Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 19
1.1.1 Функциональная анатомия, морфология костей скелета 19
1.1.2 Структурно-метаболическая характеристика костной ткани 21
1.1.2.1 Остеоид – органическая основа внеклеточного вещества костной ткани 21
1.1.2.2 Биоминерализация внеклеточного матрикса костной ткани 24
1.1.2.3 Молекулярные факторы регуляции костной ткани 27
1.1.2.4 Резидентные клетки костной ткани 30
1.2. Система ремоделирования костной ткани 34
1.2.1 Этапы ремоделирования 34
1.2.2 Клеточные и молекулярные компоненты, обеспечивающие резорбцию костной ткани 36
1.2.3. Модуляторы резорбции костной ткани 38
1.3 Взаимосвязь дифференцировки костной ткани и системы крови 44
1.4 Клинические синдромы при нарушениях ремоделирования костной ткани 51
1.5 Применение биосовместимых материалов в травматологии и ортопедии 63
1.5.1 Проблемы биоинтеграции искусственных материалов 63
1.5.2 Оценка влияния биосовместимых материалов на процессы ремоделирования костной ткани 70
Глава 2. Материал и методы исследования 84
2.1. Дизайн и методология исследования 84
2.2. Объект исследования 93
2.2.1 Дети и подростки, включенные в исследование дистантных маркеров ремоделирования костной ткани 93
2.2.2. Больные с несовершенным остеогенезом 99
2.2.3 Лабораторные животные 101
2.3. Материал исследования 101
2.3.1 Биологический материал 101
2.3.2 Культуры клеток in vitro 103
2.3.3 Характеристика модельных матриксов 105
2.4. Методы исследования 106
2.4.1. Скрининговый алгоритм клинической диагностики диспластического фенотипа подростков-спортсменов 106
2.4.2. Методы исследования in vitro 107
Определение содержания остеокальцина 107
Определение активности общей фракции кислой фосфатазы 108
Определение активности костной фракции щелочной фосфатазы 108
Определение активности общей и тартрат-резистентной форм кислой фосфатазы 108
Определение концентрации продуктов деградации коллагена I типа (С концевые телопептиды, Cross-laps) 109
Определение концентрации цитокинов 110
Определение концентраций ионов кальция, фосфора и калия 111
Иммуноцитохимическое определение экспрессии мембранных маркеров на прилипающих к пластику клетках 112
Иммуноцитохимические окрашивание прилипающих к пластику клеток на остеокальцин 112
Цитохимическая окраска прилипающих клеток на щелочную фосфатазу методом азосочетания по Beurstoun (1962) 113
Цитохимическая окраска прилипающих клеток на кислую фосфатазу методом азосочетания по A.Goldberg, T.Barka (1962) 113
Цитохимическая окраска прилипающих клеток на неспецифическую эстеразу по Леффлеру 113
Оценка экспрессии генов ССR5 и RANTES в мононуклеарах крови 113
Анализ частоты и спектра хромосомных аберраций 116
Проточная цитофлуорометрия погибших клеток и определение содержания активных форм кислорода 117
2.4.3. Костеобразование in situ 118
2.4.4. Компьютерная морфометрия видеоизображений клеток 119
2.4.5. Статистическая обработка результатов 120
Глава 3. Результаты собственных исследований 121
3.1. Характеристика дистантных маркеров метаболизма костной ткани в периферической крови у детей с различными типами её ремоделирования 121
3.2. Корреляции показателей метаболизма костной ткани и уровня цитокинов, модулирующих воспаление и ремоделирование кости в норме и при патологии 132
3.3. Характеристика дистантных маркеров метаболизма костной ткани в периферической крови у детей и подростков в условиях физической нагрузки 139
3.4. Характеристика дистантных маркеров метаболизма костной ткани периферической крови у пациентов с несовершенным остеогенезом 142
3.5. Морфофункциональный статус фетальных мезенхимных стволовых клеток, выделенных из легких человека, при краткосрочном in vitro культивировании в двумерной (2D) или трехмерной (3D) культуре 145
3.6. Цитологическая характеристика мононуклеарных лейкоцитов периферической крови в норме и при патологии 155
3.7. Морфофункциональный статус мононуклеарных лейкоцитов, выделенных из периферической крови здоровых доноров, в краткосрочной 2D- или 3D-культуре in vitro 157
3.8. Морфофункциональный статус мононуклеарных лейкоцитов периферической крови у пациентов с дисплазией соединительной ткани в краткосрочной 2D- или 3D-культуре in vitro 163
3.9. Молекулярные маркеры метаболизма костной ткани в супернатантах краткосрочной культуры мононуклеарных лейкоцитов крови подростков-спортсменов 172
3.10. Реакция костного мозга лабораторных животных на 3D-матриксы, имитирующие свойства минерального вещества регенерирующей костной ткани 177
3.10.1 Жизнеспособность миелокариоцитов в краткосрочной 2D- или 3D-культуре in vitro 177
3.10.2 Остеогенная активность 3D-матриксов, имитирующих свойства минерального вещества регенерирующей костной ткани, в тесте эктопического костеобразования 178
Глава 4. Обсуждение 181
Заключение 220
Выводы 231
Практические рекомендации 233
Список сокращений 234
Список литературы 236
- Модуляторы резорбции костной ткани
- Дети и подростки, включенные в исследование дистантных маркеров ремоделирования костной ткани
- Характеристика дистантных маркеров метаболизма костной ткани в периферической крови у детей с различными типами её ремоделирования
- Молекулярные маркеры метаболизма костной ткани в супернатантах краткосрочной культуры мононуклеарных лейкоцитов крови подростков-спортсменов
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Негативная динамика заболеваемости опорно-двигательного аппарата среди взрослого населения РФ (по данным Федеральной службы статистики РФ, прирост за период с 2009 г. по 2013 г. на 5%) делает актуальным изучение механизмов их развития и разработку новых патогенетически обоснованных методов их диагностики, прогнозирования и профилактики. Важно подчеркнуть также, что по официальным данным, распространенность патологии опорно-двигательного аппарата у детей и подростков за этот период увеличилась на 42 % (Федеральная служба государственной статистики Российской Федерации (дата обращения 07.05.2016)), что диктует необходимость оценки возрастных аспектов морфо-функционального статуса костной ткани в норме и при патологии. Современные исследования патологических изменений костной ткани посвящены, в основном, клинико-инструментальному изучению снижения минеральной плотности костной ткани (остеопенический синдром). Установлено, что 24% населения России (34 миллиона человек) входят в группу повышенного риска развития остеопороза, 14 миллионов человек (10% населения страны) уже страдают этим заболеванием (Лесняк О.М., 2011). Именно остеопенические изменения связывают с высоким риском возникновения низкоэнергетических переломов, повышающих, в свою очередь, вероятность развития инвалидности (ВОЗ (WHO), 2007).
В основе регенерации костной ткани при заболеваниях и повреждениях опорно-двигательного аппарата лежат несколько фундаментальных процессов, обусловливающих их исход: 1) репаративное ремоделирование при травмах (Риггз Б. Л., Мелтон Л. Д., 2000; Brian J. et al., 2011; Li Shan et al., 2011; Bala Y., Farlay D., Boivin G., 2012; Nikodem A., cigaa K., 2012; Strm O. et al., 2012; Свешников А.А., 2013); 2) патологическое ремоделирование при нарушении клеточно-молекулярных механизмов, обеспечивающих морфофункциональный гомеостаз костной ткани (остеопороз, дисплазия соединительной ткани (несовершенный остеогенез) и т.д.) (Sfeir Ch. et al., 2005; Берченко Г.Н., 2011; Feng X., McDonald J.M.,2011; Marsell R.,Einhorn T.A., 2011; Kini U., Nandeesh B.N., 2012; Pobel Ye.A. et al., 2013).; 3) воспаление как типовой патологический процесс (Черешнев В.А., Гусев Е.Ю., 2012).
В большинстве клинических случаев снижение минеральной плотности костной ткани обусловлено превалированием активности процессов остеорезорбции над остеогенезом под влиянием предрасполагающих факторов, таких как образ жизни, диета, гормональный фон, внекостная хроническая патология. На их долю приходится около 60% всех случаев снижения минеральной плотности костной ткани, преимущественно среди взрослого населения (Swartz L. et al., 2013). В то же время доказано, что функциональная полноценность костной ткани взрослого человека связана с пиком минеральной плотности (peak bone mass), достигающим 90% уровня к 18-летнему возрасту (Berger C., 2010). В связи с этим не вызывает сомнений актуальность изучения
клеточных и молекулярных факторов, влияющих на накопление костной массы в период роста и в последующем участвующих в поддержании костной массы в зрелом возрасте, в том числе при травмах и хронической патологии. Данные о распространенности дисплазии соединительной ткани (ДСТ), связанной с наследственными или врожденными дефектами органической матрицы опорных тканей, отрывочны и противоречивы. Тем не менее, недифференцированные формы ДСТ диагностируются в 57-94 % случаев по нарушениям скелета (Нестеренко З.В., 2010; Goremykin I.V. et al., 2012; Goremykin I.V. et al., 2013; Volovar O.S., 2013), приводящим к тяжелой инвалидизации детей и взрослых.
С другой стороны, необходимость изучения процессов ремоделирования костной
ткани продиктована высоким уровнем травматизма, который на протяжении последних 5
лет характеризуется ростом от 1 % (для всего населения) до 10% (для возрастной группы
15-17 лет), увеличением тяжести повреждений опорно-двигательного аппарата с
преобладанием случаев многооскольчатых и фрагментарных переломов длинных костей
(Федеральная служба государственной статистики Российской Федерации
(дата обращения 07.05.2016); Халиман Е.А., Виноградов В.Г., 2008). Результаты хирургического восстановления дефектов костной ткани в большей степени зависят от протекания процесса репаративного остеогенеза, который, в свою очередь, имеет прямую зависимость не только от объема травмы, но и от исходного состояния системы ремоделирования костной ткани (Тихилов Р.М., Беленький И.Г., Кутянов Д.И., 2012). При этом в решении вопроса выбора имплантата в травматологии и ортопедии предпочтение отдается биосовместимым материалам с заданными и контролируемыми характеристиками, способными симулировать пространственную архитектонику и физиологическую активность костной ткани (Oryan A. et al., 2014). Однако исход лечения (остеоинтеграция или отторжение имплантата) до сих пор остается мало прогнозируемым, так как зависит от соотношения репаративных/патологических реакций на границе раздела имплантат/клетка (ткань) (Ratner B.D. et al., 2013).
Оценка функциональной активности костной ткани in vitro по показателям периферической крови является распространенным методологическим подходом, как в клинической практике, так и в научных исследованиях. Биохимические маркеры костеобразования и резорбции дают клинически полезную информацию, отражающую динамику физиологических и патологических процессов, связанных с деятельностью клеток костной ткани (Demers L.M. 1997; Seibel M.J., 2005). Однако вариабельность молекулярных маркеров периферической крови может быть связана с направленностью регенеративных процессов в кости (Дружинина Т.В., 2010) и отражать активность нейроэндокринной системы (Camozzi V. et al., 2007). Как следствие, актуальным становится поиск новых фундаментальных подходов, лежащих в основе диагностики, прогностики и коррекции повреждений и заболеваний костной ткани, вариантов реабилитации, ускорения процессов репарации и безопасности исходов регенерации.
Степень разработанности темы. В настоящее время считается доказанным наличие в периферической крови человека пула стромальных клеток-предшественниц (Chesney J. et al., 1997; 1998), количество которых увеличивается при иммуноселекции, хронических заболеваниях человека, а также при использовании методик, способствующих их выходу из костного мозга (Aerts F., Wagemaker G., 2006; Wang X., Li B., 2007; Moore K.L., Persaud T.V.N., Torchia M.G., 2011). В некотором отношении этот факт предполагает миграцию предшественников остеобластов к сайтам активного ремоделирования костной ткани (Enghbali-Fatourechi G.Z., et al., 2005) в том случае, если их природные “ниши” в системе кость/костный мозг разрушены патологическим процессом (остеопороз, несовершенный остеогенез и т.п.).
Тем не менее, изучение механизмов остеогенеза in vitro проводится, как правило, на культурах разобщенных клеток (в том числе, стволовых), лишенных своего естественного трехмерного микроокружения. Как показывают работы последних лет (Kolf C.M. et al., 2007; Ugarte F., Forsberga E.C., 2013; Calvi L.M., Daniel C., 2014; Pal B., Das B., 2017), в подобных условиях преобладают молекулярные процессы, связанные с пролиферацией клеток, а не c их дифференцировкой. Как следствие, полученные данные в существенной степени искажают реальную динамику регенераторных процессов, протекающих in vivo.
Регуляция процессов воспаления и регенерации со стороны системы крови, проявляющаяся в модулирующем влиянии ее клеточных и гуморальных компонентов на структурно-функциональный статус клеток костной ткани и ее межклеточного вещества, а также наличие циркулирующего пула предшественников остеогенных клеток в кровеносном русле позволяют провести in vitro оценку процессов, протекающих в многоклеточной системе мононуклеарных лейкоцитов крови здорового человека и травматолого-ортопедических больных при контакте с искусственными материалами (3D-матриксами), моделирующими свойства минерального вещества регенерирующей костной ткани.
Цель исследования: выявить новые закономерности физиологического и патологического ремоделирования костной ткани на основе лабораторного исследования клеточных и молекулярных реакций крови.
Задачи исследования:
-
Изучить молекулярные маркеры ремоделирования костной ткани (остеокальцин, CrossLaps, изоферменты щелочной и кислой фосфатаз, кальций, фосфор) и воспаления (цитокины) в периферической крови в условиях физиологического, репаративного и патологического ремоделирования костной ткани.
-
Исследовать в стандартной (двумерной) и трехмерной (в присутствии 3D-матриксов) культуре in vitro морфофункциональный и метаболический статус мононуклеарных лейкоцитов крови, участвующих в процессах физиологического и патологического ремоделирования костной ткани.
-
Выявить молекулярно-клеточные реакции крови как патогенетические факторы и предикторы направленности ремоделирования костной ткани при клинически недифференцированных (у подростков-спортсменов, сколиоз) и дифференцированных (несовершенный остеогенез) формах дисплазии соединительной ткани.
-
Разработать подходы к персонализированной оценке осложнений дисплазии соединительной ткани с использованием клеток крови и 3D-матриксов, имитирующих свойства минерального вещества регенерирующей костной ткани.
Научная новизна исследования. Впервые в сравнительном аспекте получены комплексные знания о механизмах клеточных и молекулярных реакций крови в условиях физиологического, репаративного и патологического ремоделирования костной ткани человека. Оригинальным представляется применение в качестве раздражителя морфофункциональной реакции клеток крови в условиях нормы и патологии костной ткани модельных имплантатов для остеосинтеза (3D-матриксов), имитирующих свойства минерального вещества регенерирующей костной ткани. Абсолютную новизну представляют данные о защитном (антимутагенном) влиянии 3D-матриксов в виде снижения выхода аберраций в культуре мононуклеарных лейкоцитов, выделенных из крови пациентов с ДСТ и НО. Безусловный приоритет имеют результаты, свидетельствующие о присутствии в культуре мононуклеарных лейкоцитов крови при патологическом паттерне костного ремоделирования клеток с фибробластоподобным, остеобластоподобным или остеокластоподобным потенциалом. При этом добавление 3D-матриксов стимулирует in vitro морфофункциональную трансформацию лейкоцитов крови в остеобластоподобные (при минимальных признаках дисплазии (4-6 баллов по диагностической шкале), несовершенный остеогенез) и остеокластоподобные формы (при выраженной симптоматике дисплазии с суммой баллов 7 по диагностической шкале).
Установлено, что известные молекулярные показатели костного ремоделирования в периферической крови подростков 7-18 лет (остеокальцин, продукты деградации коллагена I типа (CrossLaps), изоферменты щелочной и кислой фосфатаз, кальций, фосфор), системно не занимающихся спортом, не являются надежными (с точки зрения дифференциальной диагностики) лабораторными маркерами физиологической (здоровые добровольцы), репаративной (посттравматический период) или патологической (сколиоз) регенерации костной ткани. Обосновано, что только при недифференцированной (у спортсменов-подростков 11-14 лет) и дифференцированной (несовершенный остеогенез, НО) формах дисплазии соединительной ткани (ДСТ) количественные изменения в крови продуктов деградации коллагена I типа (CrossLaps) имеют значение для анализа молекулярных механизмов нарушений ремоделирования костной ткани.
На основе изменений в крови концентраций CrossLaps и остеокальцина сформулирована гипотеза и обосновано принципиально новое ранжирование подростков-спортсменов 11-14 лет с фенотипическими проявлениями недифференцированной дисплазии соединительной ткани (НДСТ) на 2 группы: без выраженных проявлений
(сумма баллов анкетной клинической оценки менее 7) и с явными (сумма баллов 7) признаками НДСТ.
Теоретическая и практическая значимость. Выявленные закономерности клеточных и молекулярных реакций в периферической крови здоровых добровольцев и пациентов травматолого-ортопедического профиля позволяют обосновать новое прикладное направление в персонифицированной лабораторной диагностике патологии костной ткани с использованием трехмерных культур мононуклеарных лейкоцитов. Методологический подход на основе 3D-матриксов (модельных имплантатов для остеосинтеза), имитирующих свойства минерального вещества регенерирующей костной ткани, позволяет моделировать in vitro реакции остеогенеза/остеолиза, что имеет значение для оценки патогенетических основ клинической симптоматики при НДСТ, прогнозирования исходов патогенетически оправданного применения погружных конструкций при хирургическом лечении патологических переломов у пациентов с несовершенным остеогенезом.
По результатам исследования оформлены ноу-хау (секрет производства) “Способ
выявления в периферической крови клеток со стромальным фенотипом” (приказ №43 от
20.02.2014 по ГБОУ ВПО СибГМУ МЗ РФ; авторы - Хлусов И.А., Дворниченко М.В.,
Больбасов Е.Н., Саприна Т.В., Сизикова А.Е.), «Способ диагностики дисплазии
соединительной ткани у детей и подростков с учетом физической нагрузки» (приказ №40 от 15.08.2017 по ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России; авторы - Сизикова А.Е., Дворниченко М.В., Хлусов И.А., Саприна Т.В., Пашкова Е.Н.)
Методология и методы исследования. В структуре поэтапного исследования применялись подходы доказательной и персонифицированной медицины. Проведен скрининг периферической крови 355 человек с оценкой дистантных показателей метаболизма костной ткани (активность общей фракции щелочной фосфатазы (ОЩФ) и ее костного изофермента (КЩФ), общей фракции и тартрат-резистетной изоформы кислой фосфатазы (ОКФ и ТРКФ), концентрация остеокальцина и продуктов деградации коллагена 1 типа - CrossLaps), показатели кальций-фосфорного обмена (концентрация общего и ионизированного кальция (Ca), неорганического фосфора (P)), цитокинов (концентрация IL-1, 4, 6, 10, INF-, TNF).
Изучаемые показатели у обследуемыех детей и подростков 7-18 лет группировались по типу костного ремоделирования: физиологическому (здоровые дети и подростки), репаративному (дети и подростки в посттравматическом периоде через 1-1,5 года после перенесенной травмы длинных трубчатых костей), патологическому (дети и подростки с диагностированным сколиозом). Полученные данные были проанализированы с учетом возрастных и гендерных характеристик.
Фенотип (анкетный метод, клинический осмотр) подростков-учащихся спортивных школ (11-14 лет) и состояние крови (маркеры костного ремоделирования) изучали на предмет проявлений НДСТ в условиях постоянной физической нагрузки, у больных
несовершенным остеогенезом – как состояние клинически дифференцированной ДСТ с наличием костных осложнений в виде патологических переломов.
В экспериментальной части исследования, в том числе на лабораторных животных,
были протестированы 3D-матриксы, имитирующие свойства минерального вещества
регенерирующей костной ткани, как клеточные раздражители и, с другой стороны,
модельные имплантаты для остеосинтеза. Цитологические и гистологические
характеристики 3D-матриксов были исследованы in vivo и in vitro методом эктопического
костеобразования при их подкожной имплантации, методом краткосрочного
сокультивирования с мезенхимными стволовыми клетками человека (оценка остеогенных свойств), при помощи цитотоксического теста (изменение внутриклеточной концентрации активных форм кислорода и жизнеспособности миелокариоцитов лабораторных крыс; оценка жизнеспособности мононуклеарных лейкоцитов крови человека).
Краткосрочное культивирование мононуклеарных лейкоцитов периферической крови здоровых добровольцев, подростков-спортсменов с признаками НДСТ и больных с НО применяли в стандартном двумерном (2D) варианте (на пластиковой поверхности культуральной посуды) и в 3D-культуре в присутствии матриксов с разновидностями кальцийфосфатного покрытия. Сравнительный анализ изменений в 2D- и 3D-культурах проводили на основе персонализированной оценки морфофункционального состояния мононуклеарных лейкоцитов крови человека.
Морфофункциональную реакцию клеток крови определяли с использованием принципов компьютерной морфометрии (морфологические индексы прилипающих к пластику клеток), на основе биохимических (концентрация общего и ионизированного Ca, неорганического P, активности ОЩФ и ОКФ, содержание остеокальцина и CrossLaps, концентрации IL-1b, 2, 4, 6, TNF и IFN в межклеточной жидкости культуры), иммуноцитохимических (уровень экспрессии клеточными элементами CD34, CD44 и остеокальцина) и цитохимических исследований (щелочная и кислая фосфатазы, неспецифическая эстераза).
В условиях физиологического и патологического ремоделирования костной ткани исследовали частоту и спектр хромосомных аберраций в тесте спонтанного и индуцированного (в присутствии 3D-матриксов) мутагенеза, а также уровень экспрессии генов хемокинов (ССR5 и RANTES) мононуклеарными лейкоцитами.
Результаты проведенного исследования подвергали статистической обработке. Исследование проводилось на базах: ОГАУЗ Детская больница №1 (г. Томск), детское отделение Филиала ТНИИКиФ ФГБУ СибФНКЦ ФМБА России (г. Томск), Томский филиал ФГБУ «РНЦ «ВТО» им. акад. Г.А. Илизарова» Минздравсоцразвития России (г. Томск), ОГАУЗ Врачебно-физкультурный диспансер (г. Томск), кафедра морфологии и общей патологии (ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России, г. Томск), НОЦ «Биосовместимые материалы и биоинженерия» (при ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России, ФГАОУ ВО НИ ТПУ, ФГБУН ИФПМ СО РАН, г. Томск).
Положения, выносимые на защиту:
-
В периферической крови детей и подростков 7-18 лет, не занимавшихся спортом, отсутствуют выраженные различия молекулярных маркеров физиологического, репаративного и патологического ремоделирования костной ткани (концентрации остеокальцина, продуктов деградации коллагена I типа (CrossLaps), кальция, фосфора, активности изоферментов щелочной и кислой фосфатаз) и воспаления (концентрация цитокинов).
-
Фенотипически выраженная недифференцированная форма дисплазии соединительной ткани (НДСТ) сопровождается снижением в крови подростков-спортсменов 11-14 лет концентраций ионизированного кальция, а также продуктов деградации коллагена I типа (CrossLaps), коррелирующим с уменьшением содержания остеокальцина, что предполагает уменьшение активности костного ремоделирования.
-
При дифференцированной форме дисплазии соединительной ткани (несовершенный остеогенез) увеличение тяжести заболевания ассоциировано с линейным изменением в периферической крови показателей ремоделирования (повышением концентрации продуктов деградации коллагена I типа (CrossLaps) и напротив, снижением концентрации остеокальцина), что свидетельствует о выраженном функциональном дисбалансе клеточных механизмов ремоделирования костной ткани.
-
3D-матриксы, имитирующие свойства минерального вещества регенерирующей костной ткани, являются остеогенными раздражителями; стимулируют in vitro секрецию цитокинов и морфофункциональную трансформацию мононуклеарных лейкоцитов в клетки с остеобластоподобной (НДСТ, несовершенный остеогенез) и остеокластоподобной (выраженная НДСТ) активностью; снижают выход одиночных и парных разрывов хромосом, повышают экспрессию генов хемокинов в мононуклеарах крови при патологическом ремоделировании костной ткани.
-
Оценка клеточно-молекулярных реакций остеогенеза/остеолиза, в том числе, в культуре мононуклеарных клеток крови на контакт с 3D-матриксами, перспективна для разработки персонифицированной оценки тяжести НДСТ, прогнозирования исходов применения имплантатов для остеосинтеза при хирургическом лечении пациентов с несовершенным остеогенезом.
Степень достоверности и апробация результатов. Высокая степень достоверности
полученных результатов подтверждается выполнением работы на достаточном
экспериментальном и клиническом материале (358 обследованных, 26
экспериментальных животных, 11762 проб) с использованием современных и высокотехнологичных молекулярно-биологических методов исследований. Полученные результаты статистически обработаны с помощью современных методов доказательной медицины. Результаты проведенного исследования докладывались и обсуждались на ХХІІth IFMBE Proceedings World Congress on Medical Physics and Biomedical Engineering (г. Мюнхен, Германия, 2009), Российском конгрессе ASAMI (г. Курган, 2009), IV
Всероссийском симпозиуме с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (г. Санкт-Петербург, 2010), IХth Baltic- Bulgarian Conference on Bionics and prosthetics Biomechanics and mechanics mechatronics and robotics (г. Рига, Латвия, 2013), Russian-German Workshop “Biocompatible Materials and Coatings: Fundamental Problems & Trends, Biomedical Applications” (г. Томск, 2013), X Международной научно-практической конференции «Наука и технологии: шаг в будущее - 2014» (г. Прага, Чехия, 2014), III Всероссийской научной интернет-конференции с международным участием «Медицина в XXI веке: тенденции и перспективы» (г. Казань, 2014), X Юбилейном Всероссийском съезде травматологов-ортопедов (г. Москва, 2014), конгрессе «Здравоохранение России. Технологии опережающего развития» (г. Томск, 2015), ХIII конгрессе Международной ассоциации морфологов (г. Петрозаводск, 2016), Международной научно-практической конференции «Илизаровские чтения» (г. Курган, 2017).
Исследование поддержано грантами в рамках проектов Федеральных целевых
программ: «Работы по проведению проблемно-ориентированных поисковых
исследований и созданию научно-технического задела в области живых систем с участием
научных организаций Японии» (ГК № 02.512.11.2285 от 10.03.2009), «Разработка научно-
методических основ создания биокомпозитов «наноструктурный метал - наноструктурное
покрытие» на основе титана, циркония, ниобия и их сплавов, фосфатов кальция или
оксинитридов титана для медицинских имплантатов нового поколения в приложении к
регенеративной и сердечно-сосудистой хирургии» (Соглашение №8036 от 12.07.2012),
РФФИ 2009-2011 «Экспериментальное исследование и решение фундаментального
вопроса о существовании ниши для остеогенной дифференцировки стромальных
стволовых, ее количественных параметрах и топографии» (№ 09-04-00287а), Фонда
содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере («Разработка
персонализированной тест-системы патологии соединительной ткани (ПСТ-
диагностикум)» (договоры №5072ГУ1/2014 от 26.12.2014, №10490ГУ2/2015 от 26.08.16, «Разработка методов индивидуальной диагностики биосовместимости дентальных имплантантов» договор №11808ГУ/2017 от 03.06.2017).
Основные положения и выводы диссертационной работы используются в учебном процессе кафедры морфологии и общей патологии (разделы «Гистология», «Патология минерального обмена»); в программе скрининга патологии соединительной ткани у детей и подростков, учащихся спортивных школ на базе ОГАУЗ Врачебно-физкультурного диспансера (г. Томск).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 33 работы, из них 21 статья – в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Российской Федерации, 3 – цитируемых в Web of Science, 4 – цитируемых в Scopus.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 285 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав, выводов и списка цитируемой
литературы, включающего 585 источников – 99 отечественных и 486 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 26 рисунками и 54 таблицами.
Личный вклад автора. Автором проведены планирование и разработка дизайна
исследования, сформулированы его цель и задачи, выполнен анализ отечественной и
зарубежной литературы, отражающей современное состояние исследований по данной
проблеме, определен методологический подход, позволяющий наиболее полно решить
поставленные в исследовании задачи, самостоятельно выполнен весь комплекс
запланированных методов, проведена статистическая обработка данных,
интерпретированы и опубликованы основные результаты.
Модуляторы резорбции костной ткани
Процесс резорбции костной ткани происходит одновременно во многих местах скелета. Это указывает на то, что контроль осуществляется локально (с помощью аутокринных и/или паракринных механизмов) и, с другой стороны, находится под дистантным контролем. Факторы, регулирующие и контролирующие эти процессы, можно разделить на следующие группы (Department of Health and Human Services, 2004; Ruimerman R, 2005; Kini U., Nandeesh B.N., 2014):
Генетические факторы
Локальные факторы костной ткани и системы крови
Гормональные факторы
Факторы кровоснабжения и иннервации.
Минеральная плотность костной ткани является интегральным показателем полноценности процесса ремоделирования.
При этом регуляция 60-80% костной массы детерминирована генетическими факторами, что доказано популяционными отличиями (Clarke B. L. et al, 2008; Kumar D. A., 2014; Taddei F., Anburajan M., 2014) В молекулярно-клеточных взаимодействиях системы ремоделирования выявлены функциональные ассоциации между повреждением структуры ДНК и TGF-- и BMP-факторами дифференцировки остеобластов. Повреждения ДНК активируют сигнальные каскады (фосфатидилинозитол-3-киназный системы выявлены Atm (Ataxia Telangiectasia Mutated)) и Atr (Ataxia Telangiectasia and Rad3-related)), которые негативно влияют на BMP-опосредованную дифференцировку остеобластов (Rasheed N. et al., 2006; Wang X. et al, 2006; Wang X., Li B., 2007).
Кроме этого, в настоящее время ведется активный поиск генетических детерминант не только патологических состояний, но динамики возрастных особенностей изменения минеральной плотности костной массы (Duncan E. L., Brown M. A., 2008; Hastings V. M., 2009).
Группа локальных регуляторов костной ткани и системы крови включает ростовые и цитокиновые факторы, хемокины, ионы (Kini U., 2012). Следует отметить, что компоненты системы локальной регуляции ремоделирования костной ткани, процессов дифференцировки и активации основных клеточных эффекторов тесно взаимодействуют не только между собой, но и чувствительны к действию гормональных факторов. Так, прорезорбтивный эффект TGF может реализовываться не только через непосредственно презентируемые на остеокластах и их прекурсорах TGF-рецепторы, но и через остеобласты, регулируя экспрессию других локальных факторов. При этом малые концентрации вещества стимулируют остеокластогенез за счет комплекса M-CSF/RANKL, высокие дозы TGF, напротив, оказывают стимулирующее действие на остеобластный дифферон (Tang S. Y., Alliston T., 2013).
Костные морфогенетические белки (BMP) определяют дифференцировку и активность, в основном, остеобластного дифферона (Chen D.I., Zhao M., Mundy G.R., 2004; McCullough K.A. et al, 2007). Однако, концепция «костной муфты» предполагает, что полноценность вновь синтезированной костной ткани в процессе ремоделирования определяется «коэффициентом сцепления» - уровнем активности остеокластов (Parfitt, A. M., 1982; 2004; Mundy G. R. , 1993; 2006; Martin T.J., Rodan GA. , 2001; Martin T.J., Sims N. A., 2004). Активные формы остеокластов способны экспрессировать BMP-2, 4, 6, 7, которые оказывают «вербующее» действие на остеобласты для синтетической фазы ремоделирования (Friedman M. S., Long M. W., Hankenson K.D., 2006; Wutzl A. et al, 2006; Garimella R et al, 2008).
Остеокластный дифферон является наиболее цитокинчувствительной системой костной ткани в силу гемопоэтического происхождения. Анализ влияния цитокинов на резорбцию костной ткани предлагается в рамках их классификации на остеокластогенные и анти-остеокластогенные.
Фактор некроза опухоли альфа (TNF-) является одним из остеокластогенных факторов в условиях in vivo и in vitro. Он регулирует количество резорбционных предшественников костного мозга за счет увеличения экспрессии рецептора для M-CSF (Kitaura H. et al, 2013). Выявлено также ингибирующее действие TNF- на дифференцировку остеобластов и синтез коллагена посредством активации проапоптотических Fas-Fas лиганд (FasL) сигналов (Walsh M.C. et al, 2006; Takayanagi H., 2007; Lee S.H., 2008). IL-1 способен стимулировать синтез RANKL в остеобластах, чем опосредовано продлевает активность остеокластов (Lorenzo J., Horowitz M., Choi Y., 2008). Присутствие сигнального фактора NF-B повышает взаимодействие преостеокластов с компонентами внеклеточного матрикса (сиалопротеина и остеопонтина), что, в свою очередь, стимулирует собственную секрецию IL-1 остеокластами, активирует аутокринный механизм дифференцировки в остеокласты (McHugh K.P., 2007; Yao Z. et al, 2008; Yao Z., Xing L., Boyce B.F. 2009).
IL-6 - цитокин, синергичный по действию TNF- и IL-1, стимулирует синтез RANKL остеобластами, что, в свою очередь, формирует пул активных остеокластов (McCoy E.M. et al., 2013). Основной эффект IL-6 проявляется в регулировании дифференцировки клеток-предшественниц в зрелые остеокласты. IL-6 также непосредственно стимулирует синтез как RANKL, так и OPG (O Brien C.A. et al., 2005; Singh A. et al., 2012). Кроме этого, IL-6,потенциируя резорбтивную активность, влияет на адгезивные характеристики остеобластов в резорбционной лакуне (Zupan J., Jeras M., Marc J., 2013).
Ряд интерлейкинов (IL-8, IL-11, IL-15) способны опосредовано усиливать действие перечисленных выше прорезорбтивных факторов через экспрессию RANKL-системы (Bendre M.S. et al, 2003). В то же время, экспрессия соответствующих рецепторов к IL-8, IL-11 на преостеокластах предполагает возможность RANKL-независимой индукции их дифференцировки (Bendre M.S. et al, 2003; Yamada A. et al., 2007; Yao Z. et al, 2008).
Цитокины IL-4 и IL-13 имеют тесно связанные рецепторные комплексы, презентируемые на клетках остеокластноного дифферона. IL-4 обладает более высокой антиостеокластной активностью, способен блокировать транскрипционные факторы ранних этапов остеокластогенеза (NFATc-сигнальные пути), а также актиновой основы подосомы активированного остеокласта (Yao Z. et al, 2008). Антиостеокластогенный эффект IL-10 формируется путем подавления индуцированных RANKL сигнальных путей NFATc1, снижения активности кальций/кальмодулин-зависимой протеинкиназы, что создает конкуренцию с TNF- и IL-1 (Grigoriadis A.E., 1994; Min K.H. et al., 2009; Zhao B., Ivashkiv L.B., 2011). IFN- и IFN- проявляют свой антиостеокластный эффект в блокировании сигнального пути RANK-RANKL дифференцировки на прекурсорах (Gao Y. et al., 2007; Badii K. K., 2009; Ji J.D. et al., 2009; Zhao B., Ivashkiv L. B., 2011).
Простагландин Е2, как аутокринный медиатор (хемокин), косвенно активизирует остеокластогенез за счет увеличения соотношения RANKL-OPG в остеобластном комплексе и стимулирует сигнальные пути дифференцировки прекурсоров остеокластов из гемопоэтических предшественников (Roux S., 1997; Penido M.G., Alon U.S., 2012).
Ионы кальция (Ca2+), наряду с фундаментальной ролью в системе ремоделирования костной ткани, являются важными модуляторами и эффекторами многих физиологических функций, включая сокращение мышц, ферментативные реакции, стабилизацию мембранных потенциалов, свертывание крови. В организме взрослого человека содержится около 1-2 кг кальция, 99% которого приходится на формирование минерализованного матрикса костей и зубов, около 1% - на внутриклеточный компонент и менее чем 0,1% приходится на внеклеточный пул.
Среди других неорганических веществ важную гомеостатическую и структуроопределяющую роль костной ткани играют соединения фосфора (кристаллы гидроксиапатита и аморфный фосфат кальция внеклеточного матрикса). Именно резервные концентрации фосфора и кальция находятся под гормональным контролем (паратиреоидный гормон (ПТГ), кальцитриол (активная форма витамина D3) и кальцитонин) (Kearns A.E., Khosla S., Kostenuik P.J., 2008).
На системном уровне снижение уровня ионизированного кальция (Са2+) в плазме крови стимулирует секрецию паратиреоидного гормона (ПТГ; parathyroid hormone, PTH). При этом прорезорбтивное действие ПТГ стимулируют быстрые и кратковременные изменения концентрации кальция. В физиологических условиях ПТГ инициирует новые межклеточные кооперации костной ткани, стимулируя дифференцировку остеокластов из циркулирующих гемопоэтических предшественников. Этот эффект опосредуется RANKL-цитокинассоциированным сигнальным путем. Проостеокластный эффект ПТГ также усиливается его способностью подавлять синтез OPG (O Brien C. A., 2010; Lou Y. R. et al., 2010).
Гипокальциемия стимулирует синтез эндогенных активных форм метаболитов витамина D (таких, как 25-гидроксивитамина D3 ((25(ОН)D3)) и 1,25-дигидроксивитамина D3 (кальцитриол (1,25(OH)2D3)). Эти два фактора действуют синергично в регуляции пролиферации и дифференцировки клеток костной ткани (van Driel M. et al., 2006; Fukumoto S., 2014). Механизм индукции остеокластогенеза метаболитами витамина D связан с регуляцией транскрипционной RANKL-системы, ассоциированной с рецептором витамина D3 остеобластов (vitamin D receptor (VDR)). В свою очередь, синтез 1,25(OH)2D3 зависит от уровня ПТГ (Anderson P.H. et al., 2003; Naot D., Cornish J., 2008).
Дети и подростки, включенные в исследование дистантных маркеров ремоделирования костной ткани
При оценке дистантных маркеров метаболизма костной ткани, кальций-фосфорного обмена, цитокинов-модуляторов ее ремоделирования в периферической крови было обследовано 325 детей и подростков в возрасте от 7 до 18 лет (182 девочки и 143 мальчика). Все обследованные (их законные представители) были проинформированы по особенностям проводимых манипуляций согласно этическим требованиям (Хельсинкская декларация Всемирной Медицинской Ассоциации, 2013). Исследования выполняли с согласия локального этического комитета Сибирского государственного медицинского университета (заключение № 1646 от 25.10.2010). Половозрастная характеристика групп представлена в таблице 7.
Из числа обследованных выделено 173 человека, составивших группы нефизиологического ремоделирования костной ткани, 82 из которых имели переломы в анамнезе, а у 91 человека был диагностирован сколиоз. Контрольную группу составили 152 ребенка с нормальными показателями физического развития и минеральной плотности костной ткани. По Международной классификации (Квинн В., 2000), средний возраст для всех обследуемых групп наблюдения характеризовался как подростковый (юношеский) (Квинн. В., 2000; Малкина – Пых И.Г., 2005).
Обследование детей и подростков проводилось на базах: ОГАУЗ Детская больница №1 (г. Томск) (в рамках выполнения кандидатских диссертаций Е.Г. Гаприндашвили (2010 г.)), детское отделение Филиала ТНИИКиФ ФГБУ СибФНКЦ ФМБА России (г. Томск), Томский филиал ФГБУ «РНЦ «ВТО» им. акад. Г.А. Илизарова» Минздравсоцразвития России (г. Томск). При этом в качестве клинико-инструментальных методов были проведены следующие исследования: клинический осмотр, оценка минеральной плотности костной ткани по данным ультразвуковой денситометрии.
В группе детей с переломами длинных трубчатых костей верхних и нижних конечностей в анамнезе давность травматического случая составила в среднем 1,50±0,01 лет. Распределение обследованных в зависимости от вида травм в данной группе наблюдения представлено в таблице 8.
Сколиоз - одна из сложных проблем в теории и практике детской патологии. Данные литературы о распространенности сколиоза противоречивы. В заболеваниях опорно-двигательного аппарата детей развитие сколиоза может принимать конкретные формы самостоятельной болезни. Наиболее частыми в биомеханическом плане являются сколиозы на фоне дисплазии соединительной ткани, которые по данным (Кадурина Т. И., 2000) составляют до 94% этиологически ясных сколиозов. Основным морфологическим изменением в позвонках при дисплазии, как свидетельствуют клинические наблюдения F.Rathke (1958), И.А.Мовшовича (1963), А.М. Зайдман (1980), И.И.Кона (1981), Mansour S. et al. (1995), Giampietro P.F. et al. (2003), Duarte R.M., Vaccaro A.R., (2013), является точечная локализация патологического процесса в области эпифизарных пластинок позвонков (эпифизеолиз), за счет которых происходит рост позвоночника в длину. Исследования В.М.Яковлева и соавт. (1994) показывают, что чем выше диагностический коэффициент дисплазии, тем тяжелее течение сколиоза (Яковлев В. М. и соавт., 1994; Нечаева Г.И., Викторова И.А., 2007).
Верификация сколиоза проводилась по стандартной процедуре визуальной оценки состояния позвоночника, в том числе с использованием рентгенологического метода исследования (Сердюковская Г.Н., 1993; Баранова А.А., 2006; Черная Н.Л., 2011). При проведении клинического осмотра детей и подростков с диагностированным сколиозом обращалось особое внимание на наличие симптомокомплекса дисплазии соединительной ткани и прежде всего на внешние признаки дисплазии соединительной ткани с преимущественным поражением костной ткани (Российское кардиологическое общество, 2013):
1. Килевидная деформация грудной клетки
2. Воронкообразная деформация грудной клетки
3. Долихостеномелия (диагностируется при измерении длины сегментов туловища)
4. Арахнодактилия
5. Сколиотическая деформация позвоночника или спондилолистез
6. Кифоз и/или кифосколиоз
7. Ограничение выпрямления локтя до 170о и менее
8. Протрузия вертлюжной впадины любой степени
9. Высокое «арковидное» небо
10. Деформации черепа (лицевые дизморфии):
– долихоцефалия;
– энофтальм;
– антимонголоидный разрез глаз;
– гипоплазия скуловых костей;
– ретрогнатия.
11. Нарушение роста и скученность зубов
12. Прямая спина
При клиническом осмотре детей и подростков с диагностированным сколиозом была проведена бальная оценка синдрома гипермобильности суставов. Выявлено, что средняя сумма баллов по шкале Бейтона (1988) у детей с диагностированным сколиозом составляла 5,20±0,12, что соответствует выраженной степени гипермобильности суставов (Beighton R., 1988; Beighton R., Crahame R., Bird H., 1990).
Критерии включения в контрольную группу:
1. Подписание добровольного согласия.
2. Показатели физического развития от 25 до 75 центиля по росту и весу.
3. Соответствие показателей полового развития шкалам по Таннеру.
4. Отсутствие хронической патологии и болезней, сопровождающихся нарушением физического развития.
Критерии исключения:
1. Дети с показателями физического развития менее 25 и более 75 центиля по росту, дети с гипотрофией.
2. Дети, получавшие терапию кортикостероидами более 3-х месяцев.
3. Дети с синдромом мальабсорбции.
4. Дети с заболеваниями крови.
5. Дети с заболеваниями почек.
6. Дети с эндокринологическими заболеваниями (ожирение, патология щитовидной железы, сахарный диабет 1 типа).
7. Дети, длительно принимающие противосудорожную терапию.
8. Наличие глистных инвазий.
9. Дети с дисфункцией билиарного тракта.
10. Дети, имеющие в анамнезе переломы костей.
11. Дети со сколиозом, плоскостопием.
Критериями включения в группу «Дети и подростки в посттравматическом периоде» служили:
1. Наличие переломов крупных трубчатых и мелких губчатых костей в период 1-1,5 года до проведения исследования.
2. Подписание информированного согласия.
Критерии исключения:
1. Дети, получавшие терапию кортикостероидами более 3-х месяцев.
2. Дети с целиакией.
3. Дети с заболеваниями крови
4. Дети с эндокринологическими заболеваниями (ожирение, патология щитовидной железы, сахарный диабет 1 типа).
5. Дети, длительно принимающие противосудорожную терапию.
Характеристика дистантных маркеров метаболизма костной ткани в периферической крови у детей с различными типами её ремоделирования
При клинических исследованиях костной ткани в качестве неинвазивных или малоинвазивных маркеров состояния минерального матрикса кости, функциональной активности остеобластов и остеокластов широко используются инструментальные методы (денситометрия, сцинтиграфия и т.п.), а также дистантные лабораторные параметры, характеризующие формирование и/или резорбцию костной ткани (остеокальцин, костная фракция щелочной фосфатазы, тартрат-резистентная изоформа кислой фосфатазы, Cross-Laps и др.). Для понимания механизмов дисбаланса гомеостаза костной ткани при различных нозологических формах патологии опорно-двигательного аппарата необходимо учитывать метаболическую активность клеток-эффекторов. Кроме того, оценка в периферической крови содержания цитокинов, участвующих в регуляции ремоделирования костной ткани, и концентрации кальция и фосфора, как основных компонентов минерального вещества костной ткани и минерального обмена организма, позволяет получить важную информацию о межклеточной кооперации при ремоделировании костной ткани.
В таблице 11 представлена сравнительная оценка дистантных маркеров метаболизма костной ткани, показатели кальций-фосфорного обмена и цитокинового профиля у детей и подростков в группах физиологического, репаративного и патологического ремоделирования костной ткани.
С одной стороны, отмечалось повышение показателей крови, связанных с формированием костной ткани. Так, активность ОЩФ и КЩФ в сыворотке крови превышала (более чем в 1,3 раза) соответствующие показатели у детей контрольной группы. Уровень противовоспалительного цитокина интерферона-гамма (INF-) возрастал до 692 % (в посттравматическом периоде) и 397 % (при диагностированном сколиозе) от контроля. С другой стороны, активность ОКФ составляла 118% в посттравматическом периоде и и 75 % при диагностированном сколиозе от показателей у здоровых детей и подростков. Следует отметить также, что у группы детей и подростков, перенесших переломы костей, отмечалась повышенная активность ТРКФ -на 70 % от контроля (табл. 11).
Концентрация провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, участвующих в процессах резорбции/образовании кости, у обследованных (в посттравматическом периоде и при диагностированном сколиозе) в группах наблюдения либо не отличалась (TNF-, IL-10), либо оказалась сниженной по сравнению с соответствующими контрольными значениями (IL-1b; 34-53 %). Существенное снижение было зарегистрировано для уровня IL-4 (19-25 % от контроля) (табл.11). По-видимому, дистантные гуморальные механизмы локального микроокружения, участвующего в ремоделировании костной ткани, не имеют принципиального значения у детей и подростков с репаративной (переломы костей) и патологической (сколиоз) формами регенерации.
Морфологические особенности костной ткани тесно связаны с половым диморфизмом и возрастным фактором, что, в свою очередь, обусловливает специфичность процессов адаптации организма к внешним воздействиям, в том числе, к повреждающим факторам. В связи с этим, в настоящей работе был проведен анализ показателей гомеостаза костной ткани в периферической крови в зависимости от возраста и пола обследованных детей и подростков. В таблицах 12-14 представлены возрастные изменения показателей ремоделирования костной ткани в сравниваемых группах детей и подростков.
Анализ дистантных маркеров ремоделирования кости в контрольной группе (здоровые дети и подростки) показал (табл.12), что у обследованных в возрасте 7-10 и 11-14 лет изученные показатели статистически не различались.
Напротив, к 15-18-летнему возрасту метаболические показатели остеогенеза (ОЩФ, КЩФ) и остеолизиса (ОКФ) статистически значимо снижались в сравнении с соответствующими показателями у детей более ранних возрастных периодов. Цитокиновый профиль практически не менялся, за исключением INF-, концентрация которого у 15-18-летних подростков в 10 раз превышала таковую у детей в возрасте 7-10 лет (табл.12).
Полученные данные отражают, по всей видимости, возрастное уменьшение физиологической активности процессов ремоделирования костной ткани у здоровых детей и подростков.
У детей и подростков в группе репаративного (посттравматический период после переломов костей) ремоделирования костной ткани в возрасте 11-14 лет в 1,6 раза увеличивались концентрация остеокальцина и активность ОЩФ, а активность КЩФ у обследованных этой группы превышала таковую у детей 7-10 лет (табл.13).
При патологическом ремоделировании в период пубертата (11-14 лет) концентрация остеокальцина оказалась в 2 раза ниже по сравнению с таковой в группе детей в возрасте 7-10 лет (табл. 14).
В свою очередь, у подростков старшей возрастной группы (15-18 лет) с переломами или сколиозом, судя по дистантным маркерам в периферической крови, значительно снижалась активность процессов ремоделирования костной ткани, по сравнению с таковой в более ранние возрастные периоды (табл. 13,14). У детей и подростков, перенесших переломы костей, уменьшалась активность ОЩФ и КЩФ в 1,6 и 1,7 раза соответственно, а также концентрация Cross-Laps - в 2,3 раза, тогда как у подростков с диагностированным сколиозом снижалась концентрация остеокальцина и активность ОЩФ - в 5,5 и 1,6 раза соответственно. Цитокиновый профиль у 15-18-летних пациентов в подростковый период характеризовался низким уровнем IL-1b-33-40 % от индекса у детей в младших возрастных группах.
Представленные данные в группах репаративного и патологического ремоделирования соответствуют динамике возрастного уменьшения лабораторных показателей остеогенеза при физиологической регенерации. В то же время, отсутствие характерного для здоровых добровольцев параллельного снижения индексов, отражающих активность резорбции, предполагает дисбаланс в механизмах ремоделирования кости в сторону относительного преобладания процессов разрушения костной ткани в старшей возрастной группе при переломах и сколиозе (табл.12-14).
В таблице 15 представлена основные возрастные особенности анализируемых дистантных показателей ремоделирования костной ткани у детей и подростков, в посттравматическом периоде и с диагностированным сколиозом.
В возрастном периоде 7-10 лет как репаративная, так и патологическая регенерация костей сопровождалась повышением в крови активности щелочной фосфатазы. Так, в случае перенесенного перелома повышалась активность костной фракции - на 21% от контроля. При наличии сколиоза увеличивалась активность общей фракции щелочной фосфатазы -на 87% (по сравнению с таковой здоровых детей и подростков) (табл.15).
У 11-14-летних обследованных пациентов 7 изучаемых показателей статистически значимо отличались от таковых в контроле (табл.15). Два дистантных маркера костеобразования оказались выше контрольных значений (ОЩФ, КЩФ) как при репаративном (на 86 и 50 % соответственно), так и при патологическом ремоделировании (на 66 и 40%). В посттравматическом периоде также было характерно увеличение активности ТРКФ (на 35%), при этом в случае наличия сколиоза активность ОКФ уменьшалась на 50% от значений, характерных для группы здоровых детей и подростков. Изменение концентраций цитокинов в группах посттравматического и патологического ремоделирования характеризовалось схожей тенденцией: уменьшалась концентрация IL-1b на 67 и 53% от контроля соответственно) и IL-4 (на 81 и 75%), увеличивался уровень INF- -на 88% и 78% от контроля.
Концентрация IL-4 у обследованных в возрасте 15-18 лет оказалась сниженной на 64 % в группе подростков, имевших в анамнезе переломы костей, и на 59% у пациентов с диагностированным сколиозом (табл.15). Обращало на себя внимание также, что активность ТРКФ у обследованных в группе посттравматического ремоделирования на 60% превышала таковую у здоровых лиц. У подростков же с диагностированным сколиозом в 2 раза увеличивалась активность КЩФ (на 54%) и снижалась концентрация остеокальцина (на 55%) в сравнении с данными контрольной группы.
Молекулярные маркеры метаболизма костной ткани в супернатантах краткосрочной культуры мононуклеарных лейкоцитов крови подростков-спортсменов
Выявление фундаментальных закономерностей клеточных и молекулярных реакций крови как потенциальных маркеров нарушений и предикторов течения ремоделирования костной ткани при клинически недиференцированных формах дисплазии соединительной ткани является научной проблемой. С одной стороны, отсутствие ярких клинических симптомов требует введения шкальной оценки тяжести заболевания. С другой стороны, отсутствие диагностически значимых молекулярных показателей заболевания в крови требует поиска новых параклинических подходов.
Определенные возможности может дать сравнительное культивирование клеток в 2D-системе (на пластиковой поверхности культуральной посуды) и в 3D-системе (при добавлении модельного диска, имитирующего минеральный матрикс кости).
В связи с этим, была проведена оценка метаболической активности мононуклеаров крови вне зависимости от клинического ранжирования подростков-спортсменов по клинической картине недифференцированной дисплазии соединительной ткани. Результаты, полученные в 2D- и 3D-культуре клеток, оценивали относительно биохимического состава полной культуральной среды (табл. 45). Полная культуральная среда содержит остеокальцин, кальций (общий и ионизированный), фосфор, калий, ОЩФ и ОКФ, что связано с добавлением сыворотки крови эмбрионов коров.
При краткосрочном культивировании мононуклеаров крови подростков-спортсменов в 2D-системе было отмечено снижение, в сравнении с полной культуральной средой, следующих показателей в составе кондиционных жидкостей: концентраций остеокальцина (р=0,03), общего кальция (р=0,005), калия (р=0,01), фосфора (р=0,005) и активности ОКФ (р=0,048). В условиях сокультивирования с модельным диском, имитирующим трехмерный минеральный матрикс кости, в составе супернатантов дополнительно статистически значимо уменьшалось значение рН по сравнению с полной культуральной средой.
С другой стороны, были выявлены статистически значимые различия в составе кондиционной среды между 2D- и 3D-культурами клеток. При этом для 3D-культуры было зарегистрировано снижение концентрации общего и ионизированного кальция, увеличение активности ОКФ по сравнению с аналогичными показателями в 2D-культуре. В разрезе обсуждения причинно-следственных связей полученных результатов, уменьшение содержания кальция могло быть причиной уменьшения рН в 3D-системе (табл. 45), что, в свою очередь, сопровождалось повышением активности ОКФ.
В таблицах 46 и 47 представлены сравнительные данные краткосрочного культивирования мононуклеаров крови в 2D- (табл. 46) и 3D-системе (табл. 47) в зависимости от степени клинических проявлений диспластических изменений.
Анализ состава кондиционных сред с учетом различной степени проявления диспластического фенотипа не выявил значимых отличий в условиях 2D- или 3D-культивирования мононуклеаров крови. Для подростков-спортсменов (табл. 48), у которых отсутствовали выраженные клинические проявления диспластического фенотипа (сумма баллов 4-6), в кондиционной жидкости обнаружено обусловленное 3D-матриксом статистически значимое снижение содержания общего (на 5,7 %) и ионизированного кальция (на 12 %), значений рН (с 8,09до 8,04), а также увеличение активности ОКФ (на 50 %) и ОЩФ (на 2,9 %). У обследованных подростков-спортсменов с диспластическим фенотипом (сумма баллов клинической оценки 7) были установлены во многом аналогичные изменения (табл. 49). В то же время, активность ОЩФ не возрастала, в отличие от активности ОКФ и содержания калия.
В связи с этим, только сравнительный анализ 2D- и 3D-культур внутри групп, разделенных по клиническим проявлениям диспластического фенотипа, позволил получить интересные результаты (табл. 48, 49).
С помощью специфических моноклональных антител был проведен анализ на наличие специфических остеогенных маркеров (остеокальцин) в мононуклеарной фракции лейкоцитов, прилипающих к пластику. До этапа культивирования in vitro OCN-позитивные клетки не обнаруживались. После краткосрочного (3-е суток) культивирования мононуклеаров периферической крови, как в 2D-, так и 3D-системе, среди прилипающих к пластику клеток были зарегистрированы единичные клетки, позитивно окрашивающиеся на остеокальцин (рис. 18).
Таким образом, у подростков-спортсменов с признаками дисплазии соединительной ткани in vitro выявляются клетки крови, положительно окрашивающиеся на остеокальцин. При этом, в случае слабо выраженных клинических проявлений ДСТ (в диапазоне 4-6 баллов), добавление 3D-матрикса к культуре мононуклеарных лейкоцитов способствует проявлению метаболических признаков остеобластоподобных клеток (рост активности щелочной фосфатазы, снижение концентрации кальция в межклеточной жидкости культуры). Мононуклеары крови подростков-спортсменов с выраженной ДСТ (сумма баллов клинической оценки 7) реагируют на 3D-раздражитель усилением как остеобластоподобной (уменьшение уровня кальция в межклеточной жидкости культуры), так и остеокластоподобной функции (рост активности кислой фосфатазы).
Оценка проведена по изменению внутриклеточной концентрации активных форм кислорода (АФК) и процента погибших путем апоптоза и/или некроза клеток на пластике и в присутствии 3D-матрикса (табл.50).
Методом проточной цитофлуорометрии с применением нескольких внутриклеточных красителей (аннексин, пропидия йодид) в 9-суточной 2D-культуре миелокариоцитов, выделенных из костного мозга бедренной кости крыс, было обнаружено присутствие более 32 % клеток, несущих признаки различных форм клеточной гибели.