Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. Современное представление о влиянии изменений в системе гемостаза на механизм регуляции гемопоэза 12
1.1. Основные принципы регуляции гемопоэза .12
1.2. Роль паренхиматозных органов в кроветворении в норме и при патологических процессах
1.3. Патофизиологическое состояние гемопоэза при беременности в системе мать – плацента – плод 23
1.4. Компенсаторно-приспособительные механизмы системы гемостаза в период физиологической беременности .32
Глава 2. Материалы и методы исследования .37
2.1. Общие принципы постановки эксперимента 37
2.2. Экспериментальное моделирование условий повышенной кровоточивости и свертываемости крови 39
2.3. Лабораторные методы исследования .41
2.4. Статистические методы исследования 49
Глава 3. Реакция системы гемопоэза лабораторных животных при физиологически протекающей беременности и на моделях нарушения свертываемости крови
3.1. Исследование взаимозависимости показателей периферической крови, миелограммы и регуляторов эритроцитарно-тромбоцитарного ростков гемопоэза у самок крыс при физиологически протекающей беременности в день родов 53
3.2. Определение состояния гемопоэза у самок крыс при беременности на модели повышенной кровоточивости 60
3.3. Изучение влияния экспериментально смоделированного состояния повышенной свертываемости крови на реакцию красного костного мозга у беременных крыс в день родов 68
3.4. Оценка изменений в цитологической картине тканей печени и селезенки самок крыс в норме и при нарушениях в системе гемостаза во время беременности 75
Заключение 84
Выводы 95
Практические рекомендации .96
Перспективы дальнейшей разработки темы 97
Список сокращений 98
Список литературы
- Патофизиологическое состояние гемопоэза при беременности в системе мать – плацента – плод
- Экспериментальное моделирование условий повышенной кровоточивости и свертываемости крови
- Определение состояния гемопоэза у самок крыс при беременности на модели повышенной кровоточивости
- Оценка изменений в цитологической картине тканей печени и селезенки самок крыс в норме и при нарушениях в системе гемостаза во время беременности
Введение к работе
Актуальность исследования. Многочисленными исследованиями
установлено, что беременность всегда протекает с явлениями физиологической гиперкоагуляции, а в III триместре она становится необходимым атрибутом долговременной адаптации системы гемостаза (Макацария А. Д. и соавт., 2001; Белоусова Т. В. и соавт., 2014; Вереина Н. К., 2012).
Кровь – одна из важнейших тканей организма, выполняющая важные для обеспечения гомеостаза функции. Известно, что постоянство клеточного состава крови обеспечивается активностью регулируемого цитокинами костномозгового кроветворения, обеспечивающего непрерывное обновление. Нарушения баланса в системе крови и, в частности в системе гемостаза, возникающие при разных патологических состояниях или физиологических ситуациях, или приводят к кровоизлияниям, или угрожают тромбозами (Воробьев А. И., 2015).
Известно, что микротромбообразование и нарушение микроциркуляции у беременных могут приводить к развитию акушерских осложнений. Дефекты имплантации зародыша, нарушения плацентации и фетоплацентарного кровообращения могут быть причинами репродуктивной недостаточности, такими как невынашивание и бесплодие (Сидельникова В. М. и соавт., 2004). Нарушения в системе гемостаза во время беременности и родов изменяет гемодинамические реакции как матери, так и плода. При этом значительно увеличивается риск антенатальной гибели плода; по данным В. М. Сидельниковой (2005), показатель перинатальной смертности детей, рожденных от матерей с тромбогеморрагическими осложнениями беременности и родов, повышается в 15 раз, а доля тромбофилии в структуре причин синдрома потери плода составляет от 40 до 70 %.
Исследование костного мозга позволяет оценить влияние хронических и острых патологических процессов, а также внешнесредовых факторов на интенсивность гемопоэза (Козинец Г. И., 2002). Тромбогеморрагические осложнения беременности характеризуются изменением морфофункционального состояния клеток периферической крови и всей системы гемопоэза. Отсутствие в доступной литературе описания механизма регуляции гемопоэза при различных нарушениях гемостаза при беременности делает исследование актуальным.
Степень разработанности темы исследования. Данные научной
литературы косвенно указывают на важную роль интенсивности гемопоэза в
обеспечении многих компенсаторно-приспособительных механизмов,
развивающихся в организме женщины в период беременности и родов.
Особенную значимость активность синтеза регуляторных факторов гемопоэза
приобретает при развитии нарушений в системе гемостаза беременных (Абдулаева
Н. А., 2011; Гаврилов О. К. и соавт., 1985; Голберг Е. Д. и соавт., 2000). Однако в
известной нам научной литературе вопрос о клеточном составе костного мозга у
беременных не изучался. Вероятно, определенные трудности составляет то, что
взятие стернальной пункции у беременных женщин не корректно. Правомерность
использования крыс в эксперименте обусловлена наиболее близкой
гемохориальной плацентацией данных грызунов к плацентации человека.
В связи с вышеуказанным создание экспериментальных моделей нарушения свертываемости крови у беременных самок крыс с последующим исследованием показателей гемопоэза в интранатальном периоде делает настоящее исследование актуальным.
Цель исследования – изучение механизмов изменения активности гемопоэза у экспериментальных животных при физиологически протекающей беременности и на моделях нарушения свертываемости крови.
Задачи исследования:
1. Исследовать взаимозависимость показателей периферической крови,
миелограммы и регуляторов эритроцитарно-тромбоцитарного ростков гемопоэза
у самок крыс при физиологически протекающей беременности в день родов.
2. Установить состояние гемопоэза у самок крыс при беременности на
модели повышенной кровоточивости.
3. Изучить влияние повышенной свертываемости крови на реакцию
красного костного мозга у беременных крыс в день родов.
4. Оценить изменения в цитологической картине тканей печени и селезенке
самок крыс в норме и при нарушениях в системе гемостаза во время
беременности.
Научная новизна исследования
Установлены изменения гемопоэза у крыс при физиологически протекающей беременности и на моделях нарушения свертываемости крови в интранатальный период. При физиологической беременности выявлена компенсаторно-приспособительная активность гемопоэза, характеризующаяся увеличением всех ростков красного костного мозга, что связанно с готовностью организма к физиологической кровопотере в родах. При повышенной кровоточивости во время беременности происходит снижение количества форменных элементов в периферической крови, что приводит к компенсаторной
активации красного костного мозга за счет усиления синтеза эритропоэтина и тромбопоэтина. При повышенной свертываемости крови отмечается увеличение содержания форменных элементов, вследствие этого снижается синтез эритропоэтина и тромбопоэтина, что приводит к угнетению процессов кроветворения в красном костном мозге.
Впервые установлено, что при развитии состояния повышенной
кровоточивости в период беременности в тканях паренхиматозных органов
визуализируется полнокровие, диапедезные кровоизлияние, отмечается
гидропическая и баллонная дистрофия, некроз клеток и очаги
экстрамедуллярного кроветворения.
Автором установлено, что в тканях печени и селезенки лабораторных
животных в условиях экспериментально смоделированного состояния
повышенной свертываемости крови преобладают процессы усиленного микротромбообразования, застойные явления, участки инфаркта тканей.
Теоретическая и практическая значимость
Разработаны экспериментальные модели нарушения свертываемости крови в системе гемостаза для оценки изменения гемопоэза у беременных крыс линии Вистар в интранатальном периоде.
При экспериментальном моделировании нарушений в системе гемостаза у беременных лабораторных животных продемонстрирована компенсаторная активность красного костного мозга, что может лечь в основу создания системы профилактических мероприятий, проводимых женскими консультациями, родильными домами и перинатальными центрами по снижению смертности от тромбоза или кровотечения в родах и послеродовом периоде.
Методология и методы исследования. Методологической основой данной
работы является системное исследование методов научного познания. В работе
использованы экспериментальные, коагулологические, биохимические,
гематологические, гистологические и статистические методы исследования. Исследования соответствуют правилам и принципам доказательной медицины. Все эксперименты над животными были проведены в соответствии с требованиями Приказа МЗ РФ №267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики», требованиями Приказа МЗ СССР № 742 от 13.11.84 г. «Об утверждении правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» и № 48 от 23.01.85 г. «О контроле за проведением работ с использованием экспериментальных животных».
Положения, выносимые на защиту
1. В интранатальный период при физиологически протекающей
беременности у экспериментальных животных активизируется система гемопоэза,
что проявляется повышением количества эритроцитов, тромбоцитов и лейкоцитов
в периферическом кровотоке, усилением эритроцитарно-тромбоцитарного ростка
и компенсаторным снижением клеточных регуляторов костномозгового
кроветворения эритропоэтина и тромбопоэтина для поддержания баланса в
системе гемопоэза.
2. При повышенной кровоточивости во время беременности происходит
снижение количества форменных элементов в периферической крови, что
приводит к компенсаторной активации красного костного мозга, регулируемой
усилением синтеза эритропоэтина и тромбопоэтина.
-
При повышенной свертываемости крови во время беременности у лабораторных животных отмечается увеличение содержания форменных элементов, вследствие этого снижается синтез регуляторов кроветворения, что приводит к угнетению процессов кроветворения в красном костном мозге.
-
На моделях нарушений в системе гемостаза и при беременности паренхиматозные органы претерпевают ряд существенных патогистологических изменений. При повышенной кровоточивости наблюдаются полнокровие и очаги экстрамедуллярного кроветворения, а при состоянии повышенной свертываемости – некроз клетки и микротромбообразование.
Степень достоверности и апробация результатов
Достоверность результатов проведенной работы определяется объемом выполненных исследований, наличием групп сравнения, использованием современных методов анализа с контрольными материалами и проведением внутрилабораторного контроля качества лабораторных исследований, а также статистической обработкой полученных данных.
Основные положения диссертационной работы представлены на следующих
конференциях: Первая международная научно-практическая конференция
«Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в
физиологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2010); Международная научно-
практическая конференция «Высокие технологии, фундаментальные и
прикладные исследования в физиологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2011);
Ежегодная научная конференция студентов и аспирантов базовых кафедр
Южного научного центра РАН (Ростов-на-Дону, 2011, 2012); XIX итоговая
научная конференция студентов с международным участием (Ставрополь, 2011);
Региональная научно-методическая конференция «Университетская наука – региону» (Ставрополь, 2010, 2011, 2012, 2015, 2016); Региональная научно-практическая конференция «Инновационные идеи молодежи Северного Кавказа развитию экономики в России» (Ставрополь, 2012), а также на XI Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке: научные прикладные концепции здоровья и здорового образа жизни» (Москва, 2010);
Результаты работы были отмечены грамотой на выставке-конкурсе «Инновации года-2011» в Торгово-промышленной палате города Ставрополя, также работа была признана победителем в Университетском конкурсе молодежных инновационных проектов Ставропольского Государственного Университета 28.10.2011 г.
Материалы работы представлены в рекомендуемых ведущих
рецензируемых научных журналах, включенных Высшей аттестационной комиссией России в список изданий, рекомендуемых для опубликования основных научных результатов диссертаций на соискание ученой степени кандидата и доктора наук, а также включенных в глобальный индекс цитирования Scopus (Ставрополь 2013, 2014, 2015). Результаты исследования использованы при написании 1 монографии.
Внедрение результатов исследования в практику. Результаты
исследования были внедрены в работу кафедры медицинской биохимии,
клинической лабораторной диагностики и фармации ФГАОУ ВО «Северо
Кавказского федерального университета» (зав. каф. д-р мед. наук, проф. Т. П.
Бондарь), кафедры патологической физиологии ФГБОУ ВО «Ставропольского
государственного медицинского университета» Минздрава России (зав. каф. д-р
мед. наук, проф. Е. В. Щетинин). Также результаты работы используются в
практическом здравоохранении, внедрены в деятельность клинико-
диагностической лаборатории ГБУЗ СК «Ставропольской городской клинической больницы скорой медицинской помощи» (главный врач д-р мед. наук А. Б. Минаев).
Публикации результатов исследования
По материалам диссертационного исследования опубликовано 16 печатных работ, из них 3 – в журналах, включенных в Перечень рецензируемых научных изданий, не входящих в международные реферативные базы данных и системы цитирования, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук; 2 статьи – в журналах, включенных в
размещенный на сайте ВАК список «Информация об изданиях, входящих в международные реферативные базы данных и системы цитирования»; и в соавторстве с А. Ю. Муратовой, Т. П. Бондарь – 1 глава «Изменение состояния тромбоцитарного гемостаза в условиях экспериментальной гиперкоагуляции» в монографии «Тромбофилии беременных» (Ставрополь, 2016).
Личный вклад автора. Совместно с автором была сформулирована основная идея и разработаны экспериментальные модели нарушения свертываемости крови у беременных самок крыс для оценки активности гемопоэза (85 %). Так же автором был проведен анализ современной литературы для изучения реакции костного мозга при физиологически протекающей беременности на экспериментальных моделях нарушения свертываемости крови (100 %). Самостоятельно были созданы условия содержания лабораторных животных в виварии, а также произведен забор биологического материала (90 %). Автор принимал непосредственное участие в проведении оценки состояния гемостаза, клеточного состава крови и костного мозга и цитологических исследований (65 %). Совместно были разработаны протоколы исследования. На основании проведенных исследований нами сделаны достоверные, обоснованные выводы (88 %). Авторский вклад в выполнение работы и написание научных работ по теме диссертации – 95 %.
Объём и структура работы. Диссертация изложена на 118 страницах машинописного текста, который включает 14 таблиц и 23 рисунка. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав, отражающих результаты собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, списка литературы, содержащего 105 отечественных и 71 иностранных источников.
Диссертация выполнена на кафедре медицинской биохимии, клинической
лабораторной диагностики и фармации (зав. кафедрой д-р мед. наук, проф. Т. П.
Бондарь) ФГАОУ ВО «Северо-Кавказского федерального университета» и
соответствует паспорту специальности п. 2 «Изучение общих патогенетических
механизмов развития заболеваний, типовых патологических процессов и реакций
организма на воздействие патогенного фактора, в том числе механизмов
формирования патологических систем и нарушений информационного процесса,
обуславливающих развитие заболеваний», п. 6 «Изучение состояния реактивности
организма, т. н. комплекса его видовых, половых, возрастных,
конституциональных и индивидуальных особенностей, определяющих характер его реагирования на раздражители».
Патофизиологическое состояние гемопоэза при беременности в системе мать – плацента – плод
Начиная со стадии коммутированных клеток костного мозга, в регуляции гемопоэза доминируют длиннодистантные механизмы, обеспечиваемые различными цитокинами, системой «кейлоны – антикейлоны», гормонами (Гюльназарова С. В. и соавт., 2011).
Установлено, что вслед за классом ППСК возникает образование мультипотентной полустволовой клетки, или клетки – предшественницы лимфопоэза, под влиянием фактора стволовой клетки (ФСК), ИЛ-1, ИЛ-6. Параллельно происходит образование из ППСК мультипотентной полустволовой клетки – предшественницы миелопоэза под влиянием ряда цитокинов: ФСК, ИЛ-1, ИЛ-3, ИЛ-6, КСФ-Г (Lansdorp P. M., 2008).
Известно, что клетки III класса – короткоживущие, интенсивно пролиферирующие, идентифицируемые клетки. Регуляторами их пролиферации и дифференцировки являются цитокины и «специфические» гемопоэтины. Для лимфоидного ряда – это про-Т- и про-В-лимфоциты, а для миелоидного ряда – это колониеобразующие клетки (КОЕ) эозинофильного и базофильного рядов (КОЕ-Эо, КОЕ-Б), нейтрофильного ряда (КОЕ-Г), моноцитарного ряда (КОЕ-М), а также эритроцитарного (КОЕ-Э) и мегака-риоцитарного (КОЕ-Мег) рядов (Arber C. et al., 2011).
Последним этапом пролиферации являются клетки IV класса – бласты – морфологически и гистохимически распознаваемые элементы (миелобласты, лимфобласты, монобласты, эритробласты). V класс дифференцировки включает созревающие клеточные элементы (для миелоидного ряда это промиелоцит, миелоцит, метамиелоцит, палочкоядерные лейкоциты; для лимфоидного ряда – пре- и про-В- и Т-лимфоциты, проплазмоциты; для эритроцитарного ряда – пронормоцит, базофильный, полихроматофильный, оксифильный нормоцит, ретикулоцит. VI класс включает в себя зрелые клетки костного мозга и периферической крови (Кассирский И. А. и соавт., 1970). В системе регуляции гемопоэза необходимо отметить по крайней мере два его варианта: конститутивный и индуцированный гемопоэз. Конститутивный гемопоэз регулируется цитокинами и межклеточным взаимодействием и осуществляется в особых зонах скопления стволовых клеток. Часть стволовых клеток, медленно размножаясь, мигрирует в другие зоны костного мозга, где и дифференцируется (Воробьев Л. С. и соавт., 2009).
Индуцированный гемопоэз возможен при нарушениях гомеостаза вследствие различных стрессорных воздействиий (гипоксия, интоксикация, ионизирующая радиация) и регулируется в основном КСФ-Г, ИЛ-1, ФСК. Важнейшими стимуляторами пролиферации и дифференцировки клеток гранулоцитарного и моноцитарного рядов оказываются КСФ. Последние являются пептидами, продуцируемыми у человека моноцитарно макрофагальными клетками крови различных тканей, в частности костного мозга, а также лимфоцитами, эндотелиальными клетками, фибробластами, тучными клетками на фоне антигенной стимуляции (Черешнев В. А. и соавт., 2009).
Более подробно изучены мульти-КСФ, гранулоцитарно-макрофагальный КСФ (КСФ-ГМ), макрофагальный КСФ (КСФ-М), гранулоцитарный КСФ (КСФ-Г). Активация лейкопоэза возникает под влиянием провоспалительных цитокинов: ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, – а также под влиянием ряда медиаторов воспаления, в частности лейкотриенов В4, С4, а также ФСК, вырабатываемого клетками микроокружения стволовых клеток (Lansdorp P. M., 2008).
Неспециализированными стимуляторами гранулоцитарно-моноцитарного лейкопоэза являются гормоны адаптации, к которым относятся катехоламины и глюкокортикоиды, реализующие свои эффекты на костный мозг через усиление образования КСФ и интерлейкинов. К числу стимуляторов лейкопоэза относятся также витамин В12, аскорбиновая кислота, фолиевая кислота, железо (Kosmacheva S. et al., 2011). Подавление костномозгового кроветворения возможно под влиянием ряда медиаторов воспаления, таких как простагландины Е1, Е2, ИЛ-10, ИЛ-13, ФНО-а, трансформирующий фактор роста бета (ТФР-), а также лактоферрин и кислый изоферритин (Kosmacheva S. et al., 2011). Регуляция пролиферации и дифференцировки лимфоцитов находится под влиянием цитокинов, интенсивно секретируемых на фоне воздействия различных антигенов инфекционной и неинфекционной природы, лимфоцитами и моноцитами, к ним относят ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-7, бластогенный и митогенный факторы. Важнейшими ингибиторами лимфопоэза являются гормоны адаптации: адренокортикотропный гормон (АКТГ), глюкокортикоиды, индуцирующие развитие реакции апоптоза и цитолиза в лимфоидной ткани (Kotake S. et al., 2009).
Стимуляторами эритропоэза являются эритропоэтин, гормоны аденогипофиза (адренокортикотропный, тиреотропный, соматотропный гормоны), глюкокортикоиды, андрогены, гормоны щитовидной железы, витамин В12, витамин С, фолиевая кислота, железо. Активация тромбоцитопоэза возникает под влиянием КСФ мегакариоцитов, ИЛ-3, ИЛ-6, ИЛ-9, ИЛ-11, тромбопоэтина, вырабатываемого преимущественно в печени и почках (Шмонин А. А. и соавт., 2010).
Установлено, что цитокины – это группа полипептидных медиаторов, участвующих в формировании и регуляции адаптивных реакций организма. Биологические эффекты цитокинов опосредуются через «специфические» рецепторные трансмембранные гликопротеиновые комплексы, состоящие из нескольких высокоаффинных и низкоаффинных субъединиц (Луговская С. А. и соавт., 2010). При этом высокоаффинные рецепторы реагируют лишь с определенным цитокином, а низкоаффинные – с различными, обеспечивая их взаимозаменяемость. Также на мембранах клеток существуют групповые рецепторы, обеспечивающие устранение избытка цитокинов (Kotake S. et al., 2009). Рецепторы цитокинов могут быть в растворенной форме и тем не менее связывать лиганды (Васильев С. А. и соавт., 2010). Биологическая активность цитокинов реализуется при участии различных внутриклеточных систем в соответствии с морфофункциональными особенностями клеток-мишеней (Rifas L. et al., 2009).
Экспериментальное моделирование условий повышенной кровоточивости и свертываемости крови
Метод определения длительности кровотечения по Дьюке Длительность кровотечения по Дьюке – это специфическая методика оценки состояния кровеносной системы, точнее – сосудов. Проведение методики. После введения животного в эфирный наркоз крысу фиксируют в вертикальном положении головой вверх. В дистальном отделе хвоста, с помощью скарификатора производят прокол кожи глубиной 3,5 мм и длиной линейного прокола 3 мм и незамедлительно начинают отсчет времени. Капиллярную кровь с поверхности поврежденного участка снимают фильтровальной бумагой каждые 30 секунд, пока не образуется тромб. Фиксируют время. В норме период от начала до остановки кровопотери составляет от 2 до 5 минут. Время кровотечения удлиняется при выраженных тромбоцитопениях, болезни Виллебранда, тяжелых формах некоторых тромбоцитопатий. При нарушениях свертываемости крови (гемофилиях) оно обычно остается нормальным или несколько удлиняется. Удлинение отмечается при тяжелых формах тромбогеморрагического синдрома и значительной гепаринемии (Буни Н. А., 2009). Метод определения активированного парциального тромбопластинового времени
Метод заключается в определении времени свертывания плазмы в условиях стандартизированной контактной (эллаговой кислотой) и фосфолипидами (кефалином) активации процесса коагуляции в присутствие ионов кальция. Нормальные показатели АПТВ лежат в пределах 30–40 сек. Показатели АПТВ повышаются при нарушениях функционирования печени, дефиците витамина К, а также при присутствии в крови волчаного антикоагулянта. Изменения в уровне АПТВ происходят при снижении хотя бы одного из факторов свертывания на 30– 40 % от нормального состояния.
Когда свертываемость крови замедляется вследствие увеличения продолжительности АПТВ, это может стать предвестником таких заболеваний, как гемофилия, ДВС-синдром (II и III фаза), антифосфолипидный синдром, снижение свертываемости крови.
Образец крови получали у лабораторных животных из бедренной вены. Антикоагулянтом выбран 3,8 % раствор натрия лимоннокислого трёхзамещенного (цитрата натрия) в соотношении крови и цитрата натрия – 9 : 1.
Центрифугировали при 3000–4000 об/мин в течение 15 мин. Получили бедную тромбоцитами плазму. Изучение клеточного состава периферической крови
Общий анализ крови в медицинской практике занимает одно из важнейших мест среди лабораторно-диагностических процедур. Он помогает выявить различные нарушения в процессах кроветворения, определить наличие каких-либо воспалительных процессов и патологий, а также оценить состояние здоровья человека в целом.
Общий клинический анализ крови включает в себя определение количества эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, определение концентрации гемоглобина, подсчет лейкоцитарной формулы и других показателей. Изменения в общем анализе крови могут свидетельствовать об воспалительных, инфекционных процессах в организме, позволяют выявить бактериальные и вирусные заболевания, возможные гельминтозы и аллергии.
Для определения количественных показателей крови у лабораторного животного брали кровь из бедренной вены в специальные микропробирки, в которых уже имелось напыление ЭДТА (этилендиаминуксусная кислота). На гематологическом анализаторе MEDONIK M-SERIES (Швеция), который предназначен для проведения in vitro диагностических тестов образцов крови в лабораторных условиях (Abbassi-Ghanavati M. et al., 2009), определяли количество тромбоцитов, эритроцитов и лейкоцитов.
Измерение основных параметров в анализаторах данного типа основано на принципах импеданса и спектрофотометрии. Кондуктометрическим методом производится подсчет числа и определение характера импульсов, возникающих при прохождении клеток через отверстие малого диаметра (апертуру), по обе стороны которого расположены два изолированных друг от друга электрода. Каждое прохождение клетки через канал сопровождается появлением электрического импульса. Чтобы определить концентрацию клеток, достаточно пропустить определенный объем пробы через канал и сосчитать число электрических импульсов, которые при этом генерируются. Миелограмма как метод исследования активности красного костного мозга
Одним из методов прижизненного исследования клеточного состава костного мозга является костномозговая пункция, производимая через переднюю стенку грудины, которая была предложена в 1927 г. М. И. Аринкиным.
Результаты изучения мазка пунктата костного мозга под микроскопом (миелограмма) позволяют оценить активность гемопоэза, клеточный состав костного мозга, что используется в гематологической практике. При острых лейкозах в костном мозге обнаруживают увеличение числа бластных клеток, при миеломной болезни – плазматических (миеломных) клеток, при гемолитических анемиях – эритробластов и нормобластов. Исследование клеточного состава костного мозга позволяет диагностировать некоторые инфекционные болезни (например, висцеральный лейшманиоз, при котором в костном мозге выявляются лейшмании). При злокачественных опухолях в костном мозге обнаруживаются атипичные клетки, при системной красной волчанке – LE-клетки (Гаврилов О. К. и соавт., 1985).
В работе проводилось взятие костномозговой жидкости из эпифиза бедренной кости (Abdel Gader A. M. et al., 2006). После эвтаназии животного извлекали бедренную кость, удаляли метафиз, с помощью иглы набирали материал и наносили на предметное стекло. После нанесения пунктата на стекло равномерным слоем распределяли его по поверхности стекла с помощью пластикового шпателя (Sarig G. et al., 2005). Преппараты фиксировали, высушивали, окрашивали красителем Романовского, время окраски варьировалось и устанавливалось опытным путем для каждой новой партии красителя от 25 до 40 минут (Голованова Т. И., 2009).
Определение состояния гемопоэза у самок крыс при беременности на модели повышенной кровоточивости
По данным, иллюстрированным в таблице 4, мы видим повышение эритроцитарного и тромбоцитарного ростков красного костного мозга. Так, достоверно увеличиваются нормобласты оксифильные до 2,6 ± 0,04 %, р 0,05 по сравнению с 1 группой небеременных самок крыс 2,1 ± 0,02 %, а также полихраматофильные до 12,6 ± 0,07 %, р 0,05 при сравнении с 1 группой 11,7 ± 0,07 % и плазматические клетки до 1,0 ± 0,03 %, р 0,01 (в 1 группе сравнения 0,10 ± 0,01%).
При этом отмечается выраженная активизация мегакариоцитопоэза, увеличение доли мегакариоцитов до 6,0 ± 0,01 %, р 0,05 по сравнению с данными небеременных крыс (5,5 ± 0,01 %).
Для объективной оценки активизации гемопоэза у экспериментальных животных использовали интегральные показатели: индекс лейко-эритробластическго соотношения, который определяет соотношение всех клеток белого ростка (гранулоцитарного, моноцитарного и лимфоидного) к ядросодержащим клеткам эритроидного ряда; индекс созревания нейтрофилов, отражающий соотношение незрелых и зрелых нейтрофилов костного мозга, а так же индекс созревания эритрокариоцитов, который показывает соотношение гемоглобинизированных эритрокариоцитов ко всем клеткам эритроидного ряда.
Полученные результаты представлены в таблице 5. По результатам, представленным в таблице 5, установлено повышение как индексов, так и клеточных соотношений: индекс созревания нейтрофилов 1,1 ± 0,1 у.е., р 0,1 (у небеременных крыс 0,8 ± 0,1 у.е.), индекс созревания эритробластов 1,0 ± 0,1 у.е., р 0,1 (в группе сравнения 0,7 ± 0,1 у.е.), в том числе лейко-эритробластическое соотношение в значениях до 5,6 ± 0,3 у.е., р 0,1 (в сравнении с небеременными крысами 5,5 ± 0,4 у.е.).
Известно, что регуляторами кроветворения являются ЭПО и ТПО, которые обеспечивают пролиферацию и созревание клеток в костном мозге, при этом их синтез зависит от количества циркулирующих в периферической крови клеток. Результаты определения представлены на рисунке 9.
Уровень эритропоэтина и тромбопоэтина в сыворотке у небеременных крыс и крыс с физиологически протекающей беременностью. При обработке полученных результатов установлено, что уровень регулятора эритропоэза при физиологической беременности снижается на 22,9 %, по сравнению с данными в группе небеременных крыс, и составляет 9,1 ± 1,2 пкг/мл во 2-й группе и 11,8 ± 1,2 пкг/мл – в группе контроля. Это обусловлено тем, что, благодаря достаточному количеству эритроцитов в кровотоке по типу «обратной связи», ткани почки снижают синтез эритропоэтина.
Аналогичные изменения наблюдаются при изучении содержания тромбопоэтина в сыворотке крови лабораторных животных. Концентрация ТПО в крови составила 0,52 ± 0,02 пкг/мл, что на 5,5 % меньше, чем в сыворотке небеременных крыс контрольной группы (0,55 ± 0,02 пкг/мл). Известно, что незначительное снижение тромбопоэтина наблюдается в результате умеренного повышения количества тромбоцитов в крови (на 18,2 %) и, соответственно, увеличения клеточных c-MPI рецепторов, участвующих в присоединении ТПО к тромбоцитам. Таким образом, экспериментальным путем установлено, что при беременности наблюдаются признаки физиологического повышения свертываемости крови, которые проявляются укорочением длительности кровотечения по Дюке на 6,2 %, укорочением АПТВ на 20,8 % по отношению к данным лабораторных животных первой группы – небеременных самок крыс. Отмечено, что в кровотоке физиологически повышается количество эритроцитов на 14,1 %, тромбоцитов на 18,2 %, лейкоцитов на 9 %. При этом наблюдается компенсаторное снижение активности регуляторов кроветворения эритроцитарного и тромбоцитарного ростка: ЭПО – на 22,9 %, а ТПО – на 5,5 %. В пунктате красного костного мозга наблюдается повышение активности миелоидного ростка на 10,4 %, эритроцитарно-тромбоцитарного ростка на 15,6 % и повышение индекса созревания клеток на 9,1 %.
В связи с вышеизложенным можно предположить, что в период физиологической беременности система гемопоэза компенсаторно стремится к образованию новых форменных элементов для поддержания баланса во всех органах и тканях материнского организма, а также плода. 3.2. Определение состояния гемопоэза у самок крыс при беременности на модели повышенной кровоточивости
Известно, что динамические изменения в системе гемостаза, отражая характер процессов адаптации, должны создавать условия для нормального функционирования фетоплацентарного комплекса и остановки кровотечения из сосудов плацентарной площадки после отделения последа и не должны выходить за границы опасные развитием тромбозов и кровотечений (Provan D. et al., 2010).
Создание модели повышенной кровоточивости у животных 3-й группы подтверждено достоверным удлинением АПТВ и длительности кровотечения по Дьюке в сравнении с результатами исследования контрольной группы животных.
Доказательством повышения текучести крови у крыс в 3-й группе явилось увеличение длительности кровотечения по Дьюке до 8 мин 28 сек, а также удлинение АПТВ до 35,5 ± 0,7 сек по сравнению с данными небеременных самок: по Дьюке – 6 мин 10 сек и АПТВ 23,6 ± 0,5 сек. Результаты представлены на рисунке 10.
Изменение уровня АПТВ и длительности кровотечения в группе небеременных и беременных самок крыс при повышенной кровоточивости В группе крыс при экспериментально смоделированном состоянии повышенной кровоточивости во время беременности среднее количество жизнеспособных плодов в помете составило 4,1 ± 0,3 шт. (при физиологической беременности – 6,4 ± 0,5 шт.). У одного животного были отмечены преждевременные роды на 17–18-й день беременности. При визуальной оценке плодов не установлено выраженных уродств и аномалий развития, однако на коже крысят отмечались петехии и усиление сосудистого рисунка. Изучение количества клеток периферической крови беременных крыс при повышенной кровоточивости позволило выявить некоторые особенности, представленные в таблице 6.
Оценка изменений в цитологической картине тканей печени и селезенки самок крыс в норме и при нарушениях в системе гемостаза во время беременности
Ядра гепатоцитов подвергаются кариопикнозу и кариорексису. Среди некротических масс определяются глыбки распавшегося хроматина. В цитоплазме гепатоцитов происходит коагуляция белка, разрушение цитоплазмы. В исходе указанных процессов в центре долек на месте разрушенных гепатоцитов видны скопления жиробелкового детрита. По периферии описанных изменений (во II зоне ацинуса) – гепатоциты с дистрофическими изменениями.
Таким образом, при тромбоцитопатиях с синдромом гиперкоагуляции в печени развиваются гипоксически-ишемические повреждения гепатоцитов, преимущественно в центре долек. При кратковременной гипоксии развиваются обратимые изменения по типу зернистой дистрофии и набухания гепатоцитов. Длительная гипоксия приводит к необратимым изменениям с развитием центролобулярных некрозов. В исходе необратимых повреждений отмечается рассасывание некротических масс и замещение очага некроза соединительной тканью, что приводит к фиброзу печени.
В селезенке при повышенной свертываемости образуются микротромбы, которые вызывают окклюзию сосудов микроциркуляторного русла. В связи с тем, что в селезенке отсутствуют участки с взаимоперекрывающим типом артериального кровоснабжения и коллатеральные сосуды недостаточностью развиты, при тромбозе ветвей селезеночной артерии возникают инфаркты. Макроскопически инфаркты селезенки серовато-белого цвета, конусовидной формы с четко очерченными краями (рисунок 23).
В селезёнке – инфаркт и лейкоцитарная инфильтрация, со стороны сосудистой системы описаны мелкие тромбы, приводящие к венозному застою крови. Инфаркт селезенки – ишемический-коагуляционный – возникает при обтурирующем тромбозе ветвей селезеночной артерии. Вне зоны инфаркта в селезенке отмечается малокровие красной пульпы.
Механизм повреждения в селезенке ишемически-гипоксический. В его основе лежат те же механизмы, что и при повреждении печени: накопление молочной кислоты вследствие анаэробного гликолиза и активация перекисного окисления липидов.
При сравнительной характеристике паренхиматозных органов лабораторных животных при экспериментально смоделированных нарушениях свертываемости крови были выявлены цитогистологические сходства и различия у данных экспериментальных групп. Сравнительная характеристика микроскопических изменений в паренхиме печени и селезёнки лабораторных животных при смоделированных нарушениях свертываемости крови указывает на сходство процессов повреждения клеток данных органов. Основными факторами повреждения выступают нарушения гемостатических реакций под действием применяемых лекарственных препаратов, данные нарушения в свою очередь приводят к изменению равновесия между свёртывающей и противосвёртывающей системами организма, что впоследствии приводит к развитию отёков, кровоизлияний, тромбозам и гипоксии тканей данных органов.
Однако, несмотря на относительное сходство процесса повреждения, механизм развития данных микроскопических изменений различен. При повышенной кровоточивости основная роль в процессе репарации отводится увеличению текучести крови, при этом в паренхиме печени обнаруживаются полнокровие и диапедезные кровоизлияния, перисуносоидальные отёки и очаги колликвационного некроза гепатоцитов. Лимфатическая ткань селезёнки подвергается гиперплазии, в красной пульпе селезёнки отмечается кровоизлияние. Также при повышенной кровоточивости в ткани печени и селезёнки описаны очаги экстрамедуллярного кроветворения.
Механизм повреждения при повышенной свертываемости состоит в повышении вязкости и увеличении свёртывающей способности крови, при этом гистологическая картина паренхиматозных органов имеет ряд существенных особенностей, в кровеносных сосудах печени и селезёнки. Отмечается наличие тромбов, в паренхиме селезёнки – инфаркт и лейкоцитарная инфильтрация, в гепатоцитах наблюдается исчезновение гликогена.
Исходя из вышесказанного, можно сделать вывод о том, что паренхиматозные органы при моделировании нарушений свертываемости крови претерпевают ряд существенных цитогистологических изменений. Данные изменения имеют различный механизм возникновения и проявляются нарушением гемодинамики, некрозом клеток, а также появлением очагов экстрамедуллярного кроветворения.