствами в здоровых легких, а малые агрегаты содержат незначительное количество белковой части и в опытах проявляет слабо выраженную биологическую активность как in vivo, так и in vitro [75].
Изменения в респираторных зонах легких, могут способствовать появлению и других, отличающихся от конвертазы, ферменты, способные инициировать превращение крупных агрегатов сурфактанта в малые. В первую очередь это группа в которую входит эластаза нейтрофилов. Активизация ЛПС ферментативных процессов в просвете альвеолы может привести к быстрому нарастанию биологически пассивной малой фракции и истощение наиболее биологически ценной фракции сурфактанта [75, 145].
Все четыре сурфактант-ассоциированных протеина достаточно хорошо изучены. Белки SP-A и SP-D более крупные, представляют собой гидрофильные гликопротеины [26, 73, 119, 185], участвующие в защите организма [65, 167, 171, 175]. Белки SP-B и SP-C значительно меньше, и имеют полипептидную гидрофобную природу, а зачастую и липопротеидную [62, 110, 119, 202]. Эти гидрофобные белки играют ключевую роль в в снижении поверхностного натяжения и поддержании стабильности альвеол [90], помогая в адсорбции фосфолипидов и перераспределении поверхностного натяжения пленки [163, 171, 191], а также в регулировании продукции ПАВ [168]. Протеины субсемейства продуктов небно-легочно-назального эпителиального клона (Palate, Lung, Nasal Epithelial Clone, PLUNC), белки молекулярного семейства BPI, подобно белкам сурфактанта альвеол, содержатся в верхних дыхательных путях [106]. Эти белки ведут себя аналогично SP-B и SP-C, обладая поверхностным натяжением обеспечивают восстановительные свойства, в тоже время, как и SP-D участвуют в иммунном ответе [106].
Метод иммуногистохимического исследования
Часть альвеол была эмфизематозно расширена до разрывов со слиянием соседних альвеол, часть - с уменьшенным просветом за счет увеличения объема межальвеолярных перегородок. Просвет большинства альвеол был чист, но сужен за счет резкого утолщения межальвеолярных перегородок в результате их отека и лейкоцитарной (преимущественно – лимфоцитарной) инфильтрации, полнокровия микроциркуляторного русла.
Наблюдалась выраженная реакция альвеолярных макрофагов в виде увеличения их размеров и появления скоплений в межальвеолярной перегородке. Обнаруживалось множество крупных макрофагов с пенистой цитоплазмой. Кровеносные капилляры были частью спавшимися, частью - резко расширенными за счет скопления агрегатов эритроцитов.
Объемная доля воздуха альвеол незначительно, но все же ниже у контрольных крыс, чем у интактных, так же активируется небольшое количество альвеолярных макрофагов. Поэтому в дальнейшем необходимо учитывать это воздействие и определять его как синергичный эффект растворителя и дисперсии ЛПС.
При водно-солевой дисперсии ЛПС объемная доля бронхиального экссудата увеличивалась за время эксперимента более, чем шестикратно, достигая максимума через 8 ч с момента ингаляции ЛПС и несколько снижаясь к 24 ч. Следовательно, поступление в дыхательные пути ЛПС сопровождалось увеличением бронхиальной и альвеолярной секреции, в совокупности с уже описанным повреждением бронхиальной стенки и сосудистыми реакциями, приводящим к формированию бронхиального экссудата.
Поверхностная плотность эпителиоцитов бронхов через 3 ч с момента завершения ингаляции ЛПС практически не менялась, достоверное уменьшение ве 61 личины показателя было зафиксировано через 8 ч после ингаляции на 25 % при водно-солевой дисперсии ЛПС.
При этом, на более ранних сроках эксперимента снижение поверхностной плотности клеток бронхиального эпителия в большей мере объяснялось их набуханием и появлением складчатости эпителиального слоя, то к 24 ч с момента ингаляции преобладало истинное устранение клеток из эпителиального слоя и его дезинтеграция.
Проникновение ЛПС в ткани легких сопровождалось увеличением численной плотности бронхиальных МФ без заметных различий от варианта дисперсии токсина. Так через 3 ч после ингаляции их численность практически не отличалась от нормы. К 8 ч численность МФ немого увеличилась примерно в 1,7 раза и далее практически не менялась. По-видимому, основной причиной такого явления стало появление новых скоплений МФ в стенке бронхов и увеличение численности уже имеющихся групп МФ, что может быть объяснено, с учетом динамики эксперимента, исключительно миграцией моноцитов из кровотока.
Воздействие водно-солевой дисперсии ЛПС сопровождалось снижением воздушности легочной ткани. Так к 3 ч объемная доля воздуха альвеол снизилась на 40%, а к 8 ч уже более чем вдвое. Впервые часы, выявленные изменения стали следствием сосудистых нарушений и нарастающего тканевого отека, а к 24 ч, с момента ингаляции, еще и клеточной экссудации в межальвеолярные перегородки.
В альвеолах поверхностная плотность клеток эпителия прогрессивно уменьшалось во время эксперимента, примерно на 20 % к 3 ч и на 40 % к 24 ч. Это явилась отражением повреждения альвеоцитов, которое не прекращалось достаточно длительное время уже в отсутствие высокого содержания ЛПС во вдыхаемом воздухе, тканях легких и системном кровотоке.
Численная плотность альвеолярных макрофагов с течением времени имеет максимальный прирост в промежутке между 3 и 8 ч. Значение показателя увеличилось почти в 3 раза. К 24 ч значение численной плотности АМ практически не увеличилась относительно 8 ч.
При однократной ингаляции липидной дисперсии ЛПС впервые часы наблюдали более выраженную секрецию бронхиального экссудата (в 9,5 раза), чем при водно-солевой дисперсии токсина (в 7,2 раза). Вторым отличием было более выра 63 женное снижение воздушности альвеол в двое к 3 ч на 60 % к 24 ч. Однако показатель численной плотности АМ изменялся не так резко (в 2.5 раза) как при водно-солевой дисперсии ЛПС (в 3,3 раза) (рисунок 9 А, Б).
Полученные данные свидетельствуют о том, что ингаляция ЛПС сопровождается значительными изменениями со стороны паренхимы легких, основу которых составляют сосудистые и клеточные реакции.
При однократной ингаляции ЛПС, диспергированного в водно-солевом и ли-пидных носителях через 8 ч, в ткани легких выявлялась гиперэкспрессия макрофа-гальных антигенов в соответствующих клетках межальвеолярной перегородки. Макрофаги располагались периваскулярно, образуя группы по три-четыре и шесть-десять клеток в ткани опытных групп серий с водно-солевой и липидной дисперсией ЛПС соответственно. Суммарная яркость свечения иммунопозитивного материала на единице площади сечения межальвеолярных перегородок в сравнении представлено в таблице 7.
Результаты морфологического и гистологического исследования легочной ткани в модели однократного респираторного воздействия бактериального ЛПС
Наше предположение о наблюдаемом феномене заключается в хронологии действия механизмов повреждения и защиты в легких. Известно, что -1-антитрипсин синтезируется в печени и, в гораздо меньшей степени, в макрофагах и нейтрофилах. Антитрипсин равномерно распределен в тканях организма, в том числе, и в легких и является резидентным.
Действие аэрогенного ЛПС приводит к опосредованному повреждению молекулы антитрипсина, что в иммуногистохимических микропрепаратах проявляется в виде уменьшения связанных ферментом антител. Эффект однократного воздействия не затрагивает макрофаги и нейтрофилы, поскольку иммунная система некоторое время обладает определенной инерционностью на столь коротко-временное воздействие и не успевает срабатывать.
Таким образом, в течение нескольких часов после попадания ЛПС, в легочной паренхиме возникает протеазно-антипротеазный дисбаланс: с одной стороны происходит угнетение резидентного антитрипсина, а с другой резкая активация клеток системы мононуклеарных фагоцитов. Что касается резидентных альвеолярных макрофагов, то вопрос об угнетении их функции на фоне контакта с парами органических растворителей в сопряжении с угнетением -1-антитрипсина может быть подвергнут сомнению при рассмотрении соизмеримости объектов – отдельного белка и целой клетки. Одна и та же концентрация микроаэрозоля токсиканта в альвеолярном воздухе может оказаться критической для коагуляции -1-антитрипсина и в то же время хемоаттрактантной для макрофага, обладающего огромными окислительными и депонирующими способностями.
С учетом изложенных фактов и литературных данных об отдельных межклеточных взаимодействиях в легких [56, 78, 207], возможные события в межальвеолярной перегородке, развивающиеся в результате действия аэрогенного ЛПС, в нашей модели можно представить следующим образом (рисунок 16).
Токсический агент в виде ультрадисперсного аэрозоля проникает непосредственно в просвет альвеол. Частичная его задержка в слое сурфактанта сопровождается удалением части ЛПС в бронхоальвеолярную жидкость, связыванием и инактивацией клетками и вещества в составе этой жидкости. Поступивший в тка 87 ни ЛПС практически не взаимодействует с альвеоцитами, но оказывает мощное воздействие на МФ (рецепторы CD14 и TLR4) и эндотелий сосудов (CD14). Именно эти клетки становятся источником нарастающей лавины медиаторов острого токсического повреждения: фактора некроза опухоли альфа, интерлейкинов, простаноидов и оксида азота.
Рисунок – 16 Взаимодействие липополисахарида с рецепторами клеток-мишеней в межальвеолярной перегородке и выброс медиаторов в модели однократной ингаляции ЛПС.
Молекулы ЛПС, не нашедшие рецепторы на мембране клеток-мишеней, быстро связываются со специфическими белками, иммуноглобулинами, удаляются в кровоток или разрушаются на месте тканевыми ферментами. Медиаторы опосредуют повреждение альвеоцитов I типа, активацию синтеза сурфактанта альвеоци-тами II типа, по принципу положительной обратной связи воздействуют на МФ и эндотелиальные клетки. Сосудистые реакции и повреждение клеток альвеолярной выстилки приводят в итоге к нарушениям эластичности межальвеолярных перегородок, ателектазам и нарушениями легочного газообмена.
Исследование бронхоальвеолярного секрета после однократной ингаляции ЛПС выявило увеличение общего содержания клеток в осадке бронхоальвеоляр 88
ного смыва, в основном за счет интенсивного поступления в нее лимфоцитов (в 5,0 раз в модели с водно-солевой дисперсией, в 5,8 раза – с липидной дисперсией) и слущенных эпителиальных клеток (в 9,9 раза в модели с водно-солевой дисперсией, в 10,1 раза – с липидной дисперсией). Эти данные мы связываем с токсическим действием ЛПС и ЛПС-индуцированных цитокинов на проницаемость тканевого барьера и, в определенной степени, воздействии на секреторные альвеоци-ты II типа [165, 210].
Основным моментом, заслуживающим обсуждения, становится запуск сложного механизма клеточного ответа с активацией синтеза специфических хе-мокинов для реализацией межклеточных взаимодействий. Местный цитокиновый каскад, который активирует свободно-радикальное окисление и ферментативную деградацию полимеров является реакцией макрофагов на ЛПС. Вследствие этого возникают два параллельных и взаимомодулируемых процесса: развитие ателектаза и увеличение объема ткани межальвеолярных перегородок.
В современных исследованиях происходит закономерное смещение акцентов от анализа повреждений органов и тканей, как объектов исследования, к клеточным и молекулярным мишеням. С этой точки зрения выделяют два ключевых пула клеток наиболее вовлекающиеся в опосредовании эффектов ЛПС: мононуклеарные фагоциты (макрофаги) и эндотелитальные клетки сосудов [54, 101].
Данные, которые мы получили в ходе исследования, не противоречат литературным, согласно которым активированные ЛПС макрофаги выбрасывают ци-тотоксические вещества (ФНО-, ИЛ-6 и др.), способствующие вторичному повреждению окружающих клеток и тканей. Макрофагальная реакция лежит в основе пускового механизма моно- и полинуклеарной инфильтрации легочной паренхимы, а так же отвечает за дальнейшую хронизацию патологического процесса [37, 74].
С целью дополнительного изучения состояния мышечных клеток сосудов легкого, мы провели исследование экспрессии десмина, также это позволило выявить единичные миофибробласты, которые в дальнейшем становятся центрами последующего формирования соединительной ткани в легких и печени [98]. При однократной ингаляции ЛПС в липидной дисперсии экспрессия десми-на выявлялась в основном только в миоцитах стенок бронхов и артерий, отражая их патологические изменения при отеке легкого. При ингаляционном поступлении водно-солевой дисперсии ЛПС десмин-позитивные клетки выявлялись не только в разрыхленных и местами поврежденных мышечных слоях артерий и бронхов, но и вокруг них. В наиболее утолщенных межальвеолярных перегородках такие клетки образовывали группы по 4-5, окруженные МФ.
Исследование экспрессии альфа-1-антитрипсина (ААТ) выявило практически полную утрату ААТ-позитивного материала легочной тканью. Поскольку эта ан-типротеаза играет ключевую роль в регуляции активности основных ферментов тканевого разрушения биополимеров в легком, запускающих различные внутриклеточные реакции, то уменьшение ее активности мы рассматриваем как один из моментов необратимости повреждения тканей легкого.
Таким образом, исследование экспрессии ААТ позволило установить еще один механизм, касающийся динамики образования соединительной ткани в легких, запускающийся при однократной ингаляции ЛПС. Повышенное содержание ААТ в первые часы играет немаловажную роль в инициализации в дальнейшем фиброгенеза. И выражается это следующим образом: активированные протеазы, не находя естественных антагонистов, атакуют предшественников медиаторов и ферментов, что стимулирует процессы тканевой перестройки.
Период повышенной экспрессии ААТ отражает необратимое прогрессирова-ние фиброгенеза в перибронхиальных и периваскулярных участках легких. Инактивация ААТ в межальвеолярной перегородке, характерная для хронического воздействия ЛПС, запускает механизмы лизиса полимеров соединительнотканного матрикса и не допускает терминацию процессов новообразования соединительной ткани.
Завершая обсуждение собственных исследований, укажем основные решенные задачи в ходе исследования: 1. Показаны особенности эффекта ЛПС на клетки и ткани при его однократном ингаляционном поступлении в организм экспериментальных животных в составе водно-солевой и липидной ультрадисперсии.