Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы . 15
Фолликулогенез и стероидогенез в яичниках 15
Фолликулогенез в норме . 15
Стероидогенез в растущих фолликулах яичниках . 19
Гуморальные факторы в регуляции роста и атрезии фолликулов 27
Семейство инсулиноподобных факторов роста 27
Семейство эпидермального фактора роста . 28
Семейство фактора некроза опухолей (FasL/FasR) 29
Ангиогенез в растущих фолликулах яичника. Факторы роста в регуляции неоангиогенеза 34
Сосудисто-эндотелиальный фактор роста 34
Эндотелин-1 38
Нарушение фолликуло- и стероидогенеза при гиперандрогении и гиперпролактинемии 41
Глава 2. Материал и методы исследования 44
Объект и методы экспериментальной части исследования . 44
Метод иммуноферментного анализа 47
Расчетные коэффициенты 53
Статистическая обработка результатов 53
Глава 3. Результаты собственных исследований 55
Стероидогенез на разных этапах роста и созревания фолликулов при гиперандрогении и гиперпролактинемии 55
Маркеры апоптоза в динамике роста фолликулов при гиперандрогении и гиперпролактинемии 60
Маркеры ангиогенеза в динамике роста фолликулов при гиперандрогении и гиперпролактинемии . 64
Маркеры пролиферации в динамике роста фолликулов при гиперандрогении и гиперпролактинемии . 69
Корреляционный и корреляционно-регрессионный анализ полученных результатов . 76
3.6. Метод математического моделирования . 79
Глава 4. Обсуждение полученных результатов . 84
Выводы 108
Практические рекомендации 109
Список литературы 110
- Фолликулогенез в норме
- Стероидогенез в растущих фолликулах яичниках
- Метод иммуноферментного анализа
- Маркеры апоптоза в динамике роста фолликулов при гиперандрогении и гиперпролактинемии
Введение к работе
Актуальность проблемы
Исследование молекулярно-биологических маркеров развития фолликулов в процессе фолликулогенеза – одно из наиболее перспективных и социально значимых направлений репродуктивной биологии. В настоящее время актуальность изучения проблемы оогенеза и фолликулогенеза обусловлена высоким процентом бесплодных браков, связанных с проблемами в репродуктивной сфере.
Согласно данным ВОЗ, рождаемость в России не достигает уровня, необходимого для простого воспроизводства населения [Т.Г. Сухих, Т.А. Назаренко, 2010]. Весомый вклад в демографическую проблему вносят бесплодные браки.
Эндокринное бесплодие у женщин является важнейшей составляющей многофакторной структуры бесплодного брака, где на первый план выступают овариальная гиперандрогения неопухолевого генеза (ОГНГ) и функциональная гиперпролактинемия (ФГП). В основе патогенеза указанных форм эндокринного бесплодия лежит функционирование репродуктивной системы в условиях измененного гормонального статуса, что приводит к последовательному нарушению стероидо- и фолликулогенеза, овуляции и оплодотворения [В.И. Кулаков, Леонов, 2010].
Известен ряд патофизиологических механизмов, приводящих к функциональной неполноценности женских гамет. К ним следует отнести нарушенный ангиогенез, дизрегуляцию эффектов стероидных гормонов, активацию апоптоза клеток гранулезы фолликулов, изменение соотношений про- и антиапоптотических факторов и накопление цитокинов в составе фолликулярной жидкости [М.В. Яманова, А.Б. Салмина, 2009].
В связи с этим является актуальным изучение условий протекания гормонально-зависимого этапа формирования пула антральных фолликулов, регуляции их роста и селекции доминантного фолликула, а также идентификация факторов ФЖ, под влиянием которых развивающиеся ооциты при ОГНГ и ФГП становятся неполноценными.
Цель исследования состоит в исследовании функциональной компетентности ооцитов при некоторых вариантах эндокринного бесплодия человека и эффективности стимуляции овуляции в программах экстракорпорального оплодотворения.
Задачи исследования:
-
Исследовать уровень маркеров функциональной компетентности ооцитов (эстрадиола (Е2), тестотерона (Т), индекса эстрадиол/тестостерон (Е2/Т), Fas-лиганд/Fas-рецептор (sFasL/sFasR), основной фактор роста фибробластов (оФРФ), инсулиноподобный фактор роста-1 (ИФР-1), эпидермальный фактор роста (ЭФР), индекс инсулиноподобный фактор роста-1/эпидермальный фактор роста (ИФР-1/ЭФР), трансформирующий фактор роста-1 (ТФР-1) в фолликулярной жидкости в динамике созревания фолликулов при овариальной гиперандрогении неопухолевого генеза и функциональной гиперпролактинемии.
-
Изучить влияние эндотелина-1 и СЭФР в фолликулярной жидкости на развитие фолликулов при исследуемых вариантах эндокринного бесплодия.
-
Определить роль пролиферации, ангиогенеза и апоптоза в процессе созревания пула малых антральных фолликулов, их роста и селекции доминантного фолликула при овариальной гиперандрогении неопухолевого генеза и функциональной гиперпролактинемии.
-
Оценить характер взаимосвязи маркеров физиологических механизмов и развития фолликулов при овариальной гиперандрогении неопухолевого генеза и функциональной гиперпролактинемии.
-
Выявить маркеры фолликулогенеза, прогнозирующие исход лечебных циклов ЭКО при рассматриваемых вариантах эндокринного бесплодия.
Научная новизна
1. Выявлено патологическое изменение фолликулярного микроокружения при овариальной гиперандрогении неопухолевого генеза и функциональной гиперпролактинемии (снижение Е2/Т и накопление тестостерона) начиная с IV стадии гормонально-зависимого этапа фолликулогенеза.
2. Установлено, что увеличение секреции sFasR в фолликулярной жидкости при овариальной гиперандрогении неопухолевого генеза и функциональной гиперпролактинемии является косвенным свидетельством готовности гранулезных клеток развивающихся фолликулов к реализации программы апоптоза или отражает запуск механизма апоптоза гранулезных клеток.
3. Обнаружено, что снижение содержания основных маркеров пролиферации (ИФР-1, ЭФР) в развивающемся доминантном фолликуле может свидетельствовать о нарушенной пролиферации гранулезных клеток при овариальной гиперандрогении неопухолевого генеза и функциональной гиперпролактинемии, начиная со стадии раннего преовуляторного фолликула.
4. Показано, что сниженная секреция основных маркеров неоангиогенеза (СЭФР, оФРФ) в растущем фолликуле позволяет судить о недостаточном кровоснабжении доминантного фолликула как одном из механизмов развития преждевременной атрезии фолликула и/или созревания ооцита со сниженным фертилизационным потенциалом. Секреция СЭФР в растущем фолликуле при изученных вариантах эндокринного бесплодия зависит от стероидного микроокружения ооцитов.
Теоретическая значимость работы
Полученные данные о характере и выраженности патологических изменений развивающихся фолликулов при овариальной гиперандрогении неопухолевого генеза и функциональной гиперпролактинемии могут быть использованы в курсах обучения физиологии и эндокринологии, при планировании экспериментальных протоколов направленных на изучение молекулярных механизмов нарушения репродуктивной функции, ассоциированных с дизрегуляцией фолликулогенеза.
Практическая значимость работы
Выявленные закономерности развития фолликулов в зависимости от гуморального микроокружения целесообразно учитывать при оценке репродуктивного статуса пациенток с эндокринопатиями, а также при определении индивидуальных схем лечения в циклах вспомогательных репродуктивных технологий.
Настоящая работа представляет практический интерес в связи с выяснением прогностической роли ряда маркеров, которые могут быть использованы для оценки исходов лечебных циклов ЭКО у женщин с овариальной гиперандрогенией неопухолевого генеза и функциональной гиперпролактинемией.
Положения, выносимые на защиту
1. При нормальном фолликулогенезе молекулами, маркирующими эффективность фолликулогенеза, оплодотворения и имплантацию эмбриона, являются эстрогены, оФРФ и ЭФР; при функциональной гиперпролактинемии - тестостерон, ТФР-1, эндотелин-1; при овариальной гиперандрогении неопухолевого генеза - оФРФ, ТФР-1, эндотелин-1. Сниженная секреция основных маркеров неоангиогенеза в растущем фолликуле может приводит к недостаточному кровоснабжению доминантного фолликула. Имеется отрицательная корреляция между концентрацией оФРФ и степенью зрелости фолликула для пациенток с овариальной гиперандрогенией неопухолевого генеза (r=-0,93; p=0,001).
2. Особенностью развивающихся ооцитов у пациенток с исследуемыми вариантами эндокринного бесплодия является снижение их пролиферативной активности, регистрируемой по подавлению секреции полипептидных факторов и интенсификации апоптоза вследствие дизрегуляции sFasR/sFasL взаимодействий на фоне нарушенного синтеза стероидных гормонов, что в результате приводит к снижению эффективности оплодотворения и имплантации эмбриона.
Внедрение результатов исследования
Результаты работы внедрены в научно-исследовательский процесс НИИ молекулярной медицины и патобиохимии, в диагностическую деятельность РЛДЦ ИХМИ г. Красноярска, в учебный процесс кафедры биохимии с курсами медицинской, фармацевтической и токсикологической химии, кафедры патологической физиологии, кафедры клинико-лабораторной диагностики ИПО ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого МЗ РФ.
Апробация работы
Основные положения диссертационного исследования представлены и обсуждены: на V Международной конференции молодых ученых «Современные вопросы акушерства, гинекологии и перинатологии» (Москва, 2011 год); на V Международном конгрессе по репродуктивной медицине (Москва, 2011 год); на III Съезде физиологов СНГ (Ялта, 2011 год), на Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 2010 год); на заседаниях НИИ молекулярной медицины и патобиохимии ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого (Красноярск, 2009–2011 гг.); на заседании проблемной комиссии «Фундаментальная медицина» (выписка из протокола №3 от 22 декабря 2009 года).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ: из них 5 - в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ, 9 - в тезисах докладов на конгрессе и конференциях всероссийского и международного уровней, издано методическое пособие «Диагностика нарушения стероидогенеза в клетках кумулюса фолликулов яичников у женщин с эндокринным бесплодием в лечебных циклах ЭКО».
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста, иллюстрирована 9 таблицами и 33 рисунками. Состоит из введения, 4 глав, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, содержащего 173 источников (отечественных и иностранных).
Фолликулогенез в норме
Реализация репродуктивной функции женщины связана с процессом фолликулогенеза. Данный процесс включает совокупность регуляторных компонентов и факторов роста на различных молекулярных уровнях. В на-стоящее время важный вклад в изучение патогенеза эндокринного бесплодия вносят исследования необратимого дегенеративного процесса гибели фолли-кулов (атрезии), сопряженного с циклическим стероидогенезом в яичниках, и тесно связанным с ним ангиогенезом. Молекулярно-биологические маркеры позволяют оценить функционирование яичников и получить ценную объек-тивную информацию о состоянии фолликулогенеза.
Вместе с тем, имеющиеся в настоящее время литературные данные не в полной мере отражают пути решения проблем в области репродукции и не в полной мере показывают всю гамму молекулярно-биологических подходов к пониманию патогенеза эндокринного бесплодия.
Одним из современных подходов к пониманию патогенеза различных заболеваний является изучение процессов регуляции клеточной гибели (апоптоза). Косвенным маркером готовности гранулезных клеток яичника к вступлению в апоптоз является увеличение содержания в ФЖ растворимой формы FasR – sFasR. Вместе с тем в основе физиологического обеспечения функционирования репродуктивной системы женщины лежат процессы цик-лического ангиогенеза. Изучение взаимосвязи данных процессов в норме по-зволяет объяснить возникновение и характер определенных заболеваний и роль молекулярно-биологических маркеров в регуляции. Так, молекулярно-биологические маркеры при различных заболевани-ях выступают в качестве потенциальных прогностических факторов, а также дают ценную информацию о процессах, протекающих на молекулярном уровне.
Анализ причинных факторов неудач при проведении программ ЭКО позволяет признать их мультифакторный характер, опосредованный наруше-нием всех этапов репродуктивного процесса, в регуляции которого прини-мают участие нервная, эндокринная и иммунная системы.
Измененная фолликулярная среда при некоторых вариантах эндокрин-ного бесплодия может оказывать влияние на качество ооцитов, которое в свою очередь обусловливает сниженную имплантацию. Мониторинг данной проблемы является весьма сложной задачей, решение которой возможно с использованием математических методов исследования. Так, в современной медицине использование математических моделей решает многие не только прогностические, но и диагностические задачи. В нашем исследовании определенные методы статистической обработки при-менялись для изучения влияния определенных факторов роста и гормонов на результаты лечебных циклов ЭКО.
Одним из важнейших репродуктивных органов женщины являются яичники, выполняющие две основные функции. Одна из этих функций – оогенез, связана с образованием зрелых гамет (яйцеклеток), а другая – сте-роидогенез, сопряжена с производством стероидных гормонов, необходимых для развития фолликула и подготовки репродуктивных органов женщины к беременности [24, 41]. Основной структурной и функциональной единицей яичника является фолликул. Каждый фолликул состоит из ооцита, окруженного слоем или сло-ями соматических клеток. Соматические компоненты яичника (гранулеза, тека, эндотелиальные клетки и поддерживающая соединительная ткань) раз-виваются из недифференцированных гонад эмбриона. Главное предназначе-ние гранулезных клеток связано с выработкой стероидных гормонов [11,72,73]. Доказательством сложных преобразований в яичниках является факт экспрессии в них 20-30 % всех генов человека. Например, в мышечной ткани экспрессируется только 6-7 % генов. Ключевую роль в формировании яични-ков играет ген FIGLIA. Экспрессия данного фактора приводит к синтезу бел-ков блестящей оболочки (zona pellucida). Важным представителем, отвечаю-щим за взаимодействие ооцита с клетками гранулезы и теки, является ген, экспрессирующий фактор ВМР 15 (CDF9B). Указанный фактор относится к семейству ТФР-1, который контролирует процесс формирования роста пер-вичных фолликулов. Мутация в данном гене приводит к возникновению дис-генезии яичников [8,31]. Зависимость динамики фолликулярного развития от указанных факторов и сигналов показана в таблице 1.
Временные параметры фолликулогенеза ограничиваются поздним эта-пом фазы менструального цикла и началом пика гонадотропинов [106]. Ско-ординированные эндо-, экзо- и паракринные взаимодействия способствуют поэтапному развитию фолликулов [10,161]. Согласно современным данным, процесс фолликулогенеза можно раз-делить на следующие стадии: 1) формирование пула растущих фолликулов; 2) базальный рост (рост до стадии антрального фолликула); 3) селекция и со-зревание доминантного фолликула; 4) овуляция доминантного фолликула [42,160]. Первые две стадии представляют этап гормонально-независимого развития фолликулов, третья и четвертая стадия – этап гормонально-зависимого развития фолликулов [8,98].
Процесс фолликулогенеза наглядно показан в классификации Pedersen & Peters (1968 год). Данная классификация отражает наиболее развернутую картину основных морфологических событий: инициацию роста ооцита, про-лиферацию гранулезных и слоя тека-клеток, формирование антрального фол-ликула. На рис.1 показан процесс атрезии, овуляции и лютеинизации фолли-кула.
В соответствии с существующими представлениями развитие фоллику-ла в репродуктивном периоде женщины имеет ряд особенностей и претерпе-вает обозначенные на рисунке 1 стадии [98]. На основании процессов, протекающих в яичниках женщины, обнару-живается существование двух пулов фолликулов – группы «спящих» при-мордиальных фолликулов и группы первично инициированных антральных фолликулов. Основное депо представлено пулом примордиальных фоллику-лов, в то время как, пул антральных фолликулов способен к дальнейшему ро-сту и длительной стабилизации на данном этапе развития [10]. Антральные фолликулы могут быть разделены на следующие виды: малые антральные фолликулы с диаметром 1-3 мм и большие антральные фолликулы диаметром 5-6 мм. Формирование доминантного фолликула из когорты растущих антральных фолликулов находится в непосредственной зависимости от ФСГ. Формирование когорты растущих антральных фолли-кулов начинается в конце второй фазы предыдущего менструального цикла. В данной фазе наблюдается пропорциональное уменьшение объема желтого тела с одновременным увеличением секреции ФСГ гипофизом и, соответст-венно, снижается секреция Прог, Е2 и ингибина [31]. В основе роста и селекции доминантного фолликула лежит так назы-ваемая «теория окна», предложенная J. Brown (1978) & D. Baird (1987). Согласно данной теории каждый из антральных фолликулов имеет свой индивидуальный порог чувствительности к концентрации ФСГ, который, как уже отмечалось, зависит от количества рецепторов к ФСГ в гранулезных клетках. Для каждого из антральных фолликулов с диаметром 3 – 5 мм в начале фолликулярной фазы менструального цикла уровень ФСГ должен достигать определенного значения или порога. Этот порог строго индивидуален и зави-сит от сохранности овариальных резервов. В нормальных условиях снижает-ся уровень ФСГ в середине фолликулярной фазы цикла и доминантным ста-новится один фолликул, который далее овулирует [9].
Стероидогенез в растущих фолликулах яичниках
Реализация стероидогенной функции яичника осуществляется, в ос-новном, посредством таких гормонов как Прог, андрогены и эстрoгены, дей-ствующие через специфические ядерные рецепторы. Механизм действия стероидных гормонов различен у разных видов животных. Так, у мышей эмбриональные яичники не продуцируют стероид-ные гормоны. Однако, у ряда других видов животных стероидогенез в разви-вающихся яичниках достаточно активен. Данный факт подтверждается тем, что выделение этих гормонов у обезьян и овец во внутриутробном состоянии нарушает развитие гонад, фолликулов, существенно изменяет морфологию яичников и приводит, в конечном счете, к формированию кист [125,157,163].
Весьма показателен процесс стероидогенеза в развивающихся фолли-кулах овец. Клетки этих фолликулов экспрессируют рецепторы для эстроге-нов (ER и ER) и андрогенов (АR), за исключением Прог (PR), которые об-наруживаются методом гибридизации in situ и иммуногистохимией в эм-бриональный период [137]. Экспрессия перечисленных рецепторов наблюдалась у овец с 26 по 75 день эмбрионального развития. В свою очередь ER обнаруживался в грану-лезных клетках в течение всего периода развития яичников. Рецепторы к ан-дрогенам обнаруживались на 55 день в клетках стромы. мРНК рецепторов PR не наблюдалась в указанный период, однако проявлялась в малых антраль-ных и больших фолликулах [127]. Экспрессия ER и ER, АR, PR наблюдается в поверхностном эпителии и строме яичников эмбриональных, новорожденных и взрослых особей. В конечном счете, стероидные гормоны у данных животных являются регуля-торами развития различных типов клеток яичника и фолликулов в целом на ранних стадиях [137]. J. E. Fortune (2003) проанализировал эффекты стероидных гормонов на ранних стадиях фолликулогенеза у различных животных. Результаты его ис-следования представлены в табл. 2.
На протяжении постнатального развития экспрессия мРНК ER возрас-тает в соответствии с пролиферацией гранулезных клеток, а мРНК ER на-против, остается стабильной. Исследования последних лет позволили опре-делить роль ER и ER в репродуктивной функции женщины. Так, ER по-средством неизвестного пока механизма подавляют процесс овуляции, в то время как ER стимулируют рост фолликулов, подавляя атрезию и иниции-руя экспрессию специфических генов [137].
В 2002 году K. Britt & J. Findlay продемонстрировали на эксперимен-тальных моделях (мыши линии ArKO – линия с недостаточным количеством Е2 и, как следствие этого, приостановленным процессом фолликулогенеза на антральной стадии и отсутствием овуляции) биологическое действие Е2 на репродуктивную функцию. Назначение Е2 крысам с удаленным гипофизом стимулирует пролиферацию гранулезных клеток в малых преантральных фолликулах и снижает атрезию. Последующее назначение ФСГ крысам с эк-зогенным Е2, способствует росту фолликулов, дифференциации и образова-нию антральной полости [89]. Необходимо отметить, что сам по себе Е2, является потенциальным ми-тогеном, действуя на гранулезные клетки in vivo у кроликов. В условиях in vitro он лишен митогенной активности. Это показывает, что in vitro культура не способна поддерживать митогенный эффект Е2 на гранулезные клетки и/или воздействие других внутрифолликулярных факторов роста. Неизвест-ные факторы, вырабатываемые клетками теки, способны оказывать влияние на митогенный эффект эстрогенов. Научная группа под руководством M. Bley в 1997 году доказала, что комбинация эстрогенов и ФСГ или андро-генов стимулирует пролиферацию гранулезных клеток in vitro и этот эффект возрастает в присутствии инсулина или ИФР-1 [89].
Данные, полученные C. Wang и S. Roy (2007 г.), подтверждают важную роль Е2 в дифференцировке соматических клеток. Более того, данный гормон имеет двойственный эффект на развивающиеся соматические клетки. Ука-занный эффект зависит от дозы Е2, что было показано экспериментально. Ис-следование проводилось на новорожденных хомяках [170]. На первой стадии эксперимента 1-2 мкг Е2 (estradiol cypionate ECP), воздействовали на формирующиеся примордиальные фолликулы на 1 и 4 день после рождения экспериментальных животных. Параллельно проводили исследование в культуре эмбриональных яичников, где концентрация воз-действующего Е2 составила 1, 5, или 10 нг/мл. Необходимо отметить, что 1 мкг ECP соответствовал физиологической концентрации Е2. При данной концентрации значительно снижался уровень апоптоза, инициировалось формирование и развитие примордиальных фолликулов. Напротив, 2 мкг ECP содержали повышенную концентрацию Е2 (до 400 пг/мл), что значи-тельно снижало воздействие на ранние стадии развития фолликулов в про-цессе фолликулогенеза [170]. Таким образом, результаты данного исследования доказывают важ-ность рассмотренного гормона для выживания и развития соматических кле-ток, ооцитов, что приводило к развитию примордиальных фолликулов как in vivo так in vitro.
Метод иммуноферментного анализа
Метод иммуноферментного анализа (ИФА) в классическом варианте основан на принципе использования твердой фазы иммуносорбента с иммо-билизованными ферментами. Тест-система ИФА использует антитела, иммо-билизованные на твердой фазе (сорбированные на микролунках) и монокло-нальные антитела мыши в ферментном конъюгате (пероксидаза хрена). По истечении 45 минут инкубационного периода при комнатной тем-пературе, лунки промываются водой, чтобы смыть меченые антитела. Рас-твор тетраметилбензидина (TMB) добавляется на 20 минут, в результате чего окраска становится синей. Развитие изменения цвета прекращается при до-бавлении 2н HCl, причем цвет меняется на желтый и спектрофотометрически измеряется при 450 нм. Концентрация определяемых веществ прямо пропор-циональна интенсивности цвета тестового образца. В работе применяли полуавтоматический иммуноферментный анализа-тор Zenith (RADIM, Италия) и автоматический иммунолюминесцентный анализатор Immulite (DPC, США). Исследование гормонов и факторов роста осуществлялось с использо-ванием стандартных наборов реактивов, согласно приложенным к ним инст-рукциям: набор для определения тестостерона – «Immulite 1000 Total Testoserone (PILKTW-12)», набор для определения эстрадиола – «Immulite 1000 Esradiol (PILKE2-14)», набор для определения ИФР-1 – «Non-Extraction IGF-I ELISA DSL-10-2800», набор для определения эндотелина-1 – «Bl-20052 En-dotelin (1-21)», набор для определения ЭФР – «Invitrogen Immunoassay Kit KHG0062», набор для определения СЭФР – «BMS277/2 human VEGF-A Plati-num ELISA», набор для определения sFasR – «BMS245 human sAPO-1/Fas Platinum ELISA», набор для определения sFasL – «BMS260/2 human sFas-L ELISA», набор для определения оФРФ – «Invitrogen ELISE Kit KHG0021», набор для определения ТФР-1 – «BMS249/3 human TGF-1 Platinum ELISA».
Концентрация гормонов Т, Е2, выражалась в нмоль/л, а концентрация sFasL, sFasR, СЭФР, ИФР-1, ЭФР, ТФР-1, эндотелина, оФРФ – в пкг/мл. Определение факторов и стероидных гормонов осуществлялось по схожей методике. На выполнение одного исследования требовалось от 10 мкл ФЖ. Принцип действия теста, необходимые реактивы, проведение анализа, обработка результатов рассмотрены на примере определения содержания ТФР-1.
Выполнение теста осуществляется в несколько этапов: 1) используется 96-луночный планшет с анти-человеческими ТФР-1 антителами, абсорбированными в микролунках; 2) человеческие ТФР-1, присутствующие в инкубационном образце, связываются с антителами, абсорбированными в микролунках; 3) добавление биотин–конъюгированного комплекса и связывание его с человеческим ТФР-1, связавшимся с первым антителом; 4) промывка планшета. Добавление стрептавидин–HRP комплекса и связывание его с биотин–конъюгированным комплексом и первыми антите-лами. Определение количества микролуночных стрипов, требуемых для проведения исследования, количества проб, добавление соответствующего количества клеток необходимых для заполнения пустых мест и проб. Каждая проба, контрольный образец исследуется в двух параллельных постановках. Перемещение дополнительных микролуночных стрип из держателя в кон-тейнер из фольги для высушивания при температуре 2-8 С;
В. Промывание микролуночных стрипов производится дважды про-мывающим буфером (400 мкл) для каждой лунки. Оставить моющий буфер в лунках на 10-15 секунд перед аспирацией; Г. После последней промывки пустых лунок и микролуночных стри-пов поместить их на гипроскопическую прокладку или бумажное полотен-це для удаления остатков моющего буфера. Альтернативные микролуноч-ные стрипы могут быть размещены в перевёрнутом виде на влажной абсор-бирующей бумаге не более, чем на 15 минут (не до полного высыхания лу-нок);
Д. Стандартное разведение на микролуночной пластине (альтернатив-но стандартное разведение может быть приготовлено в пробирках). Добавить 100 мкл буферного раствора (1х) в удвоенном количестве ко всем стандартным лункам. Добавить 100 мкл приготовленного стандарта (S1=4000 пк/мл) в лунки А1 и А2. Смешать содержимое лунок А1 и А2. В лунки В1 и В2 добавить раствор приготовленного стандарта S1 (в концентра-ци на каждую лунку=2000 пкгр/мл). Провести данную процедуру 5 раз (раз-ведение от 2000 до 31 пк/мл); Е. Добавить 100 мкл буферного раствора (1Х) в удвоенном количестве в пустые лунки; Ё. Добавить 60 мкл Буферного раствора (1Х) в соответствующие лун-ки. Ж. Закрыть адгезионной (клейкой) плёнкой и инкубировать при ком-натной температуре (18-25 С) в течение двух часов; З. Приготовить биотин-конъюгированный комплекс; И. Уберать адгезионную плёнку. Промыть планшет 5 раз, в соответст-вии с пунктом с протокола исследования; К. Добавить 100 мкл биотин-конъюгированного комплекса во все лун-ки; Л. Закрыть адгезионной (клейкой) плёнкой и инкубировать при ком-натной температуре (18 -25 С) в течении 1 часа на микропланшетном шей-кере. М. Добавить стрептавидин-HRP раствор во все лунки, включая пус-тые; Н. Закрыть адгезионной (клейкой) плёнкой и инкубировать при ком-натной температуре (18 - 25 С) в течении 1 часа на микропланшетном шей-кере; О. Убрать адгезионную плёнку. Промыть микролуночные стрипы 5 раз, в соответствии с пунктом с протокола исследования; П. Добавить 100 мкл ТМБ-субстрата во все лунки; Р. Инкубировать микролуночные стрипы при комнатной температуре (18-25 С) в течение 30 минут, исключая прямое воздействие яркого света.
Следует проводить наблюдения за цветовым проявлением на планшете и остановкой реакции субстрата. Определение идеального временного пе-риода для цветового проявления должно быть сделано индивидуально для каждого раствора;
С. Рекомендуется добавить останавливающий раствор, когда цвет пер-вой пробы начнёт изменяться на тёмно-голубой. Реакцию субстрата следует остановить, как только она достигнет стандарта оптической плотности рав-ной 0,9 – 0,95; Т. Добавить 100 мл останавливающего раствора в каждую лунку. Очень важно, чтобы останавливающий раствор был распределён быстро и равномерно во всех микролунках до полного инактивирования фермента. Ре-зультаты обрабатываются сразу же после добавления останавливающего раствора или в течение одного часа; У. Абсорцию определяют при длине волны 450 нм (допустимая длина волны от 610нм до 650нм). Пустые лунки не учитываются. Обработка результатов. - производится вычисление средней величины абсорбции для каждого набора двойных стандартов и образцов (дубликаты должны быть в пределах 20 % от средней величины); - строится стандартная кривая методом построения средней абсорбции для каждой стандартной концентрации на ординате напротив абсциссы с расположением концентрации человеческого TGF-1. Проводится наиболее подходящая кривая через точки на графике (рекомендуется построение кри-вой по 5 параметрам); - определяется концентрация циркуляции человеческого TGF-1 для каждого образца. Находится значение средней величины абсорбции на орди-нате и проводится горизонтальная линия к стандартной кривой. В месте пе-ресечения проводится вертикальная линия к абсциссе (с учетом данных о концентрации человеческого TGF-1); - в случае если все инструкции в данном исследовании выполняются разбавленными образцами 1:30 (20мкл образца + 180 мкл буферного раствора (1х) + 20 мкл 1N HCl +20 мкл 1N NaOH и 40мкл обработанного образца + 60мл буферного раствора (1х)), то значение, определенное по стандартной кривой, умножается на коэффицент разбавления (х30); - вычисление образцов с концентрацией, превышающей стандарт, мо-жет быть результатом низкого уровня человеческого TGF-1.
Маркеры апоптоза в динамике роста фолликулов при гиперандрогении и гиперпролактинемии
Формирование полноценного доминантного фолликула во времени оп-ределяется характерными морфологическими изменениями, во многом обу-словленных совокупностью пролиферативных процессов и степени апоптоза клеток кумулюса [145,155]. Известно, что подавляющее большинство фолликулов в яичнике под-вергается атрезии посредством апоптоза [25,29,32]. У человека овариальный резерв, установленный в эмбриональный период, постепенно истощается. Рассматриваемый процесс жизненно необходим для нормального функцио-нирования яичников и, соответственно, роста фолликулов в динамике фолли-кулярного развития [83, 120].
Динамика секреции растворимого маркера апоптоза sFasR в группе пациенток с ТПФ значительно отличалась от двух групп сравнения (рис. 10). Отмечено 2 пика концентрации маркера – 17,7 пкг/мл (V класс фолликулов) и 15,4 пкг/мл (VII класс), что соотносится во времени со стадией селекции доминантного фолликула и преовуляторной стадией развития фолликула, со-ответственно. Для пациенток с ТПФ увеличение концентрации sFasR было зарегист-рировано на стадиях фолликула диаметром 2 – 5 мм и диаметром 20 мм, и это изменение уровня sFasR было достоверным (р 0,05).
Для пациенток с ОГНГ было показано достоверное (р 0,05) увеличе-ние концентрации sFasR, которое отмечалось на стадии предоминантного фолликула по сравнению с уровнем sFasR в стадии антрального фолликула. Отмечено сохранение первого пика маркера на стадии селекции доминантно-го фолликула. Вместе с тем, в ФЖ пациенток с ОГНГ уровень sFasR имел тенденцию к повышению по сравнению с уровнем sFasR в группе ФГП, на-чиная со стадии антрального фолликула. Для пациенток с ФГП увеличение содержания sFasR в ФЖ отмечалось начиная со стадии антрального и продолжалось до стадии предоминантного фолликула (р 0,05) по сравнению с данным показателем в группе пациен-ток с ТПФ (рис. 10).
Апоптоз гранулезных клеток яичника контролируют ген Fas и его ли-ганд FasL, где Fas выступает в роли рецептора. Запуск процесса апоптоза осуществляется посредством взаимодействия между FasL ооцитов и FasR гранулезных клеток [148]. На рис. 11 проанализирована динамика FasL в процессе фолликулоге-неза. В контрольной группе пациенток секреция sFasL снижалась в зависи-мости от стадии развития фолликулов. На стадии развития фолликулов с диаметром 10 – 16 мм и 20 мм значения данного маркера были достоверны низкими (р 0,05) по сравнению с уровнем sFasL начальных стадий роста фолликула.
У пациенток с ОГНГ и ФГП уровень sFasL также снижался от стадии антрального фолликула с диаметром 0,9 – 2 мм к стадии зрелого фолликула с диаметром 20 мм. У пациенток с ФГП отмечался резкий подъем концен-трации sFasL для фолликулов VI класса, который, однако, не совпадал по времени с пиками sFasR. Такое расхождение пиков по времени реализации в ходе фолликулоге-неза, очевидно, является проявлением определенного механизма адаптации к существованию ооцитов в условиях андрогенного микроокружения, оказы-вающего в течение некоторого времени протекторный антиапоптотический эффект, и направленного на выживание и развитие пула фолликулов. Однако уже на стадии овуляторного фолликула наблюдается совпаде-ние пиков по времени, что может свидетельствовать о запуске программы апоптоза. Эти данные подтверждаются более ранними работами нашей на-учной группы, где реализация апоптоза в гранулезных клетках овуляторного фолликула при ФГП и ОГНГ доказана прямыми методами детекции апоптоза [52, 53] . Вместе с тем, на развитие доминантного фолликула оказывает влияние не только равновесие про- и антиапоптотических факторов, но и факторов роста, отвечающих за циклическое формирование микроциркуляторного русла.
Степень развития сосудов фолликула имеет большое значение для рос-та и развития доминантного фолликула. Как известно, данный механизм ос-новывается на различиях в кровоснабжении фолликулов и степени прони-цаемости их капилляров [105,124]. Ангиогенный потенциал регулируется действием целого ряда молеку-лярно-биологических маркеров, обеспечивающих овариальную устойчивость и стабильный кровоток в сосудах репродуктивной системы женщины. Непо-средственный контроль процесса образования новых капилляров осуществ-ляется благодаря скоординированному действию индукторов и ингибиторов ангиогенеза. В физиологических условиях ингибиторы ангиогенеза необхо-димы для контроля за ростом кровеносных сосудов и предотвращения избы-точной неоваскуляризации [78,162,168].
Выбор лидирующего фолликула зависит от качества его кровоснабже-ния и функционирования капилляров. Установлено, что формирование сосу-дистой сети имеет сходные временные рамки с активным ростом и преобла-данием доминантного фолликула. Каждый зрелый фолликул имеет разветв-ленную систему кровоснабжения [121,127,167]. Реализация данной программы возможна посредством механизмов и факторов, которые влияют на формирование сосудов. Данные факторы могут активизировать или ингибировать образование сосудов, ускорять или замед-лять их рост, воздействовать на развитие сосудистой стенки, определять на-правление их развития [19,51,77].