Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 13
1.1 Механизм действия ионизирующего излучения и радиотерапии на организм 13
1.2 Подходы к защите здоровых тканей и методы увеличения РТИ при локальной ЛТ 18
1.3 Механизм действия дозированной гипоксии и возможности её использования для радиопротекции здоровых тканей 21
Глава 2 Объекты и методы исследования 32
2.1 Объект и дизайн исследования 32
2.2 Методы моделирования экспериментальных воздействий 35
2.2.1 Моделирование прерывистой нормобарической гипоксии 35
2.2.2 Моделирование лучевой терапии на область печени 37
2.3 Методы исследований 40
2.3.1 Определение клеточного состава и биохимических реакций крови крыс 40
2.3.2 Методы исследования морфологической структуры печени 41
2.3.3 Статистическая обработка полученных данных 43
Глава 3 Результаты собственных исследований 45
3.1 Результаты исследования крови и морфологической структуры печени контрольных крыс в динамике эксперимента 45
3.2 Эффекты влияния прерывистой нормобарической гипоксии на показатели крови и морфологическую структуру печени экспериментальных крыс 50
3.2.1. Эффекты влияния прерывистой нормобарической гипоксии на клеточный состав крови крыс 50
3.2.2. Эффекты влияния прерывистой нормобарической гипоксии на биохимические показатели крови крыс 52
3.2.3. Взаимосвязь показателей клеточного состава и биохимических показателей крови крыс в условиях воздействия прерывистой нормобарической гипоксии 59
3.2.4 Морфофункциональные характеристики печени крыс в условиях воздействия прерывистой нормобарической гипоксии 62
3.3 Эффекты влияния ионизирующего излучения при моделировании лучевой терапии печени на показатели крови и морфологическую структуру печени экспериментальных крыс 64
3.3.1. Эффекты влияния ионизирующего излучения при моделировании лучевой терапии печени на клеточный состав крови крыс 64
3.3.2. Эффекты влияния ионизирующего излучения при моделировании лучевой терапии на область печени на биохимические показатели крови крыс 66
3.3.3. Взаимосвязь показателей клеточного состава и биохимических показателей крови крыс на фоне моделирования лучевой терапии на область печени 73
3.3.4 Морфофункциональные характеристики печени крыс при моделировании локальной лучевой терапии 76
3.4 Эффекты применения ионизирующего излучения на область печени на фоне прерывистой нормобарической гипоксии на показатели крови и морфологическую структуру печени экспериментальных крыс 80
3.4.1 Эффекты применения ионизирующего излучения на область печени на фоне прерывистой нормобарической гипоксии на клеточный состав крови крыс 81
3.4.2 Эффекты применения ионизирующего излучения на область печени на фоне прерывистой нормобарической гипоксии на биохимические показатели крови 83
3.4.3. Взаимосвязь показателей клеточного состава и биохимических показателей функции печени в крови крыс при сочетанном применении экспериментальных воздействий 90
3.4.4 Морфофункциональные характеристики печени крыс при сочетанном применении экспериментальных воздействий 98
Глава 4 Заключение 102
Выводы 123
Практические рекомендации 125
Список сокращений и условных обозначений 126
Список литературы 127
- Механизм действия дозированной гипоксии и возможности её использования для радиопротекции здоровых тканей
- Эффекты влияния прерывистой нормобарической гипоксии на биохимические показатели крови крыс
- Морфофункциональные характеристики печени крыс при моделировании локальной лучевой терапии
- Взаимосвязь показателей клеточного состава и биохимических показателей функции печени в крови крыс при сочетанном применении экспериментальных воздействий
Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности
Анализ состояния медицинской помощи онкологическим больным показывает, что около 70% пациентов получают лучевую терапию (ЛТ) [Давыдов М.И. и др., 2013; Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2014]. Основным ограничением этого метода является лучевое повреждение здоровых тканей пациента вследствие побочного действия ионизирующего излучения (ИИ) при ЛТ злокачественных новообразований, что продолжает оставаться одной из неразрешённых проблем медицинской радиологии [Лазаревич Н. В., 2012; Давыдов М.И. и др., 2013; Некласова Н.Ю. и др., 2014; Andolino DL et al., 2011]. Остается важным этот вопрос и для лечения пациентов с новообразованиями в печени [Аникиева О.Ю. и др., 2010; Гурьянова В. А., Тарасова Н. Б., 2013; Vauthey JN, 2009; Kurland I.J. et al., 2015].
Для достижения терапевтического эффекта при ЛТ злокачественных новообразований печени минимально необходимая суммарная очаговая доза (СОД) составляет 30 Грей (Гр) [Курпешев О.К., Флоровская Н.Ю., 2014], а толерантность здоровой ткани печени ограничивается пределами 20-25 Гр [Стюарт Ф. А. и др., 2012]. При повышении поглощенной дозы до 40 Гр (и более) развиваются необратимые изменения паренхимы печени, которые в дальнейшем вызывают цирроз печени [Лазаревич Н.В., 2012; Таразов П.Г., 2015]. В связи с этим исследуются способы расширения радиотерапевтического интервала (РТИ), т.е. различий в радиочувствительности опухоли и попадающих в зону лучевого воздействия нормальных тканей, с помощью химических и физических радиомодифицирующих агентов [Лисин В.А., 2016]. Изучены разные агенты, изменяющие радиочувствительность клеток как в сторону увеличения (радиосенсибилизаторы), так и уменьшения (радиопротекторы) [Некласова Н.Ю. и др., 2014; Velpula N. at al., 2013]. Основным требованием к использованию радиопротекторов является улучшение результатов лечения при сохранении функциональных способностей жизненно-важных органов и тканей [Лазаревич Н.В., 2012; Pataje G.S. Prasanna at al., 2012]. К сожалению, единого мнения в отношении возможности защиты от радиационного поражения нет, как и нет "универсального" радиомодификатора.
Из большого числа существующих радиозащитных средств практическое применение получила гипоксическая гипоксия, т.е. гипоксия, создаваемая при дыхании газовыми смесями, содержащими пониженное по сравнению с воздухом количество кислорода. Ее применение не увеличивает РТИ в радиочувствительности нормальных и опухолевых тканей, а снижает величину предсуществующего "отрицательного" РТИ, который определяется наличием гипоксических радиорезистентных клеток в опухоли при их практически полном отсутствии в нормальных тканях [Хайцев Н.В., 2012; Navarrete-Opazo A., 2014]. Этот способ используется при проведении ЛТ больных, страдающих опухолями молочной железы, легких, желудка, пищевода, области головы, шеи,
лимфопролиферативными заболеваниями [Дзасохов А.С., 2011; Савкова Р. Ф. и др., 2012]. Однако, в доступной нам литературе крайне мало информации о его применении при проведении ЛТ больным с новообразованиями печени, и практически нет экспериментальных исследований радиозащитного действия прерывистой нормобарической гипоксии (ПНГ) в условиях фракционированного локального облучения печени.
Все вышеперечисленное указывает на актуальность экспериментальных исследований, направленных на изучение возможностей увеличения РТИ тканей печени.
Цель исследования – установить механизмы повышения резистентности печени крыс к действию ионизирующего излучения на фоне применения прерывистой нормобарической гипоксии и обосновать возможность ее использования в качестве фактора протекции здоровых тканей печени при лучевой терапии злокачественных новообразований печени.
Задачи исследования:
-
Определить влияние прерывистой нормобарической гипоксии на клеточный состав, биохимические показатели крови и морфологическую структуру печени крыс.
-
Установить характер изменений клеточного состава, биохимических показателей крови и морфологической структуры печени крыс при воздействия ионизирующего излучения на печень.
-
Выявить изменения клеточного состава, биохимических показателей крови и морфологической структуры печени крыс при воздействии ионизирующего излучения на печень на фоне применения прерывистой нормобарической гипоксии.
-
Оценить исследуемые показатели и корреляционные взаимосвязи между ними в различные сроки проведения эксперимента с разными моделями воздействий.
Научная новизна исследования
В работе впервые проведено комплексное экспериментальное исследование по выявлению эффектов прерывистой нормобарической гипоксии на нормальную (здоровую) ткань печени лабораторных крыс при воздействии ионизирующего излучения на область печени.
Установили, что применение ионизирующего излучения в толерантных дозах для здоровой ткани печени (СОД=21 Гр) в течение 10 суток эксперимента изолированно и на фоне прерывистой нормобарической гипоксии приводило к сопоставимым изменениям содержания форменных элементов, гемоглобина и показателей белкового обмена. А изменения церулоплазмина, гамма-глютамилтрансферазы, показателей жирового и пигментного обмена были выражены значимо меньше на фоне применения гипокситерапии, чем при изолированном воздействии радиотерапии.
Выявили, что применение ионизирующего излучения в минимальных терапевтических дозах (СОД=30 Гр) в течение 20 суток эксперимента изолированно и при сочетанном воздействии с прерывистой нормобарической гипоксии приводило к разным результатам. К концу эксперимента большинство исследуемых
показателей у животных, получавших комбинированное воздействие, возвращались к исходным значениям, наблюдалось восстановление кровообращения, лимфооттока, нормализация состояния микроциркуляции ткани печени.
Теоретическая и практическая значимость работы
Выявленные изменения показателей крови крыс, получивших курс терапевтической дозы (СОД 30 Гр) ионизирующего излучения на область печени на фоне прерывистой нормобарической гипоксии, определяются как функциональным участием гепатоцитов в ответ на лучевое воздействие, так и развитием неспецифической резистентности организма под воздействием прерывистой нормобарической гипоксии. Развиваются механизмы, вызванные гипоксическим прекондиционированием, которое нивелирует негативное влияние ионизирующего излучения на здоровую ткань печени и создает условия восстановления структурной организации, нормального функционирования паренхиматозных клеток. Другими словами прерывистая нормобарическая гипоксия оказывает радиопротекторный эффект.
Полученные данные легли в основу патогенетического обоснования возможности использования дозированной нормобарической гипоксии в качестве компонента сопроводительной терапии при лечении злокачественных образований печени гамма излучением с целью минимизации негативных последствий его воздействия на здоровые клетки печени.
Разработанные в результате эксперимента рекомендации используются в учебном процессе и научно-исследовательской работе.
Методология и методы исследования
Исследование выполнено на 195 половозрелых интактных и подопытных лабораторных крысах-самцах, подвергавшихся изолированному воздействию прерывистой нормобарической гипоксии, ионизирующего излучения при моделировании лучевой терапии (МЛТ) и при их сочетании.
Методологией диссертационного исследования стал системный подход. Избрана совокупность лабораторных, морфометрических и математико-статистических методов, позволяющая оценить механизмы резистентности здоровой ткани печени крыс к ионизирующему излучению в условиях дозированной гипоксии в эксперименте.
Предметом исследования было: содержание форменных элементов (ФЭ) и гемоглобина (Г), биохимические показатели крови, морфоструктура печени у лабораторных крыс, подвергающихся изолированному воздействию прерывистой нормобарической гипоксии, ионизирующего излучения при моделировании лучевой терапии и при их сочетании.
Методы, используемые в работе, включали в себя моделирование экспериментальных воздействий, клинико-лабораторные, биохимические, гистологические и статистические исследования.
Положения диссертации, выносимые на защиту
1. Действие прерывистой нормобарической гипоксии способствует улучшению функционирования тканей печени крыс, что проявляется усилением кислородтранспортной функции (в крови увеличивается содержание форменных
элементов и гемоглобина), улучшением микроциркуляции печени, увеличением содержания белков в крови, уменьшением параметров липидного обмена.
-
Ионизирующее излучение при моделировании лучевой терапии на область печени оказывает токсическое влияние на гепатоциты: нарушение функции (снижение показателей белкового обмена), развитие холестаза (значимое повышение параметров пигментного, липидного обмена и активности аминотрансфераз). При этом также наблюдалось снижение содержания форменных элементов и гемоглобина.
-
Сочетанное применение экспериментальных воздействий снижает негативное влияние ионизирующего излучения на клетки печени. Поэтому можно рекомендовать прерывистую нормобарическую гипоксию в качестве радиопротектора, расширяющего радиотерапевтический интервал, при лечении опухолей печени локальной лучевой терапией.
-
Применение прерывистой нормобарической гипоксии в течение 10 дней при моделировании лучевой терапии не эффективно, позитивный эффект проявляется к 20 суткам эксперимента.
Степень достоверности результатов
Достоверность полученных результатов обеспечивалась методологически обоснованным планированием и проведением исследования, системой адекватных и взаимодополняющих методик, использованием методов статистического анализа полученных данных – программа «Statistica 10,0» (демонстрационный вариант) и модули системы Microsoft Excel.
Апробация результатов диссертации
Основные результаты работы были представлены, доложены и обсуждены на Международной научно-практической конференции (г. Макеевка, Украина, 2014 г.); II Республиканской научной конференции (г. Луганск, 2016 г.); Международной научно-практической конференции «Радиационные технологии. Ядерная медицина» (Кыргызская Республика, Иссык – Куль, 2016 г); XX Российском онкологическом конгрессе (г. Москва, 2016 г.); конференции с международным участием «Научно – методические проблемы нормальной физиологии и медицинской физики» (г. Москва, 2017); 79-м медицинском конгрессе молодых ученых «Актуальные проблемы теоретической и клинической медицины» (г. Донецк, 2017 г.); III Петербургском международном онкологическом форуме «Белые ночи» (г. Санкт-Петербург, 2017).
Внедрение результатов работы в практику
Материалы диссертационного исследования (в частности применение ПНГ при проведении ЛТ печени) были внедрены в клиническую практику отделения лучевой терапии №1 ГУ ЛНР «Луганский республиканский клинический онкологический диспансер», г. Луганск, в процесс преподавания на кафедре онкологии, радиологии и рентгенологии ГУ ЛНР «Луганский государственный медицинский университет имени Святителя Луки», г. Луганск, в клиническую практику ГУ «Алчевский онкологический диспансер», ЛНР.
Личный вклад диссертанта
Автором разработаны для лабораторных животных (крысы) экспериментальная модель локального облучения печени с применением стационарной гамматерапевтической установки и методика проведения ПНГ в сочетании с МЛТ печени. Проведен эксперимент. Полученные результаты были статистически обработаны и проанализированы основные научные положения работы, написаны все разделы диссертации, доказано радиопротекторное воздействие ПНГ.
Публикации результатов исследования
По теме диссертации опубликовано 16 научных работ, в том числе 4 в журналах действующего Перечня журналов, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для опубликования результатов исследований диссертаций на соискание учёной степени кандидата и доктора наук.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 149 листах компьютерного текста (Time New Roman, 14) и состоит из введения, главы «Обзора литературы», главы «Объекты и методы исследования», главы «Результаты собственных исследований», заключения, выводов, практических рекомендаций, списка сокращений и условных обозначений, списка использованной литературы. Библиографический перечень содержит 180 наименования работ, из них 123 кириллицей и 57 латиницей. Работа иллюстрирована 28 таблицами, 43 рисунками.
Механизм действия дозированной гипоксии и возможности её использования для радиопротекции здоровых тканей
Среди факторов окружающей среды, используемых для тренировки адаптации организма и включения его резервных возможностей, гипоксии уделяют особое внимание [Heather LC at al., 2012; Gamboa JL, 2012; Jacobs RA at al., 2013; Serebrovskaya T., 2016; Kelly LP, Basset FA, 2017]. Ее тренирующий и оздоравливающий эффект издавна используется в медицине. Ещё в 1940г. K. Jochim с соавт. обнаружил, что гипоксия является более мощным сосудорасширяющим фактором, чем нитрит натрия, амилнитрит, гистамин и ксантиновые дериваты [Sugarman H., Katz L.N., Sanders A., Jochim K., 1940].
Повышение устойчивости организма к экстремальным воздействиям остаётся одной из актуальных проблем современной медицины. В формировании этого состояния важную роль играют компенсаторно-приспособительные процессы неспецифической резистентности [Karam A.K. at al., 2009; Alexandrov L. B. et al., 2013; Zhu H. at al., 2014].
Одним из перспективных физиологических методов повышения неспецифической резистентности является адаптация организма к умеренному гипоксическому стимулу. Отсроченная, или долгосрочная, адаптация формируется при длительном, или многократном, гипоксическом воздействии на организм. Характеризуется тем, что, в итоге, организм постепенно превращается из неадаптированного в адаптированный. При этом наблюдается переход на новый уровень регуляции кислородного гомеостаза [Лукьянова Л.Д., 2011; Лукьянова Л.Д. и др., 2012; Самойлов М.О. и др., 2012]. Реакции адаптации к гипоксии представляют собой каскад регуляторно-компенсаторных механизмов, формирующихся на разных уровнях организации и позволяющих уменьшить эффект нарушения кислородного гомеостаза. Мобилизация данных механизмов осуществляется значительно эффективнее в организме, предварительно адаптированном влиянием, так называемого, гипоксического прекондиционирования (ГПК). ГПК является профилактической мерой и заключается в активации механизмов адаптации в результате короткого воздействия слабого, неповреждающего гипоксического стимула [Макаренко А.Н., Карандеева Ю.К., 2013; Диверт В. Э., 2013].
Известно, что организм в процессе адаптации к гипоксии за счет фундаментального, реализуемого на генетическом уровне механизма, увеличивает функциональную мощность структур, ответственных за энергообеспечение. Повышение мощности системы энергообеспечения закономерно влечет за собой увеличение неспецифической резистентности клеток, органов, а, следовательно, и организма в целом, что позволяет ему противостоять действию факторов, приводящих к развитию воспалительного процесса. Экзогенный гипоксический стимул может рассматриваться как эффективный фактор безмедикаментозного воздействия на важнейшее звено патогенеза воспалительного процесса – тканевое дыхание [Балыкин М.В., Каркобатов Х.Д., 2012; Прокудина Е.С., 2016; Heather LC et al., 2012]. В результате он оказывает нормализующее действие на показатели углеводного, жирового, белкового, электролитного и ферментного спектров крови, повышает противовоспалительный потенциал, нормализует артериальное давление, сон, психический статус, повышает работоспособность и устойчивость к экстремальным факторам. Гипоксический стимул в определённых пределах активизирует деятельность жизненно важных систем организма, принимающих участие в сохранении кислородного гомеостаза [Еникеев Д. А. и др., 2014; Overgaard J., 2011; De Smet S et al,. 2017]. При гипоксической гипоксии происходят гемические сдвиги (увеличение содержания форменных элементов и гемоглобина в крови), в основе которых лежат физиологические механизмы стимуляции системы кроветворения, вызванные понижением содержания кислорода в воздухе [Бочаров И.Н., 2012; Шатов Д.В. и др., 2014]. В процессе адаптации к курсу нормобарической гипоксии изменения биохимических показателей крови (показатели белкового, пигментного и холестеринового обмена, уровень трансаминаз) возвращаются в пределы физиологической нормы [Шевченко Ю. Л., 2000; Лебедева Е. Н. и др., 2006; Бойко Е.Р., 2010; Ковальчук П.Н., Ковальчук Л.С. 2013; Балыкин М.В. и др., 2014].
Доказано, что гипоксия создает благоприятные условия для интенсификации процессов ПОЛ, значительному повышению активности антиоксидантных ферментов [Ельчанинова С.А. и др., 2003; Горбань Е.Н., 2013]. Имеются сведения о нормализации показателей ПОЛ и АОЗ под действием нормобарической гипокситерапии у экспериментальных животных [Behn C. at al., 2007; Wang-Fischer Y. at al., 2009; Jorge G. Faras at al., 2012; He Q. at al., 2014].
Активизирующее влияние гипоксического стимула на функциональные резервы жизненно важных систем организма в последнее время начали использовать в спортивной, авиакосмической и горноклиматической медицине [Андреева Е.Р. и др., 2011; Безкишкий Э.Н. и др., 2011; Андреев-Андриевский А.А. и др., 2014; Алчинова И.Б., 2015]. Многие авторы исследуют механизмы переносимости умеренной гипоксии здоровыми людьми – спортсменами, либо лицами, проходящими врачебно-лётную или врачебно-морскую экспертизы [Цыганова Т.Н. и др., 2010; Иванов А.О. и др., 2011; Безкишкий Э.Н. и др., 2011; Емушинцев П.А. и др., 2011]. Одно и то же воздействие (например, физическая нагрузка), в зависимости от исходного функционального состояния организма, продолжительности и интенсивности воздействия, может оказать различный эффект на функции организма: координирующий, сохраняющий существующий уровень функционирования различных систем, повышающий функциональные возможности или нарушающий гомеостаз организма [Попов Д.В. и др., 2013; Шестерова Л.Е. и др., 2014; Zhang P. et al., 2014]. Гипоксический стимул используют в комплексном лечении различных заболеваний. На большом материале было установлено закономерное и значительное ослабление симптомов хронических заболеваний сердечно-сосудистой системы, была отмечена также нормализация гематологических и биохимических показателей [Шарякова Ю.В., 2012; Братик А.В., Цыганова Т.Н., 2013; Урясьев О.М., Исаева И.А., 2015].
Известно несколько методов гипокситерапии: высотная, барокамерная и нормобарическая. Наиболее физиологичным из них является последний метод. Широкое признание получила, так называемая, прерывистая нормобарическая гипокситерапия (ПНГ) – метод, разработанный Стрелковым Р.Б. [Стрелков Р.Б., 1992]. При этом кратковременная гипоксия возникает при вдыхании газовой гипоксической смеси – 10 (ГГС-10), т.е. вдыхание смеси, содержащей 10% кислорода и 90% азота. Данный метод позволяет повысить компенсаторные возможности организма при профилактике и лечении широкого круга заболеваний, а также при адаптации к неблагоприятным условиям окружающей среды. Данный способ создания ПНГ в организме человека является альтернативой к использованию высокогорной или барокамерной гипоксии, и состоит в применении газовых смесей с пониженным содержанием кислорода, вызывающих гипоксию в нормобарических условиях. Дыхание газовыми смесями с определённым содержанием кислорода вызывает в организме гипоксию соответствующей степени, что позволяет, при необходимости, осуществить индивидуальный подбор режима гипоксического воздействия в зависимости от чувствительности больного к кислородной недостаточности [Стрелков Р.Б., Чижов А.Я., 2001; Балабекова М.К. и др., 2013].
Важнейшим условием эффективности прерывистой гипоксии является её кратковременность. А многократное повторение переходов от нормоксии к гипоксии и обратно, по сравнению с непрерывной гипоксией, вызывает более выраженный лечебный эффект за счет мобилизации резервов организма. Ежедневная ПНГ включает механизмы долгосрочной адаптации, в результате возрастает процентное содержание оксигемоглобина, кислородная ёмкость крови [Баранова Е.В. и др., 2014; Якушева Е.Н. и др., 2016; Subudhi AW et al., 2011].
Таким образом, гипокситерапия оказывает выраженный эффект стимуляции адаптационных резервов организма, вызывая увеличение содержания форменных элементов и гемоглобина в крови, оказывая позитивное влияние на процессы метаболизма. Наиболее физиологичным из современных методов гипокситерапии является ПНГ.
Следует отметить, что в последние 10 лет появилось много публикаций, основной идеей которых является повышение неспецифической реактивности организма для борьбы со злокачественными новообразованиями [Хайцев Н.В. и др., 2013; Кудряков А.Ю. и др., 2014; Воронцова З.А. и др., 2014; Кудряшева А.Г. и др., 2015; Wust RC at al., 2009; Gamboa JL, Andrade FH, 2010].
В литературе имеются сообщения о повышении неспецифической резистентности организма с помощью умеренной гипоксической гипоксии и о возможности избирательной защиты здоровых тканей онкобольных. Проведенные клинические исследования подтвердили экспериментально обоснованные предположения о высокой терапевтической эффективности применения метода нормобарической гипоксии в процессе лучевой терапии злокачественных новообразований [Нудельман Л.М., 2003; Дзасохов А.С., 2011; Савкова Р.Ф. и др., 2012; Хайцев Н.В. и др., 2012; Xi L. at al., 2012; Wittenborn TR at al., 2015; Li P. at al., 2016]. Метод ЛТ на фоне вдыхания пациентами газовых гипоксических смесей Ярмоненко С.П. обозначил термином гипоксирадиотерапия [Ярмоненко С.П., Вайнсон А.А., 2004].
Эффекты влияния прерывистой нормобарической гипоксии на биохимические показатели крови крыс
Анализ изменений показателей белкового обмена показал следующее.
В экспериментальной группе крыс ОГ 2, которые находились в эксперименте только 10 суток, содержание общего белка и альбуминов в сыворотке крови было статистически значимо (р 0,001) больше, чем в КГ2, но меньше, чем в ОГ 3, животные которой находились в эксперименте 20 суток. Содержание церулоплазмина увеличилось на 10 сутки эксперимента (р=0,0155) и оставалось повышенным на 20-е сутки (таблица 3.6).
Таким образом, содержание исследуемых белков в крови крыс увеличивается по отношению к исходным данным как на 10-е, так и на 20-е сутки эксперимента, когда на крыс воздействовали ПНГ. Причём на 20-е сутки это увеличение было статистически значимо большим, кроме церулоплазмина.
Оценка эффективности увеличения содержания в крови крыс при воздействии прерывистой нормобарической гипоксии показала, что в экспериментальной группе ОГ 2 (10 сутки) она была средней для концентрации общего белка и высокой для альбуминов. В ОГ 3 (20-е сутки) также наблюдалось эффективное увеличение содержания, как общего белка, так и альбумина. Для общего белка увеличение концентрации по отношению к 10 дню эксперимента было ниже среднего, но по отношению к исходным данным – высоким, для альбуминов увеличение было высоким в первом случае и значимо высоким во втором. Изменения содержания церулоплазмина на 10 сутки эксперимента были ниже среднего по сравнению с исходными значениями, на 20 сутки увеличение этого показателя было слабым по отношению к предыдущему уровню и ниже среднего по отношению к исходному уровню (рисунок 3.4).
Сравнительный анализ показателей пигментного обмена у лабораторных животных в процессе эксперимента выявил следующие изменения.
Содержание как прямого, так и общего билирубина в ОГ 2 (10 сутки) и в ОГ 3 (20 сутки) было статистически значимо (р0,001) увеличенным по сравнению с данными КГ 2. Так у животных ОГ 2 значение общего билирубина было в 1,6 раза больше, а прямого билирубина в 2,3 раза больше, чем исходные значения. А у крыс ОГ 3 значение общего билирубина было в 2,1 раза больше, а прямого билирубина в 4,6 раза больше, чем исходные значения (таблица 3.7).
Таким образом, на 10 день, в экспериментальной группе ОГ 2, повышение общего билирубина было средним, а прямого – высоким. На 20 сутки эксперимента в ОГ 3 эффективность увеличения уровня билирубина по отношению к предыдущим значениям была средней для общего и высокой для прямого, а по отношению к исходным значениям повышение общего и прямого билирубина было высоким.
В результате сравнительного анализа содержания показателей липидного обмена были получены следующие данные (таблица 3.8).
Концентрация общего холестерина и триглицеридов была статистически значимо меньше (р 0,001) у животных из экспериментальных групп ОГ 2 и ОГ 3, чем в КГ 2. Причём на 20 сутки эксперимента изменения были выражены больше (в 1,6 и 2,2 раза соответственно), чем на 10 сутки (1,1 и 1,6 раз соответственно). Изменения содержания липопротеидов разной плотности у экспериментальных животных носили разнонаправленный характер. Уровень ЛПВП статистически значимо (р 0,001) повышался у крыс экспериментальной группы ОГ 2 в 1,2 раза, у крыс ОГ 3 в 1,5 раза по отношению к исходным данным. Уровень ЛПНП, наоборот, статистически значимо (р 0,001) был меньше у крыс ОГ 2 в 1,4 раза, у крыс ОГ 3 в 1,6 раза по отношению к исходным данным.
На 10 сутки эксперимента эффективность уменьшения содержания холестерина была незначительной, а триглицеридов – средней (рисунок 3.6).
На 20 сутки эффективность изменений увеличивалась до высокой по отношению к предыдущим значениям для обоих показателей, а по отношению к исходным она была средней для холестерина и высокой для триглицеридов. Эффективность изменений липопротеидов на 10 сутки была ниже среднего для ЛПВП и средней для ЛПНП, на 20 сутки по отношению к предыдущим значениям соотношение эффективности оставалось таким же, а к исходным значениям увеличивалась до значимо высокой для ЛПВП и высокой для ЛПНП.
Изменения показателей активности ферментов у крыс под воздействием прерывистой нормобарической гипоксии носили следующий характер.
Уровень активности аминотрансфераз у экспериментальных животных в группе ОГ 2 характеризовался небольшим уменьшением по отношению к исходному уровню. А на 20-й день эксперимента в группе ОГ 3 – наблюдалось небольшое увеличение активности ферментов АлАТ и АсАТ по отношению к промежуточным значениям (10 день). Выявленные колебания значений аминотрансфераз были статистически незначимыми (р0,05) (таблица 3.9).
Показатели активности гамма-глютамилтрансферазы статистически значимо (р 0,05) увеличивались как на 10-й день эксперимента, так и на 20-й по сравнению с исходными значениями.
Оценка эффективности изменения активности ферментов показала, что колебания значений для аминотрансфераз были незначительными (КК был меньше 0,2). А активность гамма-глютамилтрансферазы увеличивалась на 10-й день эксперимента с эффектом ниже среднего, по сравнению с исходными значениями, на 20-й день эффект увеличения активности данного фермента был ниже среднего по сравнению с 10-м днем, а с исходными значениями – большим (рисунок 3.7).
Морфофункциональные характеристики печени крыс при моделировании локальной лучевой терапии
Макроскопически печень у экспериментальных животных после моделирования лучевой терапии была увеличена – средние размеры: 7,1±0,6 х 6,0±0,5 х 2,5±0,4 см. Диафрагмальная и вентральная ее поверхности были крупнобугристы и имели диффузную пятнистость, грязно-серого цвета, капсула тусклая, замутнена. Наблюдалось неравномерное кровенаполнение с выраженной изогнутостью краёв (рисунок 3.18).
Таким образом, у всех животных, получавших курс МЛТ на область печени в течении 20-ти дней, наблюдались выраженные изменения макроскопической картины печени.
Гистологическое исследование паренхимы печени животных при моделировании лучевой терапии выявили признаки деструктивных изменений: перицеллюлярный отёк, полнокровие сосудов, выраженная вакуольная дистрофия гепатоцитов, мелкофокусные некрозы с образованием жиробелкового детрита, дискомплектация печёночных триад, неравномерное кровенаполнение (рисунок 3.19).
Наблюдалась гиперплазия купферовских клеток, обнаруживались некротические очаги, резко выраженная жировая дегенерация. В крупноядерных и в отдельных гепатоцитах с обычной величиной ядер выражены явления некробиоза. В паренхиме печени отмечались большие участки некроза. в г
Клетки с большими ядрами отсутствовали. Ткань печени не содержала клеток, встречались лишь их "тени". В гепатоцитах наблюдались выраженные изменения. Встречаются мелкие участки центрального некроза, которые следует рассматривать, как следствие нарушения гемодинамики. В печени были определены расширенные, полнокровные синусоидальные капилляры, вокруг которых, в отдельных случаях, выявлялись очаги диапедезных кровоизлияний с преимущественным наличием эритроцитов, сегментоядерных лейкоцитов и лимфоцитов. В просветах капилляров и мелких сосудов определялись эмболы без признаков воспаления в окружающей ткани.Морфометрическое исследование ткани печени, изъятой у животных экспериментальной группы ОГ 5 через 10 дней эксперимента (СОД = 21 Гр), позволило выявить следующие изменения структурно-функциональных показателей клеток паренхимы и стромы, микроциркуляторного русла печени. Количество капиляров (КСК) и гепатоцитов (ОКГ) на единице площади статистически значимо (р 0,01) снизилось. Количество дистрофически измененных гепатоцитов значимо (р=0,0001) увеличилось в 93 раза. Число двуядерных гепатоцитов и их отношение к общему количеству печеночных клеток статистически значимо (р=0,11 и р=0,31) не изменялось.
К 20 суткам эксперимента у крыс ОГ 6 исследуемые морфометрические показатели имели значительные статистически значимые изменения (р0,05) как по отношению к КГ 4, так и по отношению к 10 суткам эксперимента. Фиксировалось уменьшение по отношению к КГ 4 количества капиляров на 14%, гапатоцитов на 10,7%, двуядерных клеток на 74,4%, соответственно и их соотношение с обычными гепатоцитами (ЧДК/ОКГ) – на 75%. Количество дистрофически измененных гепатоцитов увеличилось в 172,3 раза по отношению к КГ 4.
Результаты морфометрического исследования срезов печени крыс ОГ 5 и ОГ 6 (моделирование ЛТ) приведены в таблице 3.16.
Таким образом, применение терапевтической дозы облучения (СОД 30 Гр за 10 фракций) вызывает различные морфологические нарушения гепатоцитов и других компонентов ткани печени, что было зарегистрировано с помощью как макроскопического, так и гистологического исследования.
Зарегистрированные изменения у животных этой группы (ОГ 6) были более выраженными, чем у крыс (ОГ 5) после применения толерантной для ткани печени дозы облучения (СОД = 21 Гр). Такие патологические изменения, как микронекрозы, стаз эритроцитов в синусоидах, выраженный склероз и вакуольная дистрофия гепатоцитов, дискомплектация печёночных триад, носят характер радиационно-индуцированного поражения органа. А выявленные гистоструктурные нарушения свидетельствуют о развитии необратимых изменений паренхимы печени.
Взаимосвязь показателей клеточного состава и биохимических показателей функции печени в крови крыс при сочетанном применении экспериментальных воздействий
Оценка взаимосвязи исследуемых параметров в опытных группах третьей серии эксперимента как на 10-й, так и на 20-й день показала, что конфигурация корреляций между ними носит другой характер, чем в предыдущих сериях.
На 10-й день эксперимента у животных в экспериментальной группе ОГ 8 наблюдалась позитивная связь триглицеридов с эритроцитами, с гемоглобином и отрицательная с лейкоцитами. Альбумины прямо коррелировали с гамма-глютамилтрансферазой и обратно с аспартатаминотрансферазой. Церулоплазмин имел позитивную связь с липопротеидами высокой плотности (рисунок 3.25).
На 20-й день эксперимента в группе ОГ 9 количество статистически значимых корреляций уменьшилось. Наблюдались прямые связи между форменными элементами. Лейкоциты коррелировали с эритроцитами и тромбоцитами, которые коррелировали между собой. Липопротеиды низкой плотности коррелировали прямо с аспартатаминотрансферазой и обратно с билирубином общим (рисунок 3.26). Рисунок 3.26 – Статистически значимые корреляции между клинико-лабораторными и биохимическими показателями у животных при сочетанном воздействии экспериментальных влияний (МЛТ+ПНГ) на 20-й день эксперимента (ОГ 9).
При сочетанном воздействии экспериментальных влияний на 10- сутки были выявлены корреляционные связи форменных элементов с триглицеридами, что может свидетельствовать о мобилизации кислородотранспортной и энергетической систем. А взаимосвязь ферментов (ГГТ и АсАТ) с альбумином характеризует мобилизацию транспортных процессов в гепатоцитах, на сохранность которых может указывать связь ЛПВП с ЦП. К 20-м суткам сохраняется корреляция между форменными элементами, а также между показателями липидного обмена (ЛПНП) с ферментами и общим билирубином. Полученные результаты указывают на то, что воздействие ПНГ на фоне МЛТ направленно на повышение кислородтранспортной функции крови, стабилизацию метаболических процессов, сохранение целостности гепатоцитов и их функции. Исходя из полученных результатов, мы предположили, что ПНГ оказывает радиопротекторное воздействие на организм крыс и к окончанию эксперимента показатели адаптации и функциональной активности печени возвращаются к исходным значениям. С целью проверки этого предположения мы провели кластерный анализ случаев. Учитывали все анализируемые показатели: лейкоциты, гемоглобин, эритроциты, тромбоциты, уровень общего белка, альбумина, церулоплазмина, общего и прямого билирубина, общего холестерина и триглицеридов, липопротеидов высокой плотности и низкой плотности, активность аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы, гамма-глютамилтрансферазы. Для построения иерархического дерева были выбраны метод Варда и Евклидово расстояние. Учитывая, что выбранный нами алгоритм «древовидной кластеризации» позволяет объединять объекты в группы по сходным характеристикам, мы ставили задачу классифицировать животных опытных и контрольной групп по результатам анализа выбранных параметров.
Вначале мы оценили сходство клинико-лабораторных показателей, полученных у интактных животных (КГ 1 – клеточный состав крови, КГ 2 – показатели биохимических реакций; животные имели нумерацию от 1 до15) и у животных опытных групп из каждой экспериментальной модели (ОГ 1 – нумерация животных от 16 до 30; ОГ 4 – от 31 до 45; ОГ 7 – от 46 до 60) до начала исследования (рисунок 3.27). Рисунок 3.27 – Диаграмма древовидной классификации экспериментальных животных контрольной и опытных групп по показателям клеточного состава и биохимических реакций периферической крови до начала эксперимента
В результате на полученной диаграмме древовидной классификации выделить кластеры нельзя, что свидетельствует об однородности отобранных для эксперимента животных.
Для решения задачи классификации экспериментальных животных после окончания исследования и выявления определенной структуры в ней мы построили диаграмму древовидной классификации, в которой учитывали и клеточный состав, и показатели биохимических реакций крови у крыс интактных (КГ 4 – нумерация животных от 1 до 15 ) и экспериментальных (ОГ 3 – от 16 до 30 ; ОГ 6 – от 31 до 45 ; ОГ 9 – от 46 до 60 ).
Применение данного метода позволило выделить среди анализируемых случаев три кластера (рисунок 3.28). Рисунок 3.28 – Диаграмма древовидной классификации экспериментальных животных контрольной (КГ 4) и опытных групп (ОГ 3; ОГ 6; ОГ 9) по показателям клеточного состава и биохимических реакций периферической крови по окончании воздействий на 20-е сутки эксперимента.
Евклидово расстояние между кластерами, вычисленное с помощью метода К-средних, составляло от 1,044 до 2,103 (таблица 3.22).
Подтверждение полученного распределения проверяли с помощью метода К-средних значений. Средние меры статистических параметров для каждого кластера (рисунок 3.29) демонстрируют различия анализируемых показателей в кластерах
Таким образом, результат классификации экспериментальных животных показывает, что животные ОГ 9, у которых лучевая терапия проводилась на фоне прерывистой нормобарической гипоксии, объединены в один кластер с интактными животными КГ 4.