Механизмы эксайтотоксичности при повторном действии глутамата: роль нарушения Са2+ и Na+ гомеостаза и функционального состояния митохондрий Шарипов Ринат Рашидович

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Обзор данных литературы 17

1.1. Поражения мозга при ишемии 17

1.1.1. Ишемический инсульт 17

1.1.2. Моделирование ишемии 20

1.2. Возбуждающий нейромедиатор глутамат 22

1.2.1. Глутамат в норме 22

1.2.2. Рецепторы глутамата 23

1.2.3. Повышение уровня глутамата при ишемии 27

1.2.4. Glu-индуцированные повреждения клеток 30

1.3. Нарушения ионного гомеостаза при воздействии Glu 31

1.3.1. Изменения [Ca2+]i, развитие ОКД 31

1.3.2. Кальциевый гомеостаз 37

1.3.3. Изменения внутриклеточной концентрации Na+ 40

1.4. Энергетический обмен в мозге 45

1.4.1. Энергетический обмен в здоровом мозге 45

1.4.2. Нарушения энергетического обмена при ишемии 49

1.4.3. Дыхательная цепь митохондрий и NADH 50

1.4.4. Изменения внутриклеточной концентрации АТФ 55

1.4.5. Роль митохондриальной поры в механизмах развития ОКД 56

1.5. МТТ-тесты и активность дегидрогеназ 57

Глава 2. Материалы и методы исследования 60

2.1. Приготовление первичных культур зернистых нейронов мозга крысы 60

2.2. Трансфекция нейрональных культур 61

2.3. Микрофлуориметрические исследования 62

2.4. Обработка результатов 69

Глава 3. Результаты и обсуждение 71

3.1. Сенситизация нейронов к повторному действию Glu 71

3.1.1. Сравнение изменений [Ca2+]i и m при двукратном действии Glu 71

3.1.2. Сенситизация при пониженной концентрации внеклеточного Ca2+ ([Ca2+]o) 79

3.1.3. Сравнение динамики [Ca2+]i и m при повторных воздействиях Glu 82

3.2. Динамика изменений [Ca2+]i и m при повторном действии Glu в условиях «стронциевой» блокады PTP 84

3.3. Роль повышения протонной проводимости внутренней мембраны митохондрий в сенситизации 87

3.4. Динамика [NADH] во время и после Glu воздействия 90

3.5. Динамика изменений [АТФ]с и pHc во время и после воздействия Glu в индивидуальных нейронах 92

3.6. Исследование гомеостаза Na+ 100

3.6.1. Изменения [Na+]i во время глутаматного воздействия и после него 100

3.6.2. Ответы нейронов на замену Na+ на непроникающий катион N-метил-D-глюкозамин 104

3.7. Исследование активности дегидрогеназ нейронов с помощью восстановления МТТ до формазана 109

3.7.1. Сопоставление сигналов потенциал-зависимого флуоресцентного зонда и светопропускания в первичной культуре нейронов мозжечка 110

3.7.2. Влияние МТТ на флуоресценцию MTG и NADH-зависимую автофлуоресценцию нейронов 115

Заключение 125

Выводы 132

Благодарности 133

Список использованной литературы 133

• Рецепторы глутамата
• Дыхательная цепь митохондрий и NADH
• Сравнение изменений [Ca2+]i и m при двукратном действии Glu
• Влияние МТТ на флуоресценцию MTG и NADH-зависимую автофлуоресценцию нейронов

Введение к работе

Актуальность темы исследования.

Согласно информационному бюллетеню ВОЗ из 56,4 млн. случаев смерти во всем мире в 2015 г. ишемическая болезнь сердца и инсульт уносят больше всего человеческих жизней – в общей сложности 15 миллионов (). Последние 15 лет эти заболевания остаются ведущими причинами смерти в мире.

По данным Министерства здравоохранения Российской Федерации за 2015г в России перенесли инсульт 420000 человек. Показатели смертности населения в России в 4 раза выше, чем в США и Канаде: 84–87% больных умирают или остаются инвалидами и только 16–13% пациентов полностью выздоравливают. Среди выживших у 50% наступает повторный инсульт.

Патофизиология инсульта изучается не первый десяток лет, и было выявлено много вариантов развития событий при снижении или полном прекращении кровотока в мозге. Каскады реакций, протекающие на клеточном уровне, отличаются в различных областях мозга, и поэтому процедуры, требуемые для нейропротекции, могут отличаться при поражении разных структур [Catanese et al., 2017].

При возникновении ишемии образуется область сниженного или
отсутствующего кровотока. Поражённые безвозвратно ткани образуют, так
называемое, ишемическое ядро, вокруг которого развивается зона

энергозависимого нарушения метаболизма клеток, в первую очередь, нейронов (так называемая «ишемическая полутень» или «пенумбра» (penumbra)) [Dirnagl et al., 1999; Catanese et al., 2017]. Без терапевтического вмешательства большая часть пенумбры постепенно поглощается некротическим ядром. Этот процесс может длится до нескольких недель.

Наши исследования направлены на выяснение механизмов

патологических изменений ЦНС в пенумбре, которые могли бы послужить основой для более углубленной разработки методов уменьшения зоны поражения. Такой подход требует учета многих параметров, влияющих на способность нейронов к выживанию. Первичные культуры нейронов, полученные из различных отделов мозга млекопитающих (в основном крыс и мышей), являются общепризнанной и часто незаменимой моделью исследования процессов, происходящих в мозге в норме и при патологии [Choi, 1987; Choi, 1992; Millet, Gillette, 2012; Gordon et al., 2013].

Нейроны взаимодействуют друг с другом и с окружающими их глиальными клетками посредством специализированных структур, называемых синапсами. В синапсах нейронов, оказавшихся в зоне пенумбры, происходит неконтролируемое высвобождение глутамата (Glu) – основного возбуждающего нейромедиатора ЦНС. Избыточная стимуляция глутаматных рецепторов, прежде всего ионотропных рецепторов NMDA-типа, находящихся на теле нейронов, приводит к перегрузке нейронов ионами Са²⁺ и Na⁺, нарушению сигнальных, метаболических и энергетических процессов и, в итоге, к увеличению области поражения мозга в результате отсроченной гибели нейронов [Sattler et al., 1998; Orrenius et al., 2003; Mattson, 2007].

Предшествующие исследования, выполненные, в том числе, с участием нашего коллектива (см. обзор [Khodorov, 2004]), показали, что длительное воздействие высоких доз Glu в нейрональных культурах вызывает двухфазное увеличение [Ca²⁺]_i. Вторая фаза подъема [Ca²⁺]_i, так называемая отсроченная кальциевая дизрегуляция (ОКД), всегда сопровождается значительным падением трансмембранного потенциала внутренней мембраны митохондрий (далее «митохондриального потенциала», _m) [Keelan et al., 1999; Vergun et al., 1999; Khodorov, 2004; Abramov, Duchen, 2010; !Сурин et al., 2014; Safina et al., 2015]. Исследования на сестринских культурах показывают, что доля нейронов, в которых возникает ОКД, почти линейно соотносится с долей нейронов, погибающих через несколько часов после окончания Glu-воздействия [Limbrick et al., 1995; !Сурин et al., 2014]. По этой причине, а также потому, что Са²⁺ является вторичным мессенджером во всех типах клеток и регулирует мириады внутриклеточных процессов [!Авдонин, Ткачук, 1994; Berridge et al., 2000; Gellerich et al., 2013], неизменно сохраняется интерес к выяснению деталей механизмов возникновения ОКД и тестированию возможных нейротропных свойств различных агентов.

Выполненные за последние годы исследования выявили ряд возможных причин развития ОКД и сохранения последующего высокого [Ca²⁺]_i плато. Эти исследования можно разделить на два направления, в зависимости от того, какой из механизмов развития ОКД считается основным: (1) возникновение неспецифической поры высокой проводимости во внутренней мембране митохондрий (mitochondrial permeability transition pore, РТР) [Schinder et al., 1996; Liu et al., 2015]; (2) развитие энергетического кризиса, приводящего к дисбалансу ионного гомеостаза, кульминацией которого является ОКД [Nicholls, Budd, 2000; Abramov, Duchen, 2010; Rousset et al., 2012]. Центральная роль

митохондрий не подвергается сомнению в любой из гипотез развития ОКД и последующей гибели нейронов.

Несмотря на тестирование более 1000 терапевтических стратегий в
моделях ишемического инсульта и более 100 терапий при ишемическом
инсульте человека, только tPA (tissue plasminogen activator) успешно переведен в
клиническую практику при лечении инсульта [Ginsberg, 2008; Jeyaseelan et al.,
2008; Jickling, Sharp, 2015]. Поэтому более углублённое исследование
молекулярных клеточных механизмов развития патологий ЦНС при ишемии,
инсульте, черепно-мозговой травме, безусловно, является актуальной задачей,
решение которой позволит улучшить методы терапии поражений,

обусловленных глутаматной эксайтотоксичностью.

Цель исследования

Выяснить роль митохондрий в нарушениях гомеостаза ионов Ca²⁺ и Na⁺ в первичных культурах из головного мозга крысы при двукратном действии Glu, моделирующем повторный эпизод ишемии/гипоксии мозга и приводящем к гибели нейронов.

Задачи исследования

1. Выяснить отличия параметров ионного гомеостаза при первом и повторном
воздействии токсических доз Glu:

A. Роль усиления протонной проводимости митохондриальной мембраны или
ингибирования дыхания

Б. ОКД в условиях блокады высокопроницаемой митохондриальной поры (PTP) с помощью замены Ca²⁺ на его суррогат, Sr²⁺

B. Вклад изменений [NADH] и [АТФ] в сенситизацию нейронов к
повторному действию Glu

Г. Роль Na⁺/Ca²⁺-обмена и Na⁺/K⁺-АТФазы

2. Оценить активность звеньев дыхательной цепи митохондрий и дегидрогеназ
цикла трикарбоновых кислот, используя кинетику восстановления тетразолия
до формазана.

Научная новизна

1. Обнаружено ускоренное наступление ОКД при повторном воздействии Glu (сенситизация нейронов).

2. Впервые продемонстрировано, что сенситизация проявляется при увеличении протонной проводимости внутренней мембраны митохондрий или при понижении внеклеточной [Na⁺].

3. Впервые получена и проанализирована динамика восстановления [АТФ]с и pHc в индивидуальных нейронах после удаления Glu.

4. Впервые показано, что для оценки функциональной активности митохондрий индивидуальных нейронов может быть использована динамика изменений оптических сигналов (флуоресценции и поглощения проходящего света) при восстановлении тетразолия (МТТ) до формазана.

Теоретическое и практическое значение работы.

Результаты работы показывают, что в развитии ОКД как при первом, так и при повторном воздействии Glu принимают участие разнообразные факторы. Доминирующая роль какого-то из них определяется условиями эксперимента и индивидуальными особенностями нейрона. Отслеживания [Ca²⁺]_i и _m не всегда достаточно для адекватной оценки состояния нейронов. Для более полного описания функционального состояния этих клеток следует также учитывать такие параметры, как степень набухания нейронов, количество Ca²⁺, захваченного митохондриями, pH цитозоля и митохондрий, [Na⁺]_i , [АТФ]c и [NADH].

При тестировании биологически активных веществ потенциально нейропротекторного действия следует учитывать не только их влияние на развитие ОКД, но также на восстановление функционального состояния митохондрий, баланса ионов, соотношения внутри- и внеклеточного пространства после прекращения эксайтотоксического действия Glu. Вещества, способствующие быстрому восстановлению [Na⁺]_i и [АТФ]c после прекращения действия Glu, могут быть перспективными при разработке препаратов нейропротекторного действия. Обнаружено, что изменения концентрации внутриклеточного Na⁺ способны служить косвенной оценкой изменений уровня АТФ в цитозоле.

Показано, что МТТ-тест, широко используемый для анализа выживаемости клеток, может, при совместном применении оптической трансмиссионной и флуоресцентной микроскопии, дать информацию об активности отдельных комплексов дыхательной цепи митохондрий в индивидуальных клетках.

Положения, выносимые на защиту:

4. Воздействия, способствующие увеличению протонной проводимости внутренней мембраны митохондрий или частичное ингибирование дыхания, ускоряют дизрегуляцию кальциевого гомеостаза.

5. Истощение запасов АТФ и NADH в нейронах не является единственным условием развития отсроченной кальциевой дизрегуляции (ОКД).

6. Для развития ОКД формирование PTP не является обязательным условием.

4. При анализе механизмов глутаматной эксайтотоксичности следует учитывать как внутри-, так и внеклеточную концентрацию Na⁺.

5. Сочетание методов флуоресцентной и трансмиссионной оптической микроскопии позволяет использовать МТТ-анализ для количественной оценки активности дегидрогеназ ферментов гликолиза, цикла Креббса и комплексов дыхательной цепи митохондрий.

Апробация работы.

Основные результаты работы доложены на межлабораторной

конференции ФГБНУ «НИИ общей патологии и патофизиологии» 26 октября 2017г, Москва, Россия; Международной конференции “Рецепторы и внутриклеточная сигнализация”, Пущино, 2013г; XI международной научно-технической конференции Актуальные вопросы биологической физики и химии. БФФХ-2016, Севастополь; Международной конференции “Рецепторы и внутриклеточная сигнализация” Пущино, 2017 г; Международной школе ADFLIM, Саратов, 2018; Международной конференции 9th World Congress on Targeting Mitochondria, Berlin, 2018.

Публикации и личный вклад автора.

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых журналах (из перечня ВАК) и 6 тезисов в сборниках материалов научных конференций.

Личный вклад автора состоит в выполнении экспериментов, обработке данных, представлении результатов в докладах, участие в обсуждении и подготовке результатов к публикации. Все основные экспериментальные данные диссертационного исследования получены автором лично.

Структура и объем работы.

Диссертационная работа содержит: список сокращений, введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы и библиографический указатель, включающий работы на русском (17) и иностранном (318) языках. Диссертация изложена на 166 страницах машинописного текста и содержит 1 таблицу и 41 рисунок.

Рецепторы глутамата

Глутаматные рецепторы (Рис. 2) делятся на два больших класса: ионотропные и метаботропные. Все ионотропные Glu рецепторы представляют из себя лиганд-управляемые ионные каналы и разделяются на 3 подтипа:

NMDA рецепторы (агонист N-метил-О-аспартат, (2К)-2-(метиламино)бутандиовая кислота)

AMPA рецепторы (агонист -амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовая кислота);

КА рецепторы - каинатные рецепторы. (агонист каиновая кислота, (28,38,48)-3-(карбоксиметил)-4-проп-1-ен-2-ил-пирролидин-2-карбоновая кислота).

NMDA-каналы играют важную роль в долговременной синаптической пластичности, процессах обучения и памяти. Антагонисты NMDA каналов (АР5, АР7, МК-801) вызывают различные нарушение обучаемости животных [Xiao et al., 1991; Novitskaya et al., 2010]. Именно NMDA-каналы играют особую роль в глутаматной нейротоксичности. Условиями открывания канала является связывание Glu с рецептором и деполяризация мембраны, приводящая к удалению Mg2+, который является блокатором канала. NMDА-каналы обладают высокой проводимостью для ионов Са2+, но пропускают не только Са2+, но и одновалентные катионы, такие как K+ и Na+.

Рецепторы NMDA (NMDAR) состоят из различных комбинаций семи NMDAR субъединиц, которые идентифицированы следующим образом: одна разновидность NR1, четыре NR2 (A-D), и две NR3 (А и В) [Vyklicky et al, 2014]. Функциональные характеристики определяются специфической комбинацией NR1 и NR2 субъединиц в рецепторе. Большинство NMDAR в мозге, по-видимому, действуют как гетеротетрамерные сборки, состоящие из двух глицин-связывающих NR1 и двух Glu-связывающих NR2 субъединиц [Khr, 2006]. NR2A-содержащие рецепторы деактивируются быстрее, по сравнению с NR2B-содержащими, о чем свидетельствует различное количество поступившего в цитозоль Ca2+ при их активации [Sobczyk, 2005]. Кроме того, в зрелых культивируемых нейронах NR2A-содержащие NMDAR способствуют экспрессии субъединицы GluR1 АМРА-рецепторов (AMPAR), в то время как NR2B-содержащие NMDAR снижают способность GluR1 встраиваться в мембрану [Kim et al., 2005]. NR3 субъединица уменьшает амплитуду и значительно уменьшает Са2+-проницаемость связанных с NMDAR каналов, и предполагается, что эндогенный NR3A защищает нейроны [Nakanishi et al., 2009].

Субклеточная локализация NMDAR также влияет на характер сигнализации NMDAR. Синаптическая деятельность NMDAR крайне важна для жизнеспособности нейронов в то время как внесинаптические NMDAR связаны с некоторыми путями клеточной смерти [Papadia et al., 2005]. Активность внесинаптических NMDAR, в отличие от синаптических NMDAR, вызывает активацию CREB (cAMP response element-binding protein), приводя к гибели клетки [Pokorska et al., 2003].

Было показано, что NMDAR организуются в несколько белковых комплексов в пределах специализированной структуры, известной как «постсинаптическое уплотнение» (ПСУ, PSD), расположенной под постсинаптической мембраной в соответствии с активными зонами пресинаптических терминалей в ЦНС [Sheng, Hoogenraad, 2007]. ПСУ способствует выполнению нескольких функций, в том числе: адгезия клеток, регулирование кластеризации рецепторов и модуляция функций рецепторов. Из белков, участвующих в ПСУ, PSD-95 играет важную организационную роль, связывая NR2 субъединицы NMDAR с внутриклеточными белками и ферментами сигнализации, такими как нейрональная синтаза оксида азота (nNOS) [Cui et al., 2007; Forder, Tymianski, 2009; Doucet et al., 2012].

АМРА-рецепторы (AMPAR) состоят из четырех видов субъединиц, обозначаемых GluR1-GluR4 или, по другой классификации, субъединиц A-D, кодируемых в соответствии с четырьмя генами [Santos et al., 2009]. Проницаемость для Ca2+ зависит от наличия или отсутствия субъединицы GluR2. Её присутствие делает канал AMPAR непроницаемым для Са2+. Активация AMPAR после ишемии вызывает приток Na+ в цитозоль нейронов. Именно благодаря поступлению Na+ через AMPA каналы, клеточный мембранный потенциал может снизиться до такого уровня, что это приведет к высвобождению иона Mg2+ из NMDA канала (снятие потенциал-зависимого Mg2+-блока) и поступлению ионов Сa2+ в клетку [Hollmann et al., 1989; Vyklicky et al., 2014].

До последнего времени было крайне мало сведений о роли каинатных рецепторов. Однако недавние исследования выявили ключевую роль каинатных рецепторов, наряду с NMDA и AMPA каналами, в процессах синаптической пластичности, в частности, протекающих на соматосенсорной коре головного мозга [Kamiya, 2002; Lerma, 2003; Sihra, Rodrguez-Moreno, 2013].

Молекулярное клонирование каинатных рецепторов (KAR) позволило обнаружить пять типов субъединиц: GluK1-GluK5, которые могут собираться в различных комбинациях, образуя функциональные рецепторы [Jane et al., 2009]. Функциональные исследования показывают, что KAR в основном играют регулирующую роль в синаптической передаче (возбуждения и торможения) по отношению к NMDA и AMPA рецепторам, влияя на высвобождение Glu [Lerma, 2003]. При многократной синаптической активации они могут функционировать как ауторецепторы, усиливающие или ингибирующие сигнал [Sihra, Rodrguez-Moreno, 2013]. Также KAR могут отвечать на изменения уровня Glu вне клеток и обеспечивать улучшение выделения Glu [Rodrguez Moreno, Sihra, 2011]. KAR модулируют синаптическую передачу в некоторых типах нейрональных культур [Paternain et al., 1995; Palacios-Filardo et al., 2016].

В частности, GABA-ергические нейроны могут подавлять синхронную активность большой популяции нейронов через активацию глутаматом пресинаптических каинатных рецепторов, содержащих субъединицу GluR5/GLUK1 [Кононов и др., 2012].

Метаботропные глутаматные рецепторы (mGluRs), в отличие от "быстродействующих" ионотропных, обеспечивают медленную реакцию на воздействия Glu. Структурно mGluRs входят в C-класс G-белок сопряженных рецепторов [Brauner-Osborne et al., 2007; Vafabakhsh et al., 2015]. MGluRs выполняют множество функций в центральной и периферийной нервных системах [Kolber, 2015]. Они участвуют в процессах памяти, обучения, ощущении тревоги, восприятии боли [Kolber, 2015; Bhattacharyya, 2016]. Рецепторы содержатся на мембранах как пре-, так и постсинаптических нейронов гиппокампа, мозжечка и коры мозга, а также в других областях. Метаботропные рецепторы активируют внутриклеточные сигнальные каскады, ведущие к модификации других белков, например, ионных каналов [Chiechio et al., 2004]. Это в итоге может изменять возбудимость синапса, например, через ингибирование нейротрансмиссии либо модулирование или даже индукцию постсинаптических реакций [Kolber, 2015; Bhattacharyya, 2016].

Дыхательная цепь митохондрий и NADH

Основная часть АТФ производится за счет протонной АТФ-синтазы митохондрий. Она использует протонный градиент на внутренней мембране митохондрий для присоединения третьего остатка фосфорной кислоты к АДФ. Для производства одной молекулы АТФ требуется ровно 3 протона, что обеспечено структурой Fo и F1 субъединиц АТФ-синтазы [Junge, Nelson, 2015].

Протонный градиент, используемый АТФ-синтазой, создается электрон-транспортной цепью митохондрий (ЭТЦ), также называемой дыхательной цепью митохондрий (Рис. 9). ЭТЦ состоит из нескольких белковых ферментных комплексов: трёх протонных насосов (комплексы I, III и IV), встроенных во внутреннюю митохондриальную мембрану, и двух подвижных молекул-переносчиков — убихинона и цитохрома с. Комплекс II дыхательной цепи – сукцинатдегидрогеназа – также встроен в митохондриальную мембрану и принадлежит, собственно, к ЦТК. АТФ-синтаза иногда называется комплексом V, хотя она не принимает участия в переносе электронов. Компоненты дыхательной цепи катализируют перенос электронов от NADH или восстановленного убихинона (QH2) на молекулярный кислород [Murray et al., 2003].

Перенос протонов комплексами I, III и IV протекает векторно (однонаправленно) из матрикса в межмембранное пространство за счет падения окислительно-восстановительного потенциала по цепи. При pH=0,5 митохондрии не способны производить АТФ ни при каких реально существующих в клетке концентрациях АДФ и фосфата, если потенциал митохондрий падает ниже 100 мВ [Cortassa et al., 2003; Cortassa, Aon, 2012]. В случае сильной деполяризации митохондрии, митохондриальная АТФ-синтаза может претерпевать реверсию, превращаясь в протонную АТФазу, чтобы воспрепятствовать полной потере m [Ходоров и др., 2001; Nesci et al., 2015].

Электрохимический потенциал на мембране митохондрий создается «выкачиванием» протонов из матрикса I, III и IV комплексами. Возврат протонов в матрикс происходит по Fo каналу АТФ-синтазы. Различные разобщители могут повышать протонную проводимость мембран, позволяя протонам возвращаться в матрикс в обход АТФ-синтазы [Murray et al., 2003].

Создаваемый дыхательной цепью m используется не только для производства АТФ, но и для других потенциал-зависимых процессов. При достижении [Ca2+]i определенного порога (0,5-1 мкM) положительно заряженные Ca2+ захватываются посредством унипортера митохондрий за m [Kirichok et al., 2004; Marchi, Pinton, 2014; Foskett, Philipson, 2015]. Работа унипортера критично зависит от m. При большом падении m поглощение Ca2+ экспоненциально снижается, а при m, близком к нулю, поток Са2+ в митохондрии по унипортеру прекращается [Gunter, Gunter, 1994]. При высоких концентрациях Са2+ поглощение Са2+ митохондриями сильно ограничивается скоростью откачки протонов, т.е. способностью митохондрий поддерживать m [Bernardi, 1999].

Основной субстрат, используемый для работы дыхательной цепи митохондрий – это восстановленная форма никотинамидадениндинуклеотида (NADH). NADH, окисляясь, передает 2 электрона на I комплекс дыхательной цепи. Высвобождающаяся при дальнейшем движении электронов по цепи энергия используется для перемещения протонов. За счет одной молекулы NADH происходит перенос 10 протонов из матрикса митохондрий в межмембранное пространство митохондрии. NADH вырабатывается в результате работы пируватдегидрогеназы и трех дегидрогеназ цикла Кребса [Kornberg, 2000] (Рис. 10).

Естественно предположить, что возникновение ОКД и сильной МД при токсическом воздействии Glu на нервные клетки может являться следствием Са2+-зависимых нарушений процессов производства и потребления NADH в митохондриях этих нейронов.

Благодаря развитию техники флуоресцентной микроскопии появилась возможность исследовать динамику [NADH] в индивидуальных живых клетках, т.к. эта молекула сама по себе обладает флуоресценцией [Ince et al., 1992; Li et al., 2008; Bartolom, Abramov, 2015]. Изменения [NADH] при действии Glu имеют характерные особенности, непосредственно коррелирующие с развитием ОКД. В опытах на культивируемых гиппокампальных нейронах было обнаружено, что возникновению ОКД при длительном действии Glu предшествует падение [NADH] до некоторого минимального уровня, что указывало на тесную связь между этими явлениями [Abramov, Duchen, 2008]. Эксперименты Сурина и др., 2010 на культивированных клетках мозжечка подтвердили основную находку Abramov&Duchen о том, что у подавляющего большинства нейронов возникновению II фазы Са2+-ответа на Glu предшествует снижение [NADH]. Однако в нейронах мозжечка ОКД лишь в некоторых случаях возникало после предельного снижения [NADH]. В большей части гранулярных клеток мозжечка после добавления Glu сначала наблюдалось умеренное снижение [NADH], которое продолжалось и после возникновения ОКД, причем в 60% клеток происходило отчетливое ускорение падения [NADH] во время вторичного усиления деполяризации, но в некоторых клетках ОКД развивалась без снижения сигнала NADH [Surin et al., 2010].

Для выяснения зависимости МД и [NADH] от входа Са2+ в митохондрии [Abramov, Duchen, 2008] применили Ru360 - мембрано-проникающий ингибитор митохондриального Ca2+-унипортера. Ингибирование унипортера значительно снижает потребление NADH, а также подавляется МД. Из этого был сделан вывод, что Glu –индуцированное снижение [NADH], также как и МД в гиппокампальных нейронах, обусловлены входом Са2+ в митохондрии.

Снижение флуоресценции NADH в период, предшествующий началу ОКД, или в момент возникновения ОКД может быть вызвано как усилением потребления NADH, так и снижением скорости восстановления NAD+ до NADH.

Не подлежит сомнению, что Glu-индуцированная токсичность накладывает на нейроны повышенные энергетические требования. Однако основной гипотезой для объяснения смерти клетки из-за Glu-токсичности выдвигалась активация поли-(аденозинрибозил полимеразы)-1 (PARP-1), а внутримитохондриальная PARP-2 выдвигалась на роль агента, вызывающего МД [Abramov, Duchen, 2010]. PARP-1 – это фермент, принимающий активное участие в репарации ДНК. Активированная PARP-1 потребляет NAD+, таким образом, активно уменьшая количество NADH и его доступность для дыхательной цепи митохондрий. Ингибиторы PARP-1 3-аминобензамид (3-AB) и 3,4-дигидро-5-[4-(1-пиперидинил)бутоксил]-1(2H)-изоквинолинон (DPQ) сокращают падение [NADH] [Abramov, Duchen, 2008]. Существенно и то, что ингибиторы вызвали задержку МД относительно ОКД, что показывает существенную роль PARP-1 в развитии МД.

Помимо исчерпания NAD+, вызванного гиперактивацией PARP-1/2, существуют и другие механизмы, ведущие к дефициту NADH. Известно, что активность ферментов цикла трикарбоновых кислот, восстанавливающих NAD+ до NADH, резко падает при рН матрикса митохондрий (рНм) ниже 7. Токсические концентрации Glu способны понизить рНм до 6.2–6.5, причем наиболее резкое падение рНм приходится на фазу развития ОКД. В число ферментов, поставляющих NADH для дыхательной цепи, входит -кетоглутаратдегидрогеназа, активность которой резко падает при рН 7 (см. [Surin et al., 2010] и ссылки в ней). Таким образом, сам факт падения [NADH] при развитии ОКД не вызывает сомнения, однако причины этого явления нельзя считать полностью выясненными.

Сравнение изменений [Ca2+]i и m при двукратном действии Glu

Как отмечалось выше, развитие Са2+-дизрегуляции подразделяют на три фазы [Keelan et al., 1999]. Эта динамика представлена на Рис. 12, где приведены типичные ответы [Ca2+]i и митохондриального потенциала (m) индивидуальных нейронов. В первую фазу [Ca2+]i повышается незначительно, деполяризация митохондрий мала. По прошествии некоторого времени (латентный период) происходит вторичное повышение [Ca2+]i, которое, как было отмечено выше, обозначают термином «отсроченная кальциевая дизрегуляция» (ОКД). Латентный период ОКД, который определяли как время от момента добавления Glu до начала вторичного подъема [Ca2+]i, составлял 488±26 с (96 клеток). Эта величина колебалась в культурах, приготовленных в разное время, поэтому здесь и далее указаны значения, которые были получены в парных экспериментах на сестринских культурах. ОКД сопровождает сильная митохондриальная деполяризация (сильные изменения m), которая развивается синхронно с повышением [Ca2+]i (Рис. 12 Б,В). Далее следует третья фаза (фаза высокого Са2+-плато).

Повторное воздействие Glu осуществляли по следующему протоколу: вызывали Glu-индуцированную ОКД примерно у половины клеток. После этого удаляли Ca2+ и Glu из буферного раствора и дожидались восстановления [Ca2+]i и m до низкого уровня, соответствующего первой фазе Ca2+-ответа в большинстве нейронов. Далее Glu и Ca2+ возвращали в буфер (Рис. 12).

Необходимо отметить, что удаление Glu у некоторых нейронов приходилось на восходящую фазу Ca2+-дизрегуляции. У таких нейронов отмывание Glu приводило к быстрому восстановлению [Ca2+]i и m до уровней, соответствующих состоянию покоя. Если удаление Ca2+ и Glu приходилось на тот момент, когда уже наступила фаза [Ca2+]i-плато, восстановление происходило с задержкой или вовсе не наблюдалось за время отмывания Glu. Зависимость между продолжительностью латентного периода ОКД и временем восстановления исходных значений [Ca2+]i и m в постглутаматный период показана на Рис. 13А. Время восстановления исходных значений этих параметров определяли как период от момента удаления Glu и Ca2+ и до окончания снижения [Ca2+]i.

Невысокая, но значимая корреляция между этими событиями (Pearson s coefficient = -0,66±0,13; R2=0,43, p 0.01) свидетельствует о том, что индивидуальность клеток проявляется не только в длительности латентных периодов ОКД, но и в особенностях процессов, происходящих в клетках в период высокого Ca2+-плато (Рис. 13А).

Индивидуальность нейронов нивелировались при повторном действии Glu – Ca2+ дизрегуляция развивалась практически в том же количестве нейронов, но с укороченными латентными периодами (96 нейронов с ОКД при первой добавке Glu, 109 при повторной; 2 эксперимента). Длительность латентного периода при повторной дизрегуляции (без учёта нейронов, впервые ответивших на второе воздействие Glu) составляла в среднем 123±7 с (96 нейронов, 2 эксперимента), то есть ОКД наступала в 4 раза быстрее, чем при первом воздействии Glu. Длительность латентных периодов ОКД при повторном воздействии Glu не зависела от длительности латентных периодов при первой аппликации Glu (=0,12±0,25, p=0,4, т.е. недостоверно отлично от 0; R2=0,02) (Рис. 13Б). Подобное сокращение латентного периода ОКД при повторном воздействии Glu наблюдали в других экспериментах, выполненных в разные дни. Это явление повышенной чувствительности нейронов к повторному действию Glu мы в дальнейшем обозначили термином «сенситизация».

Редукция индивидуальности в Ca2+-ответах нейронов при повторном воздействии Glu, по сравнению с первым воздействием Glu, позволяет предположить существование какого-то доминирующего фактора(ов), вызывающего сенситизацию. Феномен, напоминающий сенситизацию, наблюдали ранее при действии Glu на нейроны, у которых функциональное состояние митохондрий было нарушено с помощью митохондриальных и метаболических ядов или протонофоров [Nicholls, Budd, 2000; Khodorov, 2004]. Одним из последствий дисфункции митохондрий является снижение производства АТФ. Для того чтобы проверить, как влияет недостаток АТФ, удаляли только Ca2+, оставляя Glu. Такая постановка эксперимента приводит к тому, что в период действия Glu в без-Ca2+ буфере через каналы активных NMDA-рецепторов продолжает поступать Na+ [Novelli et al., 1988; Rose, Konnerth, 2001; Vyklicky et al., 2014]. При этом большая часть производимого АТФ тратится Na+/K+-АТФазой, которая даже в норме потребляет 40% производимого АТФ [Ames, 2000]. В таком протоколе характер снижения [Ca2+]i и восстановления m практически не отличался от экспериментов с удалением одновременно Glu и Ca2+ (Рис. 14Е).

При возвращении Ca2+ в буфер, количество клеток с ОКД увеличивалось в 1,5-5 раз (4 эксперимента, 30 нейронов с ОКД при первой добавке Glu, 74 при повторной из общего количества n=132 нейрона в 4-х экспериментах) и сокращались латентные периоды ОКД. На Рис. 14 приведены изображения нейронов в одном из этих экспериментов. [Ca2+]i представлена в палитре псевдоцветов от синего к красному (синий цвет соответствует [Ca2+]i в покоящихся нейронах, красный соответствует высокому Ca2+-плато (III фазе)).

На Рис. 14А видно, что до действия Glu у всех нейронов [Ca2+]i низкая. При повышении [Ca2+]i в результате ОКД, цвет клеток меняется на красный (Рис. 14Б). При удалении Ca2+, большая часть клеток восстанавливается до состояния, близкого к исходному (Рис. 14В). Количество нейронов с ОКД (красные) в конце повторного действия Glu и Ca2+ (Рис. 14Г) возросло в 1,5 раза, по сравнению с Рис. 14Б (от 23 до 34).

При добавлении Glu всегда происходили изменения формы и размеров клеток, что хорошо видно при сопоставлении Рис. 14 А и В. Естественно предположить, что эти изменения отражают набухание нейронов, вызванное нарушением баланса ионов. Мы проанализировали эти изменения с помощью программы ImageJ. Те объекты, которые на Рис. 14 А и В считали клетками, на Рис. 15 А, Б обведены по контуру желтой линией.

Общая площадь нейронов при воздействии Glu увеличилась на 40% (Рис. 15 В, Г), что соответствует увеличению объёма на 65% или изменению диаметра на 20%, что соответствует данным, полученным с помощью лазерной интерференционной микроскопии [Бибинейшвили и др., 2014]. Оказалось, что дальнейшие изменения площади при удалении Ca2+ зависели от того, оставляли мы Glu в растворе или нет. Если Glu отсутствовал, набухание постепенно спадало (Рис. 15 В, снижение 20% до повторного воздействия). Если Glu оставляли в растворе, то после удаления Ca2+ наблюдалось ещё большее набухание клеток (Рис. 15 Г, повышение ещё на 20% до повторного воздействия). Судя по тенденции, в данных экспериментах объем клеток не успевал стабилизироваться до повторного воздействия Glu и Ca2+, т.е. реальная величина изменений может быть даже выше.

При этом во время повторного воздействия Glu и Ca2+ площадь в обоих случаях возвращалась к той же величине, что и при первом воздействии (на 40% больше, чем в состоянии покоя) (Рис. 15 В, Г). Это свидетельствует о том, что механизмы, регулирующие объём клеток приходят в одинаковое состояние при первом и повторном воздействиях Glu.

При удалении и Glu, и Ca2+ мы сохраняли осмолярность раствора, добавляя 2мМ MgCl2. Снижение общей площади в этом буфере (Рис. 15 В) обусловлено тем, что клетки постепенно приходят в норму по ионному составу.

По-видимому, основной причиной дальнейшего набухания при удалении только Ca2+ (Рис. 15 Г) является то, что осмолярность без-Ca2+ буфера с Glu была на 6 мМ ниже, чем Ca2+ буфера с Glu (на 2 мМ CaCl2). Это может объяснить как дальнейшее набухание, несмотря на снижение [Ca2+]i, так и снижение объёма, когда клетки были возвращены в Ca2+ буфер с Glu. Однако величину изменений (объём на 30%) сложно обосновать только изменением осмолярности на 2% (6 мМ от общей концентрации катионов и анионов 300мМ). Нельзя, однако, исключить влияние свойств мембраны на форму клеток в результате изменений характера взаимодействия липидов мембран и белков с катионами в растворе и в цитозоле [Mao et al., 2015].

Набухание является важным аспектом функционального состояния клеток, т.к. уменьшение концентрации внутриклеточных веществ влияет на метаболизм [Платонова и др., 2013; Orlov et al., 2013]. Изменения метаболизма в результате увеличения объёма нейронов может быть одним из факторов, приводящих к сенситизации нейронов к повторному действию Glu.

Влияние МТТ на флуоресценцию MTG и NADH-зависимую автофлуоресценцию нейронов

Для подтверждения того, что следующий за быстрым падением сигнала Rh123 рост его флуоресценции отражает деполяризацию митохондрий, исследовали влияние МТТ на флуоресценцию Митотрекера зеленого (MTG). MTG относится к числу наиболее специфичных митохондриальных зондов, имеет практически такие же спектры возбуждения и испускания флуоресценции, как и Rh123, однако в отличие от последнего, образует ковалентные связи с сульфгидрильными группами белков и пептидов в матриксе митохондрий и поэтому после их деполяризации не выходит в цитозоль [Buckman et al., 2001]. МТТ быстро и необратимо тушил флуоресценцию MTG (Рис. 34 Б и Д и Рис. 35А), подтверждая тем самым, что вторичный подъем флуоресценции Rh123 является отражением деполяризации митохондрий. Кроме того, быстрое тушение MTG указывает на митохондрии, как место первоначального накопления МТТ.

Окрашивание тех же самых клеток ядерным красителем Hoechst 33342 показало, что за время почти полного тушения MTG, сигнал Hoechst 33342 снижался лишь на 25-30% (Рис. 34 В,Е). Кинетика снижения флуоресценции Hoechst 33342 представлена на Рис. 35Б. Небольшое тушение этого ядерного зонда обусловлено, очевидно, сильным поглощением МТТ УФ-излучения, возбуждающего Hoechst 33342 (365 нм). Это подтверждается тем, что использование более длинноволнового возбуждения (405 нм) не вызвало изменений флуоресценции конфокальных изображений в ядерной области при этом тушило MTG в митохондриях более чем на 90% как в нейритах (Рис. 36 А,В), так и в соме (Рис. 36 Б,Г).

Выше было показано (Рис. 33), что деполяризация митохондрий развивается почти одновременно с началом восстановления МТТ до формазана. Мы проверили, влияет ли деполяризация митохондрий сама по себе на светопропускание при длинах волн 610 нм и выше. Частичная деполяризация митохондрий с помощью ингибитора комплекса IV дыхательной цепи цианида (NaCN, 1 мМ) не влияла на интенсивность проходящего света (Рис. 37В).

Очевидно, частичное снижение m в результате блокады дыхательной цепи не влияет на структуру клетки настолько, чтобы вызвать изменения интенсивности проходящего сквозь клетку света. В то же время, кратковременное добавление цианида вызывало обратимый рост флуоресценции Rh123 (Рис. 37Б), обусловленный временным выходом зонда из матрикса митохондрий в цитозоль и ядро [Nicholls, Ward, 2000; Duchen et al., 2003].

Падение m в присутствии МТТ отражает, по-видимому, то, что NADH, образующийся в результате восстановления NAD+ дегидрогеназами матрикса митохондрий, стал затрачиваться на восстановление МТТ до формазана. В результате этого возник дефицит NADH для комплекса I дыхательной цепи и, соответственно, ослабла (или прекратилась) генерация m . Для проверки данного предположения были одновременно отслежены изменения флуоресценции потенциал-чувствительного зонда, NADH-автофлуоресценции и интенсивности проходящего света. Оказалось, что сразу после добавления МТТ, автофлуоресценция NADH (Рис. 37Б) начала снижаться одновременно с падением сигнала Rh123 (Рис. 37А). Снижение сигнала NADH имело двухфазный характер и после первоначальной быстрой фазы наступало медленное падение [NADH], которое продолжалось в течение всего времени действия МТТ вплоть до достижения минимального уровня [NADH]. Добавление протонофора FCCP (1мкМ), который обычно используют в конце эксперимента для определения минимального сигнала NADH [Duchen et al., 2003; Surin et al., 2010], не вызывало дальнейшего падения автофлуоресценции (не показано).

Основная доля NADH сосредоточена в матриксе митохондрий, хотя и зависит от типа клеток [Berridge, Tan, 1993; Marshall et al., 1995; Bernas, Dobrucki, 2002]. Мы проверили участие комплексов дыхательной цепи и АТФ-синтазы, а также гликолиза в образовании формазана. Для этого сравнили начальную скорость снижения интенсивности проходящего света в контрольных экспериментах со скоростями снижения светопропускания в парных экспериментах в присутствии соответствующих ингибиторов ферментных комплексов и ингибитора гликолиза 2-DG. Средняя скорость образования формазана в контрольных экспериментах составляла -13,9±0,4 усл.ед./сек (среднее±стандартная ошибка среднего; 16 экспериментов, 439 клеток) (Рис. 38). Действие ингибиторов дыхания было различным. Блокада дыхания ингибитором комплекса I ротеноном (20 мкМ) вызвала достоверное падение скорости образования формазана по сравнению с контролем (р 0,001). Напротив, ингибирование комплекса IV цианидом (NaCN, 1mM) привело к росту скорости образования формазана по сравнению с контролем (-20,9±0,7 у.е./с; р 0,001). Ингибирование АТФ-синтазы (комплекса V) олигомицином (2,5 мкг/мл = 3мкМ) не вызывало достоверных отличий в скорости образования формазана по сравнению с контролем. Блокада комплекса III антимицином А (1,8 мкМ) показала тенденцию снижения скорости образования формазана (р=0,0553).

Как известно, конечным продуктом гликолиза является пируват (Pyr). Он служит основным субстратом митохондрий, окисляемым в матриксе с восстановлением четырех молекул NAD+ до NADH, которые потребляет NADH/убихинон оксидоредуктаза (комплекс I дыхательной цепи). Добавление Pyr (5 мМ) в буфер, содержащий глюкозу, концентрационно-зависимо увеличивало скорость восстановления МТТ (Рис. 39). Ингибирование с помощью 2-дезокси-D-глюкозы (2-DG, 5 мМ) гликолиза, а значит и образование Pyr, подавляло скорость возникновения формазана до -1,66±0,12 усл.ед/сек, то есть на 85-90% по сравнению с контролем (Рис. 39). Добавление Pyr в буфер, в котором гликолиз был ингибирован, увеличивало скорость образования формазана тем больше, чем выше была концентрация Pyr (Рис. 39).

Стоит отметить, что при блокаде гликолиза в присутствии Pyr, когда МТТ мог восстанавливаться только в митохондриях, благодаря добавленному пирувату, распределение гранул формазана в соме нейронов и в нейритах было практически таким же, как в обычном буфере с глюкозой (изображение не показано).

Деполяризация митохондрий, вызванная МТТ, может быть связана не только с дефицитом NADH, но также непосредственным ингибирующим действием МТТ и/или формазана на активность ферментов дыхательной цепи. Для проверки возможного непосредственного воздействия МТТ на дыхательную цепь сотрудники нашей лаборатории измерили скорость дыхания первичных нейрональных культур, а также изолированных митохондрий из печени крыс. Измерения скорости потребления кислорода (oxygen consumption rate, OCR) культивируемых нейронов показали, что в контрольном эксперименте ингибитор комплекса V (F1Fo-АТФ-синтазы) олигомицин снижал OCR примерно вдвое (Рис. 40А). Протонофор FCCP (2 мкМ) резко увеличивал OCR, тогда как одновременная аппликация ингибиторов комплексов I и III (ротенона и антимицина) вызывала быстрое падение OCR до самого низкого уровня, соответствующего небольшому потреблению кислорода, не связанному с окислительным фосфорилированием (Рис. 40А). Эти изменения согласуются с теми, которые описаны для культур клеток [Gerencser et al., 2009], в том числе первичной культуры нейронов [Andrabi et al., 2014]. Введение МТТ после протонофора FCCP (Рис. 40Б), то есть добавление МТТ вместо ротенона и антимицина, снижало скорость дыхания до уровня, ниже которого она не опускалась даже последующей добавкой ротенона с антимицином. Добавка МТТ за 15мин до олигомицина вызывала снижение OCR до того же уровня, до которого скорость дыхания опускалась при совместном действии ротенона и антимицина (Рис. 40В). Последующие добавки олигомицина, FCCP и ротенона с антимицином уже не вызывали изменений скорости дыхания (Рис. 40В).

Таким образом, данные по измерению скорости дыхания нейрональной культурой не противоречат предположению о том, что МТТ и/или формазан могут вызывать падение m не только за счет исчерпания NADH, но и в результате ингибирования комплексов дыхательной цепи, по крайней мере, комплекса I (Рис. 38).